PL245315B1 - Kompozycja bakterii, zawierająca ją szczepionka do biotyzacji gatunków roślin kapustnych oraz zawarte w niej szczepy bakterii - Google Patents
Kompozycja bakterii, zawierająca ją szczepionka do biotyzacji gatunków roślin kapustnych oraz zawarte w niej szczepy bakterii Download PDFInfo
- Publication number
- PL245315B1 PL245315B1 PL442045A PL44204522A PL245315B1 PL 245315 B1 PL245315 B1 PL 245315B1 PL 442045 A PL442045 A PL 442045A PL 44204522 A PL44204522 A PL 44204522A PL 245315 B1 PL245315 B1 PL 245315B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- vaccine
- plants
- deposited
- bacteria
- plant
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 54
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 32
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 9
- 241000219198 Brassica Species 0.000 title claims description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 91
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 22
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 17
- 241001134775 Lysinibacillus fusiformis Species 0.000 claims description 12
- 241000467496 Pseudomonas protegens Species 0.000 claims description 12
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 11
- 241000895301 Chryseobacterium lathyri Species 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 claims description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 20
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 15
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 14
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 14
- 244000221633 Brassica rapa subsp chinensis Species 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 12
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 12
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 11
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 10
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 9
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000026811 Brassica nipposinica Species 0.000 description 4
- 235000007294 Brassica nipposinica Nutrition 0.000 description 4
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 4
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 3
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 3
- 244000308180 Brassica oleracea var. italica Species 0.000 description 3
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 3
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 3
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 3
- 241001249699 Capitata Species 0.000 description 3
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 3
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 3
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 235000000183 arugula Nutrition 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241001127180 Acidovorax valerianellae Species 0.000 description 2
- 102100033806 Alpha-protein kinase 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710082399 Alpha-protein kinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 240000004073 Brassica oleracea var. viridis Species 0.000 description 2
- 241001635598 Enicostema Species 0.000 description 2
- 240000005926 Hamelia patens Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000999303 Pseudomonas lutea Species 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 241001291486 Pseudomonas rhodesiae Species 0.000 description 2
- 241000577491 Psychrobacillus psychrodurans Species 0.000 description 2
- 241000007094 Sporobolomyces ruberrimus Species 0.000 description 2
- 241001377938 Yara Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- FUIZKNBTOOKONL-DPSBJRLESA-K trisodium;5-[(e)-(3-carboxy-5-methyl-4-oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)-(2,6-dichloro-3-sulfonatophenyl)methyl]-3-methyl-2-oxidobenzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=C(C([O-])=O)C(=O)C(C)=C\C1=C(C=1C(=C(C=CC=1Cl)S([O-])(=O)=O)Cl)\C1=CC(C)=C(O)C(C([O-])=O)=C1 FUIZKNBTOOKONL-DPSBJRLESA-K 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001520750 Arabidopsis arenosa Species 0.000 description 1
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 description 1
- 241000835167 Bacillus safensis Species 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 1
- 241000168767 Brevibacillus nitrificans Species 0.000 description 1
- 241000611330 Chryseobacterium Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000223208 Curvularia Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241001600129 Delftia Species 0.000 description 1
- 244000046038 Ehretia acuminata Species 0.000 description 1
- 235000009300 Ehretia acuminata Nutrition 0.000 description 1
- 241001217893 Enterobacter ludwigii Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000557258 Lathys Species 0.000 description 1
- 241000033241 Lelliottia Species 0.000 description 1
- 241000881808 Lelliottia amnigena Species 0.000 description 1
- 241000568397 Lysinibacillus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001216686 Pseudomonas helmanticensis Species 0.000 description 1
- 241001515920 Pseudomonas koreensis Species 0.000 description 1
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001571329 Solibacillus Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N monobenzone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Description
Opis wynalazku
Dziedzina techniki
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka poprawiająca parametry wzrostowe roślin z rodzaju Kapusta, zawierająca w swoim składzie szczepy mikroorganizmów: Chryseobacterium lathyri, dla którego przypisano numer B/00412 - (wewn. UNIJAG.PL.OP280), Lysinibacillus fusiformis, dla którego przypisano numer B/00414 - (wewn. UNIJAG.PL.OP290), Bacillus cereus, dla którego przypisano numer B/00413 - (wewn. UNIJAG.PL.OP287), Pseudomonas protegens, dla którego przypisano numer B/00415 - (wewn. UNIJAG.PL.OP300). Ujawniona szczepionka może być wykorzystana do biotyzacji roślin z rodzaju Kapusta i produkcji w pełni wykształconych rozsad roślinnych przeznaczonych m.in. do bezpośredniej sprzedaży.
