PL248603B1

PL248603B1 - Podłoże do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory

Info

Publication number: PL248603B1
Application number: PL450244A
Authority: PL
Inventors: Klaudia Dębiec-Andrzejewska; Marcin Musiałowski; Łucja Kowalewska; Robert STASIUK; Robert Stasiuk
Original assignee: Univ Warszawski
Priority date: 2022-08-17
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2026-01-05
Also published as: PL450244A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowe podłoże do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory. Syderofory wytwarzane są przez szczep Pseudomonas H12B zdeponowany pod numerem B/00321 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska.

Description

Przedmiotem wynalazku jest podłoże do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory. Syderofory wytwarzane są przez szczep Pseudomonas H12B zdeponowany pod numerem B/00321 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska.

Żelazo jest pierwiastkiem niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania roślin, zwierząt oraz bakterii. Dzięki swoim właściwościom chemicznym bierze udział w licznych reakcjach utleniania i redukcji kluczowych z punktu widzenia komórki, jak np. w transporcie elektronów w łańcuchu oddechowym. Żelazo występuje w skorupie ziemskiej głównie w postaci minerałów zawierających tlenki (magnetyt, hematyt) lub wodorotlenki (getyt) tego metalu. Pomimo powszechnego występowania w środowisku, żelazo (III) ze względu na swoją niską rozpuszczalność nie jest biodostępne. Z tego powodu wiele organizmów wykształciło, w trakcie ewolucji, różne mechanizmy mające na celu umożliwienie pobierania ze środowiska tego kluczowego pierwiastka. Jedną z najbardziej powszechnie występujących strategii zwiększenia biodostępności żelaza przez organizmy jest synteza syderoforów - związków wydajnie chelatujących ten pierwiastek.

Syderofory są grupą związków o niskiej masie cząsteczkowej, charakteryzujących się wysokim powinowactwem do żelaza (III). Cechują się bardzo dużym zróżnicowaniem, zarówno pod kątem struktury, funkcjonalności, jak i pełnionych funkcji biologicznych. Syderofory są produkowane przez bakterie, grzyby czy rośliny w warunkach niedoboru żelaza, a następnie wydzielane do środowiska. W środowisku tworzą kompleksy z jonami żelaza, a powstałe związki kompleksowe są następnie pobierane z powrotem do komórki przy udziale odpowiednich receptorów powierzchniowych. Wysokie powinowactwo syderoforów do żelaza związane jest z obecnością ujemnie naładowanych atomów tlenu. Mogą one funkcjonować jako donory elektronów dla żelaza (III), stanowiącego silny kwas według teorii Lewisa, co pozwala na powstanie związków kompleksowych.

Ze względu na znaczną różnorodność strukturalną i funkcjonalną, syderofory posiadają szczególnie duży potencjał aplikacyjny w różnych dziedzinach biotechnologii. Stanowią one przedmiot wielu badań, mających na celu lepsze poznanie ich biologii i zwiększenie możliwości ich praktycznego zastosowania. Ze względu na wysokie powinowactwo do jonów metali takich jak żelazo, ale także do innych jonów dwu- i trójwartościowych, syderofory mogą być użyteczne w bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi. Dzięki powinowactwu syderoforów do różnych jonów możliwe jest chelatowanie metali ciężkich obecnych w glebie oraz skuteczne ekstrahowanie ich z zanieczyszczonych gruntów. Procesy te prowadzone są ex situ, np. na pryzmach remediacyjnych.

Syderofory poprzez zwiększenie biodostępności żelaza w glebie, w bezpośredni sposób przyczyniają się do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby. Pod wpływem zwiększonej podaży biodostępnego żelaza w glebie, zwiększa się aktywność oraz liczebność mikroorganizmów glebowych. Na poprawę jakości biologicznej gleby mają wpływ nie tylko same syderofory, ale także metabolity współwytwarzane przez mikroorganizmy podczas syntezy syderoforów. Taka kompozycja metabolitów zawierająca syderofory może być aplikowana do gleby i dodatkowo przyczyniać się do poprawy jej jakości mikrobiologicznej. Wśród metabolitów współwytwarzanych podczas syntezy syderoforów, mogą być różnego rodzaju kwasy organiczne, ligandy, krótkołańcuchowe peptydy, alkohole oraz nienasycone kwasy tłuszczowe, które w synergistycznej relacji z syderoforami wspólnie przyczyniają się do zwiększenia liczebności i aktywności mikrobioty glebowej poprawiając jakość mikrobiologiczną gleby. Poprawa jakości mikrobiologicznej gleby (liczebności i aktywności mikroorganizmów) może być także użyteczna w kontekście zwiększania efektywności biodegradacji związków organicznych w zanieczyszczonych glebach (bioremediacja in situ).

Innym potencjalnym zastosowaniem syderoforów może być promowanie wzrostu roślin. W badaniach wykazano, że bakteryjne syderofory wpływają pozytywnie nie tylko na zwiększanie biodostępności żelaza dla mikroorganizmów, które je wytwarzają, ale również przyczyniają się do poprawy zaopatrzenia roślin w żelazo. Zwiększenie podaży żelaza dla roślin (poprzez zwiększenie biodostępności tego pierwiastka) ma kluczowe znaczenie w kontekście prawidłowego przebiegu syntezy chlorofilu. Wykazano m.in., że syderofory produkowane przez bakterie z rodzaju Pseudomonas (piowerdyna) i Streptomyces wpływają pozytywnie na przyrost biomasy roślin, dzięki zwiększonej podaży żelaza. Pod wpływem zwiększonej zawartości żelaza w komórkach roślinnych zwiększa się także aktywność fotosyntetyczna roślin. W związku z tym, obecnie prowadzone są liczne badania nad rozwojem procesów biotechnologicznych, które pozwolą na wykorzystanie aktywności syderoforów jako środka wspomagającego nawożenie roślin.

Na wzrost roślin, pozytywnie mogą także wpływać różnego rodzaju metabolity wtórne, produkowane przez mikroorganizmy przy okazji wytwarzania syderoforów. Jak wspomniano powyżej, mogą być to różne związki organiczne o wysokiej bioprzyswajalności zarówno dla mikroorganizmów glebowych, jak i dla roślin. Działanie metabolitów współtowarzyszących syntezie syderoforów na rośliny może być zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie. Metabolity, takie jak aminokwasy, krótkołańcuchowe peptydy, kwasy organiczne czy witaminy mogą być naturalnymi stymulatorami wzrostu roślin, które w znaczący sposób przyczyniają się do zwiększania ich biomasy i poprawy ich ogólnej kondycji. Kwasy organiczne mogą także dodatkowo zwiększać przyswajalność innych składników odżywczych, takich jak np. fosfor. Działanie pośrednie metabolitów współtowarzyszących produkcji syderoforów polega na stymulowaniu wzrostu i aktywności mikrobioty glebowej, która wchodząc w symbiotyczne oddziaływania z roślinami przyczynia się do poprawy ich wzrostu i/lub zwiększenia odporności na działanie fitopatogenów.

Syderofory bakteryjne wytwarzane są na podłożach mikrobiologicznych zawierających zwykle organiczne źródło węgla oraz organiczne lub nieorganiczne źródło azotu. Podłoże to musi być pozbawione żelaza. Najlepiej przebadanym i najczęściej opisywanym w literaturze jest podłoże GASN, przeznaczone do wytwarzania syderoforów, zawierające glukozę oraz asparaginę jako odpowiednio źródło węgla i azotu. Zawiera ono także sole mineralne. Podłoże to sprzyja stosunkowo wysokiej produkcji syderoforów przez bakterie, jednak wytwarzanie ich na większą skalę (przemysłową) wymaganą w badaniach bioremediacyjnych czy rolniczych, jest nieopłacalne ekonomicznie. Dodatkowo, metabolity, w tym syderofory, wytwarzane na podłożu GASN charakteryzują się zwykle obojętnym odczynem pH, który z punktu widzenia wydajności ekstrakcji metali ciężkich z zanieczyszczonych gruntów jest niepożądany. W bioremediacji gruntów zanieczyszczonych metalami ciężkimi odczyn dodawanych metabolitów powinien być kwaśny, w celu zwiększenia mobilności metali ciężkich w glebie.

