PL247975B1

PL247975B1 - Sposób utrwalania preparatu mikrobiologicznego

Info

Publication number: PL247975B1
Application number: PL446482A
Authority: PL
Inventors: Wojciech Białas; Roman Marecik; Katarzyna CZACZYK; Katarzyna Czaczyk; Agnieszka Wita; Michał Słodziński; Anna Dobrowolska; Katarzyna Zarobkiewicz
Original assignee: Univ Przyrodniczy W Poznaniu
Priority date: 2023-10-24
Filing date: 2023-10-24
Publication date: 2025-09-22
Also published as: PL446482A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób utrwalania preparatu mikrobiologicznego w jakim zawiesinę spor bakteryjnych uzyskanych po zakończeniu 72h hodowli prowadzonej w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce lub w bioreaktorze wiruje się, a następnie pozyskany w ten sposób osad miesza się wysterylizowanymi termicznie roztworami: nośnika i formulacji, przy czym formulacja jako substancje indukujące kiełkowanie spor zawiera co najmniej L-alaninę w stężeniu od 4,45 g/L do 17,81 g/L, korzystnie 8,9 g/L oraz L-asparaginę w stężeniu od 6,06 g/L do 26,42 g/L, korzystnie 13,21 g/L, a nośnikiem formulacji jest roztwór maltodekstryny zawierającej w swoim w składzie od 80,5% do 97% polisacharydów, korzystanie 97%, stężenie roztworu maltodekstryny stosowanej w charakterze nośnika wynosi od 100 g/L do 300 g/L, korzystanie 200 g/L, przy czym hodowle produkcyjne w kolbkach jak i bioreaktorze prowadzi się przez 3 doby w temperaturze 30°C, jako inokulum stosuje się 24 godzinną hodowlę Peanibacillus polymyxa AW 2,12, 5% objętości hodowli właściwej, po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany zawierający komórki w formie spor tj. 1 litr hodowli w kolbkach stożkowych i 2 L w hodowli bioreaktorowej, odwirowuje się na wirówce laboratoryjnej przy 5000xg przez 20 min, po zakończeniu wirowania zlewa się klarowny płyn pohodowlany znad osadu, po czym do naczynia wirówkowego zawierającego koncentrat biomasy komórek dodaje się dwukrotnie stężony roztwór nośnika - maltodekstryny o stężeniu 400 g/L, korzystnie o 97% zawartości polisacharydów, w ilości 0,25 L dla hodowli kolbkowych i 0,5 L dla hodowli bioreaktorowych oraz dwukrotnie stężony roztwór składników formulacji zawierającej substancje wspomagające kiełkowanie spor: L-alaninę w stężeniu 17.8 g/L, L-asparaginę w stężeniu 26,42 g/L oraz substancje promujące wzrost komórek: bulion odżywczy w stężeniu 60 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu 10 g/L; chlorek sodu w stężeniu 16 g/L i glukozę krystaliczną w stężeniu 2 g/L - w ilości 0,25 L dla hodowli kolbkowych i 0,5 L dla hodowli bioreaktorowych, zawiesinę komórek miesza się z wymienionymi roztworami za pomocą mieszadła mechanicznego typu śruba okrętowa (10 min, temp. 20°C, 250 obr/min) i zawiesinę rozlewa się na tace wykonane ze stali nierdzewnej o głębokości 2,5 cm i grubości warstwy cieczy na tacy od 0,5 do 2 cm, korzystnie 1,5 cm, a przygotowany w ten sposób materiał poddaje się procesowi suszenia sublimacyjnego w urządzeniu Christ Beta 1 - 6 tak, że proces liofilizacji prowadzi się w kilku etapach: zamrażanie zawiesiny spor w temp. od -50°C do -20°C, korzystnie w -35°C, suszenie pod ciśnieniem 5 Pa i w temperaturze 0°C przez 12 h (I faza suszenia), suszenie pod próżnią i w temperaturze 15°C przez 24 h (II faza suszenia); dosuszanie pod próżnią i w temperaturze 20°C przez 12 h (III faza procesu suszenia), po zakończeniu procesu suszenia preparat pakuje się bez dalszej obróbki do zgrzewanego opakowania barierowego wykonanego z wielowarstwowego laminatu tworzyw sztucznych oraz folii aluminiowej, po czym produkt przechowuje się w temperaturze 20°C, aż do użycia.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób utrwalania preparatu mikrobiologicznego zawierającego żywe mikroorganizmy zapewniający wysoką stabilność komórek podczas przechowywania oraz wysoką zdolność do kiełkowania spor podczas uwadniania preparatu poprzedzającego jego aplikację. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania preparatu w postaci proszku uzyskiwanego metodą suszenia sublimacyjnego zawierającego bakterie z rodzaju Bacillus i Peanibacillus, w szczególności Peanibacillus sp. wykazujące aktywność fungistatyczną.

Mikroorganizmy glebowe mają ogromny potencjał dla rolnictwa. Aby zwiększyć produkcję roślinną, wykorzystuje się szeroką gamę drobnoustrojów mających zdolność do kolonizacji środowiska glebowego, a także interakcji w układzie roślina - komórka bakteryjna [1]. Niestety w wielu przypadkach obserwuje się niską przeżywalność stosowanych mikroorganizmów, co związane jest z niekorzystnymi dla wzrostu warunkami środowiskowymi, takimi jak susza czy nieodpowiednie pH gleby. Komórki mikroorganizmów muszą zatem przezwyciężyć liczne stresy, które ograniczają ich zdolność do wzrostu. U bakterii istnieje wiele strategii radzenia sobie ze niekorzystnymi warunkami panującymi w środowisku.