Stan techniki
Prace nad stworzeniem biopreparatów powodujących polepszenie parametrów jakościowych, a także zwiększenie biomasy roślin przeznaczonych do konsumpcji są istotne, nie tylko z ekonomicznego, ale także utylitarnego punktu widzenia. Prowadzone prace dotyczą również wpływu tych preparatów na zwiększenie produkcji i jakości gatunków roślin z rodziny kapustowatych, jako dużej części rynku warzyw, co ukazano np. w pracy Pawedy i in., gdzie zaobserwowano pozytywny wpływ koinokulacji grzybem z rodzaju Trichoderma i mykoryzowych grzybów arbuskularnych [1]. Rynek warzyw jest rynkiem wzrastającym i ważnym z punktu widzenia zapewnienia pożywienia ludziom, co uzasadnia poszukiwania nowych stymulantów, które mogłyby być stosowane w zastępstwie produktów opartych na solach nieorganicznych, często zanieczyszczonych metalami ciężkimi. Rozpatrując zagadnienie produkcji roślin kapustowatych, należy podkreślić, że do zapoczątkowania hodowli roślin często używa się gotowych rozsad, które można zakupić na rynku. Produkcja rozsady roślin z rodziny kapustowatych wymaga zapewnienia roślinom wysokiej jakości podłoża oraz optymalnych parametrów, takich jak temperatura, wilgotność, natężenie i barwa światła. Szczególnie istotnym czynnikiem jest zapewnienie odpowiedniej ilości składników pokarmowych młodym roślinom, co uzyskuje się poprzez ich nawożenie. Jakość rozsady jest kluczowa w kontekście skutecznego wysadzenia do gruntu, bowiem słaba rozsada trudniej przyjmuje się w gruncie oraz słabiej i później plonuje. W chwili obecnej w produkcji rozsady warzyw kapustnych stosuje się wieloetapowe nawożenie nawozami wieloskładnikowymi oraz aktywatorami rozwoju korzeni. Podkreślić należy zatem, że zastąpienie stymulantów opartych na nieorganicznych solach bioproduktami jest korzystne w aspekcie ochrony środowiska, a także stoi w zgodzie z zasadami zrównoważonego rozwoju.
Znany jest z amerykańskiego opisu patentowego nr: US 7.232.565 B2, pt.: „Use of endophytic fungi to treat plants” sposób inokulacji roślin w tym z rodzaju kapustowatych za pomocą grzybów endofitycznych, w szczególności rodzaju Curvularia w celu zwiększenia ich tolerancji na suszę, zwiększoną zawartość metali i wysoką temperaturę. Przytoczony opis patentowy różni się od niniejszego tym, że jako mikroorganizmów użyto grzybów, nie bakterii, a także cel prowadzonych badań był inny. Również nie wykorzystano tych gatunków roślin, które zostały użyte w badaniach w ramach niniejszego opisu patentowego.
Znane jest z amerykańskiego opisu patentowego nr: US 7.259.004 B1 pt.: „Endophytic Streptomycetes from higher plants with biological activity” wykorzystanie endofitycznego szczepu bakterii do produkcji związków chemicznych pozytywnie wpływających na zdolność roślin do obrony przed patogenami zarówno mikrobiologicznymi jak i roślinnymi. Zarówno szczep bakterii, jak i sposób jego wykorzystania nie wykazują podobieństwa do niniejszego opisu.
Znana jest z amerykańskiego opisu patentowego nr: US 10556839 B2 pt.: „Methods and Compositions for Improving Plant Traits” metoda zwiększania wiązania azotu w roślinie niebędącej rośliną strączkową za pomocą bakterii. In planta, bakterie wytwarzają 1 % lub więcej azotu związanego w roślinie. Sposób wykorzystania bakterii różni się znacząco od sposobu zaprezentowanego w niniejszym opisie.
Znany jest z publikacji pt.: „Growth promotion of canola (rapeseed) seedlings by a strain of Pseudomonas putida under gnotobiotic conditions” (Can. J. Microbiol, vol. 33: str.390-395) sposób inokulacji nasion rzepaku (Brassica campestris) wiążącym azot szczepem Pseudomonas putida (GR 12-2), w którym to sposobie powierzchniowo sterylizowane nasiona moczono w zawiesinie bakteryjnej przez 60 min, a następnie sterylnie wysiewano do podłoża. Hodowla roślin odbywała się w warunkach sterylnych. Inokulacja statystycznie istotnie zwiększyła długość korzeni siewek uprawianych w sterylnych wa runkach. Inokulacja nasion bakteriami niewiążącymi azotu nie wpłynęła na długość korzeni. W przedstawionej pracy, sposób inokulacji, szczep bakterii oraz sposób hodowli (warunki sterylne) odbiegają od tych prezentowanych w niniejszym opisie patentowym.