Z punktu widzenia promowania wzrostu roślin za pomocą suplementacji gleby mieszaniną metabolitów bakteryjnych zawierających syderofory, najlepszym odczynem pH takiej hodowli bakteryjnej powinien być odczyn kwaśny lub zasadowy, w zależności od preferencji żywieniowych i środowiskowych roślin. Zróżnicowany odczyn metabolitów dodawanych do gleby wpływa na jej odczyn a to z kolei ma kluczowy wpływ na biodostępność oraz efektywność pobierania makro- i mikroskładników odżywczych przez mikroorganizmy oraz rośliny. Oznacza to, że zakwaszanie lub alkalizacja gleby za pomocą mieszaniny metabolitów zawierających syderofory może się przyczyniać do poprawy jakości odżywiania roślin.

Wytwarzanie kompozycji metabolitów zawierającej syderofory o kwaśnym charakterze produkowanych na podłożu GSA oraz jej zastosowanie w bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi zostało ujawnione w polskim zgłoszeniu patentowym nr P.440597.

Istota wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest podłoże do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory wytwarzane przez szczep Pseudomonas H12B, charakteryzujące się tym, że ma pH 7,0 i zawiera: 0,96 g/l Na2HPO4, 0,44 g/l KH2PO4, 0,2 g/l MgSO4 χ 7H2O oraz dodatkowo zawiera dwa następujące składniki:

a. 7 g/l glukozy, 1,35 g/l NH4CI jako podłoże GC1;

b. 3,5 g/l glicerolu o stężeniu 50%, 1 g/l (NH4)2SO4 jako podłoże G1SA; lub

c. 4 g/l kwasu cytrynowego, 1 g/l (NH4)2SO4 jako podłoże CSA; lub

d. 3,5 g/l glicerolu o stężeniu 50%, 2 g/l L-asparaginy jako podłoże G1ASN.

Korzystnie podłoże według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest podłożem do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory o właściwościach zakwaszających i jest podłożem GC1 lub G1SA.

Korzystnie podłoże według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest podłożem do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory o właściwościach alkalizujących i jest podłożem CSA lub G1ASN.

Szczegółowy opis ujawnienia

Szczepem bakteryjnym wykorzystywanym w badaniach przedstawionych w niniejszym ujawnieniu jest Pseudomonas ANT_H12B. Szczep ten był przedmiotem polskiego zgłoszenia patentowego nr P.437824, dotyczącego zastosowania ANT_H12B jako czynnika promującego wzrost roślin (kompozycji metabolitów wytwarzanych na podłożu GASN) oraz polskiego zgłoszenia patentowego nr P.440597, dotyczącego zastosowania tego szczepu jako producenta syderoforów wykorzystywanych w bioremediacji gruntów zanieczyszczonych metalami ciężkimi (kompozycja metabolitów wytwarzanych na podłożu GSA). Szczep ten został zdeponowany w dniu 30 marca 2021 r. w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska, pod numerem B/00321.

Syderofory są wytwarzane przez szczep Pseudomonas H12B zdeponowany pod numerem B/00321 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska. Znane są zastosowania kompozycji metabolitów zawierającej syderofory, zarówno o charakterze kwaśnym, jak i alkalicznym, oraz możliwości ich wykorzystania do:

a) poprawy jakości mikrobiologicznej gleby;

b) zwiększania biodostępności mikro- i makroskładników niezbędnych do prawidłowego wzrostu i rozwoju mikroorganizmów glebowych oraz roślin, takich jak żelazo i fosfor;

c) przyspieszania biodegradacji związków ropopochodnych, użytecznej w procesach oczyszczania skażonych gruntów lub

d) promowania kiełkowania roślin uprawnych.

Kompozycja zawierająca syderofory jest uzyskiwana poprzez hodowanie szczepu Pseudomonas H12B na podłożu wybranym spośród GC1, G1SA, CSA lub G1ASN i jest dodatkowo przeznaczona do zwiększania mobilności metali ciężkich w glebie, użytecznej w procesach oczyszczania skażonych gruntów. Kompozycja ta jest uzyskiwana poprzez hodowanie szczepu Pseudomonas H12B na podłożu GSA. Uzyskiwana poprawa jakości mikrobiologicznej gleby obejmuje wzrost liczebności mikroorganizmów glebowych. Ponadto stwierdzono, że poprawa jakości mikrobiologicznej gleby obejmuje wzrost aktywności dehydrogenaz mikroorganizmów glebowych. Rośliny uprawne wybiera się spośród buraka, grochu i tytoniu.

Ponadto ujawniono zastosowanie syderoforów wytwarzanych przez szczep Pseudomonas H12B zdeponowany pod numerem B/00321 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska, do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby, zwiększania biodostępności mikro- i makroskładników niezbędnych do prawidłowego wzrostu i rozwoju mikroorganizmów glebowych oraz roślin, takich jak żelazo i fosfor; przyspieszenia biodegradacji związków ropopochodnych, użytecznej w procesach oczyszczania skażonych gruntów lub promowania kiełkowania roślin uprawnych.

Przedstawiono również sposób wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory, obejmujący następujące etapy:

a) otrzymuje się inokulum szczepu bakterii Pseudomonas sp. ANT_H12B, zdeponowanego pod numerem B/00321 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, Polska, na płynnym podłożu pełnym przeznaczonym do namnażania komórek bakteryjnych, korzystnie podłożu LB, prowadząc hodowlę bakterii w temperaturze 20-25°C, aż do uzyskania logarytmicznej fazy wzrostu;

b) odwirowuje się hodowlę uzyskaną w etapie a), a następnie zawiesza się biomasę komórek w roztworze soli fizjologicznej, korzystnie odwirowuje się dwukrotnie;

c) zaszczepia się podłoże hodowlane zawiesiną bakterii otrzymaną w punkcie b) korzystnie w ilości dającej początkową gęstość optyczną hodowli 0.06, mierzonej przy długości fali 600 nm;

d) hodowlę bakteryjną uzyskaną w etapie c) prowadzi się w temperaturze 10-20°C;

e) odwirowuje się uzyskaną w punkcie d) brzeczkę hodowlaną i oddziela się supernatant otrzymując w ten sposób kompozycję zawierającą syderofory;

przy czym w punkcie c) stosuje się podłoże GC1, G1SA, CSA lub G1ASN.

W powyższym sposobie hodowlę bakteryjną w etapie d) można prowadzić przez 48-72 godziny.

Ponadto w powyższym sposobie hodowlę bakteryjną w etapie d) można prowadzić z wytrząsaniem przy 150 rpm. W ujawnionym sposobie w etapie c) jako podłoże hodowlane do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory o właściwościach zakwaszających można zastosować podłoże GC1 lub podłoże G1SA. W etapie c) jako podłoże do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory o właściwościach alkalizujących można zastosować podłoże CSA lub podłoże G1ASN.

Opracowano sposób wytwarzania kompozycji metabolitów zawierających syderofory, charakteryzujących się różnym odczynem pH, w zależności od podanych składników odżywczych w podłożu mikrobiologicznym. Wspomniany sposób wytwarzania kompozycji metabolitów zawierających syderofory polega na hodowli szczepu Pseudomonas sp. ANT_H12B na podłożach mikrobiologicznych zawierających różne źródła oraz zawartości węgla i azotu. Dzięki hodowli mikroorganizmów na podłożach zawierających różne substraty odżywcze, bakterie wytwarzają znaczne zawartości syderoforów oraz innych metabolitów współtowarzyszących, które przyczyniają się do zakwaszania lub alkalizacji podłoża mikrobiologicznego. Wytworzenie kompozycji metabolitów bakteryjnych zawierających syderofory obejmuje następujące etapy:

a) wytworzenie inokulum bakterii Pseudomonas sp. ANT_H12B zdeponowanej jako B/00321 na płynnym podłożu przeznaczonym do namnożenia komórek bakteryjnych i hodowla bakterii w temperaturze 20-25°C, aż do uzyskania logarytmicznej fazy wzrostu;

b) przygotowanie inokulum bakteryjnego poprzez odwirowanie hodowli bakterii uzyskanych w podłożu przeznaczonym do namnożenia komórek bakteryjnych, a następnie zawieszenie biomasy komórek w roztworze soli fizjologicznej. Ta procedura powinna być wykonana dwukrotnie;

c) zaszczepienie przygotowanym inokulum jednego z płynnych podłoży - podłoży płynnych pozwalających na wytwarzanie metabolitów o właściwościach zakwaszających - podłoże GC1 i podłoże G1SA lub podłoży CSA lub G1ASN,pozwalających na wytwarzanie metabolitów o właściwościach alkalizujących;

d) zaszczepienie jednego z podłoży przygotowanym inokulum bakteryjnym powinno być wykonane w taki sposób, aby początkowa gęstość optyczna hodowli wynosiła 0,06 przy długości fali 600 nm;

e) zaszczepione podłoże do wytwarzania metabolitów, w tym syderoforów o właściwościach zakwaszających lub alkalizujących, stanowi hodowlę bakteryjną, która w celu uzyskania właściwego stężenia metabolitów w tym syderoforów, powinna być prowadzona przez 48-72 godziny, w temperaturze 10-20°C, z wytrząsaniem przy 120-150 rpm.

