PL247632B1

PL247632B1 - Sposób otrzymywania bogatego w białko wodnego ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) oraz jego hydrolizatu oraz zastosowanie ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) i jego hydrolizatu do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium

Info

Publication number: PL247632B1
Application number: PL445190A
Authority: PL
Inventors: Urszula Kosikowska; Sylwia Andrzejczuk; Dorota Pietras-Ożga; Katarzyna Michalak; Stanisław Winiarczyk
Original assignee: Univ Medyczny W Lublinie; Univ Przyrodniczy W Lublinie
Priority date: 2023-06-12
Filing date: 2023-06-12
Publication date: 2025-08-11
Also published as: PL445190A1

Abstract

Wynalazek dotyczy otrzymywania ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) o działaniu antyoksydacyjnym oraz przeciwgrzybiczym wobec grzybów pleśniowych, bez potrzeby frakcjonowania czy separacji produktu na pojedyncze składowe lub ich grupy. Zastosowanie wody jako rozpuszczalnika ekstrahującego umożliwia łatwe i nietoksyczne wytworzenie ekstraktu oraz hydrolizatu. Sposób według wynalazku polega na tym, że przed ekstrakcją oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20°C do -80°C, korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem, korzystnie trzykrotnie, następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50°C do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w/w od 1:5 do 1:15, korzystnie 1:10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50°C do 80°C, korzystnie 60°C, stale mieszając przez 1,5 do 2-ch godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu. Korzystnie zatężony ekstrakt poddaje się hydrolizie enzymatycznej za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie od 5% do 20%, optymalnie 10%, a reakcję prowadzi się w warunkach pH od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35°C do 50°C, korzystnie 40°C, w czasie od 1 do 3 godzin, a po zakończeniu reakcji otrzymuje się hydrolizat bogaty w białka oraz peptydy o aktywności antyoksydacyjnej i przeciwdrobnoustrojowej, szczególnie antymikotycznej wobec grzybów pleśniowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bogatego w białko wodnego ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) oraz jego hydrolizatu, o właściwościach antyoksydacyjnych i aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec grzybów pleśniowych oraz jego zastosowanie do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.

W znanym stanie techniki opisywano endogenne białka i peptydy, w tym stosowane do regulowania (obniżania) ciśnienia krwi np. u pacjentów z nadciśnieniem oraz o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Były to białka i peptydy bezpośrednio wyekstrahowane w różnych temperaturach ze świeżych owocników grzybów¹, wysuszonych owocników w formie proszków² lub sfermentowanych proszków³przy użyciu wody destylowanej o temp. 4°C/25°C⁴, 30°C/50°C⁵, i 95°C/100°C⁶, jak również z wykorzystaniem buforu Tris-HCl⁷, 0,1 M buforu HEPES-KOH (pH 7,5)8, roztworu NaOH (pH 12,0)9, roztworu 0,15 M NaCl¹⁰, acetonu¹¹, a także etanolu lub metanolu^{5, 12} oraz 5% (v/v) zmrożonego kwasu octowego z 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolem¹³.