Z kolei znane jest z publikacji pt.: „Effect of bacteria on the biology of diamondback moth (Plutella xylostella) on cabbage (Brassica oleraceae VAR. Capitata) cv. Midori” (Anais da Academia Pemambucana de Ciencia Agronomica, Recife, vol. 2, str. 204-212, 2005) zastosowanie inokulacji bakteryjnej nasion roślin z rodziny kapustowatych. Prezentowana praca miała na celu sprawdzenie możliwości użycia różnych ryzobakterii promujących wzrost roślin do biologicznego zwalczania P. xylostella (Tantniś krzyżowiaczek) w kapuście odmiany Midori w okresie wegetacji. Zastosowane bakterie, sposób inokulacji a także cel pracy jest inny od tych przedstawionych w niniejszym zgłoszeniu. Ponadto wykorzystanie prezentowanych w pracy bakterii w innych gatunkach roślin, a także w innym momencie (różny czas inokulacji) nie gwarantuje uzyskania wskazanych przez autorów wyników. Może również okazać się przeciwskuteczne.
Celem wynalazku jest zapewnienie nowej metody przygotowania szczepionki do biotyzacji roślin kapustnych, korzystnie Mizuny (łac. Brassica rapa L. subsp. nipposinica (L. H. Bailey) Hanelt), Kalafiora zielonego (łac. Brassica oleracea L. convar. botyris (L.) Alef. var. botrytis cv. ‘Verde di Macerata’), Jarmużu wysokiego (łac. Brassica oleracea L. var. sabellica L. cv. ‘Halbhoher Gruner Krauser’), Kapusty chińskiej (łac. Brassica rapa L. subsp. chinensis (L.) Hanelt), Kapusty pekińskiej (łac. Brassica rapa L. var. pekinensis (Lour.) Hanelt cv. ‘Manoko F1’), Kapusty głowiastej białej (łac. Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. alba DC.), Kapusty czerwonej (łac. Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef. var. rubra (L.) Thell.) oraz zastosowania otrzymanej szczepionki w procesie hodowli do momentu uzyskania rozsad, poprzez zastosowanie wyizolowanych i wybranych mikroorganizmów, korzystnie Chryseobacterium lathyri, Lysinibacillus fusiformis, Bacillus cereus, Pseudomonas protegens. Biopreparat znacząco przyśpiesza wzrost roślin, pozytywnie oddziałuje na przyrost zarówno suchej i świeżej masy części zielonych, jak i korzeni roślin. Jego pozytywne oddziaływanie zostało zaobserwowane w warunkach bez dodatku nawozu, ale również w przypadku suplementacji roślin nawozem, gdzie jednoczesne nawożenie roślin oraz ich biotyzacja były skuteczniejsze aniżeli wyłączne nawożenie - w kontekście uzyskanej biomasy roślin. Opracowany biopreparat może zostać z powodzeniem wykorzystany w przemysłowej produkcji rozsady warzyw kapustnych, jako środek ograniczający dodatkowe nawożenie roślin bądź je wspomagający.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja bakterii zawierająca następujące szczepy bakterii: Chryseobacterium lathyri zdeponowanego w PCM pod numerem B/00412 - (wewn. UNIJAG.PL.OP280), Lysinibacillus fusiformis zdeponowanego w PCM pod numerem B/00414 - (wewn. UNIJAG.PL.OP290), Bacillus cereus zdeponowanego w PCM pod numerem B/00413 - (wewn. UNIJAG.PL.OP287), Pseudomonas protegens zdeponowanego w PCM pod numerem B/00415 - (wewn. UNIJAG.PL.OP300).
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka do biotyzacji roślin kapustnych zawierająca kompozycję określoną powyżej.
Korzystnie, szczepionka według wynalazku jest przeznaczona do przyśpieszania wzrostu roślin kapustnych, szczególnie korzystnie poprawy przyrostu masy części zielonych lub korzeni roślin.
Korzystnie, szczepionka według wynalazku ma postać zawiesiny bakterii w roztworze wodnym.
Przedmiotem wynalazku jest także szczep bakterii wybrany spośród: Chryseobacterium lathyri zdeponowanego w PCM pod numerem B/00412 - (wewn. UNIJAG.PL.OP280), Lysinibacillus fusiformis zdeponowanego w PCM pod numerem B/00414 - (wewn. UNIJAG.PL.OP290), Bacillus cereus zdeponowanego w PCM pod numerem B/00413 - (wewn. UNIJAG.PL.OP287), Pseudomonas protegens zdeponowanego w PCM pod numerem B/00415 - (wewn. UNIJAG.PL.OP300).
Wszystkie szczepy mikroorganizmów według wynalazku zostały zdeponowane zgodnie z traktatem budapesztańskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) działającej przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk z siedzibą przy ul. Rudolfa Weigla 12, 53-114 Wrocław.
