PL249601B1 - Sposób wzbogacania preparatów plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę G (IgG) - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Immunoglobuliny IgG są dominującą klasą występującą w surowicy/osoczu krwi zwierząt, w szczególności drobiu. Są odpowiedzialne za wiązanie antygenów drobnoustrojów zagrażających zdrowiu zwierząt i we współpracy z innymi mechanizmami odporności tworzą barierę ochronną dla infekcji. IgG drobiu (oznaczana też jako IgY) cechuje się dużą odpornością na warunki występując e w przewodzie pokarmowym i dzięki możliwości uzyskiwania jej w dużych ilościach z krwi pozyskanej przy uboju ptaków stanowią atrakcyjną alternatywę dla antybiotyków w ochronie zdrowia zwierząt (Pacheco i in. 2023 Animals, 13(19), 3130).

Niekontrolowane, nadmierne, trwające szereg dziesięcioleci nadużywanie antybiotyków w chowie zwierząt doprowadziło do pojawienia się wielu szczepów antybiotykoopornych, zagrażających zwierzętom i ludziom-konsumentom. Jednym ze sposobów przeciwdziałania tej sytuacji jest zakaz stosowania antybiotykowych stymulatorów wzrostu, ale wówczas w wielu krajach zaobserwowano wzrost liczby zachorowań zwierząt gospodarskich szczególnie drobiu w warunkach intensywnego chowu produkcji oraz przenoszenia zakażeń z ptaków na konsumentów mięsa (najczęstsze są zakażenia drobiu szczepami Campylobacter jejuni - Paul i in. 2014, Poultry Sci., 93(11), 2779-2787). Aby ograniczyć negatywne skutki wycofywania antybiotyków poszukuje się rozwiązań alternatywnych tj. zwiększenia odporności biernej młodych zwierząt przez stosowanie immunoglobulin w paszy (Chalghoumi i in. 2009, Biotechnol. Agron. Soc. Environ., 13(2), 295 -308). IgG jest możliwa do uzyskania z krwi (plazmy) drobiu - dotychczas niedocenianego źródła immunoglobulin, które mogą być z powodzeniem użyte do ochrony zdrowia zwierząt gospodarskich. Plazma krwi zebranej od wielu zwierząt z różnych ferm zawiera mieszaninę przeciwciał pozwalających na ochronę zwierząt otrzymujących immunoglobulin w karmie przed działaniem i wzrostem takich patogenów Salmonella sp., Clostridium perfringens, Escherichia coli, rotawirusy i inne (Caly i in. 2015, Front. Microbiol., 6, 1 -12). Z powyższych powodów istotne jest uzyskanie preparatów o zwiększonym udziale IgG w białkach plazmy krwi drobiu, co można osiągnąć prze z wyizolowanie immunoglobuliny z plazmy i jej ewentualne dalsze oczyszczanie z użyciem szeregu technik rozdziału białek i innych substancji czynnych lub przy zastosowaniu prostych technik wzbogacenia preparatów plazmy w IgG.

Opisane są metody wykorzystania technik chromatografii powinowactwa (z użyciem przeciwciał specyficznych wiążących IgG) lub chromatografii jonowymiennej, w której wykorzystuje się zdolność wiązania IgG przez złoże na zasadzie oddziaływań jonowych a następnie wymywania ze złoża wymieniacza jonowego immunoglobuliny m.in. w wyniku zastosowania roztworu o zwiększonej sile jonowej co podano w opisach patentu US 11,261,238 B2 z 1 marca 2022 roku oraz CN101402671A z 21 października 2008 roku dotyczącego równoległego rozdziału fibrynogenu i immunoglobuliny z plazmy krwi poprzez precypitację fibrynogenu w roztworach nasyconych soli nieorganicznych, a następnie wiązanie i oczyszczanie IgG z wykorzystaniem chromatografii kolumnowej adsorpcyjnej.