Zastosowania wytworzonych kompozycji metabolitów, w tym syderoforów, na opracowanych podłożach mikrobiologicznych: GC1, G1SA, CSA i G1ASN, obejmują ich pozytywne działanie w następujących aspektach:

a) poprawa jakości mikrobiologicznej gleby;

b) zwiększenie biodostępności mikro- i makroskładników niezbędnych do prawidłowego wzrostu i rozwoju mikroorganizmów glebowych oraz roślin, takich jak żelazo i fosfor;

c) zwiększenie mobilności metali ciężkich w glebie, użytecznej w procesach oczyszczania skażonych gruntów;

d) przyspieszenie biodegradacji związków ropopochodnych, użytecznej w procesach oczyszczania skażonych gruntów;

e) promowanie kiełkowania roślin uprawnych.

Zastosowanie opisanej we wcześniejszym polskim zgłoszeniu P.440597 kompozycji metabolitów bakteryjnych, w tym syderoforów, wytwarzanych przez szczep Pseudomonas sp. ANT_H12B na podłożu GSA obejmuje:

a) poprawę jakości mikrobiologicznej gleby;

c) przyspieszenie biodegradacji związków ropopochodnych, użytecznej w procesach oczyszczania skażonych gruntów;

d) promowanie kiełkowania roślin uprawnych.

Uzyskane metabolity, w tym syderofory wytworzone na podłożach GC1, G1SA, CSA, G1ASN lub GSA, mogą być suplementowane do różnych rodzajów gleb i wykazywać różne pozytywne działania:

a) w przypadku suplementacji gleb rolniczych, następuje mobilizacja związków odżywczych takich jak Fe i P, dzięki czemu zwiększa się ich biodostępność dla mikroorganizmów i roślin;

b) w przypadku suplementacji gleb rolniczych, dzięki zwiększeniu biodostępności Fe i P następuje stymulacja liczebności i aktywności mikroorganizmów glebowych, co może mieć pozytywny wpływ na wzrost i rozwój roślin uprawnych;

c) w przypadku suplementacji gleb zanieczyszczonych związkami ropopochodnymi, zwiększenie liczebności mikroorganizmów glebowych przyczynia się do zwiększenia efektywności biodegradacji tych związków, co także może być użyteczne w procesach bioremediacji takich gleb.

Dodatkowo, metabolity, w tym syderofory wytworzone na podłożach GC1, G1SA, CSA lub G1ASN, mogą być suplementowane do gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi, dzięki czemu następuje zwiększenie mobilności metali ciężkich takich jak Cu, Zn oraz Ni, co może być użyteczne w procesach bioremediacji takich gleb.

Kompozycja metabolitów, w tym syderoforów, może także znaleźć zastosowanie w promowaniu kiełkowania oraz wzrostu roślin uprawnych. Na podstawie uzyskanych danych wykazano, że wytworzone na podłożach GC1, G1SA, CSA, G1ASN lub GSA metabolity, w tym syderofory, przyczyniają się do zwiększania efektywności kiełkowania roślin uprawnych takich jak np. groch czy burak.

Jeśli nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach stosowano standardowe materiały i metody znane specjaliście w dziedzinie lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla podanych materiałów i metod.

Przykład 1. Wytwarzanie metabolitów, w tym syderoforów, o odczynie kwaśnym i zasadowym na podłożach GC1, G1SA, G1ASN i CSA przez szczep Pseudomonas H12B

A. Hodowla na podłożu GASN

Wytwarzane w warunkach deficytu żelaza przez szczep Pseudomonas H12B syderofory mogą stanowić przyjazny środowisku, biologiczny środek do bioremediacji gruntów i promocji wzrostu roślin. Szczep Pseudomonas H12B rośnie na podłożach pełnych, takich jak LB (Luria Bertani), jednakże ze względu na obecność żelaza w ich składzie syderofory nie są wytwarzane. Z tego względu hodowano szczep na znanym, przeznaczonym do wytwarzania syderoforów (brak żelaza) podłożu płynnym GASN o składzie: glukoza 7 g/l, asparagina 2 g/l, Na2HPO4 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO4 χ 7H2O 0,2 g/l [Bultreys A., Gheysen I. 2000], Standardowa procedura produkcji syderoforów obejmowała w pierwszym etapie przygotowanie inokulum bakteryjnego. W tym celu zaszczepiano płynne podłoże LB (50 ml) kolonią szczepu Pseudomonas H12B pobraną z szalki zawierającej czystą kulturę. Hodowlę w LB prowadzono przez około 12-24 godzin w temperaturze pokojowej (18-25°C) z wytrząsaniem (około 150 rpm), aż do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu mikroorganizmów. Następnie uzyskana hodowla była dwukrotnie odwirowywana (8000 rpm, 5 minut), a powstały osad po zlaniu supernatantu zawieszano w roztworze soli fizjologicznej (0,85% NaCl), celem usunięcia pozostałości żelaza z pochodzących z pełnego podłoża LB. Właściwą hodowlę wytwarzającą syderofory przygotowywano poprzez zaszczepienie 200 ml odpowiednich podłoży (pozbawionych żelaza), np. GASN, inokulum otrzymanym zgodnie z opisaną procedurą. Ilość inokulum była dobierana w taki sposób, żeby uzyskać wartość początkowej gęstości optycznej hodowli OD600nm = 0,06, co odpowiadało około 10⁶ JTK/ml. Hodowle prowadzono przez 5 dni w kolbach szklanych, z natlenianiem przez wytrząsanie (150 rpm) w temperaturze 10°C. Każdego dnia hodowli pobierano próbkę, w której oznaczano pH, liczebność mikroorganizmów (JTK/ml) oraz stężenie syderoforów za pomocą spektrofotometrycznej metody z odczynnikiem CAS ([2] Arora, N. K., & Verma, 2017). Jako kontrolę chemiczną wykorzystywano jałowe podłoża do produkcji syderoforów. Po zakończeniu hodowli uzyskaną brzeczkę hodowlaną odwirowywano, a końcowy produkt stanowił oddzielony od biomasy supernatant, zawierający bakteryjne metabolity, w tym syderofory. Zastosowanie podłoża GASN pozwoliło na uzyskanie wysokiej produkcji syderoforów (stężenie -450 pM), jednakże pH uzyskanego roztworu metabolitów znajdowało się blisko obojętnego poziomu (~7,3). Dla zwiększenia efektywności stosowania syderoforów zarówno w biormediacji, jak i rolnictwie, korzystna byłaby możliwość otrzymywania roztworu o szerszym zakresie pH, zarówno kwaśnego, jak i alkalicznego.

B. Opracowanie podłoży hodowlanych GC1, G1SA, CSA i G1ASN oraz sposobu hodowli do wytwarzania metabolitów zawierających syderofory o odczynie kwaśnym i zasadowym

W celu uzyskania kompozycji metabolitów, w tym syderoforów o zróżnicowanym odczynie pH przeprowadzono badania nad opracowaniem składu podłoży do ich produkcji. Przetestowano różne źródła węgla i azotu, mając na celu uzyskanie wysokiej efektywności produkcji syderoforów przez szczep Pseudomonas H12B (na poziomie co najmniej zbliżonym do GASN) przy różnych wartościach końcowego pH brzeczki hodowlanej. Wszystkie badania przeprowadzono zgodnie z opisaną w punkcie A. procedurą, zmieniając stosowane podłoże. W wyniku przeprowadzonych badań udało się wytypować cztery składy podłoży, podzielonych na dwie grupy:

(i) podłoża o właściwościach zakwaszających:

GC1: glukoza 7 g/l (jako źródło C), NH4CI 1,35 g/l (jako źródło N), Na2HPO4 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO4 χ 7H2O 0,2 g/l pH podłoża po przygotowaniu wynosiło 7,0, i było regulowane za pomocą 0,1 M NaOH i 0,1 M HCl.