Jest to między innymi tworzenie cyst i przetrwalników, zmiany w błonach komórkowych, ekspresja genów odpowiedzialnych za syntezę enzymów biorących udział w naprawie uszkodzonych kwasów nukleinowych oraz substancji łagodzących niekorzystne oddziaływanie czynników stresowych. Bakterie tworzące przetrwalniki wykazują bardzo wysoką odporność na oddziaływanie warunków stresowych, stąd też są powszechnie stosowane jako podstawowy składnik bioaktywny w produktach o charakterze bionawozów, biostymulatorów czy preparatów o działaniu fungistatycznym [2]. Do najczęściej wykorzystywanych należą bakterie tlenowe tworzące przetrwalniki, takie jak Bacillus spp. oraz Paenibacillus spp. Stanowią one jedną z głównych grup bakterii glebowych [3] i mogą być izolowane zarówno ze zbiorowisk leśnych, łąkowych jak i gleb uprawnych [4]. Zarodniki czy inaczej spory są uwalniane do środowiska podczas lizy komórki macierzystej. Struktury te wykazują niewielką aktywność metaboliczną lub nie wykazują jej wcale, dlatego uważa się je za uśpione [5]. Oporność na działanie stresów środowiskowych, która przekłada się na możliwość długoletniego przechowywania komórek w formie zarodników wynika z unikalnych właściwości chemicznych składników tworzących spory oraz specyficznej konfiguracji struktur powstających na ich bazie. Zarodniki mają kilka warstw, które nie występują w komórkach wegetatywnych, w tym rdzeń, wewnętrzną błonę przetrwalnika stanowiącą barierę chroniącą materiał genetyczny przed szkodliwymi czynnikami, korę oraz płaszcz. Rdzeń przetrwalnika składający się głównie z chelatu kwasu dipikolinowego i jonów wapnia ma kluczowe znaczenie dla ochrony materiału genetycznego zamkniętego w przetrwalniku [6]. Transformacja komórek do formy przetrwalnej gwarantuje, że preparat mikrobiologiczny będzie mógł być przechowywany przez długi okres czasu bez znaczącego wpływu na jego jakość. Należy jednakże zaznaczyć, że o stabilności preparatu decyduje jego forma. Zazwyczaj produkt zawierający spory bakteryjne musi mieć okres przydatności do użycia co najmniej od jednego do dwóch lat. Wytworzenie preparatów charakteryzujących się bardzo wysoką stabilnością podczas przechowywania stanowi wyjątkowe wyzwanie, w szczególności w odniesieniu do formulacji ciekłych opartych na roztworach wodnych. Środowisko wodne sprzyja niestety przedwczesnemu kiełkowaniu zarodników zawartych w produkcie, często na długo przed jego planowanym zastosowaniem na polu. Potencjalnym rozwiązaniem tego problemu jest produkcja preparatów w formie stałej, uzyskiwanej na drodze suszenia rozpyłowego lub sublimacyjnego. Jak wynika z danych literaturowych suszenie rozpyłowe jest technologią znacznie tańszą od suszenia sublimacyjnego, jednakże przyczynia się do spadku liczebności spor zdolnych do kiełkowania po procesie uwodnienia. Spadek ten w zależności od fazy wzrostu z której pobrano komórki celem ich utrwalania metodą suszenia rozpyłowego może wynosić od 68 do 99% [7]. Wysoka przeżywalność komórek w trakcie procesu suszenia jak i późniejsza wydajność procesu kiełkowania przetrwalników warunkuje poprawne działanie preparatu w środowisku glebowym. Proces kiełkowania mający na celu przekształcenie komórek z formy przetrwalnej do formy wegetatywnej jest wieloetapowy i obejmuje kolejno: inicjację procesu, transformację w obrębie rdzenia przetrwalnika, zmiany degradacyjne w przetrwalniku oraz finalnie odtworzenie komórki wegetatywnej i wznowienie metabolizmu [8]. Kiełkowanie może być inicjowane na kilka sposobów związanych między innymi z odpowiedzią na zmieniające się warunki środowiskowe. Zdecydowanie sprzyja mu poprawa dostępności substancji odżywczych takich jak cukry czy aminokwasy. Inicjatorami kiełkowania są także takie związki jak CaDPA (dipikolinian wapnia) oraz kationowe środki powierzch niowo czynne, takie jak dodecyloamina. Istotne znaczenie mają także czynniki fizyczne takie jak wysokie ciśnienie (HP) rzędu kilku tysięcy atmosfer oraz traktowanie przetrwalników substancjami abrazyjnymi. W warunkach naturalnych (polowych) inicjatorami kiełkowania będzie zdecydowanie obecność określonych składników odżywczych. Dane literaturowe wskazują, że wybrane składniki odżywcze znajdujące się w glebie wiążą się w sposób stereospecyficzny ze specyficznymi dla zarodników kompleksami białkowymi, zwanymi receptorami kiełkowania (GR). Na przykład w przypadku zarodników B. subtilis substancjami inicjującymi kiełkowanie są L-alanina, L-walina oraz L-asparagina [9]. Po zmieszaniu danej substancji zdolnej do inicjalizacji procesu germinacji następuje zwykle okres opóźnienia, którego długość waha się od kilku minut do > 24 godzin dla poszczególnych zarodników znajdujących się w badanej populacji. W przypadku preparatów stosowanych w rolnictwie czas przygotowania preparatu do użycia jest istotnym czynnikiem warunkującym jego przydatność. Należy dążyć do stworzenia formulacji gwarantującej uzyskanie w możliwie krótkim czasie produktu gotowego do aplikacji, zawierającego aktywne formy komórek bakterii wykazujące zdolność do wzrostu w warunkach polowych. Na przykład według sposobu opisanego w patencie WO2018140542A1 pobudza się kiełkowanie zarodników i/lub wzrost wegetatywny izolatów bakterii z rodzaju Bacillus lub Paenibacillus zdolnych do wspomagania wzrostu roślin, poprzez jednoczesne lub kolejne nanoszenie na roślinę nieorganicznego fosforanu i wspomnianych izolatów Bacillus lub Paenibacillus pobudzających wzrost roślin, część rośliny, nasiona rośliny i/lub miejsce, w którym roślina rośnie lub ma rosnąć.