Znane są też techniki wykorzystania procesów filtracji membranowej do rozdziału lub frakcjonowania białek plazmy krwi (w tym drobiowej), szczególnie według opisu wynalazku CN101849612A z 3 kwietnia 2009 roku dotyczącego sposobu wytwarzania proszku białkowego (suszonego preparatu) z plazmy krwi kurcząt, w którym kluczową operacją jest rozdział plazmy jako metoda ultrafiltracji z użyciem membran w zakresie punktu odcięcia 1 kDa do 300 kDa, pozwalającą praktycznie na odzyskanie wszystkich białek plazmy oraz innych substancji wielkocząsteczkowych tj. polisacharydów i kwasów nukleinowych po oddzieleniu substancji niskocząsteczkowych i soli mineralnych (następnie zagęszczanych przez nanofiltrację, przy czym funkcja tego procesu jest ukierunkowana głównie na usunięcie własnych substancji mineralnych plazmy, ale bez znacznego wzbogacenia ekstraktu (proszku) w IgG. Z kolei w opisie wynalazku CN1972961B z pierwszeństwem z 7 czerwca 2004 roku podano sposób izolowania jednego lub większej liczby białek z roztworu białka otrzymywanego ze źródła wybranego spośród krwi, surowicy i/lub osocza (plazmy) krwi, w tym drobiowej, ale ta izolacja jest uzyskiwana metodą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej ze złożem ekspandowanym.

Przytoczone sposoby oczyszczania lub wzbogacania preparatów plazmy krwi drobiowej są skomplikowane technicznie i wykorzystują drogie urządzenia lub materiały do ich realizacji, ponadto nie stosują sformułowania wysalania białek i z tego względu proponowana będzie inna technologia.

ISTOTA WYNALAZKU

Sposób według wynalazku ma na celu wzbogacenie preparatów plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę, a nie jej izolację (wyodrębnienie) i zasadniczo polega na pojedynczym lub podwójnym wysalaniu IgG z plazmy krwi drobiowej przy zastosowaniu tańszych i mniej skomplikowanych narzędzi i urządzeń, czyli najtańszej soli NaCl i z użyciem prostych urządzeń typu zbiorniki do uzyskania preparatu IgG o czystości rzędu 60% udziału w białkach plazmy po podwójnym wysalaniu (podczas gdy z użyciem chromatografii uzyskuje się ok 70% czystości w skomplikowanym procesie rozdziału).

Wzbogacanie plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG, polega na zwiększeniu udziału IgG w białkach plazmy krwi drobiowej uzyskanej w wyniku wirowania pełnej krwi przy użyciu znanych metod i wirówek rozdzielających krew na plazmę i składniki upostaciowane (gąszcz krwinek) a następnie zmianie wartości pH plazmy do 9,0-10,3 w celu zmniejszenia stopnia żelowania fibrynogenu co ułatwia ewentualny proces zagęszczania plazmy z użyciem technik filtracji membranowej znanymi powszechnie metodami, gdzie plazma zostaje poddana zasoleniu do poziomu co najmniej 15% wag. soli przez dodanie NaCl. Zasolenie jest prowadzone stopniowo porcjami przy jednoczesnym mieszaniu. Zasoloną plazmę pozostawia się na co najmniej 8-16 godzin w temperaturze w zakresie +4°C do +20°C w celu uzyskania osadu białek sedymentującego w części dolnej zbiorników a następnie lewarowania roztworu znad osadu (zazwyczaj około 2/3 objętości zasolonej plazmy) z pozostawieniem 1/3 objętości plazmy w zbiorniku. Pozostały roztwór jest zawiesiną zawierającą osad wysolonych białek i zostaje rozpuszczony wodą oczyszczoną (demineralizowaną) w stosunku zawiesina z osadem białek do wody jak 1 do 2 w celu rozpuszczenia wysolonych białek (w tym immunoglobuliny G); osiągane jest wówczas stężenie NaCl rzędu 5% wag. Następnie tak przygotowany roztwór jest zagęszczany metodą nanofiltracji z użyciem filtrów o punkcie odcięcia 200 Da (Daltonów) do uzyskania wyjściowej objętości zawiesiny z osadem białek lub 1/3 tej objętości a następnie prowadzone jest odsalanie roztworu zawierającego ok 5% NaCl poprzez wprowadzanie wody porcjami w stosunku do zagęszczonego roztworu jak 1 do 1 obj. co najmniej 2-3 krotnie i kolejne zagęszczanie metodą nanofiltracji do uzyskania poziomu NaCl poniżej 1% wag. Odsolony i zagęszczony roztwór jest następnie suszony w suszarni rozpyłowej w temperaturze nie wyższej niż 160 stopni C.