Większość grup badawczych skupiała się na pełnych ekstraktach otrzymywanych z grzybów różnymi metodami i z użyciem często skomplikowanych, czasochłonnych i materiałochłonnych procedur, szczególnie z wykorzystaniem rozpuszczalników organicznych, w tym alkoholowych (głównie metanol i/lub etanol). Zgodnie ze znanym stanem techniki, do dnia dzisiejszego pojawiła się niewielka liczba odniesień literaturowych dotyczących hydrolizy białek grzybowych i otrzymywania z nich aktywnych biologicznie peptydów. Temat hydrolizy enzymatycznej białek grzybowych został przedstawiony w publikacji And i Ismail-Fitry¹⁴ dotyczącej przydatności peptydów otrzymywanych na bazie hydrolizy bromelainą. Enzym ten wykorzystywano do cięcia białek z takich grzybów jak: shitake, boczniak ostrygowaty, grzyby shimeji i płomiennica zimowa w celu stworzenia najbardziej aromatycznego proszku kulinarnego. Autorzy przedstawili stopnie hydrolizy (DH, ang. degree of hydrolysis), wahające się w zakresie od 54% do 67%. Kolejną pozycją dotyczącą pozyskiwania hydrolizatów grzybowych jest publikacja z zastosowaniem proteazy¹⁵. W tej pozycji literaturowej, 0,1% (w/w) roztwór proteazy ProtamexTM był wykorzystywany do pozyskiwania peptydów z podstawczaka pochwiaka wielkopochwowego (Volvariella volvaceae). Reakcję prowadzono w trzech różnych temperaturach i różnych czasach trwania reakcji, co dało ostatecznie stopień hydrolizy sięgający 25%. Skuteczność trawienia proteinazą K, pepsyną i trypsyną przy różnych stężeniach enzymów (0,05%, 0,10%, 0,15%) i temperaturach (30°C, 40°C i 50°C) oraz odstępach czasu (60, 90 i 120 min) była również badana przez zespół Goswami i in.¹⁶. Materiałem do badań prowadzonych przez tę grupę badawczą były suszone owocniki boczniaka ostrygowatego Pleurotus ostreatus, uprawiane na słomie ryżowej. Przedstawione w tej publikacji dane na temat optymalizacji procesu enzymatycznej hydrolizy wyraźnie pokazały, że najbardziej odpowiednią pod względem uzyskiwanej wartości DH jest reakcja z użyciem 0,15% proteinazy K, w temperaturze 50°C przez 2 godziny. Produkt otrzymany przez Goswami i in.¹⁶ w drodze hydrolizy białek grzybowych charakteryzował się wysoką wydajnością pienienia, stabilnością piany oraz właściwościami emulgującymi. Podobne wartości DH uzyskał zespół Farzaneh i in.¹⁷ podczas trawienia trypsyną dwóch grzybów z gatunku podstawczaków - pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus bisporus) i z gatunku workowców - trufli pustynnej (Terfezia clavery). We wspomnianym artykule otrzymana wartość DH mieściła się w zakresie od 7,50 do 20,10%, a przygotowywanie badanych próbek różniło się występowaniem lub brakiem etapu blanszowania.

Ze stanu techniki znanych jest kilka sposobów pozyskiwania surowca, ekstraktów i niektórych związków, w tym polisacharydów, z boczniaka ostrygowatego. Jeden ze sposobów hodowli boczniaka ostrygowatego, opracowany przez Zhao Yuncai, został objęty ochroną patentową w roku 2015 [patent CN104342467 (A)]. Z publikacji tego patentu znany jest również sposób ekstrakcji surowego polisacharydu z Pleurotus ostreatus. Przedstawiona w tym patencie metoda obejmowała zarówno etap przygotowania świeżej grzybni, jak również właściwy proces enzymolizy z użyciem papainy. Sposób otrzymywania polisacharydu oparty został na odpowiednim rozdrabnianiu grzybni w ciepłej wodzie, której pH zostało doprowadzone do konkretnej wartości (brak konkretnych danych na temat wartości pH). Ekstrakt następnie był poddawany odwirowaniu, zagęszczaniu oraz filtrowaniu.

W kolejnym zgłoszeniu patentowym UA83530 (C2) zgłoszonym przez Kucherenko Natalię Vaylvina, Demianenko Vikrora Hryhorovych oraz Stolietov Yurii Vitaliiovych w 2008 roku przedstawiono sposób wytwarzania kompleksu białkowo-polisacharydowego o działaniu hipolipidemicznym otrzyma nego przez co najmniej trzykrotną ekstrakcję wodą grzyba Pleurotus ostreatus przez 60 minut w temperaturze 50-60°C. Ekstrakt redukowano do 1/30 początkowej objętości i wytrącano 96% etanolem. Zdaniem autorów patentu, otrzymana substancja biologicznie czynna wykazująca aktywność hipolipidemiczną może być stosowana jako aktywny składnik produktów farmaceutycznych hipolipidemicznych.