Celem wynalazku było opracowanie nowego sposobu otrzymywania aktywnych biologicznie preparatów zawierających w swoim składzie komórki bakterii należące do rodzaju Paenibacillus sp., (szczep Paenibacillus polymyxa AW 2.12, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów, znajdującej się w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu pod numerem akcesyjnym B/00465) wykazujące aktywność fungistatyczną. Cel ten został zrealizowany dzięki zastosowaniu suszenia sublimacyjnego zawiesiny komórek z dodatkiem formulacji zawierającej bulion odżywczy, pepton bakteriologiczny, chlorek sodu, glukozę, L-alaninę, L-asparaginę oraz nośnik w postaci maltodekstryny.

Sposób utrwalania preparatu mikrobiologicznego polega na tym, że zawiesinę spor bakteryjnych uzyskanych po zakończeniu 72 h hodowli prowadzonej w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce lub w bioreaktorze wiruje się, a następnie pozyskany w ten sposób osad miesza się wysterylizowanymi termicznie roztworami: nośnika i formulacji. Uzyskaną w ten sposób zawiesinę spor rozlewa się w warunkach aseptycznych na tace i suszy sublimacyjnie.

Formulacja według jako substancje indukujące kiełkowanie spor zawiera L-alaninę w stężeniu od 4.45 g/L do 17.81 g/L, korzystnie 8.9 g/L oraz L-asparaginę w stężeniu od 6.06 g/L do 26.42 g/L, korzystnie 13.21 g/L. Korzystanie formulacja w charakterze substancji promujących wzrost komórek zawiera dodatkowo bulion odżywczy w stężeniu od 10 g/L do 50 g/L, korzystnie 30 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu od 2 g/L do 10 g/L, korzystnie 5 g/L; chlorek sodu w stężeniu od 6 g/L do 10 g/L, korzystnie 8 g/L oraz glukozę krystaliczną w stężeniu od 0.5 g/L do 1.5 g/L, korzystnie 1 g/L. Nośnikiem formulacji jest roztwór maltodekstryny zawierającej w swoim w składzie od 80,5% do 97% polisacharydów, korzystanie 97%. Stężenie roztworu maltodekstryny stosowanej w charakterze nośnika wynosi od 100 g/L do 300 g/L, korzystanie 200 g/L.

Szczegółowo sposób według wynalazku realizuje się w kilku następujących po sobie etapach. W pierwszym etapie bakterie hoduje się na podłożu o pH 7.0, zawierającym: bulion wzbogacony 16 g/L; KCI 2 g/L; MgSO4 x 7H2O 0.5 g/L; Ca(NOs)2 x 4H2O 0.24 g/L; MnCb x 4H2O 0.0125 g/L; FeSO4 x 7H2O 0.0005 g/L oraz glukozę 1 g/L. Hodowle prowadzi się w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce rotacyjnej (250 obr/min, temp. 30°C, czas 72 h) lub w bioreaktorze laboratoryjnym o pojemności roboczej 2 L, w warunkach aerobowych (napowietrzanie 1 vvm, poziom nasycenia tlenem 30% regulowany w kaskadzie z obrotami mieszadła w zakresie 100-1000 obr/min). Hodowle w bioreaktorze prowadzi się w pożywce o objętości 2 L, przy stałym pH regulowanym za pomocą roztworów NaOH (20% w/w) oraz H3PO4 (10% w/w), dozowanych w oparciu o sygnał z pochodzący z elektrody pH umieszczonej w bioreaktorze. Hodowle produkcyjne w kolbkach jak i bioreaktorze prowadzi się przez 3 doby w temperaturze 30°C. Jako inokulum w obu opisanych wyżej przypadkach stosuje się 24 godzinną hodowlę Bacillus lub Peanibacillus, w szczególności Peanibacillus polymyxa AW 30 2.12 (5% objętości hodowli właściwej). Po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany zawierający komórki w formie spor (1 litr hodowli w kolbkach stożkowych i 2 L w hodowli bioreaktorowej) odwirowuje się na wirówce laboratoryjnej przy 5000 x g przez 20 min. Po zakończeniu wirowania zlewa się klarowny płyn pohodowlany znad osadu. Następnie do naczynia wirówkowego zawierającego koncentrat biomasy komórek dodaje się dwukrotnie stężony roztwór nośnika (maltodekstryny o stężeniu 400 g/L, korzystnie o 97% zawartości polisacharydów, w ilości 0,25 L dla hodowli kolbkowych i 0,5 L dla hodowli bioreaktorowych) oraz dwukrotnie stężony roztwór składników formulacji zawierającej substancje wspomagające kiełkowanie spor: L-alaninę w stężeniu 17.8 g/L, L-asparaginę w stężeniu 26.42 g/L oraz substancje promujące wzrost komórek: bulion odżywczy w stężeniu 60 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu 10 g/L; chlorek sodu w stężeniu 16 g/L i glukozę krystaliczną w stężeniu 2 g/L (w ilości 0,25 L dla hodowli kolbkowych i 0,5 L dla hodowli bioreaktorowych). Zawiesinę komórek miesza się z wymienionymi roztworami za pomocą mieszadła mechanicznego typu śruba okrętowa (10 min, temp. 20°C, 250 obr/min). W ten sposób zawiesina zawiera korzystne stężenia poszczególnych składników formulacji. Następnie zawiesinę rozlewa się na tace wykonane ze stali nierdzewnej o głębokości 2.5 cm. Grubość warstwy cieczy na tacy wynosi od 0.5 do 2 cm, korzystnie 1.5 cm. Przygotowany w ten sposób materiał poddaje się procesowi suszenia sublimacyjnego. Proces liofilizacji prowadzi się w kilku etapach: zamrażanie zawiesiny spor w temp. od -50°C do -20°C, korzystnie w -35°C, suszenie pod ciśnieniem 5 Pa i w temperaturze 0°C przez 12 h (I faza suszenia), suszenie pod próżnią i w temperaturze 15°C przez 24 h (II faza suszenia); dosuszanie pod próżnią i w temperaturze 20°C przez 12 h (III faza procesu suszenia). Po zakończeniu procesu suszenia preparat pakuje się bez dalszej obróbki do zgrzewanego opakowania barierowego wykonanego z wielowarstwowego laminatu tworzyw sztucznych oraz folii aluminiowej. Produkt przechowuje się w temperaturze 20°C aż do użycia.