G1SA: glicerol 50% 3,5 g/l (jako źródło C), (NH4)2SO4 1 g/l (jako źródło N), Na2HPO4 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO4 χ 7H2O 0,2 g/l. pH podłoża po przygotowaniu wynosiło 7,0, i było regulowane za pomocą 0,1 M NaOH i 0,1 M HCl.

PL 248603 Β1 (ii) podłoża o właściwościach alkalizujących:

CSA: kwas cytrynowy 4 g/l (jako źródło C), (NH4)2SO4 1 g/l (jako źródło N), Na2HPO4 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO4 χ ΪΗςΟ 0,2 g/l. pH podłoża po przygotowaniu wynosiło 7,0, i było regulowane za pomocą 0,1 M NaOH i 0,1 M HCI.

G1ASN: glicerol 50% 3,5 g/l (jako źródło C), L-asparagina 2 g/l (jako źródło N), Na2HPO4 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO4 χ 7H2O 0,2 g/l pH podłoża po przygotowaniu wynosiło 7,0, i było regulowane za pomocą 0,1 M NaOH i 0,1 M HCI.

W przykładach wykorzystywano również podłoże GSA, którego skład ujawniono w polskim zgłoszeniu P.440597.

GSA: glukoza 7 g/l (jako źródło C), (NH4)2SO4 1 g/l (jako źródło N), Na2HPO4 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO4 χ 7H2O 0,2 g/l pH podłoża po przygotowaniu wynosiło 7,0, i było regulowane za pomocą 0,1 M NaOH i 0,1 M HCI.

C. Porównanie produkcji metabolitów prowadzonych na różnych podłożach, uzyskiwanej produkcji syderoforów i odczynu uzyskanego roztworu

W prezentowanym przykładzie porównano produkcję syderoforów i pH uzyskanego roztworu metabolitów bakteryjnych produkowanych przez szczep Pseudomonas H12B na podłożu GASN, GSA o składzie glukoza 7 g/l, (NH₄)₂SO4 1 g/l, Na₂HPO₄ 0,96 g/l, KH2PO4 0,44 g/l, MgSO₄ χ 7H₂O 0,2 g/l (polskie zgłoszenie patentowe P.440597) i nowo opracowanych podłożach GC1, G1SA, CSA i G1ASN. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną w punkcie A. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Zmiana pH hodowli bakteryjnej oraz zmiana stężenia syderoforów [μΜ] w trakcie hodowli szczepu Pseudomonas H12B oraz w końcowo uzyskanych po odwirowaniu metabolitach na podłożu: GASN („M-GASN”), GSA („M-GSA”), GC1 („M-GC1”), G1SA („M-G1SA”), CSA („M-CSA”) i G1ASN („M-G1ASN”) oraz samych podłożach GASN („K-GASN”), GSA („K-GSA”), GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), CSA („K-CSA”) i G1ASN („K-G1ASN”).

Zmiany wartości pH w trakcie hodowli
Wariant	Dzień 0	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Uzyskane metabolity
M-GASN	6,96	6,55	6,26	7,15	7,24	7,28
K-GASN	7,00	6,99	6,99	7,00	7,00	7,02
M-GC1	7,13	6,78	6,40	5,79	4,87	4,66
K-GC1	7,09	7,19	7,14	7,18	7,17	7,08
M-G1SA	7,31	6,52	5,92	5,60	4,95	4,88
K-G1SA	7,34	7,33	7,34	7,32	7,31	7,29
M-CSA	7,34	7,46	7,84	8,18	8,64	8,72
K-CSA	7,34	7,29	7,27	7,26	7,26	7,15
M-G1ASN	7,06	7,74	8,39	8,37	8,81	8,94
K-G1ASN	7,08	7,06	7,07	7,14	7,32	7,44
M-GSA	7,11	6,74	6,34	5,79	4,92	4,53
K-GSA	7,09	7,10	7,07	7,11	7,10	7,08

PL 248603 Β1

Zmiany wartości syderoforów w trakcie hodowli [μΜ]
Wariant	Dzień 0	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Uzyskane metabolity
M-GASN	0	90,25	322,89	327,41	430,85	463,82
K-GASN	0	0	0	0	0	0
M-GCI	0	91,95	361,29	546.91	571.11	573,37
K-GC1	0	0	0	0	0	0
M-G1SA	0	59,43	110,76	215,09	287,84	386,14
K-G1SA	0	0	0	0	0	0
M-CSA	0	76,72	135,13	257,99	311,89	376,95
K-CSA	0	0	0	0	0	0
M-G1ASN	0	77,66	165,22	326,56	390,95	389,1 1
K-G1ASN	0	0	0	0	0	0
M-GSA	0	100,23	329,35	496,13	512,22	533,23
K-GSA	0	0	0	0	0	0

Uzyskane wyniki pokazały, że wszystkie nowo opracowane podłoża przeznaczone do produkcji syderoforów pozwalają na wydajną produkcję tych metabolitów przez szczep Pseudomonas H12B na zbliżonym poziomie, mieszczącym się w zakresie 300-600 μΜ. W przypadku podłoża GC1 zaobserwowano produkcję syderoforów wyższą niż z zastosowaniem podłoża GASN o ponad 20%, natomiast w przypadku pozostałych podłoży ta produkcja była niższa o około 20%. Niemniej wykazane różnice nie są znaczne, z punktu widzenia potencjalnych zastosowań. Wykazano również, że do uzyskania wysokiego stężenia syderoforów (powyżej 100 μΜ) konieczna jest co najmniej dwudniowa hodowla, korzystniej trwająca 3-4 dni. Dalsze wydłużanie czasu hodowli nie wpływa na zwiększoną produkcję metabolitów. Pomiędzy badanymi podłożami zaobserwowano zróżnicowany odczyn hodowli i uzyskanego końcowego roztworu metabolitów. Hodowla szczepu Pseudomonas H12B na podłożu GASN skutkowała produkcją roztworu metabolitów o obojętnym pH (—7,3). Podłoża GC1, GSA i G1SA pozwoliły na produkcję syderoforów w roztworze o charakterze kwaśnym (pH poniżej 5), natomiast podłoża CSA i G1ASN pozwoliły na otrzymanie roztworu syderoforów o charakterze alkalicznym (pH powyżej 8). W wielu zastosowaniach metabolitów zarówno w rolnictwie, jak i w bioremediacji odczyn stosowanego roztworu ma istotny wpływ na efektywność stosowanej metody. Z tego względu możliwość uzyskiwania syderoforów w roztworach o zróżnicowanym pH stanowi istotną zaletę proponowanego rozwiązania.

Przykład 2· Zwiększenie biodostępności żelaza w glebie za pomocą metabolitów powstałych w wyniku prowadzenia hodowli szczepu Pseudomonas H12B na podłożach GC1, G1SA i CSA, G1ASN i GSA

Prezentowany przykład dotyczy wpływu metabolitów wyprodukowanych przez szczep Pseudomonas H12B na podłożach hodowlanych GC1, G1SA, G1ASN, CSA i GSA na zwiększenie biodostępności żelaza w glebie. Hodowlę Pseudomonas sp. H12B na wymienionych podłożach oraz przygotowanie metabolitów przeprowadzono tak jak w Przykładzie 1. Zbadano wpływ na biodostępność żelaza za pomocą:

(i) metabolitów bakteryjnych wyprodukowanych na podłożach: GC1 („M-GCL”), G1SA („MG1SA”), CSA („M-CSA”), G1ASN („M-G1ASN”) oraz GSA („M-GSA”);

(ii) jałowych podłoży: GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), CSA („K-CSA”), G1ASN („K-G1ASN”) oraz GSA („K-GSA”) jako kontroli chemicznych;

PL 248603 Β1 (iii) wody destylowanej jako dodatkowej kontroli („K-W”).