W publikacji zgłoszenia patentowego CN106261444 (A) autorstwa Liu Bin, Wu Linxiu, Chen Yixuan, Liu Xiaoyan oraz Lu Xin z 2017 roku opisano sposób wytwar zania skoncentrowanego napoju z mieszaniny następujących grzybów: pieczarka dwuzarodnikowa (Agaricus biporus), boczniak ostrygowaty (Pleurotus ostreatus), Ganoderma lucidum, Pleurotus geesteranus, boczniak mikołajkowy (Pleurotus eryngii), polownica południowa (Agrocybe cylindracea) oraz grzyb bambusowy. W patencie przedstawiono kolejne etapy ekstrakcji koncentratu grzybowego (mycie, rozgniatanie i dodawanie piwa) w celu uzyskania koncentratu grzybowego. Tak otrzymany ekstrakt bogaty w białko i polisacharydy, poddawano homogenizacji, sterylizacji oraz puszkowaniu termicznemu. Skoncentrowany napój sporządzony tą metodą jest bogaty w składniki odżywcze i posiada niepowtarzalny smak oraz charakteryzuje się wysoką skutecznością przeciwutleniającą.

Celem wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) o działaniu antyoksydacyjnym oraz przeciwgrzybiczym wobec grzybów pleśniowych, bez potrzeby frakcjonowania czy separacji produktu na pojedyncze składowe lub ich grupy. Zastosowanie wody jako rozpuszczalnika ekstrahującego umożliwia łatwe i nietoksyczne wytworzenie ekstraktu oraz hydrolizatu. Ponadto w procesie poddawania ekstraktu hydrolizie enzymatycznej zastosowano proteazę serynową pochodzenia zwierzęcego, która okazała się korzystna do tego ekstraktu.

Sposób otrzymywania ekstraktu i jego hydrolizatu został zmodyfikowany w porównaniu z metodyką znaną ze stanu techniki o zastosowanie ciekłego azotu lub procesu liofilizacji na etapie przygotowania surowca z boczniaka ostrygowatego do rozdrobnienia oraz dobór optymalnej temperatury ekstrakcji białek endogennych. Ponadto w procesie hydrolizy ekstraktu zastosowano proteazę serynową pochodzenia zwierzęcego, która okazała się korzystna.

Sposób według wynalazku polega na tym, że przed ekstrakcją oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w/w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, korzystnie 60°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.

Korzystnie supernatant odwirowuje się przy obrotach od 3000 do 6000, korzystnie 5000 xg, w temperaturze 4°C.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania hydrolizatu z ekstraktu według wynalazku polegający na tym, że zatężony ekstrakt poddaje się hydrolizie enzymatycznej za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie od 5 do 20%, optymalnie 10%, a reakcję prowadzi się w warunkach pH od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35 do 50°C, korzystnie 40°C, w czasie od 1 do 3 godzin, a po zakończeniu reakcji otrzymuje się hydrolizat bogaty w białka oraz peptydy o aktywności antyoksydacyjnej i przeciwdrobnoustrojowej, szczególnie antymikotycznej wobec grzybów pleśniowych.

Korzystnie po zakończeniu hydrolizy prowadzi się dezaktywację enzymu w temperaturze od 95 do 105°C, korzystnie 98°C, w czasie 10 do 15 minut.

Wynalazek dotyczy także ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy oraz jego hydrolizatu otrzymanych według wynalazku do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest otrzymanie zmodyfikowaną metodą produktu końcowego ekstrakcji z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) o działaniu przeciwgrzybiczym obejmującym wpływ bójczy na grzyby pleśniowe a zwłaszcza Aspergillus i Penicillium, a także właściwości antyoksydacyjne, bez potrzeby frakcjonowania czy separacji produktu poddawanego ekstrakcji na pojedyncze składowe lub ich grupy. Zastosowanie ciekłego azotu do rozdrobnienia owocnika umożliwia uzyskanie w szybki i efektywny sposób surowca rozdrobnionego (roztartego do proszku), dzięki czemu proces ekstrakcji przebiega szybko i efektywnie. Sposobem według wynalazku otrzymuje się ekstrakt lub jego hydrolizat o właściwościach bioaktywnych.

W procesie hydrolizy ekstraktu zastosowano proteazę serynową pochodzenia zwierzęcego, która okazała się korzystna z uwagi na zgodność miejsc jej hydrolizowania wiązań peptydowych w stosunku do składu aminokwasowego.

Zastosowanie wody jako rozpuszczalnika ekstrahującego umożliwia łatwe i nietoksyczne wytworzenie ekstraktu oraz hydrolizatu.