Z uzyskanego proszku pobierano próbkę, w której oznaczano zawartość suchej substancji metodą grawimetryczną oraz liczebność komórek wegetatywnych po zakończeniu procesu rehydratacji, którą prowadzono w jałowej wodzie destylowanej, w czasie od 1 do 4 h, korzystanie 2 h. Badano także aktywność metaboliczną komórek za pomocą testu z wykorzystaniem resazuryny. Test ten pozwala na ilościową ocenę aktywności metabolicznej komórek za pośrednictwem pomiaru stopnia redukcji resazuryny (barwa niebieska) do resorufiny o barwie różowej. Im większy stopień redukcji resazuryny, tym większa aktywność metaboliczna komórek [10]. Sposób według wynalazku został przedstawiony bliżej w opisanych niżej przykładach zastosowania.

Przykład 1 Produkcja preparatu zawierającego spory z wykorzystaniem materiału namnażanego w hodowlach okresowych prowadzonych w kolbach stożkowych

Przygotowano ciekłe podłoże hodowlane do namnażania szczepu Peanibacillus polymyxa AW 2.12 w taki sposób, że w pierwszej kolejności odważono na wadze analitycznej następujące ilości składników pożywki: bulion wzbogacony 16 g; KCI 2 g; MgSO4 x 7H2O 0.5 g; Ca(NO3)2 x 4H2O 0.24 g; MnCb x 4H2O 0.0125 g; FeSO4 x 7H2O 0.0005 g oraz glukozę 1 g. Składniki te rozpuszczono w 800 ml wody dejonizowanej, dokonano korekty pH do poziomu 7.0, a następnie uzupełniono objętość pożywki do 1 litra za pomocą wody dejonizowanej. Z tak przygotowanej pożywki pobrano po 475 ml do dwóch szklanych kolb stożkowych wyposażonych w przegrody wspomagające proces natleniania oraz zakrętki polipropylenowe z wtopioną membraną wykonaną z PTFE, umożlwiającą swobodny transfer gazów podczas hodowli (O2/CO2). Pozostałe 50 ml przelano do kolby stożkowej o pojemności 250 ml, wyposażonej jak wyżej w przegrody wspomagające proces natleniania oraz zakrętkę polipropylenową z wtopioną membraną wykonaną z PTFE, umożlwiającą swobodny transfer gazów podczas hodowli (O2/CO2). Pożywki umieszczono w autoklawie i wykonano proces sterylizacji według następujących parametrów: temp. sterylizacji 121°C, czas przetrzymania w temp. sterylizacji 20 minut. Po zakończeniu procesu sterylizacji kolbki schłodzono do temperatury pokojowej. Następnie do kolbki zawierającej 50 ml jałowej pożywki wprowadzono 2 ml czystej kultury bakteryjnej zawierającej szczep Peanibacillus polymyxa AW 2.12 (szczep przechowywano w postaci banku glicerynowego w temp. -80°C). Hodowlę inokulacyjną prowadzono na wytrząsarce rotacyjnej (250 obr/min, temp. 30°C) przez 24 h. Po upływie tego czasu pobrano w warunkach aseptycznych (komora z laminarnym przepływem powietrza przeznaczona do pracy z mikroorganizmami) próbkę o objętości 0.1 ml i wykonano barwienie metodą Grama w celu kontroli czystości inokulum. Następnie zaszczepiono dwie przygotowane uprzednio kolby stożkowe zawierające 475 ml jałowej pożywki 25 ml hodowli inokulacyjnej. Hodowle prowadzono na wytrząsarce rotacyjnej (250 obr/min, temp. 30°C) przez 3 doby. Równolegle przygotowano skoncentrowany roztwór nośnika zawierającego maltodekstrynę. W tym celu do zlewki szklanej o pojemności 0.5 L wlano 125 ml wody dejonizowanej podgrzanej do temperatury 60°C. Następnie odważono 100 g maltodekstryny zawierającej w swoim składzie 97% polisacharydów. Zlewkę umieszczono na blacie grzejnym umożliwiającym podgrzanie roztworu do temp. 90°C. Do tak przygotowanego naczynia włożono mieszadło mechaniczne typu śruba okrętowa. Po włączeniu mieszadła (500 obr/min) wsypywano porcjami odważoną uprzednio maltodekstrynę. Roztwór w trakcie rozpuszczania podgrzano do temp. 90°C. Po rozpuszczeniu maltodekstryny roztwór ostudzono do temp. pokojowej i uzupełniono jego objętość do 250 ml. Tak przygotowany roztwór przelano do butelki o poj. 500 ml wyposażonej w korek polipropylenowy i wyjałowiono go w autoklawie (temp. sterylizacji 121°C, czas przetrzymania w temp. sterylizacji 20 minut.). W analogiczny sposób przygotowano koncentrat zawierający składniki formulacji indukującej proces kiełkowania spor. W tym celu do zlewki szklanej o pojemności 0.5 L wlano 175 ml wody dejonizowanej. Następnie odważono na wadze analitycznej: 4.45 g L-alaniny, 6.605 g L-asparaginy oraz substancje promujące wzrost komórek: 15 g bulionu odżywczego; 2.5 g peptonu bakteriologicznego; 4 g chlorku sodu i 0.5 g glukozy krystalicznej. Do zlewki włożono mieszadło mechaniczne typu śruba okrętowa. Po włączeniu mieszadła (200 obr/min) wsypywano kolejno odważone składniki formulacji. Po rozpuszczeniu wszystkich składników uzupełniono objętość roztworu za pomocą wody dejonizowanej do 250 ml. Tak przygotowany roztwór przelano do butelki o poj. 500 ml wyposażonej w korek polipropylenowy i wyjałowiono go w autoklawie (temp. sterylizacji 121°C, czas przetrzymania w temp. sterylizacji 20 minut.).