Działanie metabolitów przebadano na glebie środowiskowej pochodzenia rolniczego. 200 g powietrznie suchej gleby przesiano przez sito (średnica oczka 2 mm) i umieszczono w pojemniku PCV, a następnie dodawano do niej 20 ml odpowiednich metabolitów/kontroli (w stosunku 10:1, (wag./obj.)).

Dla każdego wariantu przygotowano trzy powtórzenia. Mieszaninę uzupełniano wodą destylowaną w ilości niezbędnej do uzyskania wilgotności gleby na poziomie 40% maksymalnej pojemności wodnej i przemieszano ręcznie. Pojemniki umieszczono w szafie termicznej ustawionej na temperaturę 25°C. Eksperyment prowadzono przez 14 dni, utrzymując stałą wilgotność próbek gleby za pomocą wody destylowanej. Próbki gleby pobrano po uruchomieniu eksperymentu, 7 dnia i 14 dnia. W celu oznaczenia biodostępności żelaza w glebie 5 g wysuszonej próbki gruntu poddawano ekstrakcji w 10 ml roztworu ekstrakcyjnego (0,005 M DTPA, 0,01 M chlorku wapnia, 0,1 M trietyloaminy, pH 7,3) przez 2 godziny, a następnie filtrowano przez bibułę filtracyjną. W uzyskanych płynach poekstrakcyjnych oznaczono stężenie żelaza za pomocą metody płomieniowej atomowej spektrometrii absorpcyjnej (FAAAS - Flame Atomizer - Atomie Absorption Spectroscopy) z wykorzystaniem spektrometru Thermo Fisher ICE 3300. Na podstawie tych danych obliczono ilość biodostępnego żelaza w próbce (mg/kg gruntu). Dla każdego wariantu obliczono procentową zmianę biodostępności żelaza w 7 i 14 dniu eksperymentu (obliczono różnicę ilości biodostępnego żelaza (mg/kg) pomiędzy 7 lub 14 dniem a początkiem eksperymentu, a następnie obliczono jaki procent początkowej ilości biodostępnego żelaza stanowi ta różnica). Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2. Zmiana biodostępności żelaza w badanej glebie w wyniku dodawania roztworu metabolitów wyprodukowanych na podłożu: GC1 („M-GC1”), G1SA („M-G1SA”), CSA („M-CSA”), G1ASN („M-G1ASN”) i GSA („M-GSA”) oraz samych podłoży GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), CSA („K-CSA”), G1ASN („K-G1ASN”) i GSA („K-GSA”), a także samej wody („K-W”). W kolumnie „TO [mg/kg]” i „T14 [mg/kg]” przedstawiono ilość biodostępnego żelaza w glebie na początku (TO) i na końcu eksperymentu (T14), a w kolumnie „T14 [%]” przedstawiono procentową zmianę biodostępności żelaza w trakcie trwania eksperymentu.

Zmiana biodostępności żelaza w glebie
Wariant	TO [mg/kg]	T14[mg/kg]	T14 [%]
M-GC1	50,62	71,79	41,82
K-GC1	47,58	59,86	25,80
M-G1SA	53,15	72,84	37,04
K-G1SA	48,60	60,32	24,13
M-CSA	52,14	69,51	33,32
K-CSA	52,14	60,43	15,90
M-G1ASN	52,05	72,24	38,80
K-G1ASN	47,96	59,00	23,03
M-GSA	50,41	69,52	37,92
K-GSA	47,96	59,00	23,03
K-W	46,63	49,22	5,55

Zastosowanie roztworu metabolitów zawierających syderofory miało pozytywny wpływ na zwiększenie biodostępności żelaza w badanej glebie rolniczej, która wzrosła o ponad 30% w stosunku do początkowej wartości. Wzrost ten był istotnie większy niż w przypadku stosowania kontroli w postaci

PL 248603 Β1 jałowego podłoża oraz samej wody. Biodostępność żelaza została zwiększona przy zastosowaniu preparatów zarówno o charakterze kwaśnym (M-GC1, M-GSA i M-G1SA), jak i charakterze zasadowym (M-CSA, M-G1ASN), co świadczy o tym, że wszystkie nowoopracowane podłoża, tj. GC1, G1SA, G1ASN i CSA niezależnie od ich charakteru chemicznego oraz podłoże GSA o charakterze kwaśnym, pozwalają na produkcję roztworu metabolitów wpływających na mobilizację i zwiększenie biodostępności żelaza.

Przykład 3· Zwiększenie biodostępności fosforu w glebie za pomocą metabolitów powstałych w wyniku prowadzenia hodowli szczepu Pseudomonas H12B na podłożach GC1, G1SA, CSA, G1ASN i GSA

Niniejszy przykład dotyczy wpływu metabolitów wyprodukowanych przez szczep Pseudomonas H12B na podłożach hodowlanych GC1, G1SA, G1ASN, CSA i GSA na zwiększenie biodostępności fosforu w glebie. Hodowla Pseudomonas sp. H12B na wymienionych podłożach oraz przygotowanie metabolitów zostało przeprowadzone tak jak w Przykładzie 1. Zbadano wpływ na biodostępność fosforu za pomocą:

(i) metabolitów bakteryjnych wyprodukowanych na podłożach: GC1 („M-GCL”), G1SA („M-G1SA”), CSA („M-CSA”), G1ASN („M-G1ASN”) oraz GSA („M-GSA”);

(iii) wody destylowanej jako dodatkowej kontroli („K-W”).

Działanie metabolitów przebadano na glebie środowiskowej pochodzenia rolniczego analogicznie jak w Przykładzie 2, z różnicą dotyczącą sposobu oznaczania zawartości fosforu w próbce, które przeprowadzono metodą fotometryczną. W tym celu wykorzystano zestawy probówkowe NANOCOLOR (Macherey-Nagel), a pomiarów dokonano w fotometrze Pf-12 Plus (Macherey-Nagel). Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 3.

Tabela 3. Zmiana biodostępności fosforu w badanej glebie w wyniku dodawania roztworu metabolitów wyprodukowanych na podłożu: GC1 („M-GC1”), G1SA („M-G1SA”), i CSA („M-CSA”), G1ASN („M-G1ASN”) i GSA („M-GSA”) oraz samych podłoży GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), CSA („K-CSA”), G1ASN („K-G1ASN”) i GSA („K-GSA”), a także samej wody („K-W”). W kolumnach „TO [mg/kg]” i „T14 [mg/kg]” przedstawiono ilość biodostępnego fosforu w glebie na początku (TO) i na końcu eksperymentu (T14), a w kolumnie „T14 [%]” przedstawiono procentową zmianę biodostępności fosforu w trakcie trwania eksperymentu.

Zmiana biodostępności fosforu w glebie
Wariant	TO [mg/kg]	T14 [mg/kg]	Tl 4 [%]
M-GC1	14,95	18,28	22,31
K-GC1	13,82	15,56	12,61
M-G1SA	14,10	18,20	29,08
K-G1SA	13,82	15,04	8,84
M-CSA	13,54	16,92	25,00
K-CSA	13,96	14,60	4,59
M-G1ASN	14,91	18,38	23,28
K-G1ASN	14,01	15,56	11,13
M-GSA	15,32	18,54	21,03

PL 248603 Β1

K-GSA	13,17	14,62	10,95
K-W	15,54	15,76	1,44

Podobnie jak w przypadku biodostępności żelaza, zastosowanie roztworu metabolitów zawierających syderofory miało pozytywny wpływ na zwiększenie biodostępności fosforu w badanej glebie rolniczej. Wzrost ten wynosił około 20-30% i był istotnie większy niż w przypadku stosowania kontroli w postaci jałowego podłoża oraz samej wody. Biodostępność fosforu została zwiększona również przy zastosowaniu preparatów zarówno o charakterze kwaśnym (M-GC1, M-GSA i M-G1SA), jak i o charakterze zasadowym (M-CSA i M-G1ASN). Wyniki otrzymane w Przykładzie 2 i 3 świadczą o tym, że wszystkie nowo opracowane podłoża, tj. GC1, G1SA, G1ASN i CSA, niezależnie od ich charakteru chemicznego oraz podłoże GSA o charakterze kwaśnym, pozwalają na produkcję roztworu metabolitów wpływających na mobilizację żelaza i fosforu, co pozwala na poprawienie jakości chemicznej gleby.

