PL249584B1 - Sposób otrzymywania halfordyny z liści Halfordia kendack (Montrouz.) Guillaumin (Rutaceae) - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania halfordyny z liści Halfordia kendack (Montrouz.) Guillaumin (Rutaceae).

Halfordia kendack (Montrouz.) Guillaumin (Rutaceae) jest rośliną endemiczną dla Australii, Nowej Gwinei i Nowej Kaledonii. Jest to krzew lub drzewo rosnące w lasach deszczowych, z liśćmi zwężającymi się ku podstawie, biało-żółtawymi kwiatami i owocami w kształcie sferycznym do okrągłego koloru purpurowego do czarnego. Liście i kora rośliny jest bogata w kumaryny P.442710, pochodne furanokumaryn i alkaloidy chinolinowe [Sultana N et al. 3,5-Dimethoxy-3-(1,1-dimethylprop-2-enyl)-3,4-dihydropsoralen-4-one: An unusual furanocoumarin derivative from Halfordia kendack. Phytochemistry 2000, 55, 675-678] [Sultana N, Waterman PG. 3-Monoterpenyl-2,4-dioxygenated quinoline alkaloids from the aerial parts of Halfordia kendack. Phytochemistry 2001,58, 329-332].

Po raz pierwszy halfordyna (3,4,5-trimethoxypsoralen) wyizolowana została z H. kendack w 1956 roku przez Hegharty and Lahey. W pierwszej kolejności otrzymano ekstrakt z kory przy użyciu eteru naftowego, poprzez 12-godzinną ekstrakcję w aparacie Soxleta. Kumaryna została wykrystalizowana, a następnie poddana chromatografii na tlenku glinu z dodaniem 3% KOH, a później 15% HCl. W wyniku procesu uzyskano 3 g halfordyny z 3 kg zmielonej kory [Hegarty MP, Lahey FN. The Coumarins Of Halfordia Scleroxyla F.Muell. Aust. J. Chem. 1956, 9, 120-131].

Kumaryny pochodzenia roślinnego wykazują wielokierunkowe działanie, mogą być wykorzystywane w wielu przemyśle między innymi w farmaceutycznym, kosmetycznym, czy spożywczym.

W roku 2000 Sultana i współpracownicy [Sultana, N et al. 3,5-Dimethoxy-3-(1,1-dimethylprop-2-enyl)-3,4-dihydropsoralen-4-one: an unusual furanocoumarin derivative from Halfordia kendack. Phytochemistry 2000, 55, 6 675-678] otrzymali halfordynę z n-heksanowego ekstraktu z nadziemnych części rośliny. Zastosowano ciśnieniową chromatografię cieczową na żelu krzemionkowym z rosnącym stężeniem octanu etylu. Następnie przefiltrowano frakcje na kolumnie wypełnionej Sephadex LH-20. W ten sposób uzyskano 416 mg halfordyny z 6.82 g ekstraktu.

Quek i współpracownicy [Quek A, et al. α-Amylase and dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitory effects of Melicope latifolia bark extracts and identification of bioactive constituents using in vitro and in silico approaches. Pharmaceutical Biology 2021, 59, 1, 964-973] w 2021 wyizolowali halfrodynę z kory Melilope latifolia (DC.) T. G. Hartley (Rutaceae). Izolację poprzedziła 72-godzinna maceracja z n-heksanem, a następnie chloroformem i metanolem. Następnie ekstrakt chloroformowy (17 g) został rozdzielony z zastosowaniem chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym 60, z użyciem gradientu n-heksan, n-heksan + octan etylu, octan etylu + metanol, metanol. W wyniku tej procedury uzyskano 6.4 mg halfordyny (0.38% wydajności).

Przedstawione metody są czasochłonne oraz mało wydajne i nie nadają się do izolacji na większą skalę.

Wynalazek rozwiązuje problem izolacji halfordyny zawierającej kumarynę z dużą wydajnością przy zastosowaniu techniki chromatografii odśrodkowej (centrifugal partitioned chromatography - CPC). Zastosowanie układu ciecz-ciecz i brak fazy stałej jako fazy stacjonarnej zapewnia bezstratne pozyskanie czystego związku w krótkim czasie z dużą wydajnością o wysokiej czystości do 98%. Dodatkową zaletą jest możliwość przełożenia warunków procesu izolacji na większą skalę, w tym skalę przemysłową przy zachowaniu wysokiej wydajności procesu.