Po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany zawierający komórki w formie spor (1 litr hodowli w dwóch kolbach stożkowych zawierających po 500 ml hodowli) przelano do jałowych naczyń wirówkowych o pojemności 1 L. Następnie spory odwirowano za pomocą wirówki laboratoryjnej przy 5000 x g przez 20 min. Po zakończeniu wirowania zlano klarowny płyn pohodowlany znad osadu. Następnie do naczynia wirówkowego zawierającego koncentrat biomasy dodano kolejno 0,25 L dwukrotnie stężonego roztworu nośnika (maltodekstryny o stężeniu 400 g/L) oraz 0,25 L dwukrotnie stężonej formulacji zawierającej substancje wspomagające kiełkowanie spor: L-alaninę w stężeniu 17.8 g/L, L-asparaginę w stężeniu 26.42 g/L oraz substancje promujące wzrost komórek: bulion odżywczy w stężeniu 60 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu 10 g/L; chlorek sodu w stężeniu 16 g/L i glukozę krystaliczną w stężeniu 2 g/L. Zawiesinę komórek mieszano z wymienionymi roztworami za pomocą mieszadła mechanicznego typu śruba okrętowa (10 min, temp. 20°C, 250 obr/min). W ten sposób zawiesina zawierała korzystne stężenia poszczególnych składników formulacji oraz nośnika maltodekstrynowego. Następnie zawiesinę rozlano na tace wykonane ze stali nierdzewnej o głębokości 2.5 cm. Grubość warstwy cieczy na tacy wynosiła 1.5 cm. Przygotowany w ten sposób materiał poddano procesowi suszenia sublimacyjnego. Proces liofilizacji prowadzono w kilku etapach: zamrażanie zawiesiny spor w temp. -35°C, suszenie pod ciśnieniem 5 Pa i w temperaturze 0°C przez 12 h (I faza suszenia), suszenie pod próżnią i w temperaturze 15°C przez 24 h (II faza suszenia); dosuszanie pod próżnią i w temperaturze 20°C przez 12 h (III faza procesu suszenia). Po zakończeniu procesu suszenia preparat zapakowano bez dalszej obróbki do zgrzewanego opakowania barierowego wykonanego z wielowarstwowego laminatu tworzyw sztucznych oraz folii aluminiowej. Produkt przechowano w temperaturze 20°. W charakterze próby kontrolnej zastosowano preparat zawierający Peanibacillus polymyxa AW 2.12 wytworzony w analogiczny sposób z tym, że podczas suszenia zastosowano jedynie nośnik zawierający maltodekstrynę, przy zachowaniu odpowiednich stosunków masowych poszczególnych składników (kontrola nie zawierała formulacji wspomagającej kiełkowanie spor). Z uzyskanych proszków pobrano próbki, w których oznaczano zawartość suchej substancji metodą grawimetryczną. Wynosiła ona dla kolejnych trzech powtórzeń procesu produkcji preparatu z dodatkiem nośnika i formulacji wspomagającej kiełkowanie spor 96.2±0.8%. W próbie kontrolnej uzyskano podobny poziom zawartości suchej substancji wynoszący dla kolejnych trzech powtórzeń procesu produkcji preparatu wyłącznie z dodatkiem nośnika 95.5±0.6%. Liczebność komórek wegetatywnych po zakończeniu procesu rehydratacji, którą prowadzono w jałowej wodzie destylowanej w czasie 2 h dla kolejnych trzech powtórzeń procesu produkcji preparatu z dodatkiem nośnika i formulacji wspomagającej kiełkowanie spor wynosiła 5 x 109 jtk/ml. Liczebność komórek wegetatywnych w próbie kontrolnej zawierającej jedynie dodatek nośnika była o jeden rząd wielkości niższa i wynosiła 4 x 108 jtk/ml. Badano także aktywność metaboliczną komórek za pomocą testu z wykorzystaniem resazuryny. Badanie wykonano w kolejnych 4 h od momentu rozpoczęcia procesu rehydratacji, wyniki przedstawiono na Rys. 1.

Dane zaprezentowane na Rys. 1 potwierdzają skuteczność działania formulacji mającej na celu indukcję kiełkowania spor. Aktywność metaboliczna komórek wyrażona za pomocą stopnia redukcji resazuryny jest znacznie wyższa w próbie zawierającej zarówno nośnik jak i składniki formulacji.