Oznaczenia szczepów według wynalazku zostały podsumowane w Tabeli 1 poniżej.
PL 245315 Β1
Tabela 1
Szczepy mikroorganizmów według wynalazku
| gatunek | oznaczenie własne szczepu | Oznaczenie skrócone (patrz Figury) | nr dostępu depozytu złożonego w PCM |
| Chryseobacterium lathyri | UNIJAG.PL ΌΡ280 | OP280 | B/00412 |
| Lysinibacillus fasiformis | UNIJAG.PL.OP290 | OP290 | B/00414 |
| Bacillus cereus | UNIJAG.PL.OP287 | OP287 | B/00413 |
| Pseudomonas protegens | UNIJAG.PL.OP300 | OP300 | B/00415 |
Szczegółowy opis wynalazku
Pierwszym aspektem wynalazku jest zatem szczepionka oraz sposób przygotowania szczepionki do biotyzacji roślin poprzez połączenie czterech szczepów bakterii Chryseobacterium lathyń, Lysinibacillus fusiformis, Bacillus cereus, Pseudomonas protegens .
Kolejnym aspektem wynalazku jest natomiast biotyzacja roślin szczepionką w warunkach hodowli rozsad.
W realizacji pierwszego aspektu wynalazku, wyizolowane, oczyszczone, zidentyfikowane oraz zdeponowane w związku z niniejszym zgłoszeniem czyste kultury bakteryjne prowadzi się osobno w płynnym podłożu przeznaczonym do hodowli bakterii, wytrząsając z prędkością 120-220 obr. min-1 do uzyskania gęstości optycznej 1-2, odwirowuje, osad płucze się roztworem soli fizjologicznej, zlewając roztwór znad osadu bakterii płukanych, zawiesza wypłukany osad w roztworze soli fizjologicznej, łączy się przygotowane zawiesiny ze sobą i całość rozcieńcza się 5-12 krotnie;
W realizacji drugiego aspektu wynalazku inokuluje się rośliny w momencie wysiewu do podłoża doglebowo, używając 0,2-2 mL inokulum na roślinę, przy czym zabieg powtarza się 5-15 dni po wysiewie. Szczepionkę można stosować w podłożu glebowym o pH z zakresu 4,0-8,0. Szczepionkę można dodawać do podłoża sterylnego albo niesterylnego.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, podłożem płynnym jest sterylne podłoże bakteryjne nutrient agar (NA), którego skład przedstawia się następująco: pepton - 5 g/L; meat extract - 3 g/L; Agar - 15 g/L.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, kultury bakterii są wytrząsane z prędkością 180 obr. min-1.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, gęstość optyczna kultur OD600 wyniosła 1,8 ± 0.4
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, kultury bakterii wirowano przez 5 min (5000 g).
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, osad bakteryjny płukano dwukrotnie.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, osad bakteryjny płukano 0,9% wodnym roztworem NaCI.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, osad bakteryjny po płukaniu zawieszono w 40 mL 0,9% wodnego roztworu NaCI.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, zawiesiny kultur zmieszano i uzupełniono 0,9% roztworem NaCI do pojemności 1 L.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, przygotowaną łączną zawiesinę użyto do inokulacji roślin w ilości 1 mL inokulum na roślinę.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, rośliny inokulowano doglebowo dwukrotnie.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, pierwszą dawkę inokulum zaaplikowano w dniu wysiewu nasion.
PL 245315 Β1
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, drugą dawkę inokulum zaaplikowano drugą po 7-10 dniach od pierwszej dawki.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, szczepionkę stosuje się w podłożu glebowym o pH równym 5,5.
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, podczas przenoszenia roślin z multidoniczek do większych doniczek, rośliny inokuluje się szczepionką.
Identyfikację gatunkową przeprowadzono za pomocą technik biologii molekularnej (amplifikacja i sekwencjonowanie regionu 16S rDNA). Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu odczynników DNA Mini Kit (Syngen). Fragment 16S rDNA zamplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem primerów 27F oraz 1492R [2], wykorzystując do tego celu odczynniki DREAMTAO HS GREEN MASTER ΜΙΧ (Thermo Scientific). Parametry PCR: wstępna denaturacja w 95°C przez 3 min; 35 cykli obejmujących kolejno denaturację w 95°C przez 30 s, przyłączanie starterów w 60°C przez 30 s i elongację w 72°C przez 90 s; końcowa elongacja w 72°C przez 5 min. Obecność produktów PCR została zweryfikowana za pomocą elektroforezy agarozowej. Produkty PCR zostały zsekwencjonowane z zastosowaniem starterów 27F oraz 1492R. Sekwencje nukleotydów zostały przeanalizowane za pomocą programu Genious Prime oraz porównane z sekwencjami zamieszczonymi w bazie danych NCBI [www.ncbi.nlm.nih.gov] przy zastosowaniu algorytmu BLASTn. Wyniki identyfikacji molekularnej zostały przedstawione w tabeli 2.