Rozdrobniony surowiec z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) może być użyty do pozyskiwania białek endogennych, z których w wyniku hydrolizy z zastosowaniem proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, otrzymuje się białka oraz peptydy wykazujące właściwości antyoksydacyjne i przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie antymikotyczne wobec grzybów pleśniowych. Otrzymany ekstrakt oraz jego hydrolizat mogą znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu, w szczególności do wspomagania profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe jako w pełni naturalny konserwant żywności, kosmetyków oraz wyrobów medycznych i farmaceutycznych, będący alternatywą do powszechnie stosowanych w tym celu substancji syntetycznych i związków chemicznych wykorzystywanych do wzbogacania produktów lub ich konserwacji.

Przedmiot wynalazku objaśniony jest bliżej w przedstawionych poniżej przykładach wykonania.

Jak wykazano warunkami sprzyjającymi ekstrakcji jest zamrożenie i roztarcie owocników poprzedzone kilkukrotnym zanurzeniem ich w ciekłym azocie lub alternatywnie, przeprowadzenie liofilizacji przed etapem ekstrakcji.

Przykład 1.

Przed przystąpieniem do procesu ekstrakcji, owocniki oczyszczano, dzielono na mniejsze fragmenty i mrożono w temperaturze -80°C. Zamrożone owocniki umieszczano w tyglu ceramicznym i zalewano ciekłym azotem. Po odparowaniu azotu, materiał powtórnie zalewano ciekłym azotem i tak postępowano trzykrotnie. Następnie, zamrożone owocniki rozcierano celem rozdrobnienia oraz rozbicia ściany komórkowej grzyba. Roztarty proszek umieszczano w zlewce z mieszadłem magnetycznym, zalewano wodą w : w, 1 : 10 i ogrzewano w temperaturze 60°C. Po dwóch godzinach reakcji, mieszaninę chłodzono do temperatury 30°C, umieszczano w falkonach i odwirowywano przez 20 minut w temperaturze 4°C przy obrotach 5000 xg. Uzyskany supernatant zlewano i poddawano dziesięciokrotnej koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego. W wyniku powyższego procesu uzyskany został materiał o następującym składzie białkowo-peptydowym: stężenie białka 6,68 mg/mL (0,0305 - błąd standardowy średniej) i stężenie peptydów 2,32 mg/mL (0,009 - błąd standardowy średniej).

Przykład 2.

Owocniki grzyba boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) przed ekstrakcją oczyszczone i pocięte na mniejsze fragmenty zamrażano na czas 24 h w temperaturze -80°C w celu przygotowania ich do liofilizacji. Proces liofilizacji prowadzono w temperaturze -45°C, przy ciśnieniu wynoszącym 5 Pa, aż do uzyskania stałej masy liofilizatu. Następnie zliofilizowane i rozdrobnione (roztarte) owocniki zalewano wodą [w : w 1 : 10] i ogrzewano w temperaturze 60°C, stale mieszając przez 2 godziny, a następnie chłodzono do temperatury 30°C, odwirowywano w temperaturze 4°C, przy obrotach 5000 xg, a uzyskany supernatant zlewano i poddawano koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.

Przykład 3.

Ekstrakt otrzymany sposobem jak w przykładzie 1 i 2 poddano hydrolizie poprzez dodatek proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego w ilości 10% wobec stężenia białka w ekstrakcie w ilości 15 mg/mL. Po dodaniu enzymu, mieszaninę ogrzewano do 40°C i ustalano pH na poziomie 8,0. Po dwóch godzinach reakcję wstrzymywano poprzez zakończenie hydrolizy przez 10-minutowe ogrzewanie mieszaniny w temperaturze 95°C. Po ochłodzeniu, hydrolizat umieszczano w falkonach i odwirowywano przez 20 minut w temperaturze 4°C przy obrotach 5000 xg. Supernatant zlewano i poddawano dziesięciokrotnej koncentracji przy użyciu koncentratora próżniowego.

P rzy kład 4.