Kumaryna pozyskiwana z liści Halfordia kendack (Montrouz.) Guillaumin (Rutaceae) może mieć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym oraz kosmetycznym.

Sposób izolacji halfordyny według wynalazku polega na tym, że rozdrobnione liście Halfordia kendack (Montrouz.) Guillaumin (Rutaceae) poddaje się najpierw ekstrakcji metanolem, a następnie ekstrakt metanolowy poddaje się rozdzielaniu przy użyciu chromatografii odśrodkowej z dwufazową mieszaniną rozpuszczalników użytych w proporcji n-heksan, octan etylu, metanol, woda od 1:1:1:1 do 1.6:0.4:1.6:0.4 (v/v/v/v). Ekstrakt w ilości 5% do 30%, korzystnie 27% w stosunku do objętości dozowanej do kolumny mieszaniny rozpuszczalników, przed rozdzielaniem rozpuszcza się w próbce mieszaniny rozpuszczalników o takim samym składzie jak dwufazowa mieszanina rozpuszczalników, albo w jednej z faz stosowanego układu rozpuszczalników, korzystnie w fazie ruchomej, a rozdzielanie prowadzi się w układzie faz odwróconych, stosując rotację kolumny aż do uzyskania stanu równowagi faz, w temperaturze od 25 do 35°C korzystnie 26°C, następnie po rozdzieleniu zbiera się frakcje stanowiące halfordynę.

Korzystnie na 1 część rozdrobnionego materiału roślinnego stosuje się od 5 do 10 części metanolu 100%.

Korzystnie dwufazową mieszaninę rozpuszczalników stosuje się w proporcji n-heksan, octan etylu, metanol, woda 1.43:0.57:1.43:0.57 lub 1.5:0.5:1.5:0.5.

Korzystnie rotację kolumny prowadzi się przy maksymalnej ilości obrotów kolumny 1700 rpm.

Rozdzielone frakcje zawierające halfordynę zbiera się przy prędkości przepływu w kolumnie od 8 do 10 ml/min, korzystnie 8 ml/min od pojawienia się na chromatogramie pierwszego piku.

Rozdzielenie monitoruje się przy długości fali 254 nm. Halfordynę izoluje się w czasie 16-45 minut.

Proponowana metoda pozwala uzyskać halfordynę o wysokiej czystości do 98% i wydajności procesu na poziomie 4.16%. Ponadto metoda według wynalazku pozwala zredukować czas izolacji. Efekty te są możliwe dzięki zastosowaniu chromatografii odśrodkowej z układem rozpuszczalników: n-heksan, octan etylu, metanol, woda i metanolowego ekstraktu z liści jako źródła związku, użytych w określonych ilościach. Sposób według wynalazku nadaje się do zastosowania na skalę przemysłową.

Halfordyna jest kumaryną, której aktywność biologiczna jest słabo poznana. Jest ona inhibitorem α-amylazy (IC50: 197.53 μΜ), co wskazuje na jej działanie przeciwcukrzycowe [Quek A, et al. a-Amylase and dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitory effects of Melicope latifolia bark extracts and identification of bioactive constituents using in vitro and in silico approaches. Pharmaceutical Biology 2021, 59, 1, 964-973]. Struktura chemiczna związku wskazuje, że posiada ona działanie w kierunku ośrodkowego układu nerwowego. Może być wykorzystywana do otrzymywania preparatów farmaceutycznych zwłaszcza przydatnych w leczeniu cukrzycy, oraz w chorobach neurodegeneracyjnych.

Wynalazek zobrazowano na poniższych przykładach nie ograniczających zakresu ochrony, w których zastosowano ekstrakt metanolowy (stosując 1 część rozdrobnionego materiału roślinnego na 5 części metanolu 100%).

Przykład 1

W rozdzielaczu przygotowano dwufazowy układ rozpuszczalników będący mieszaniną n-heksanu, octanu etylu, metanolu i wody w proporcjach: 1.5:0.5:1.5:0.5 (v/v/v/v).