Tabela 2
Wyniki identyfikacji molekularnej bakterii użytych w szczepionce
| Lp. | Szczep | Nazwa zidentyfikowanego szczepu | Sekwencja referencyjna (NCBI) | Podobieństwo |
| 1. | UNIJAG.PL.OP280 | Chryseobacterium lathyri | Chryscobacicrium lathy ri NR_115853 | 1333/1339 (99%) |
| 2. | UNIJAG.PL.OP290 | Łysin ibacillus fusiformis | Łysinibacillus fusiformis NR_112628 | 1370/1370 (100%) |
| 3. | UNIJAG.PL.OP287 | Bacillus cereus | Bacillus cereus NR115714 | 1374/1374 (100%) |
| 4. | UNIJAG.PL.OP300 | Pseudomonas protegens | Pseudomonas protegens NR_114749 | 1348/1349 (99%) |
Nieoczekiwanie okazało się, że opracowany biopreparat przyśpiesza wzrost roślin oraz wpływa na wzrost biomasy zarówno części zielonych, jak i korzeni z całkowitym wyłączeniem jakiejkolwiek dodatkowej suplementacji. Nieoczekiwanie okazało się również, że łączone zastosowanie biopreparatu oraz nawożenia przynosi również lepsze rezultaty w kontekście biomasy roślin niż samo nawożenie. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość znaczącego ograniczenia nawożenia roślin w produkcji rozsady przy zastosowaniu opracowanego biopreparatu, co przekłada się na znaczne ograniczenie kosztów produkcji. W przygotowaniu rozsady bardzo ważny jest rozwój jej systemu korzeniowego, zastosowany biopreparat skutecznie zwiększał biomasę korzeni badanych roślin. Jego zastosowanie w produkcji przemysłowej z dużym prawdopodobieństwem mogłoby całkowicie zastąpić konieczność stosowania dodatkowych preparatów wpływających na rozwój korzeni, opierających się na dolistnym podawaniu kompozycji agrochemikaliów. Biotyzacja roślin z wykorzystaniem szczepionki wymaga jedynie dwukrotnego jej podania doglebowo, co eliminuje wykonywanie dodatkowych zabiegów podczas produkcji rozsady.
Przedstawiona szczepionka wykonana sposobem według wynalazku posiada duży potencjał komercjalizacyjny i może być stosowana w uprawach roślin kapustnych. Ze względu na nieoczekiwane właściwości szczepionki w aspekcie korzystnego wpływu na parametry wzrostowe roślin może być zastosowana jako alternatywa dla powszechnie wykorzystywanych nawozów opartych na solach nieorganicznych lub użyta jako kosuplement.
Tych nieoczekiwanych właściwości otrzymanej szczepionki, bez wiązania się teorią, należy upatrywać w tym, że zastosowane w szczepionce szczepy bakterii w sposób skuteczny kolonizują co najmniej korzenie roślin, oddziałując na gospodarkę wodno-mineralną roślin. Oddziaływanie to skutkuje lepszym zaopatrzeniem rośliny w wodę oraz związki mineralne. Endofityczne bakterie będące składnikami szczepionki mogą również wpływać na równowagę fitohormonalną roślin, co z kolei powoduje zwiększenie tempa wzrostu oraz osiąganej masy przez rośliny na etapie ich wczesnego wzrostu. Co więcej, tak skonstruowana szczepionka jest aktywna podczas całej fazy wstępnej wzrostu rozsady, co skutkuje nieprzerwanym wpływem na wymienione parametry wzrostu roślin.
Krótki opis figur
Figura 1 przedstawia świeżą masę roślin porównanie roślin inokulowanych (T4) z nieinokulowanymi: A - nietraktowanymi nawozem - dawka 0, B - traktowane nawozem o stężeniu w podłożu 0,5% (m/m), C - traktowane nawozem o stężeniu w podłożu 1,0% (m/m). Gwiazdki na wykresie oznaczają różnice istotne statystycznie pomiędzy roślinami inokulowanymi i nieinokulowanymi na poziomie istotności 0.05 (*), 0.01 (**) oraz 0.005 (***).
Figura 2 przedstawia wyniki testowania wpływu pojedynczych szczepów bakterii - komponentów szczepionki T4 na wzrost kapustowatych obserwowany jako zmiana świeżej masy pędu.
Figura 3 przedstawia wyniki testowania wpływu pojedynczych szczepów bakterii - komponentów szczepionki T4 na wzrost kapustowatych obserwowany jako zmiana pola powierzchni liścia.