Mieszanina o wysokiej zawartości białka oraz jej hydrolizat wykazują także właściwości antyoksydacyjne. Celem zbadania właściwości antyoksydacyjnych wykonywano badanie wygaszenia kationorodnika ABTS*+. Aby ocenić zdolność wygaszania rodnika DPPH* zastosowano zmodyfikowaną metodę Brand-Williamsa. W tym celu użyto 0,5 mM roztworu rodnika rozcieńczonego etanolem do wartości

PL 247632 BI absorbancji 0,9 przy długości 517 nm. Zdolności antyoksydacyjne wyznaczono na podstawie ubytku koloru próby otrzymanej przez zmieszanie 1 mL etanolu z 1 mL rodnika przygotowanego w powyższy sposób oraz z 1 mL próby grzybowej. Pomiar absorbancji wykonano po 30-minutowej inkubacji w ciemnym miejscu dla długości fali 517 nm. Procent inhibicji obliczono według poniższego wzoru:

% DPPH* inhibicji = [(Abs kontrola - Abs próby)/Abs kontrola] x 100

Aby ocenić zdolność wygaszania kationorodnika ABTS^,+ zastosowano roztwór nadsiarczanu potasu i kationorodnika. Po całonocnej inkubacji powyższy roztwór rozcieńczono buforem fosforanowym do wartości absorbancji równej 0,7 przy długości fali 734 nm. Zdolności antyoksydacyjne wyznaczono na podstawie ubytku koloru próby otrzymanej przez zmieszanie 1 mL rodnika przygotowanego w powyższy sposób oraz 50 pL próby ekstraktu bądź hydrolizatu. Pomiar absorbancji wykonano po 6-minutowej inkubacji w ciemnym miejscu dla długości fali 734 nm. Procent inhibicji obliczono według poniższego wzoru:

% ABTS^,+ inhibicji = [(Abs kontrola - Abs próby)/Abs kontrola] *100

Pomiary wykonano dla serii rozcieńczeń ekstraktów i hydrolizatów w zakresie stężeń białek i peptydów: 0,25-8 mg/mL dla wygaszenia kationorodnika ABTS^,+ oraz 0,1625-20 mg/mL dla wygaszenia rodnika DPPH*.

Określano procent inhibicji rodnika (Rys. 1.) i porównywano go z wartościami uzyskanymi dla liofilizowanych owoców o powszechnie znanych właściwościach przeciwutleniających. Na podstawie uzyskanych danych wyznaczono wartość parametru IC50 dla danego rodnika, który określa stężenie antyoksydantu powodujące spadek początkowego stężenia rodnika o 50% (Tab. 1.):

Tab. 1. Wartości IC50 uzyskane dla liofilizatów owoców o powszechnie znanych właściwościach przeciwutleniających oraz badanego ekstraktu i hydrolizatu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus)

Próba	IC50 ABTS·[mg/mL]	IC50 DPPH’ [mg/mL]
boczniak ostrygowaty ekstrakt	4,300,039	1,540,021
boczniak ostrygowaty hydrolizat	2,520,020	0,360,011
borówka	1,190,035	0,270,020
czarna porzeczka	2,780,045	0,390,025
Malina	2,630,315	0,310,021
Jabłko	4,620,060	1.290,030

Na rysunku na Fig. 1 przedstawiono inhibicję rodnika DPPH* oraz kationorodnika ABTS^,+ dla ekstraktu (POE) oraz hydrolizatu (POH) otrzymanego z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus).

Na Fig. 2 pokazano ocenę wartości MIC ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) wobec wzorcowych szczepów grzybów pleśniowych z rodzaju Aspergillus i Penicillium.

Zaś Fig. 3 pokazano ocenę mikroskopową wpływu badanego ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) w stosunku do wzorcowych szczepów grzybów pleśniowych z rodzaju Aspergillus (powiększenie 2000χ, automatyczny mikroskop świetlny odwrócony Olympus DP22, oprogramowanie CellSens Dimensions 2.3 (Olympus Corporation).

Aktywność antyoksydacyjną ekstraktów i hydrolizatów będących przedmiotem wynalazku oceniano metodami badającymi procent wygaszenia wolnych rodników: kationorodnika ABTS^,+ [siarczan 2,2’azyno-di-(3-etylobenztiazoliny)] oraz rodnika DPPH* [2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl]. Jak wynika z uzyskanych danych, powyższy ekstrakt i hydrolizat charakteryzowała zróżnicowana zdolność wygaszania wobec kationorodnika ABTS oraz rodnika DPPH* wahająca się od 50% do niemal 100%.

Przykład 5.

