PL49898B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania A ^4—sterydów Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia AM-sterydów z A4-sterydów przez selektywne odwodornienie z udzialem mikroorganizmów.Reakcje selektywnego odwodornienia róznych zwiazków z grupy sterydów przy zastosowaniu prp- cesów biologicznych sa znane. Jezeli posiada sie szczep, który jest w stanie przeprowadzic wymaga¬ na reakcje, powazna trudnosc w uzyskaniu czyste¬ go produktu polega na oddzieleniu produktu od substratu, które to zwiazki sa do siebie bardzo podobne pod wzgledem wlasciwosci. Najprostsze byloby doprowadzenie reakcji do konca to jest do calkowitego zaniku substratu, jednakze w wielu przypadkach jest to nieosiagalne lub mozliwe tylko przy niskich i ekonomicznie- nieoplacalnych steze¬ niach surowca. Na ogól zbyt daleko idaca intensy¬ fikacja parametrów technologicznych nie jest wskazana ze wzgledu na destrukcje zwiazków ste¬ rydowych, która w mniejszym lub wiekszym stop¬ niu towarzyszy reakcji pozadanej.W znanych sposobach prowadzi sie inkubacje mikroorganizmu przez wlasciwy dla niego okres czasu, nastepnie dodaje sie do kultury substrat, po czym prowadzi sie reakcje do pewnego z góry przyjetego stopnia przereagowania substratu, po czym calosc mieszaniny reakcyjnej poddaje sie ekstrakcji organicznymi rozpuszczalnikami. Do ekstraktu przechodzi zarówno produkt jak i nie- przereagowany jeszcze substrat. Po oczyszczeniu ekstraktu i oddestylowaniu rozpuszczalników otrzy- 20 2 so muje sie w najlepszym razie mieszanine dwóch zwiazków, których rozdzial wymaga uciazliwych zabiegów jak np. chromatografowania lub wielo¬ krotnej krystalizacji danych zwiazków badz ich pochodnych itp.Sposób wedlug wynalazku opiera sie na wyko¬ rzystaniu równowagi miedzy substratem i produk¬ tem oraz na stwierdzeniu, ze rozpuszczalnosc sub¬ stratu w fazie cieklej podloza fermentacyjnego jest minimalna. W oparciu o to opracowano sposób wedlug wynalazku pozwalajacy na dobre wykorzy¬ stanie aktywnosci enzymatycznej cehydrogenezy wytworzonej przez drobnoustroje. W sposobie we¬ dlug wynalazku usuwa sie sukcesywnie ze srodo¬ wiska reakcji produkt wolny od substratu oraz sukcesywnie dodaje sie substrat. Postepujac w ten sposób otrzymuje sie czysty produkt z duza wy¬ dajnoscia tak pod wzgledem stopnia przemiany jak i wykorzystania mikroorganizmu i objetosci fer- mentora, a dzieki temu uzyskuje sie kilkakrotne zwiekszenie wydajnosci calego procesu jak i skró¬ cenie czasu trwania procesu. Skomplikowane za¬ biegi zwiazane z rozdzialem produktu i substratu po ukonczonym procesie biologicznym droga chro¬ matografii lub krystalizacji, staja sie tu calkowicie zbedne, a pozostaje jedynie koncowe oczyszczenie produktu np. droga chromatografii lub frakcjono¬ wanej krystalizacji do osiagniecia czystosci wyma¬ ganej dla celów terapeutycznych.Wedlug wynalazku przygotowuje sie pozywke 4989849898 3 «WM zawierajaca zródlo azotu i wegla, dodaje don zwia¬ zek sterydowy stanowiacy substrat, który ma byc odwodorniony i po wyjalowieniu wprowadza sie przygotowana poprzednio zawiesine drobnoustro¬ jów. Zawiesine te uzyskuje sie droga wielokrotnego przeszczepiania kultury mikroorganizmów wycho¬ dzac ze szczepu liofilizowanego poprzez skosy aga¬ rowe i dalsza hodowle aerobowa we wstrzasanych kolbach. Reakcje prowadzi sie kontrolujac metoda chromatografii bibulowej zawartosc produktu w roztworze. Stezenie produktu wzrasta w ciagu L reakcj), a nastepnie ustala sie co dowodzi zakon¬ ni-\ czeMa| reakcji. Wówczas grzybnie czy mase bakte¬ ryjna oddziela sie od cieczy. Calosc nieprzereago- wanego substratu wraz ze stosunkowo nieznaczna iloscia produktu znajduje sie w odsaczonej grzyb¬ ni. Grzybnie wprowadza sie do nowego srodowiska, | A )l ^ ewentualnie uzupelnia sie przy tym ilosc substratu i prpces biolo^czny^ prowadzi sie dalej. Opisany cykl moze byc kilkakrotnie powtórzony przy zasto- [ «ctwolf^sófwdnfu stale tej samej grzybni. Ze wszystkich przesgezów otrzymaiiych w, poszczególnych cyklach, ekstrahuje sie 'organicznym rozpuszczalnikiem pro¬ dukt reakcji. Po oczyszczeniu ekstraktu i oddesty¬ lowaniu rozpuszczalnika, uzyskuje sie produkt wy¬ magajacy jedynie koncowego ostatecznego oczy¬ szczenia, gdyz z reguly jest on w stanie dosc wy¬ sokiej czystosci, a przede wszystkim nie zawiera on substratu, najtrudniejszego do oddzielenia. Dzie¬ ki stosowaniu tej samej grzybni w kolejnych cy¬ klach, przenosi sie wraz z nia bez straty zatrzyma¬ ne przez nia sterydy. Jezeli grzybnia ma byc usu¬ nieta np. na skutefe degeneracji, po daje sie ja ekstrakcji w znany sposób i odzyskuje z niej zwiaz¬ ki sterydowe. Rozdzialu tych zwiazków nie prze¬ prowadza sie, gdyz substancje sterydowe z ekstrak¬ tu nadaja sie do zastosowania jako surowiec w na¬ stepnych szarzach produkcyjnych, prowadzonych z nowa grzybnia.Z wyjatkiem pierwszego cyklu, calosc procesu prowadzi sie bez zachowania warunków jalowosci, co stanowi istotne Uproszczenie technologiczne produkcji. Zawieszanie grzybni w drugim i nastep¬ nych cyklach w wodzie utrudnia rozwój innych drobnoustrojów, które dostaly sie do srodowiska reakcji i moglyby niekorzystnie wplywac na zasad¬ niczy proces.Sposób wedlug wynalazku ilustruje podany przy¬ klad dotyczacy wytwarzania AMTa-metylotestoste- ronu przez odwodornienie 17a-metylotestosteronu.Przyklad. Przygotowano grzybnie wychodzac z lio¬ filizowanego szczepu Didymella lycopersici. Hodo¬ wle przeprowadzono aerobowo we wstrzasanych kolbach. Do tanku fermentacyjnego wprowadzono 2,25 litra pozywki zawierajacej zródlo azotu i we¬ gla oraz dodano 1250 mg 17a-metylotestosteronu.Tank wraz z zawartoscia wyjalowiono, po czym wprowadzono okolo 400 g swiezo ocwirowanej grzybni z wyzej wymienionej hodowli. Proces bio¬ logiczny prowadzono przy temperaturze 28° w cia¬ gu 16 godzin, po czym zawartosc tanku przesaczono.Przesacz pozostawiono do dalszej przeróbki, a grzy- s bnie zawrócono do tanku, dopelniono roztworem buforowym wzglednie woda/ do 2,5 litra. Do tej fazy transformacji i do nastepnej dodano porcje po 625 mg substratu. Do dwóch ostatnich faz sub¬ stratu juz nie dodawano. Lacznie wprowadzono za- 10 tern 2,5 g substratu, to jest 1000 mgA brzeczki. Kaz¬ dorazowe prowadzenie procesu biologicznego prze¬ rywano z chwila kiedy ilosciowa chromatograficz¬ na kontrola prowadzona metoda bibulowa nie wy¬ kazala dalszego wzrostu stezenia produktu w roz- 15 tworze. Przesacze z poszczególnych cykli poddano ekstrakcji chloroformem. Ekstrakt w organicznym rozpuszczalniku przemyto trzykrotnie l°/o-owym roztworem kwasnego weglanu sodowego i woda az do odczynu obojetnego, a nastepnie po wysuszeniu 20 bezwodnym siarczanem sodowym oddestylowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Su¬ rowy produkt rozpuszczono w rozcienczonym meta¬ nolu. Roztwór wodno-metanolowy poddano ekstrak¬ cji eterem naftowym w celu usuniecia substancji 25 niesterydowych, a nastepnie oddestylowano meta¬ nol i wo^e a wytracony produkt odsaczono i prze- krystalizowano z octanu etylu. Otrzymano 1,82 g AMTa-metylotestosteronu o czystosci odpowia¬ dajacej wymaganiom brytyjskiej farmakopei 30 „B.P.1963". Stanowi to 72,9^/d wydajnosci teoretycz¬ nej. Po przeprowadzeniu ostatniego cyklu wyek¬ strahowano organicznym rozpuszczalnikiem z grzy¬ bni 225 mg substratu zmieszanego z produktem.Substancja sterydowa zawarta w ekstrakcie moze 85 sluzyc jako surowiec do nastepnej szarzy produk¬ cyjnej. PO wprowadzeniu poprawki rachunkowej uwzgledniajacej odzyskanie substancji sterydowej z grzybni, wyliczono wydajnosc praktyczna, która wynosi okolo 80*/». 40 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania AM-sterydów przez odwo¬ dornienie zwiazków A4-sterydowych przy udziale 45 drobnoustrojów aerobowych w plynnym srodowi¬ sku, do którego wprowadza sie substrat sterydowy, znamienny tym, ze podczas prowadzenia procesu kontroluje sie systematycznie stezenie produktu w roztworze i proces przerywa sie gdy stezenie to 50 praktycznie przestaje wzrastac, po czym grzybnie odsacza sie i przenosi do nowego srodowiska poste- . pujac jak wyzej parokrotnie, a produkt zawarty w przesaczach ekstrahuje sie organicznym rozpu¬ szczalnikiem i poddaje ostatecznemu oczyszczeniu 55 w znany sposób, przy czym w razie degeneracji grzybni ekstrahuje sie z niej w znany sposób zwiazki sterydowe, które odwodarnia sie w nastep¬ nym cyklu produkcji. Zaklady Kartograficzne, Wroclaw, A/447, naklad 400 egz. PL