Figura 4 przedstawia wyniki testowania wpływu pojedynczych szczepów bakterii - komponentów szczepionki T4 na wzrost kapustowatych obserwowany jako zmiana świeżej masy korzeni.
Figura 5 przedstawia wyniki testowania wpływu pojedynczych szczepów bakterii - komponentów szczepionki T4 na wzrost kapustowatych obserwowany jako zmiana suchej masy korzeni.
Figura 6 przedstawia wyniki testowania wpływu szczepionki T3 na świeżą masę wybranych gatunków roślin.
Wybrane przygotowane i przetestowane szczepionki do biotyzacji roślin sposobem wg wynalazku przedstawiono za pomocą poniższych przykładów wykonania.
Przykład 1. Selekcja wstępna mikroorganizmów do inokulum
Celem działania było stworzenie konsorcjum mikroorganizmów posiadającego zdolność przyspieszenia wzrostu oraz poprawienia cech jakościowych roślin z rodziny Brassicaceae. Pozyskano bakterie endofityczne z naturalnie występujących populacji rzodkiewnika piaskowego (Arabidopsis arenosa (L.) Lawalree). Bakterie zostały zidentyfikowane na podstawie sekwencji nukleotydów regionu 16S rDNA. Tylko mikroorganizmy oznaczone do poziomu gatunku zostały użyte w dalszej selekcji. Według założeń, bakterie wchodzące w skład konsorcjum powinny charakteryzować się możliwie szerokim spektrum właściwości biotyzujących tj. syntezy kwasu indolilooctowego (IAA), syntezy sideroforów oraz zdolności do rozpuszczania P (ze źródeł organicznych). Dodatkowo, wykorzystano zaobserwowaną wcześniej w badaniach prowadzonych w Laboratorium Interakcji Roślin z Mikroorganizmami MCB, UJ (dane niepublikowane) synergię oddziaływania podobnych grup mikroorganizmów (np. mikroorganizmy mykoryzowe, endofity) na wzrost roślin. Według wcześniejszych obserwacji, zastosowanie w preparacie takiej grupy mikroorganizmów pozwalało zwiększyć wydajność oddziaływania mikroorganizmów na wzrost roślin w porównaniu z zastosowaniem inokulum składającego się z pojedynczych mikroorganizmów. Wykorzystanie konsorcjum mikroorganizmów w inokulum pozwala zwiększyć zakres oddziaływania szczepionki na większą liczbę gatunków roślin w związku z możliwym brakiem kompatybilności wybranych szczepów bakterii z określonym gatunkiem gospodarza. Wymienione cechy mikroorganizmów zostały zbadane przy użyciu następujących metod:
1. synteza IAA - wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas + metoda kolorymetryczna z wykorzystaniem odczynnika Salkowskiego (Gang et al. 2019);
2. synteza sideroforów - na podstawie metody Schwyn and Neilands (1987) wykorzystującej Chrome Azurol S (CAS);
3. rozpuszczanie P - na podstawie obserwacji stref przejaśnienia wokół kolonii bakterii spowodowanych rozpuszczeniem fosforanu wapnia w podłożu stałym na płytce Petriego przygotowanym wg Pikovskaya (1948).
Wyniki przeprowadzonych badań zestawiono w tabeli 3. Znakiem „+” oznaczono zdolność mikroorganizmu do przeprowadzenia danej reakcji, znakiem „-” brak takiej zdolności.
PL 245315 Β1
Tabela 3
Zdolność wybranych mikroorganizmów do syntezy IAA, syntezy sideroforów oraz udostępniania P.