Badano wpływ będących przedmiotem wynalazku ekstraktu i hydrolizatu otrzymanych zmodyfikowaną metodą hydrolizy enzymatycznej z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) na wzrost grzybów pleśniowych z rodzajów Aspergillus i Penicillium. Przed wykonaniem oznaczeń hodowlę grzybów pleśniowych prowadzono in vitro w warunkach tlenowych na stałym podłożu Sabourauda w temperaturze 35 ± 2°C przez okres 5 dni. Do badań wykorzystywano szczepy wzorcowe z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (ATCC): Aspergillus fumigatus ATCC 46645, Aspergillus niger AtCc 16404, Penicillium chrysogenum ATCC 10106, będące w kolekcji muzealnej Katedry i Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Aktywność badanych ekstraktów i hydrolizatów otrzymanych w wyniku hydrolizy enzymatycznej oceniano metodą seryjnych mikrorozcieńczeń w podłożu płynnym, zgodnie z rekomendacjami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST) z 2023 roku¹⁸. W tym celu zastosowano płytki titracyjne 96-dołkowe. Do świeżej hodowli grzybów pleśniowych dodawano badany ekstrakt boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) w postaci homogennej zawiesiny oraz dostępny komercyjnie lek - nystatynę (kontrola dodatnia).

Podczas eksperymentu sporządzano roztwór podstawowy 50 mg badanego ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) poprzez jego rozpuszczenie w 1 mL dimetylosulfotlenku (DMSO). Następnie, z roztworu podstawowego przygotowywano wyjściowy roztwór o stężeniu 32 mg/mL w jałowym płynnym podłożu Mueller-Hinton (MHB, Biomaxima) wzbogaconym 2% glukozy (Biocorp), alternatywnie wykorzystywanym do badania wrażliwości grzybów pleśniowych na środki przeciwgrzybicze¹⁹’ ^{20, 21}. Do pierwszych dołków płytki wielodołkowej dodawano pipetą automatyczną po 200 μL ekstraktu w stężeniu 32 mg/mL, a do pozostałych dołków po 100 μL jałowego płynnego podłoża, zachowując przy tym warunki aseptyczne. Zawartość dołków dokładnie mieszano i wykonywano seryjne rozcieńczenia za pomocą wielokanałowej pipety automatycznej. Dzięki temu uzyskano podwójnie malejące stężenia badanych ekstraktów i hydrolizatów w zakresie 0,0156-32 mg/L. Następnie, przygotowywano zawiesiny badanych grzybów pleśniowych. W tym celu, za pomocą zwilżonej jałowej wymazówki pobierano mikrokonidia do jałowej probówki zawierającej 5 mL jałowej wody destylowanej, zawiesinę wirowano przez 15 sekund, a następnie przenoszono do sterylnej strzykawki z filtrem o średnicy porów 11 μm, filtrowano i zbierano do sterylnej probówki. Sporządzoną zawiesinę doprowadzano do gęstości 0,5 w skali McFarlanda (5 χ 10⁵ CFU/mL; CFU: colony forming units - jednostki tworzące kolonie) w jałowym roztworze 0,85% NaCl (Biomerieux). Tak uzyskane zawiesiny badanych drobnoustrojów, rozcieńczano w jałowym podłożu MHB z 2% glukozą do uzyskania gęstości końcowej odpowiadającej 5 χ 10⁶ CFU/mL i wprowadzano do wszystkich dołków płytki w objętości 2 μL za pomocą pipety automatycznej. Równocześnie z oznaczeniami aktywności ekstraktu w stosunku do badanych szczepów grzybów z rodzaju Aspergillus i Penicillium, przeprowadzano: (a) kontrolę żywotności badanych szczepów grzybów poprzez dodanie 2 μL rozcieńczonej zawiesiny do trzech dołków zawierających czyste podłoże MHB z 2% glukozą dla każdego szczepu, (b) kontrolę czystego podłoża poprzez umieszczenie w dołkach płytki 96-dołkowej 100 μL jałowego podłoża bez dodatku badanych ekstraktów i hydrolizatów oraz (c) kontrolę badanego ekstraktu i hydrolizatu przy tej samej serii rozcieńczeń bez dodatku zawiesiny mikroorganizmów.

