PL50085B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 12.X.1965 50085 KL 30h, 2/10 MKP A 61 k M/OLi UKD B I B L i O i ^ ii A Urzedu Pai*nfcweg» Twórca wynalazku: mgr inz. Ryszard Koj er Wlasciciel patentu: Tarchominskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa", Warszawa (Polska) Sposób otrzymywania insuliny W znanych sposobach otrzymywania insuliny jedna z podstawowych faz procesu jest destylacja prózniowa (zageszczanie) alkoholowych ekstrak¬ tów z trzustki. Proces ten wplywa jednak szkod¬ liwie na trwalosc hormonu, dlatego tez starano sie 5 wydzielac insuline w inny sposób. Wedlug niektó¬ rych danych z* literatury (T. Schibata, Huk, Acta Mfed. 43. 278, 1952 — ref. C. A. 47. 2433, 1953) jak równiez nielicznych patentów proponowano wy¬ tracac insuline z alkoholowego ekstraktu trzustki 10 za pomoca soli cynkowych (np. indyjski opis pa¬ tentowy nr 43 403 i japonski opis patentowy nr 5448).W pierwszym z cytowanych opisów patento¬ wych dla wytracenia insuliny z ekstraktu etano- lowego zastosowano chlorek cynkowy i wodorotle- 15 nek amonu. Po dlugim i zlozonym procesie tech¬ nologicznym, a mianowicie: straceniu w mocnym etanolu, dializie, straceniu kwasem trój chlorooc¬ towym i przeprowadzeniu przez punkty izoelek- tryczne, uzyskiwano preparat insuliny o mocy fiz- 20 jologicznej zaledwie okolo 8—10 jednostek w 1 mg.W drugim opisie patentowym zastosowano eks¬ trakcje metanolowa trzustki wielorybiej, a na¬ stepnie uzyto siarczan cynkowy wobec wodoro¬ tlenku amonu jako czynnika stracajacego insuli- 25 ne z tego ukladu. Uzyskiwano w koncu w miare oczyszczona insuline o mocy 19 jednostek w 1 mg przy stosunkowo niskiej wydajnosci okolo 730 jed¬ nostek z 1 kg trzustki.Stwierdzono, ze mozna uzyskac insuline z wy- 30 2 wysoka wydajnoscia przy zastosowaniu wytraca¬ nia insuliny solami cynku z ekstraktu alkoholo¬ wego, nastepnego rozpuszczania, wysalania i eks¬ trakcji acetonem. Cel ten osiaga sie zgodnie z wy¬ nalazkiem w ten sposób, ze insuline ekstrahuje sie z trzustki zwierzecej slabym roztworem zakwa¬ szonego metanolu, a nastepnie wytraca sie. ja so¬ lami cynku zwlaszcza octanem cynku w srodo¬ wisku slatoo alkalicznym w obecnosci buforu octa¬ nowego. W dalszych fazach procesu technologicz¬ nego osad rozpuszcza sie w kwasie solnym a na¬ stepnie wysala chlorkiem sodu.Wysolone równoczesnie z insulina substancje ba¬ lastowe (barwniki i lipoidy) wymywa sie aceto¬ nem i dalszy proces prowadzi znanymi sposobami (otrzymywanie bezpostaciowej insuliny cynkowej i krystalizacja). Wiadomym jest, ze insulina jako hormon, w sklad którego wchodzi jon cynkowy, ma powinowactwo do tego metalu.Jednak wobec zlozonej i nietrwalej budowy cza¬ steczki insuliny, wszelkie procesy chemicznego wiazania jej z cynkiem powinny byc prowadzone w mozliwie najlagodniejszych warunkach, o ile ma pozostac nienaruszona struktura wewnetrzna hor¬ monu. Stwierdzono, ze cel ten osiaga sie, jezeli insuline wytraca z ekstraktu metanolowego sola¬ mi cynku w srodowisku slabo alkalicznym w obec¬ nosci octanów. Jednakze, jak wiadomo, czastecz¬ ka insuliny jest stosunkowo nietrwala w srodowi¬ sku alkalicznym. Proces rozkladu jest zas szcze- -j50085 3 golnie szybki w obecnosci pankreatycznych enzy¬ mów trawiennych dzialajacych optymalnie w sro¬ dowisku alkalicznym.Stwierdzono, ze przy wytracaniu insuliny jo¬ nami cynku w srodowisku slabo alkalicznym wo¬ bec octanowego ukladu buforujacego — nie tylko unika sie rozkladu w czasteczce insuliny, ale rów¬ niez zostaja zahamowane enzymatyczne procesy trawienne. Sposób wedlug wynalazku opiera sie na teorii wytwarzania wewnetrznych soli