Przykład 4· Zwiększanie mobilności metali ciężkich w zanieczyszczonych gruntach przemysłowych za pomocą metabolitów powstałych w wyniku prowadzenia hodowli szczepu Pseudomonas H12B na podłożach GC1, G1SA, G1ASN i CSA

W prezentowanym przykładzie pokazany został wpływ metabolitów produkowanych przez szczep Pseudomonas H12B na podłożach hodowlanych GC1, G1SA, G1ASN i CSA na zwiększenie mobilności zanieczyszczeń metalami ciężkimi (cynkiem, miedzią i niklem) w gruntach. W tym przykładzie celowo pominięto podłoże GSA, którego wytwarzanie i zastosowanie w zakresie bioremediacji metali ciężkich jest przedmiotem polskiego zgłoszenia patentowego P.440597. Hodowlę Pseudomonas sp. H12B na wymienionych podłożach oraz przygotowanie metabolitów przeprowadzono tak jak w Przykładzie 1. Zbadano wpływ na mobilność metali ciężkich za pomocą:

(i) metabolitów bakteryjnych wyprodukowanych na podłożach: GC1 („M-GC1”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („M-G1ASN”) i CSA („M-CSA”) (ii) jałowych podłoży: GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), GIASN („K-G1ASN”) i CSA („K-CSA”) jako kontroli chemicznych (iii) wody destylowanej jako dodatkowej kontroli („K-W”).

Działanie metabolitów oraz oznaczenie mobilności pierwiastków przebadano na zanieczyszczonym metalami ciężkimi gruncie przemysłowym, analogicznie jak w Przykładzie 2. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 4.

Tabela 4. Zmiana mobilności cynku, miedzi i niklu w badanym gruncie w wyniku dodawania roztworu metabolitów wyprodukowanych na podłożu: GC1 („M-GCL”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („M-G1ASN”) i CSA („M-CSA”) oraz samych podłoży: GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), G1ASN („K-G1ASN”) i CSA („K-CSA”), a także samej wody („K-W”). W kolumnach „TO [mg/kg]” i „T14 [mg/kg]” przedstawiono ilość biodostępnego pierwiastka w gruncie na początku (TO) i na końcu eksperymentu (T14), a w kolumnach „T14[%]” przedstawiono procentową zmianę biodostępności danego pierwiastka w trakcie trwania eksperymentu.

Wariant	Zmiana mobilności cynku	Zmiana mobilności miedzi	Zmiana mobilności niklu
TO [mg/kg]	T14 [mg/kg]	T14 [%]	TO [mg/kg]	T14 [mg/kg]	T14 [%]	TO [mg/kg]	T14 [mg/kg]	T14 [%]
M-GC1	36,67	49,87	36,00	24,65	32,79	33,02	34,57	46,67	35,00
K-GC1	35,94	38,45	6,98	23,67	25,56	7,98	33,18	35,51	7,02
M-CSA	34,11	41,95	22,98	24,16	30,2	25,00	36,3	45,37	24,99
K-CSA	38,14	41,57	8,99	23,92	25,35	5,98	35,6	38,1	7,02
M-G1SA	35,04	47,29	34,97	24,41	32,87	34,66	32,60	43,02	31,96
K-G1SA	34,82	40,01	14,91	22,13	23,91	8,04	33,36	35,23	5,61

PL 248603 Β1

M-G1ASN	32,45	40,11	23,61	24,65	30,09	22,07	33,80	41,64	23,20
K-GLASN	34,48	38,01	10,22	21,15	22,36	5,73	30,98	33,17	7,06
K-W	37,04	37,04	0	23,67	23,2	-1,99	35,26	34,55	-2,01

Mobilność metali ciężkich w gruncie została zwiększona dzięki aplikacji roztworów metabolitów zawierających syderofory. Wzrost mobilności był istotnie większy w przypadku zastosowania wszystkich preparatów niż w przypadku wszystkich wariantów kontrolnych. W przypadku zastosowania roztworu o charakterze kwaśnym (M-GC1 i M-G1SA) zaobserwowano największy wzrost mobilności pierwiastków, który wynosił ponad 30% dla wszystkich badanych metali. Roztwory metabolitów o charakterze zasadowym (M-CSA i M-G1ASN) zwiększały mobilność metali w nieco mniejszym zakresie (22-25%). Różnica ta może wynikać z kwaśnego odczynu preparatów M-GC1 i M-G1SA, co dodatkowo zwiększa rozpuszczalność metali takich jak cynk, miedź czy nikiel. Wyniki te pokazują potencjał zastosowania do remediacji zanieczyszczonych gruntów zarówno zasadowych, jak i kwaśnych roztworów metabolitów wyprodukowanych na nowo opracowanych podłożach.

Przykład 5· Poprawa jakości biologicznej gleby poprzez zwiększenie liczebności i aktywności mikroorganizmów za pomocą metabolitów powstałych w wyniku prowadzenia hodowli szczepu Pseudomonas H12B na podłożach GC1, G1SA i CSA, G1ASN i GSA

Prezentowany przykład dotyczy wpływu metabolitów produkowanych przez szczep Pseudomonas H12B na podłożach hodowlanych GC1, G1SA, G1ASN, CSA i GSA na zwiększenie (a) liczebności i (b) aktywności mikroorganizmów glebowych - aktywności dehydrogenaz. Hodowlę Pseudomonas sp. H12B na wymienionych podłożach oraz przygotowanie metabolitów przeprowadzono takjak w Przykładzie 1.

W eksperymencie zbadano:

(a) wpływ na liczebność mikroorganizmów glebowych (heterotrofów) za pomocą:

(i) metabolitów bakteryjnych wyprodukowanych na podłożach: GC1 („M-GCL”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („M-G1ASN”), GSA („M-GSA”) i CSA („M-CSA”);

(ii) jałowych podłoży; GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), G1ASN („K-G1ASN”), GSA („K-GSA”) i CSA („K-CSA”) jako kontroli chemicznych;

(iii) wody destylowanej jako dodatkowej kontroli („W”).

Działanie metabolitów przetestowano na środowiskowej glebie pochodzenia rolniczego i zanieczyszczonym metalami ciężkimi i związkami organicznymi gruncie przemysłowym. Warunki prowadzenia eksperymentu były analogiczne jak w Przykładzie 2. Liczebność mikroorganizmów we wszystkich wariantach oznaczano w próbkach pobranych na początku, a następnie 3, 5, 7, 10, 12 i 14 dnia eksperymentu. Zastosowano metodę wysiewów rozcieńczeń ekstraktu glebowego na szalki ze stałym podłożem LB. 1 g pobranej próbki gruntu umieszczano w szklanej kolbie i dodawano do niej 10 ml roztworu soli fizjologicznej (0,85% NaCI) i wytrząsano (150 rpm) przez 24 godziny. Następnego dnia z otrzymanego ekstraktu glebowego przygotowywano rozcieńczenia i wysiewano na szalki ze stałym podłożem LB. Po 2-dniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zliczano wyrosłe kolonie i obliczano liczebność mikroorganizmów heterotroficznych, wyrażoną jako JTK/ml. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 5.

(b) wpływ na aktywność mikroorganizmów glebowych (aktywność dehydrogenaz) za pomocą:

(i) metabolitów bakteryjnych wyprodukowanych na podłożach; GC1 („M-GCL”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („M-G1ASN”), GSA („M-GSA”) i CSA („M-CSA”);

(ii) jałowych podłoży: GC1 („K-GC1”), G1SA („K-G1SA”), G1ASN („K-G1ASN”), GSA („K-GSA”) i CSA („K-CSA”) jako kontroli chemicznych;

(iii) wody destylowanej jako dodatkowej kontroli („W”).

Działanie metabolitów przetestowano na środowiskowej glebie pochodzenia rolniczego i zanieczyszczonym metalami ciężkimi i związkami organicznymi gruncie przemysłowym. Warunki prowadzenia eksperymentu były analogiczne jak w Przykładzie 2. Aktywność dehydrogenaz oznaczono za pomocą metody z zastosowaniem chlorku 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylotetrazolu (INT). Próbkę gruntu (0,5 g) umieszczono w probówce, a następnie dodano do niej 2 ml 0,2% roztworu INT, po czym inkubowano w ciemności z wytrząsaniem przez 2 godziny. Po tym czasie dodano 4 ml roztworu ekstrakcyjnego (DMF:etanol 1:1 (obj./obj.)) i inkubowano próbki przez kolejną godzinę w ciemności

PL 248603 Β1 z wytrząsaniem. Po zakończeniu inkubacji próbki odwirowywano (2 minuty / 8000rpm), po czym mierzono absorbancję supernatantu w spektrofotometrze przy długości fal 464 nm. Pomiarów dokonywano na początku i na końcu eksperymentu (po 14 dniach). Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 6.