Alternatywny jest proces dwukrotnego wysalania immuoglobuliny w celu uzyskania większej czystości preparatu (60% IgY w białku rozpuszczalnym), wówczas po zagęszczeniu roztworu o stężeniu ok. 5% (rozpuszczony osad białek) następuje dodanie kolejnej porcji soli NaCl w celu osiągnięcia nie mniej niż 15% wag. soli i pozostawienie na kolejny proces wysalania (co najmniej na 6-8 godzin), a dalsze postępowanie z roztworem przebiega tak jak przy pojedynczym wysalaniu.

Niniejszy wynalazek zapewnia wiele korzyści.

W odróżnieniu od stanu techniki, wynalazek stanowi uproszczenie procesu i nie wymaga stosowania kosztownych urządzeń do chromatografii, a co za tym idzie obniża koszty monitorowania wartości parametrów i użytego sprzętu, bez obniżania jakości procesu, to pozwala na uproszczenie i skrócenie (zmniejszenie ilości operacji jednostkowych) procesu pozyskania z plazmy krwi drobiowej preparatu o wysokim stopniu wzbogacenia w immunoglobulinę, wyeliminowanie czasochłonnych procedur rozdziałów chromatograficznych. Sposób jednocześnie umożliwia pełne wykorzystanie wszystkich składników przetwarzanej plazmy, ponieważ oddzielana w czasie procedury frakcja białek (frakcja górna) może być zagospodarowana jako tzw. białko żelujące ze względu na zawartość albuminy krwi i częściowo fibrynogenu. W procesie według wynalazku nie są stosowane żadne składniki chemiczne poza chlorkiem sodu powszechnie używanym jako sól konsumpcyjna również dla zwierząt, a jej ilość w wyniku procesu jest finalnie utrzymywana na poziomie stężeń fizjologicznych czyli obojętnych. Natomiast stosowanie innych soli lub składników chemicznych wymaga całkowitego ich usunięcia w procesie izolacji czy wzbogacania w immunoglobulinę, głównie z powodu użycia suszonej plazmy wzbogaconej w immunoglobulinę jako paszy lub składnika paszy dla zwierząt hodowlanych.

PRZYKŁADY WYKONANIA

Przykład 1

Do plazmy krwi kurcząt o pH = 9,6 w ilości 200 l wprowadzono sól NaCl (przeznaczoną do celów spożywczych) w ilości 36 kg i rozpuszczono stopniowo w ciągu około 2 godzin mieszając ręcznie. Roztwór pozostawiono na 16 godzin w temperaturze ok. 10°C w celu wysolenia części białek wypadających z roztworu w formie sedymentującego osadu. Po tym czasie dokonano dekantowania (lewarowania) roztworu z nad osadu (usunięto około 75% objętości plazmy) i pozostawiono w dolnej części zbiornika 25% objętości plazmy z zawiesiną (osadem) wysolonych białek. Do tej zawiesiny (około 60 l) dodano porcje wody, tj. 120 l. Spowodowało to obniżenie stężenia soli do 5% i pozostawiono na 2 godziny w celu rozpuszczeniu osadu białek wysolonych, w tym IgG. Po rozpuszczeniu osadu roztwór zagęszczono 3 krotnie metodą ultrafiltracji a następnie dodawano wodę demineralizowaną porcjami w stosunku 1:1 do zagęszczanego roztworu białek w celu odsolenia, czynności te powtórzono trzykrotnie do uzyskania stężenia soli poniżej 1%. Po odsoleniu i zagęszczeniu roztwór o objętości ok. 50 l suszono rozpyłowo przy temperaturze powietrza wlotowego 160°C. Udział białka rozpuszczalnego w suszonym produkcie (białko rozpuszczalne po rehydratacji proszku oznaczono metodą biuretową spektrofotometrycznie przeliczone na produkt suchy) wyniósł 774 g/kg a ilość aktywnego IgG mierzona metodą immunodyfuzji radialnej mierzona z użyciem przeciwciała anty IgG kury wydzielonego z surowicy immunizowanej kozy wyniosła 40,9% białka rozpuszczalnego.