Po wytrząśnięciu i rozdzieleniu faz, fazę górną i dolną zebrano do dwóch oddzielnych, opisanych butelek. Butelki umieszczono w łaźni ultradźwiękowej na 10 minut w celu pozbycia się pęcherzyków powietrza. Po wypełnieniu kolumny fazą stacjonarną, (faza górna układu dwufazowego), włączono obroty kolumny, które stopniowo zwiększano do 1700 rpm. Następnie wypełniano kolumnę fazą ruchomą (faza dolna układu dwufazowego) z prędkością przepływu 8 ml/min. Po osiągnięciu przez układ stanu równowagi, czyli momentu w którym nie wypływa faza stacjonarna, do kolumny zadozowano 270 mg ekstraktu rozpuszczonego w 10 ml fazy ruchomej. Zbierano jednominutowe frakcje przy prędkości przepływu 8 ml/min od pojawienia się na chromatogramie pierwszego piku. Halfordynę zebrano w czasie 17 minut. Detekcję związków prowadzono przez pomiar absorbancji przy długości fali λ = 254 nm. Izolację prowadzono w temperaturze 26°C. Frakcje identyfikowano z zastosowaniem chromatografii cieczowej (HPLC i LC-MS).

Wydajność procesu wynosiła 4.16%. Po zadozowaniu do kolumny 270 mg ekstraktu otrzymano 11.23 mg halfordyny o czystości ponad 98% w czasie 17 minut.

Proponowana metoda jest procesem szybkim, tanim, przyjaznym ekologicznie, pozwala zredukować koszty i czas izolacji, jest odpowiednia do przeniesienia warunków na skalę przemysłową.

Przykład 2

Wykonano analogicznie jak w przykład 1, przy czym zastosowano dwufazowy układ rozpuszczalników będący mieszaniną n-heksanu, octanu etylu, metanolu i wody w proporcji 1.43:0.57:1.43:0.57 (v/v/v/v).

Do kolumny zadozowano 230 mg ekstraktu, rozpuszczonego w 10 ml fazy ruchomej. Izolację prowadzono analogicznie jak w Przykładzie 1.

Wydajność procesu wynosiła 3.83%. Po zadozowaniu do kolumny 230 mg ekstraktu otrzymano 8.81 mg halfordyny o czystości ponad 98% w czasie 20 minut.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania halfordyny z liści H. kendack przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników, znamienny tym, że rozdrobnione liście poddaje się najpierw ekstrakcji metanolem, a następnie ekstrakt metanolowy poddaje się rozdzielaniu przy użyciu chromatografii odśrodkowej z dwufazową mieszaniną rozpuszczalników użytych w proporcji n-heksan, octan etylu, metanol, woda od 1:1:1:1 do 1.6:0.4:1.6:0.4 (v/v/v/v), przy czym ekstrakt w ilości 5% do 30%, korzystnie 27% w stosunku do objętości dozowanej do kolumny mieszaniny rozpuszczalników, przed rozdzielaniem rozpuszcza się w próbce mieszaniny rozpuszczalników o takim samym składzie jak dwufazowa mieszanina rozpuszczalników, albo w jednej z faz stosowanego układu rozpuszczalników, korzystnie w fazie ruchomej, a rozdzielanie prowadzi się w układzie faz odwróconych, stosując rotację kolumny aż do uzyskania stanu równowagi faz, w temperaturze od 25 do 35°C korzystnie 26°C, następnie po rozdzieleniu zbiera się frakcje stanowiące halfordynę.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na 1 część rozdrobnionego materiału roślinnego stosuje się od 5 do 10 części metanolu 100%.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dwufazową mieszaninę rozpuszczalników stosuje się w proporcji n-heksan, octan etylu, metanol, woda 1.43:0.57:1.43:0.57 lub 1.5:0.5:1.5:0.5.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rotację kolumny prowadzi się przy maksymalnej ilości obrotów kolumny - 1700 rpm.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po rozdzieleniu frakcje odpowiadające eluowanemu związkowi - halfordynę zbiera się przy prędkości przepływu 8 do 10 ml/min korzystnie 8 ml/min od pojawienia się na chromatogramie pierwszego piku.