Tabela 5. Zmiana liczebności mikroorganizmów heterotroficznych w badanej glebie rolniczej i gruncie przemysłowym w wyniku dodawania roztworu metabolitów wyprodukowanych na podłożu: GC1 („M-GC1”), G1SA(„MG1SA”), G1ASN („M-G1ASN”), GSA („M-GSA”) i CSA („M-CSA”) oraz samych podłoży: GC1 („K-GC1”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („K-G1ASN”), GSA („K-GSA”) i CSA („K-CSA”), a także samej wody („K-W”). W kolejnych kolumnach przedstawiono liczebność na początku eksperymentu oraz po 3, 5, 7, 10, 12 i 14 dniach.

Liczebność mikroorganizmów heterotroficznych w glebie rolniczej
Wariant	TO	T3	T5	T7	T10	T12	T14
M-GC1	3,45E+05	7.84E+05	1.60E+06	4.42E+06	8,71E+06	l,43E+07	2,86E+07
K-GC1	3,52E+05	5,07E+05	l,06E+06	2,75E+06	5,13E+06	8,79E+06	l,85E+07
M-G1SA	4,54E+05	7,76E+05	l,55E+06	4,33E+06	8,71E+06	l,50E+07	2,95E+07
K-G1SA	4,40E+05	5,12E+05	9J3E+05	2,63E+06	5,64E+06	9,42E+06	l,87E+07
M-CSA	4,21E+05	7.76E+05	l,57E+06	4,46E+06	9,15E+06	l,52E+07	2,98E+07
K-CSA	3,96E+05	5,02E+05	9,32E+05	2,89E+06	5,62E+06	l,02E+07	l,96E+07
M-GLASN	4,27E+05	7,94E+05	l,45E+06	4,58E+06	9,74E+06	l,51E+07	3,02E+07
K-GLASN	3,92E+05	5,02E+05	9,68E+05	2,70E+06	5,08E+06	8,81E+06	l,86E+07
M-GSA	3,82E+05	7,48E+05	1J1E+06	4,80E+06	9,48E+06	l,39E+07	3,16E+07
K-GSA	3,96E+05	4,92E+05	9.10E+05	2,76E+06	5,14E+06	9,19E+06	l,87E+07
K-W	3,10E+05	3,31E+O5	3,38E+05	3,24E+05	3,55E+05	3,20E+05	3_;58E+05
Liczebność mikroorganizmów heterotroficznych w gruncie przemysłowym
Wariant	TO	T3	T5	T7	T10	T12	T14
M-GC1	6,15E+04	7,02E+04	1.02E+05	1.40E+05	4,10E+05	8,01E+05	8,55E+05
K-GC1	5,48E+04	7,02E+04	l,01E+05	l,32E+05	3,69E+05	7,53E+05	6_;09E+05
M-CSA	6,03E+04	8,70E+04	l,30E+05	l,82E+05	5,31E+05	1J2E+06	L05E+06
K-CSA	5,65E+04	7,08E+04	9,67E+04	1.28E+05	4,06E+05	8,14E+05	7,50E+05
M-G1SA	6,39E+04	7,15E+04	l,24E+05	l,67E+05	4,42E+05	9,61E+05	L20E+06
K-G1SA	5,18E+04	6,42E+04	9,49E+04	l,25E+05	3,76E+05	7,68E+05	6,25E+05
M-GLASN	5,72E+04	8,49E+04	l,16E+05	l,45E+05	4,89E+05	9,99E+05	l,05E+06
K-GLASN	5,62E+04	6,63E+04	9,79E+04	l,22E+05	3,60E+05	7,84E+05	6,66E+05
M-GSA	5,54E+04	8,41E+04	l,19E+05	l,50E+05	5,18E+05	l,06E+06	9,91E+06

PL 248603 Β1

K-GSA	5,I8E+04	6,35E+04	9,79E+04	l,17E+05	3,57E+05	7,60E+05	5,46E+05
K-W	5,15E+04	5,75E+04	6,49E+04	7,21E+04	6,59E+04	5,78E+04	5,97E+04

Tabela 6. Zmiana aktywności dehydrogenaz w badanej glebie rolniczej i gruncie przemysłowym w wyniku dodawania roztworu metabolitów wyprodukowanych na podłożu: GC1 („M-GC1”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („MIGI ASN”), GSA („M-GSA”) i CSA („M-CSA”) oraz samych podłoży: GC1 („K-GC1”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („K-G1ASN”), GSA („K-GSA”) i CSA („K-CSA”), a także samej wody („K-W”). W kolejnych kolumnach przedstawiono aktywność dehydrogenaz ma początku eksperymentu, po 14 dniach oraz procentowa_c zmianę aktywności dehydrogenaz.

Zmiana aktywności dehydrogenaz w glebie rolniczej
Wariant	TO [nmol INTF/ml]	T14 [nmol INTF/ml\|	T14 \|%]
M-GC1	2,491	3,791	34,30
K-GC1	2,441	3,295	25,92
M-G1SA	2,491	3,402	26,79
K-G1SA	2,441	2,957	17,45
M-CSA	2,466	3,611	31,72
K-CSA	2,466	3,206	23,10
M-G1ASN	2,458	3,281	33,48
K-GIASN	2,449	3,027	23,57
M-GSA	2,334	2,833	21,38
K-GSA	2,400	2,684	11,83
K-W	2,491	3,791	34,30
Zmiana aktywności dehydrogenaz w zanieczyszczonym gruncie
Wariant	TO [nmol INTF/mlJ	T14 [nmol INTF/mll	T14 [%]
M-GC1	5,126	7,882	53,76
K-GC1	5,280	7,015	32,85
M-CSA	5,376	7,419	38
K-CSA	5,178	6,708	29,56
M-G1SA	5,409	7,804	44,28
K-G1SA	4,968	6,062	22,02
M-G1ASN	5,834	8,656	48,37

PL 248603 Β1

K-G1ASN	4,731	5,944	25,65
M-GSA	5,262	7,885	49,83
K-GSA	4,711	5,944	26,18
K-W	5,118	4,576	-10

Zarówno w wyniku aplikacji metabolitów, jak i jałowych podłoży zaobserwowano wzrost liczebności mikroorganizmów w stosunku do wariantu kontrolnego z wodą. Jest to związane z dostarczeniem w obydwu przypadkach substancji odżywczych, które mogą być wykorzystywane przez mikroorganizmy do wzrostu. Jednakże, w przypadku zastosowania metabolitów dynamika przyrostu populacji bakteryjnej była wyższa w każdym wariancie i oznaczona liczba mikroorganizmów była większa o 40-50% w stosunku do jałowych podłoży, we wszystkich badanych wariantach i glebach/gruntach.

Aktywność dehydrogenaz została zwiększona w wyniku suplementacji gruntu zarówno jałowymi podłożami, jak i metabolitami bakteryjnymi. Jednakże, zastosowanie metabolitów zarówno o odczynie kwaśnym (M-GC1, M-G1SA i M-GSA), jak i zasadowym (M-CSA, M-G1ASN) pozwoliło na znaczne większe zwiększenie aktywności dehydrogenaz, niż w analogicznych wariantach kontrolnych.

W glebie rolniczej zastosowanie wszystkich metabolitów wpływało na zwiększenie aktywności dehydrogenaz o 8-10% w stosunku do wariantu kontrolnego. Dla gruntu przemysłowego w przypadku większości podłoży zaobserwowano wzrost aktywności dehydrogenaz o ponad 20% w stosunku do wariantu kontrolnego, natomiast w przypadku podłoża M-CSA różnica względem wariantu kontrolnego wynosiła 8,5% na korzyść zastosowania metabolitów.