Przykład 2

Do plazmy krwi indyków o pH=10,3 w ilości 800 l dodano 175 kg soli NaCl (spożywczej), rozpuszczając sól stopniowo porcjami z mieszaniem mechanicznym. Roztwór plazmy z solą pozostawiono na 14 godzin w celu częściowego wysolenia globulin, w tym immunoglobuliny G, wypadających z roztworu jako osad wytrącony w dolnej części zbiornika. Po tym okresie dekantowano (lewarowano za pomocą pompy) zasoloną plazmę z górnej części zbiornika z pozostawieniem w dolnej części zbiornika ok. 300 l plazmy z zawiesiną białek. Do tej zawiesiny dodano wodę demineralizowaną w ilości 600 l uzyskując stężenie soli ok. 6%, co umożliwiło rozpuszczenie osadu immunoglobulin w ciągu ok. 2 godzin. Następnie stosując nanofiltrację o wydajności filtracji ok. 300 l/h zagęszczono 6% roztwór NaCl do ok. 300 l i przeprowadzono odsalanie (metodą tzw. diafiltracji) dodając porcjami wodę demineralizowaną w stosunku 1:1 obniżając stężenie soli o ok. ¹Z w stosunku do wyjściowego, ponownie zagęszczano i ten cykl powtórzono jeszcze trzykrotnie. Uzyskany roztwór o objętości ok. 250 l suszono rozpyłowo w temperaturze 160°C. Uzyskano produkt o zawartości białka ogółem 86,5% (wyliczonej na podstawie analizy azotu ogółem metodą Kjeldahla) i ilości aktywnej immunoglobuliny 41,9% (mierzona metodą immunodyfuzji radialnej) podana w stosunku do białka rozpuszczalnego oznaczonego metodą biuretową po rehydratacji suszonego preparatu IgG.

Przykład 3

Do plazmy krwi indyków o pH ustalonym na poziomie 9,5 zagęszczonej dwukrotnie metodą nanofiltracji o zawartości białka 79,6 g/l w ilości 7 ton podzielonej następnie na dwie partie po 3,5 tony dodano sól NaCl w ilości 620 kg/partię (razem 1240 kg) i pozostawiono w warunkach chłodniczych przez 14 godzin. Następnie dokonano lewarowania górnej frakcji roztworu z pozostawieniem w zbiorniku dolnej części roztworu (zawiesiny) z osadem wysolonych globulin w ilości 1/3 wyjściowej objętości. Roztwory (zawiesiny) pozyskane z 2 partii surowca połączono uzyskując ok. 2,3 m 3, które rozcieńczono 4,6 m³ wody demineralizowanej (stężenie soli wyniosło ok. 5% wag.) i pozostawiono do rozpuszczenia osadu białek przez 1,5 h. Następnie roztwór zagęszczono do 2,25 m³ metodą nanofiltracji i odebrano 233 l roztworu białek o stężeniu soli ok. 5% wag. przeznaczonego do ponownego wysolenia. Pozostałe ok. 2,0 m³ odsalano trzykrotnie dodając wodę w stosunku do roztworu jak 1:1 a następnie każdorazowo zagęszczając roztwór. Uzyskany roztwór suszono w suszarni rozpyłowej 160°C uzyskując produkt o zawartości białka ogółem 83,5% i ilości aktywnej IgG 38,3% (oznaczonej metodą immunodyfuzji radialnej) w przeliczeniu na białko rozpuszczalne (stężenie oznaczone po rehydratacji produktu suszonego).