| Cecha badana | |||
| IzOlat | Synteza IAA | Synteza sideroforów | Udostępnianie fosforu |
| Brevibaeiuus nwijicans OP247 | 4- | - | 4- |
| Pseudomonas rhizosphaere OP237 | 4- | 4- | 4- |
| Pseudomonas lutea OP193 | -i- | 4- | 4- |
| Pantoea agglomerans OP198 | 4- | 4- | 4- |
| Acidovorax valerianellae OP253 | 4- | 4- | 4- |
| Sporobolomyces ruberrimus OP177 | + | 4- | - |
| Psychrobacilluspsychrodurans OP200 | + | - | 4- |
| Pseudomonas rhodesiae OP244 | 4- | 4- | 4- |
| Aureobasidium pullulans OP1164 | 4- | - | 4- |
| Chryseobacterium lathyri OP280 | 4- | 4- | 4- |
| Lysinibacillus fusiformis OP290 | 4- | 4- | + |
| Bacillus mycoides OP287 | 4- | 4- | - |
| Pseudomonas protegens OP300 | 4- | 4- | 4- |
| Pseudomonas koreensis OP519 | - | - | - |
| Pseudomonas brasstcacearum OP563 | - | - | 4- |
| Pseudomonas helmanticensis OP349 | - | - | - |
| Lelliottia nimipressuralis OP369 | - | - | - |
| Lysinibacillusfusiformis OP267 | - | - | - |
| Lelliottia amnigena OP458 | - | - | - |
| Bacillus safensis OP506 | 4- | - | - |
| Enterobacter ludwigii OP479 | 4- | - | - |
| Delftia aadovorans OP538 | 4- | - | - |
| Solibacillus silrestris OP364 | 4- | - | - |
Na podstawie wyników badań skomponowano następujące konsorcja mikroorganizmów, które posłużyły w badaniach nad przyspieszeniem wzrostu i poprawą cech produkcyjnych wybranych gatunków/odmian roślin kapustnych:
T1: Brevibacillus nitrificans OP247, Pseudomonas rhizosphaere OP237, Pseudomonas lutea OP193, Acidovorax valerianellae OP253, Sporobolomyces ruberrimus OP 177
T3: Psychrobacillus psychrodurans OP200, Pseudomonas rhodesiae OP244, Aureobasidium pullulans OPI 164
T4: Chryseobacterium lathyri OP280, Lysinibacillus fusiformis 0290, Bacillus cereus OP287, Pseudomonas protegens OP300
Przykład 2. Przygotowanie szczepionki (inokulum)
Do przygotowania szczepionki wykorzystano następujące szczepy bakterii Chryseobacterium lathyri (UNIJAG.PL.OP280), Lysinibacillus fusiformis (UNIJAG.PL.OP290), Bacillus cereus (UNIJAG.PL.OP287), Pseudomonas protegens UNIJAG.PL.GP300). Kultury bakterii hodowano w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 mL zabezpieczonych korkiem celulozowym i folią aluminiową od góry, w płynnym podłożu do hodowli bakteryjnej nurtient agar (NA) po wcześniejszym wysterylizowaniu, o składzie: pepton - 5 g/L; meat extract - 3 g/L; Agar -15 g/L; przez 72 h w temperaturze 30°C, wytrząsając z prędkością 180 obr. min-1. Gęstość optyczna kultur po tym czasie wyniosła GD600 = 1.8 ± 0.4 Abs. Następnie kultury bakterii wirowano przez 5 min (5000 g), dekantowano i płukano 0.9% roztworem NaCI. Płukanie przeprowadzono dwukrotnie za każdym razem osad na nowo zawieszano w 0,9% roztworze NaCI, wytrząsano przez 30 s na wytrząsarce typu wortex, wirowano i dekantowano ponownie. Tak otrzymany osad zawieszono w 40 mL 0.9% wodnym roztworze NaCI. Czynności powyższe prowadzono dla każdej z kultur osobno. Po uzyskaniu zawiesin bakteryjnych w soli fizjologicznej, zawiesiny te zmieszano a następnie uzupełniono 0.9% wodnym roztworem NaCI w kolbie miarowej do pojemności 1 L.
Stwierdzono, że w korzystnym wykonaniu szczepionki mikroorganizmy namnażały się w sposób właściwy, co potwierdza wartość gęstości optycznej plasującej na poziomie 1,8 Abs.
Przykład 3. Weryfikacja oddziaływania szczepionki w warunkach laboratoryjnych na biomasę roślin
Przygotowaną zawiesinę według przykładu 1. wykonania użyto do inokulacji roślin. W każdej doniczce z multipalety umieszczono niesterylną ziemię uniwersalną do hodowli roślin wymieszaną z wodą kranową w objętościowym stosunku ilościowym 1 : 2 oraz jedno nasiono rośliny. W tym celu do każdej z doniczek z nasionami dodano 1 mL inokulum. Do doniczek z nasionami będącymi wariantem kontrolnym dodano 1 mL 0.9% wodnego roztworu NaCI w dniu wysiewu i w 10. dniu hodowli. Inokulację powtórzono po 10 dniach, dodając do każdej doniczki z rośliną 1 mL inokulum. Rośliny umieszczono w komorze do hodowli roślin - parametry hodowli: fotoperiod - 16 h, natężenie światła - 190 μmol · m2 · s-1 temperatura 24/19°C, wilgotność 70%.
Stwierdzono pozytywny wpływ szczepionki na świeżą masę roślin hodowanych tym sposobem dla Mizuny, Kalafiora fioletowego, Jarmużu wysokiego, Kapusty chińskiej, Kapusty pekińskiej, Kapusty głowiastej białej o ok. 40% względem roślin kontrolnych. Dla Kalafiora zielonego zaobserwowano mniejszy wpływ wynoszący niecałe 10% względem roślin kontrolnych.