Przykład 2 Produkcja preparatu zawierającego spory z wykorzystaniem materiału namnażanego w hodowlach okresowych prowadzonych w bioreaktorach laboratoryjnych

Analogicznie jak w przykładzie 1 przygotowano ciekłe podłoże hodowlane do namnażania szczepu Peanibacillus polymyxa AW 2.12 w taki sposób, że w pierwszej kolejności odważono na wadze analitycznej następujące ilości składników pożywki: bulion wzbogacony 32 g; KCI 4 g; MgSO4 x 7H2O

0.1 g; Ca(NO3)2 x 4H2O 0.48 g; MnCl2 x 4H2O 0.025 g; FeSO4 x 7H2O 0.0010 g oraz glukozę 2 g. Składniki te rozpuszczono w 1.5 L wody dejonizowanej, dokonano korekty pH do poziomu 7.0, a następnie uzupełniono objętość pożywki do 2 litrów za pomocą wody dejonizowanej. Z tak przygotowanej pożywki pobrano 1.9 L, które przelano do naczynia bioreaktora. W pokrywie bioreaktora umieszczono wykalibrowaną uprzednio sondę pH (wobec buforów o pH 4.0 i 7.0), a także cyfrową sondę tlenową. Podłączono także butelki o pojemności 250 ml zawierające odpowiednio roztwór NaOH (20% w/w), H3PO4 (10% w/w) oraz wodny roztwór środka antypiennego (Antifoam 204 z firmy Sigma, o stężeniu 10% w/w). Pozostałe 100 ml przelano do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, wyposażonej jak wyżej w przegrody wspomagające proces natleniania oraz zakrętkę polipropylenową filtrem wykonanym z PTFE i króćcem z zamontowanym wężem umożliwiającym aseptyczny transfer inokulum do bioreaktora. Filtr PTFE umożliwiał swobodny transfer gazów podczas hodowli (O2/CO2). Bioreaktor oraz pożywkę inokulacyjną znajdującą się w butelce umieszczono w autoklawie i wykonano proces sterylizacji według następujących parametrów: temp. sterylizacji 121°C, czas przetrzymania w temp. sterylizacji 30 minut. Po zakończeniu procesu sterylizacji naczynia hodowlane schłodzono do temperatury pokojowej. Następnie do kolbki zawierającej 100 ml jałowej pożywki wprowadzono 4 ml czystej kultury bakteryjnej zawierającej szczep Peanibacillus polymyxa AW 2.12 (szczep przechowywano w postaci banku glicerynowego w temp. -80°C, zastosowano dwa banki, każdy o pojemności 2 ml). Hodowlę inokulacyjną prowadzono na wytrząsarce rotacyjnej (250 obr/min, temp. 30°C) przez 24 h. Po upływie tego czasu pobrano w warunkach aseptycznych (komora z laminarnym przepływem powietrza przeznaczona do pracy z mikroorganizmami) próbkę o objętości 0.1 ml i wykonano barwienie metodą Grama w celu kontroli czystości inokulum. Następnie zaszczepiono przygotowany uprzednio bioreaktor zawierający 1.9 L jałowej pożywki 100 ml hodowli inokulacyjnej. Hodowlę produkcyjną w bioreaktorze prowadzi się w warunkach aerobowych (napowietrzanie 1 vvm, czyli 2 L powietrza o ciśnieniu wlotowym 1,3 bara/min, poziom nasycenia tlenem 30% regulowany w kaskadzie z obrotami mieszadła w zakresie 100-1000 obr/min). Hodowle w bioreaktorze prowadzi się przy stałym pH wynoszącym 7.0, regulowanym za pomocą roztworów NaOH (20% w/w) oraz H3PO4 (10% w/w), dozowanych w oparciu o sygnał z pochodzący z elektrody pH umieszczonej w bioreaktorze. W przypadku wystąpienia nadmiernego pienienia się automatyczny system będzie dozował środek przeciwpienny (zgodnie z sygnałem pochodzącym z czujnika piany, który znajduje się w pokrywie bioreaktora). Hodowle bioreaktorowe prowadzono przez 3 doby w temp. pożywki wynoszącej 30°C. Równolegle przygotowano skoncentrowany roztwór nośnika zawierającego maltodekstrynę. W tym celu do zlewki szklanej o pojemności 1.0 L wlano 250 ml wody dejonizowanej podgrzanej do temperatury 60°C. Następnie odważono 200 g maltodekstryny zawierającej w swoim składzie 97% polisacharydów. Zlewkę umieszczono na blacie grzejnym umożliwiającym podgrzanie roztworu do temp. 90°C. Do tak przygotowanego naczynia włożono mieszadło mechaniczne typu śruba okrętowa. Po włączeniu mieszadła (500 obr/min) wsypywano porcjami odważoną uprzednio maltodekstrynę. Roztwór w trakcie rozpuszczania podgrzano do temp. 90°C. Po rozpuszczeniu maltodekstryny roztwór ostudzono do temp. pokojowej i uzupełniono jego objętość do 500 ml. Tak przygotowany roztwór przelano do butelki o poj. 1.0 L wyposażonej w korek polipropylenowy i wyjałowiono go w autoklawie (temp. sterylizacji 121°C, czas przetrzymania w temp. sterylizacji 20 minut.). W analogiczny sposób przygotowano koncentrat zawierający składniki formulacji indukującej proces kiełkowania spor. W tym celu do zlewki szklanej o pojemności 1.0 L wlano 350 ml wody dejonizowanej. Następnie odważono na wadze analitycznej: 8.9 g L-alaniny, 13.21 g L-asparaginy oraz substancje promujące wzrost komórek: 30 g bulionu odżywczego; 5 g peptonu bakteriologicznego; 8 g chlorku sodu i 1 g glukozy krystalicznej. Do zlewki włożono mieszadło mechaniczne typu śruba okrętowa. Po włączeniu mieszadła (500 obr/min) wsypywano kolejno odważone składniki formulacji. Po rozpuszczeniu wszystkich składników uzupełniono objętość roztworu za pomocą wody dejonizowanej do 500 ml. Tak przygotowany roztwór przelano do butelki o poj. 1.0 L wyposażonej w korek polipropylenowy i wyjałowiono go w autoklawie (temp. sterylizacji 121°C, czas przetrzymani a w temp. sterylizacji 20 minut).