kom¬ pleksowych aminokwasów, z których zbudowana jest czasteczka insuliny. Np. reakcja miedzy cyn¬ kiem i kwasem alfa-aminooctowym przebiega jak podano na rysunku, na którym X) oznacza anion.W procesie tym powstaje wewnetrzna sól kom¬ pleksowa, w której cynk swoimi wartosciowoscia¬ mi glównymi wiaze sie z grupami karboksylowy- mi, a wartosciowosciami pobocznymi z grupami aminowymi oraz uwalnia sie kwas.' Przy zastosowaniu soli cynkowych w techno¬ logii wytracania insuliny zachodzi proces wiaza¬ nia jonów cynku prawdopodobnie w postaci kom¬ pleksowych polaczen. Uzycie w sposobie wedlug wynalazku octanu cynku ulatwia proces komplek- sowania sie, wlasnie dzieki slabej dysocjacji wy¬ twarzajacego sie kwasu octowego. Przesuniecie calego ukladu do srodowiska slabo alkalicznego (pH = 7,3—7,5) powoduje nasilenie procesu wiaza¬ nia jonów cynku oraz procesu asocjacji i agre-. gacji czastek insuliny.W sposobie wedlug wynalazku przy zastosowa¬ niu nadmiaru jonów cynku w srodowisku slabo alka¬ licznym nastepuje wydzielanie sie koloidalnego osa¬ du wodorotlenku cynku, który okluduje kompleksy insulinowo-cynkowe i zlozone zwiazki cynkowe (z barwnikami, lipoidami i peptydami) i powo¬ duje ich calkowite wytracenie z roztworu alkoho¬ lowego. Zawartosc insuliny w osadzie jest stosun¬ kowo niewielka (ulamek procentu). W dalszej fazie sposobu wedlug wynalazku odsaczony osad roz¬ puszcza sie w 1—2% roztworze kwasu solnego przy wartosci pH okolo 2,5 i wysala chlorkiem sodu. Osad oddziela sie od cieczy i zawiesza sie w 10-krotnej ilosci acetonu, miesza i saczy. Stwier- 10 15 20 25 30 35 40 dzono, ze aceton umozliwia jednoczesnie wymycie balastowych tluszczów i barwników. Po wymyciu substancji balastowych proces prowadzi sie dalej znanym sposobem do uzyskania insuliny w po¬ staci krystalicznej.Przyklad. 3 kg mieszanej trzustki wieprzo- wo-wolowej ekstrahuje sie 4—7 litrami metanolu zakwaszonego 40—50 ml kwasu siarkowego. Po odsaczeniu do przesaczu dodaje sie niewielka ilosc kwasu octowego i okolo 30 g octanu cynku w roz¬ tworze a nastepnie wodorotlenku sodu do osiag¬ niecia wartosci pH = 7,3—7,5. Wypada klaczkowaty osad. Po zlewarowaniu roztworu osad od¬ sacza sie i rozpuszcza sie w 200—300 ml. 1—2°/o- owego kwasu solnego az do uzyskania w roztwo¬ rze wartosci pH = kolo 2,5. Do otrzymanej met¬ nej cieczy dodaje sie chlorku sodowego do pel¬ nego nasycenia. Wysolony osad oddziela sie od cieczy i zawiesza w 10-krotnej ilosci acetonu. Za¬ wiesine dobrze sie miesza i odsacza. Do roztworu przechodza barwniki i tluszcze a w osadzie po¬ zostaje insulina (obok innych substancji). Dalsze fazy procesu (stracenie bezpostaciowej insuliny cynkowej i krystalizacja), prowadzi sie znanym sposobem. Uzyskuje sie okolo 120—170 mg krysta¬ licznej insuliny o mocy 21—24 j/mg i normalnej zawartosci cynku. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania insuliny przez ekstrakcje z trzustki za pomoca alkoholu zwlaszcza metanolu, wydzielenie jej z ekstraktu na drodze wytracenia, znamienny tym, ze ekstrakt insuliny traktuje sie octanem cynku w srodowisku buforowanym octa¬ nami i doprowadza wartosc pH srodowiska do okolo 7,3—7,5, przy czym insulina wytraca sie calkowicie z roztworu w postaci kompleksu z cyn¬ kiem, a otrzymany osad rozpuszcza sie w rozcien¬ czonym kwasie solnym, po czym wysala z roz¬ tworu osad, który traktuje sie acetonem w celu usuniecia substancji balastowych, przede wszyst¬ kim barwników i tluszczów, po czym dalsze oczy¬ szczanie insuliny prowadzi sie w znany sposób. Zn(x)2-h2NH2CH2C00H 5^ CH2-NHZ jpk-CHt Zn co-o' o-co +2H(X) ZG w Fab. zam. 946-65 230 egz f. A-4 PL