Do roztworu w ilości 233 l o stężeniu soli ok. 5% dodano NaCl w ilości 26 kg ( do uzyskania stężenia łącznego 15% wag.), w celu uzyskania jeszcze większego stopnia wzbogacenia plazmy w IgG przez ponowne wysalanie białek, i pozostawiono na 8 godzin. Następnie oddzielono górną część roztworu znad osadu, pozostawiając ok. 80 l, które zagęszczono oraz odsalano tak jak przy pierwszej fazie wysalania. Po wysuszeniu w suszarni rozpyłowej w 160°C uzyskano produkt o zawartości białka ogółem 84,2%, udziale IgY 63,6% oznaczonego metodą immunodyfuzji radialnej w odniesieniu do białka rozpuszczalnego po rehydratacji oraz oznaczonej metodą ELISA zwiększonej reaktywności (wzrost absorbancji z 0,25 do 0,33) przeciwko antygenom patogennego Campylobacter jejuni w porównaniu do plazmy wyjściowej.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG, polegający na zwiększeniu udziału IgG w białkach plazmy krwi drobiowej uzyskanej w wyniku wirowania pełnej krwi przy użyciu znanych metod i wirówek rozdzielających krew na plazmę i składniki upostaciowane, (gąszcz krwinek), a następnie zmianie wartości pH plazmy do 9,0-10,3 w celu zmniejszenia stopnia żelowania fibrynogenu co ułatwia proces zagęszczania plazmy z użyciem technik filtracji membranowej znanymi powszechnie metodami znamienny tym, że plazma zostaje poddana zasoleniu przez dodanie chlorku sodu NaCl do uzyskania co najmniej stężenia soli w zakresie 15-18% wag. co powoduje częściowe wytrącenie, wysolenie białek plazmy, które następnie osiadają, sedymentują w zbiorniku, tworząc w jego dolnej części frakcję zawierającą osad białkowy, który po oddzieleniu górnej warstwy plazmy w wyniku dekantacji, lewarowania cieczy znad osadu z użyciem pompy, zostaje rozpuszczony w wyniku dodania wody w takiej ilości aby uzyskać stężenie NaCl nie więcej niż 6% wag. tworząc roztwór wzbogacony w IgG, a tak uzyskany roztwór jest zagęszczany i odsalany przez dodawanie wody i kolejne zagęszczanie do uzyskania stężenia NaCl poniżej 1% wag.
2. 2. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG według zastrz. 1, znamienny tym, że zasolenie plazmy jest prowadzone stopniowo porcjami soli NaCl z jednoczesnym mieszaniem.
3. 3. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG według zastrz. 1-2, znamienny tym, że proces wysolenia białek powinien trwać co najmniej 8 godzin a korzystnie 16 godzin w temperaturze w zakresie +4°C do +20°C.
4. 4. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG według zastrz. 1-3, znamienny tym, że pozostawiona zostaje frakcja osadu frakcja w dolnej części zbiornika, zawierającej wysolone białka w ilości co najwyżej 1/3 wyjściowej objętości zasolonej plazmy.
5. 5. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG według zastrz. 1-4, znamienny tym, że w sposobie stosuje się co najmniej trzykrotne zagęszczenie roztworu wzbogaconego w IgG o stężeniu poniżej 6% wag. NaCl metodą nanofiltracji z użyciem filtrów o punkcie odcięcia 200 Da, a następnie prowadzone jest odsalanie tak zagęszczonego roztworu zawierającego nie więcej niż 6% wag NaCl poprzez wprowadzanie wody w stosunku do zagęszczonego roztworu nie więcej niż jak 1:1 obj. i kolejne zagęszczenie. Należy powtarzać cykl dodawania wody i zagęszczania do uzyskania poziomu NaCl w roztworze poniżej 1% wag.
6. 6. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG według zastrz. 1-5, znamienny tym, że dodatkowo zwiększa się stopień wzbogacenia plazmy krwi drobiowej w IgG przez ponowne przeprowadzenie procesu wysalania immunoglobuliny w wyniku dodania kolejnej porcji soli NaCl do roztworu rozpuszczonego osadu po pierwszym wysalaniu białek, nie więcej jak 6% wag soli NaCl, w celu osiągnięcia nie mniej niż 15% wag. soli i pozostawieniu zasolonego roztworu w celu wytrącenia białek.
7. 7. Sposób wzbogacania plazmy krwi drobiowej w immunoglobulinę IgG według zastrz. 1 -6, znamienny tym, że odsolony i zagęszczony roztwór jest następnie suszony w suszami rozpyłowej w temperaturze nie wyższej niż 160°C.