Po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany zawierający komórki w formie spor (2 litry hodowli bioreaktorowej) przelano do jałowych naczyń wirówkowych o pojemności 1 L. Następnie spory odwirowano za pomocą wirówki laboratoryjnej przy 5000 x g przez 20 min. Po zakończeniu wirowania zlano klarowny płyn pohodowlany znad osadu. Następnie do naczynia wirówkowego zawierającego koncentrat biomasy dodano kolejno 0,5 L dwukrotnie stężonego roztworu nośnika (maltodekstryny o stężeniu 400 g/L) oraz 0,5 L dwukrotnie stężonej formulacji zawierającej substancje wspomagające kiełkowanie spor: L-alaninę w stężeniu 17.8 g/L, L-asparaginę w stężeniu 26.42 g/L oraz substancje promujące wzrost komórek: bulion odżywczy w stężeniu 60 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu 10 g/L; chlorek sodu w stężeniu 16 g/L i glukozę krystaliczną w stężeniu 2 g/L. Zawiesinę komórek mieszano z wymienionymi roztworami za pomocą mieszadła mechanicznego typu śruba okrętowa (10 min, temp. 20°C, 250 obr/min). W ten sposób zawiesina zawierała korzystne stężenia poszczególnych składników formulacji oraz nośnika maltodekstrynowego. Następnie zawiesinę rozlano na tace wykonane ze stali nierdzewnej o głębokości 2.5 cm. Grubość warstwy cieczy na tacy wynosiła 1.5 cm. Przygotowany w ten sposób materiał poddano procesowi suszenia sublimacyjnego. Proces liofilizacji prowadzono w kilku etapach: zamrażanie zawiesiny spor w temp. -35°C, suszenie pod ciśnieniem 5 Pa i w temperaturze 0°C przez 12 h (I faza suszenia), suszenie pod próżnią i w temperaturze 15°C przez 24 h (II faza suszenia); dosuszanie pod próżnią i w temperaturze 20°C przez 12 h (III faza procesu suszenia). Po zakończeniu procesu suszenia preparat zapakowano bez dalszej obróbki do zgrzewanego opakowania barierowego wykonanego z wielowarstwowego laminatu tworzyw sztucznych oraz folii aluminiowej. Produkt przechowano w temperaturze 20°. W charakterze próby kontrolnej zastosowano preparat zawierający Peanibacillus polymyxa AW 2.12 wytworzony w analogiczny sposób z tym, że podczas suszenia zastosowano jedynie nośnik zawierający maltodekstrynę, przy zachowaniu odpowiednich stosunków masowych poszczególnych składników (kontrola nie zawierała formulacji wspomagającej kiełkowanie spor). Z uzyskanych proszków pobrano próbki, w których oznaczano zawartość suchej substancji metodą grawimetryczną. Wynosiła ona dla kolejnych trzech powtórzeń procesu produkcji preparatu z dodatkiem nośnika i formulacji wspomagającej kiełkowanie spor 95.8±0.7%. W próbie kontrolnej uzyskano podobny poziom zawartości suchej substancji wynoszący dla kolejnych trzech powtórzeń procesu produkcji preparatu wyłącznie z dodatkiem nośnika 96.1±0.4%. Liczebność komórek wegetatywnych po zakończeniu procesu rehydratacji, którą prowadzono w jałowej wodzie destylowanej w czasie 2 h dla kolejnych trzech powtórzeń procesu produkcji preparatu z dodatkiem nośnika i formulacji wspomagającej kiełkowanie spor wynosiła podobnie jak w przypadku hodowli kolbkowych 5 x 109 jtk/ml. Liczebność komórek wegetatywnych w próbie kontrolnej zawierającej jedynie dodatek nośnika była niespełna o jeden rząd wielkości niższa i wynosiła 8 x 10⁸ jtk/ml. Analogicznie jak w przykładzie 1 badano także aktywność metaboliczną komórek za pomocą testu z wykorzystaniem resazuryny. Badanie wykonano w kolejnych 4 h od momentu rozpoczęcia procesu rehydratacji, wyniki przedstawiono na Rys. 2.

Dane zaprezentowane na Rys. 2 potwierdzają skuteczność działania formulacji mającej na celu indukcję kiełkowania spor. Aktywność metaboliczna komórek wyrażona za pomocą stopnia redukcji resazuryny jest znacznie wyższa w próbie zawierającej zarówno nośnik jak i składniki formulacji.

Literatura

[1] Toyota K, Watanabe T. Recent trends in microbial inoculants in agriculture. Microbes Environ. 2013;28:403-4.

[2] Haruta S, Kanno N. Survivability of Microbes in Natural Environments and Their Ecological Impacts. Microbes Environ. 2015;30:123-5.

[3] Abiala MA, Odebode AC, Hsu SF, Blackwood CB. Phytobeneficial Properties of Bacteria Isolated from the Rhizosphere of Maize in Southwestern Nigerian Soils. Appl Environ Microbiol. 2015;81:4736-43.

[4] Ikenaga M, Sakai M. Application of Locked Nucleic Acid (LNA) oligonucleotide-PCR clamping technique to selectively PCR amplify the SSU rRNA genes of bacteria in investigating the plant-associated community structures. Microbes Environ. 2014;29:286-95.

[5] Segev E, Smith Y, Ben-Yehuda S. RNA dynamics in aging bacterial spores. Cell. 2012;148:139-49.

[6] Setlow P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 2014;196:1297-305.

[7] Yanez-Mendizabal V, Vinas I, Usall J, Canamas T, Teixidó N. Endospore production allows using spray-drying as a possible formulation system of the biocontrol agent Bacillus subtilis CPA-8. Biotechnology Letters. 2012;34:729-35.

[8] Moir A. How do spores germinate? Journal of Applied Microbiology. 2006;101:526-30.

[9] Atluri S, Ragkousi K, Cortezzo DE, Setlow P. Cooperativity between different nutrient receptors in germination of spores of Bacillus subtilis and reduction of this cooperativity by alterations in the GerB receptor. J Bacteriol. 2006;188:28-36.