Przygotowane w ten sposób mikropłytki, inkubowano w temperaturze 35 ± 2°C przez 5 dni w warunkach tlenowych. Po upływie tego czasu, dokonywano odczytu wzrostu drobnoustrojów w poszczególnych dołkach płytki przy użyciu czytnika spektrofotometrycznego Bio -Tek Elx800 (Biokom, Polska) przy długości fali 570 nm oraz obserwacji makroskopowej widocznego zmętnienia. Następnie, pomiary przetwarzano z udziałem programu komputerowego Gen5 v er. 3.03.14 (Biokom, Polska). O wzroście grzybów pleśniowych świadczyło widoczne wzrokowo zmętnienie w studzienkach płytki. Działanie badanego ekstraktu i hydrolizatu w stosunku do szczepów Aspergillus i P enicillium spp. oceniano na podstawie wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost grzybów (MIC) oraz minimalnego stężenia grzybobójczego (MFC). Za wartość MIC uznawano stężenie b adanych substancji w dołkach, w których zaobserwowano >90% redukcję wzrostu grzybów. Najmniejsze stężenie ekstraktu i hydrolizatu, przy którym stwierdzano brak wzrostu 99,9% grzybów pleśniowych uznawano za wartość minimalnego stężenia grzybobójczego (MFC). Na podstawie otrzymanych wyników i w oparciu o współczynnik MFC/MIC, oznaczano aktywność bójczą (MFC/MIC < 4) lub statyczną (MFC/MIC > 4) testowanego ekstraktu i hydrolizatu wobec badanych grzybów pleśniowych. Otrzymane dane przedstawiono w Tabeli 2.

PL 247632 BI

Tab. 2. Porównanie aktywności przeciwgrzybiczej wobec Aspergillus spp. i Penicillium spp. badanego ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) otrzymanego metodą będącą przedmiotem wynalazku

Szczep	Badany ekstrakt
MIC [pg/mL ]	MFC [pg/mL]	MFC/M IC	efekt działań ia
Aspergillus fumigatus ATCC 46645	1000	1000	1	(+)
Aspergillus niger ATCC 16404	8000	8000	1	(+)
Penicillium chrysogenum ATCC 10106	8000	8000	1	(+)

Objaśnienia: (+) - efekt grzybobójczy

Literatura:

1. Lau, C. C. et al. Novel angiotensin l-converting enzyme inhibitory peptides derived from edible mushroom Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach identified by LC-MS/MS. Food Chem. 148, 396 (2014).

2. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).

3. He, H. et al. The Hepatoprotective Effects of Ganoderma Lucidum Peptides Against Carbon Tetrachloride-lnduced Liver Injury in Mice. J. Food Biochem. 32, 628 (2008).

4. Geng, X. et al. ATricholoma matsutake Peptide with Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory and Antioxidative Activities and Antihypertensive Effects in Spontaneously Hypertensive Rats. Sci. Rep. 6, (2016).

5. Jang, J.-H. et al. Characterisation of a new antihypertensive angiotensin l-converting enzyme inhibitory peptide from Pleurotus cornucopiae. Food Chem. 127, 412 (2011).

6. Choi, H. S. et al. Angiotensin l-converting enzyme inhibitor from Grifola frondosa. Food Res. Int. 34, 177 (2001).

7. Mishra, J. et al. Antibacterial Natural Peptide Fractions from Indian Ganoderma lucidum. Int. J. Pept. Res. Ther. 24, 543 (2018).

8. Takakura, Y. et al. Novel avidin-like proteins with Iow isoelectric points from shiitake mushroom (Lentinula edodes). J. Biosci. Bioeng. 121,420 (2016).

9. Zhang, Q. et al. Improvement of antioxidant activity of Morchella esculenta protein hydrolysate by optimized glycosylation reaction. J. Food 16, 238 (2018).

10. Zheng, S. et al. A novel alkaline protease from wild edible mushroom Termitomyces albuminosus. Acta Biochim. Pol. 58, 269 (2011).

11. Chen, J. et al. In Vitro Antitumor and Immunomodulatory Effects of the Protein PCP-3A from Mushroom Pleurotus citrinopileatus. J. Agric. Food Chem. 58, 12117 (2010).

12. Sillapachaiyaporn, C. et al. HIV-1 Protease and Reverse Transcriptase Inhibitory Activities of Curcuma aeruginosa Roxb. Rhizome Extracts and the Phytochemical Profile Analysis: In Vitro and In Silico Screening. Pharmaceuticals 14, 1115(2021).