Wyniki wskazują, że zastosowanie nowo opracowanych podłoży (zarówno o odczynie kwaśnym, jak i zasadowym) oraz podłoża GSA o charakterze kwaśnym, stanowi istotny czynnik stymulujący autochtoniczną mikrobiotę glebową w kontekście gleb rolniczych i zanieczyszczonych gruntów przemysłowych, zwiększając zarówno jej liczebność, jak i aktywność.

Przykład 6· Zwiększenie wydajności kiełkowania nasion buraka, grochu i tytoniu za pomocą metabolitów powstałych w wyniku prowadzenia hodowli szczepu Pseudomonas H12B na podłożach GC1, G1SA, G1ASN, CSA i GSA

W prezentowanym przykładzie zbadany został wpływ roztworu metabolitów wyprodukowanych na podłożach GC1, G1SA, G1ASN, CSA i GSA na kiełkowanie nasion buraka, grochu i tytoniu. Hodowlę Pseudomonas sp. H12B na podłożach GC1, G1SA, G1ASN i CSA oraz przygotowanie metabolitów przeprowadzono tak jak w Przykładzie 1. Hodowlę Pseudomonas sp. H12B na podłożu GSA oraz przygotowanie metabolitów przeprowadzono tak jak opisano w polskim zgłoszeniu patentowym nr P.440597. Zbadano wpływ na liczebność mikroorganizmów glebowych za pomocą:

(i) metabolitów bakteryjnych wyprodukowanych na podłożach: GC1 („M-GCL”), G1SA („M-G1SA”), G1ASN („M-G1ASN”), GSA („M-GSA”) i CSA („M-CSA”). Metabolity do testów kiełkowania rozcieńczono dziesięciokrotnie, a następnie połączono w stosunku 1:1 (obj./obj.) z pożywką dla roślin (KNOPP - 3 mM Ca(NO₃)₂, 1,5 mM KNO₃, 1,2 mM MgSO₄, 1,1mM KH2PO4, 0,1 mM CioHi2N20sFeNa, 5 μΜ CuSO4, 2 μΜ MnSO4 χ 5H2O, 2 μΜ ZnSO4 χ 7H2O, 15 ηΜ (ΝΗ₄)6Μο₇θ2 χ 4Η₂Ο);

(ii) pożywki dla roślin - KNOPP wymieszanej z wodą w stosunku 1:1 (obj./obj.) („Kontrola”).

W szklanych szalkach (średnia 200 mm) umieszczano warstwę ligniny o wysokości 2 cm. Nasączano ją za pomocą 125 ml odpowiedniego dla danego wariantu roztworu metabolitów/kontrolą. Następnie umieszczano na warstwie ligniny krążek bibuły filtracyjnej o średnicy 18 cm. Nasiona kondycjonowano, mocząc je przez 30 minut w 100 ml dziesięciokrotnie rozcieńczonego roztworu odpowiednich metabolitów. Po tym czasie zlewano nadmiar płynu i umieszczano 100 nasion danego gatunku na bibule filtracyjnej umieszczonej w szalce. Nasiona inkubowano w ciemności przez 5 dni w temperaturze 20°C. Każdego dnia eksperymentu zliczano ilość kiełkujących nasion w każdym z wariantów. Wyniki przedstawiono w Tabeli 7.

PL 248603 Β1

Tabela 7. Liczba kiełkujących nasion buraka, grochu i tytoniu w wyniku kondycjonowania nasion roztworami metabolitów wyprodukowanych na podłożu: GC1 („M-GC1”), G1SA („M-G1SA”), CSA („M-CSA”), GSA („M-GSA”) i G1 ASN („M-G1 ASN”) oraz kondycjonowania w samym podłożu Knopp („Kontrola”). W kolejnych kolumnach przedstawiono liczbę kiełkujących nasion na początku eksperymentu i po 1,2, 3, 4, 5, 6 dniach eksperymentu.

Liczba wykiełkowanych nasion
Burak	TO	Tl	T2	T3	T4	T5	T6
M-GC1	0	5	44	68	79	79	80
M-G1SA	0	5	46	60	68	75	78
M-CSA	0	5	51	68	77	84	84
M-G1ASN	0	9	55	71	82	85	86
M-GSA	0	10	58	76	81	83	84
Kontrola	0	5	44	64	70	72	75
Groch	TO	Tl	T2	T3	T4	T5	T6
M-GC1	2	6	50	98	98	98	98
M-G1SA	0	2	31	86	100	100	100
M-CSA	0	0	39	97	100	100	100
M-G1ASN	0	3	45	95	99	100	100
M-GSA	0	14	98	100	100	100	100
Kontrola	0	0	12	62	95	99	100
Tytoń	TO	Tl	T2	T3	T4	T5	T6
M-GC1	0	0	0	70	95	96	96
M-G1SA	0	0	2	86	95	95	95
M-CSA	0	0	0	63	70	83	83
M-G1ASN	0	0	2	88	95	95	97
M-GSA	0	0	0	89	98	98	98
Kontrola	0	0	2	70	94	94	94

Zastosowanie metabolitów wyprodukowanych na nowo opracowanych podłożach GC1, G1SA, CSA i G1ASN oraz na podłożu GSA wpływało na przyspieszenie tempa kiełkowania wszystkich bada nych nasion w porównaniu do kontroli z pożywką Knopp. W przypadku grochu pierwsze nasiona rozpoczynały proces kiełkowania dzień wcześniej niż w wariancie kontrolnym. W przypadku nasion buraka zaobserwowano większą liczbę kiełkujących nasion w eksperymencie niż w wariancie kontrolnym. W przypadku nasion tytoniu zaobserwowano większą szybkość kiełkowania nasion w eksperymencie niż w wariancie kontrolnym. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ badanych metabolitów na tempo i efektywność kiełkowania, niezależnie od wyjściowego pH wyprodukowanych metabolitów. Badania wskazują również na brak efektu toksycznego metabolitów na rośliny.

Przykład 7. Zwiększenie efektywności remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi za pomocą metabolitów powstałych w wyniku prowadzenia hodowli szczepu Pseudomonas H12B na podłożach GC1, G1SA, G1ASN, CSA i gSa

W prezentowanym przykładzie wykorzystano wyniki uzyskane w Przykładzie 5.

Efektywność mikrobiologicznej bioremediacji gruntów zanieczyszczonych związkami organicznymi jest bezpośrednio i pozytywnie związana z liczebnością oraz aktywnością mikrobioty glebowej. Odpowiednia stymulacja mikroorganizmów, np. na drodze suplementacji gruntu, wpływa na zwiększenie liczebności autochtonicznych bakterii, co skutkuje zwiększeniem tempa biodegradacji związków organicznych, które stanowią źródła ważnych biopierwiastków, np. węgla. Zwiększone tempo biodegradacji znajduje odzwierciedlenie w aktywności dehydrogenaz, ponieważ są to enzymy istotne w rozkładzie związków organicznych. Tak jak to pokazano w Przykładzie 5, suplementacja zanieczyszczonych gruntów przemysłowych metabolitami wyprodukowanymi na podłożach GC1, G1SA, G1ASN, CSA i GSA wpływa zarówno na zwiększenie liczebności mikroorganizmów w gruntach, jak również stymuluje ich aktywność. Z tego względu metabolity mogą zostać zastosowane w różnych zabiegach bioremediacyjnych jako środek wspomagający efektywną biodegradację zanieczyszczeń organicznych w glebie.

Claims

1. Podłoże do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory wytwarzane przez szczep Pseudomonas H12B, znamienne tym, że ma pH 7,0 i zawiera:

0,96 g/l Na2HPO4, 0,44 g/l KH2PO4, 0,2 g/l MgSO4 χ 7H2O oraz dodatkowo zawiera dwa następujące składniki:

a. 7 g/l glukozy, 1,35 g/l NH4CI jako podłoże GC1;

b. 3,5 g/l glicerolu o stężeniu 50%, 1 g/l (NH4)2SO4 jako podłoże G1SA; lub

c. 4 g/l kwasu cytrynowego, 1 g/l (NH4)2SO4 jako podłoże CSA; lub

d. 3,5 g/l glicerolu o stężeniu 50%, 2 g/l L-asparaginy jako podłoże G1ASN.

2. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że jest podłożem do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory o właściwościach zakwaszających i jest podłożem GC1 lub G1SA.

3. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że jest podłożem do wytwarzania kompozycji zawierającej syderofory o właściwościach alkalizujących i jest podłożem CSA lub G1ASN.