[10] Njoku Dl, Guo Q, Dai W, Chen JL, Mao G, Sun Q, et al. The multipurpose application of resazurin in micro-analytical techniques: Trends from the microbial, catalysis and single molecule detection assays. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2023;167:117288.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób utrwalania preparatu mikrobiologicznego, znamienny tym, że zawiesinę spor bakteryjnych uzyskanych po zakończeniu 72 h hodowli prowadzonej w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce lub w bioreaktorze wiruje się, a następnie pozyskany w ten sposób osad miesza się wysterylizowanymi termicznie roztworami: nośnika i formulacji przy czym formulacja jako substancje indukujące kiełkowanie spor zawiera co najmniej L-alaninę w stężeniu od 4.45 g/L do 17.81 g/L, korzystnie 8.9 g/L oraz L-asparaginę w stężeniu od 6.06 g/L do 26.42 g/L, korzystnie 13.21 g/L, a nośnikiem formulacji jest roztwór maltodekstryny zawierającej w swoim w składzie od 80,5% do 97% polisacharydów, korzystanie 97%, stężenie roztworu maltodekstryny stosowanej w charakterze nośnika wynosi od 100 g/L do 300 g/L, korzystanie 200 g/L, przy czym hodowle produkcyjne w kolbkach jak i bioreaktorze prowadzi się przez 3 doby w temperaturze 30°C, jako inokulum stosuje się 24 godzinną hodowlę Peanibacillus polymyxa AW 2.12, 5% objętości hodowli właściwej, po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany zawierający komórki w formie spor tj. 1 litr hodowli w kolbkach stożkowych i 2 L w hodowli bioreaktorowej, odwirowuje się na wirówce laboratoryjnej przy 5000 x g przez 20 min, po zakończeniu wirowania zlewa się klarowny płyn pohodowlany znad osadu, po czym do naczynia wirówkowego zawierającego koncentrat biomasy komórek dodaje się dwukrotnie stężony roztwór nośnika - maltodekstryny o stężeniu 400 g/L, korzystnie o 97% zawartości polisacharydów, w ilości 0,25 L dla hodowli kolbkowych i 0,5 L dla hodowli bioreaktorowych oraz dwukrotnie stężony roztwór składników formulacji zawierającej substancje wspomagające kiełkowanie spor: L-alaninę w stężeniu 17.8 g/L, L-asparaginę w stężeniu 26.42 g/L, oraz substancje promujące wzrost komórek: bulion odżywczy w stężeniu 60 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu 10 g/L; chlorek sodu w stężeniu 16 g/L i glukozę krystaliczną w stężeniu 2 g/L - w ilości 0,25 L dla hodowli kolbkowych i 0,5 L dla hodowli bioreaktorowych, zawiesinę komórek miesza się z wymienionymi roztworami za pomocą mieszadła mechanicznego typu śruba okrętowa (10 min, temp. 20°C, 250 obr/min) i zawiesinę rozlewa się na tace wykonane ze stali nierdzewnej o głębokości 2.5 cm i grubości warstwy cieczy na tacy od 0.5 do 2 cm, korzystnie 1.5 cm, a przygotowany w ten sposób materiał poddaje się procesowi suszenia sublimacyjnego tak, że proces liofilizacji prowadzi się w kilku etapach: zamrażanie zawiesiny spor w temp. od -50°C do -20°C, korzystnie w -35°C, suszenie pod ciśnieniem 5 Pa i w temperaturze 0°C przez 12 h (I faza suszenia), suszenie pod próżnią i w temperaturze 15°C przez 24 h (II faza suszenia); dosuszanie pod próżnią i w temperaturze 20°C przez 12 h (III faza procesu suszenia), po zakończeniu procesu suszenia preparat pakuje się bez dalszej obróbki do zgrzewanego opakowania barierowego wykonanego z wielowarstwowego laminatu tworzyw sztucznych oraz folii aluminiowej, po czym produkt przechowuje się w temperaturze 20°C aż do użycia.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że korzystnie formulacja zawiera dodatkowo bulion odżywczy w stężeniu od 10 g/L do 50 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu od 2 g/L do 10 g/L; chlorek sodu w stężeniu od 6 g/L do 10 g/L oraz glukozę krystaliczną w stężeniu od 0.5 g/L do 1.5 g/L.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że formulacja zawiera dodatkowo bulion odżywczy w stężeniu 30 g/L; pepton bakteriologiczny w stężeniu 5 g/L; chlorek sodu w stężeniu 8 g/L oraz glukozę krystaliczną w stężeniu 1 g/L.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że w pierwszym etapie sposobu bakterie hoduje się na podłożu o pH 7.0, zawierającym: bulion wzbogacony 16 g/L; KCI 2 g/L; MgSO4 x 7H2O 0.5 g/L; Ca(NOs)2 x 4H2O 0.24 g/L; MnCI2 x 4H2O 0.0125 g/L; FeSO4 x 7H2O 0.0005 g/L oraz glukozę 1 g/L, hodowle prowadzi się w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce rotacyjnej (250 obr/min, temp. 30°C, czas 72 h), w warunkach aerobowych, tj. napowietrzanie 1 vvm, poziom nasycenia tlenem 30% regulowany w kaskadzie z obrotami mieszadła w zakresie 100-1000 obr/min.

PL 247975 Β1
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że w pierwszym etapie sposobu bakterie hoduje się na podłożu o pH 7.0, zawierającym: bulion wzbogacony 16 g/L; KCI 2 g/L; MgSO₄ x 7H₂O 0.5 g/L; Ca(NO₃)₂ x 4H₂O 0.24 g/L; MnCI₂ x 4H₂O 0.0125 g/L; FeSO₄ x 7H₂O 0.0005 g/L oraz glukozę 1 g/L, hodowle prowadzi się w bioreaktorze w pożywce o objętości 2 L, przy stałym pH regulowanym za pomocą roztworów NaOH (20% w/w) oraz H₃PO₄ (10% w/w), dozowanych w oparciu o sygnał z pochodzący z elektrody pH umieszczonej w bioreaktorze.