13. Kimatu, B. M. et al. Antioxidant potential of edible mushroom (Agaricus bisporus) protein hydrolysates and their ultrafiltration fractions. Food Chem. 230, 58 (2017).

14. Ang, S.-S. et al. Production of Different Mushroom Protein Hydrolysates as Potential Flavourings in Chicken Soup Using Stern Bromelain Hydrolysis. Food Technol. Biotechnol. 57, 472 (2019).

15. Palupi, N. et al. The Effect of Enzymatic Hydrolysis on The Properties of Protein Hydrolysate from Paddy Mushroom. Makara J. Technol. 14, (2010).

16. Goswami B. et al. Evaluation of bioactive properties of Pleurotus ostreatus mushroom protein hydrolysate of different degree of hydrolysis, LWT 149, 1 (2021)

17. Farzaneh, P. et al. Bioactive properties of Agaricus bisporus and Terfezia claveryi proteins hydrolyzed by gastrointestinal proteases. LWT 91, 322 (2018).

18. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zonę diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org.

19. Khadka, S. et al. Isolation, speciation and antifungal susceptibility testing of Candida isolates from various clinical specimens at a tertiary care hospital, Nepal. BMC Res. Notes 10, 218 (2017).

20. Pinto, E. et al. Evaluation of Etest performed in Mueller-Hinton agar supplemented with glucose for antifungal susceptibility testing of clinical isolates of filamentous fungi. Mycopathologia 177, 157 (2014).

21. Peano, A. et al. Methodological Issues in Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia pachydermatis. J. Fungi Basel Switz. 3, 37 (2017).

Claims

1. Sposób otrzymywania ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy, znamienny tym, że przed ekstrakcją oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, korzystnie -45°C przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w/w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, korzystnie 60°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że supernatant odwirowuje się przy obrotach od 3000 do 6000, korzystnie 5000 xg, w temperaturze 4°C.

3. Ekstrakt z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy uzyskany sposobem opisanym w zastrz. 1 do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.

4. Sposób otrzymywania hydrolizatu z ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy, znamienny tym, że najpierw otrzymuje się ekstrakt gdzie oczyszczone i podzielone na mniejsze fragmenty owocniki mrozi się w temperaturze od -20 do -80°C korzystnie -80°C, po czym zamrożony materiał zalewa się ciekłym azotem korzystnie trzykrotnie następnie rozciera na proszek lub owocniki poddaje się liofilizacji w temperaturze od -50 do -40°C, przy ciśnieniu wynoszącym od 4 do 6 Pa, optymalnie 5 Pa aż do uzyskania stałej masy liofilizatu, który dzieli się na kawałki i tak przygotowany surowiec poddaje ekstrakcji zalewając wodą w proporcji w/w od 1 : 5 do 1 : 15 korzystnie 1 : 10, przy czym proces prowadzi się w temperaturze od 50 do 80°C, stale mieszając przez 1,5 do 2 godzin, a następnie chłodzi do temperatury 30°C, odwirowuje supernatant i poddaje koncentracji, korzystnie do uzyskania dziesięciokrotnie zatężonego ekstraktu, następnie tak zatężony ekstrakt poddaje się hydrolizie enzymatycznej za pomocą proteazy serynowej pochodzenia zwierzęcego, gdzie ilość enzymu wobec białka zawartego w ekstrakcie od 5 do 20%, optymalnie 10%, a reakcję prowadzi się w warunkach pH od 7 do 9, optymalnie 8, w temperaturze w zakresie od 35 do 50°C, korzystnie 40°C, w czasie od 1 do 3 godzin, a po zakończeniu reakcji otrzymuje się hydrolizat.

5. Sposób według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że po zakończeniu hydrolizy prowadzi się dezaktywację enzymu w temperaturze od 95 do 105°C, korzystnie 98°C, w czasie 10 do 15 minut.

6. Hydrolizat z ekstraktu z boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus) bogatego w białka i peptydy uzyskany sposobem opisanym w zastrz. 4 do zastosowania we wspomaganiu profilaktyki i leczenia chorób wywoływanych przez grzyby pleśniowe Aspergillus i Penicillium.