Przykład 4. Weryfikacja oddziaływania szczepionki na parametry w warunkach hodowlanych (skala półtechniczna) oraz porównanie wpływu szczepionki na parametry wzrostowe wybranych gatunków roślin z rodzaju kapustowatych z zastosowaniem nawozów na bazie soli nieorganicznych
Etap I
Oceniono wzrost siewek warzyw należących do rodziny Brassicaceae. W doświadczeniu uwzględniono następujące rośliny: kapustę głowiastą białą ‘Kamienna Głowa’ (PNOS w Ożarowie Mazowieckim Sp. z o.o.), kapustę głowiastą czerwoną ‘Koda’ (W. Legutko Przedsiębiorstwo Hodowlano-Nasienne Sp. z o.o.), kalafiora zielonego ‘Verde di Macerata’ (PlantiCo Hodowla i Nasiennictwo Ogrodnicze Zielonki Sp. z o.o.), kalafiora fioletowego ‘Di Sicilia Violette’ (W. Legutko Przedsiębiorstwo Hodowlano-Nasienne Sp. z o.o.), jarmuż ‘Halbhoher Gruner Krauser’ (W. Legutko Przedsiębiorstwo Hodowlano-Nasienne Sp. z o.o.), rukolę ‘Athena’ (Tozer Seeds Ltd), kapustę pekińską ‘Manoko’ F1 (PlantiCo Hodowla i Nasiennictwo Ogrodnicze Zielonki Sp. z o.o.), kapustę chińską ‘Pak-choi’ (W. Legutko Przedsiębiorstwo Hodowlano-Nasienne Sp. z o.o.), mizunę (Torseed S.A.). Wymienione rośliny inokulowano szczepionką bakteryjną T4. Rośliny nieszczepione traktowano jako kontrolę.
Dla każdego obiektu doświadczenia (T4, kontrola) zastosowano trzy powtórzenia. Pojedyncze powtórzenie obejmowało połowę rozsadowej tacy 96-komórkowej VELI (48 komórek/roślin). Zastosowane tace były koloru czarnego o stożkowatych komórkach, pojemność pojedynczej komórki wynosiła 53 cm3. Tace, po wypełnieniu substratem torfowym Floragard Vetriebs GmbH, Oldenburg, Niemcy typu Florabalt Growing medium (biały torf bałtycki odkwaszony wapnem i wzbogacony wszystkimi podstawowymi głównymi i śladowymi pierwiastkami) ustawiono na stołach produkcyjnych. Do tak przygotowanych tac wysiano nasiona (po jednym nasieniu na komórkę tacy za wyjątkiem rukoli, gdzie zastosowano siew gniazdowy, a następnie przerywkę, pozostawiając jedną siewkę w gnieździe), które następnie przykryto cienką warstwą substratu torfowego.
Doświetlanie prowadzono w godzinach rannych i wieczornych za pomocą lamp sodowych (HPS) Elektro Valo Oy, Lady bird, Netafim Ltd., umieszczonych na wysokości 100 cm nad stołami, które zapewniały dzień 14-godzinny i natężenie promieniowania (PPFD) = 200 μmol · m-2 · s-1. Przy irradiancji wynoszącej powyżej 200 W/m2 stosowano światło pochodzenia naturalnego. Temperaturę do wschodów utrzymywano w zakresie 22-24°C, po wschodach (3-4 dni od wysiewu) utrzymywano temperaturę w zakresie temperatury do 18-20°C (średnia dobowa temperatura powietrza). Codziennie monitorowano kondycję siewek i uwilgotnienie substratu, wodę dostarczano lancą do podlewania o drobnokroplistym opadzie. Po wysiewie i zwilżeniu substratu przeprowadzono pierwszą inokulację szczepionką, a po następnym tygodniu - drugą inokulację. Na tym etapie doświadczenia prowadzono dokarmianie dolistne roślin po 3 tygodniach od siewu w postaci jednorazowego zasilenia nawozem Kristalon Zielony 18-18-18 firmy YARA Poland Sp. z o.o. (1 % roztwór, 60 mL wody/roztworu na 1 tacę 96-komórkową).
Wykonano następujące pomiary i analizy roślin: 1) liczby liści sekwencyjnie (liczono wszystkie liście o długości co najmniej 5 mm, zawsze na tych samych dokładnie oznakowanych roślinach, łącznie 15 roślin na obiekt, 5 roślin na 1 powtórzenie), pomiary wykonano 3-krotnie, w odstępach tygodniowych, poczynając od 2 tygodnia od siewu; 2) liczby liści roślin w fazie optymalnej do sadzenia (po około 4-5 tygodniach od siewu), przy czym liczono wszystkie liście posiadające co najmniej 5 mm długości; 3) w tym czasie przeprowadzono również ocenę świeżej i suchej masy części nadziemnej oraz świeżej i suchej masy korzeni (z obiektu doświadczalnego pobierano losowo 15 roślin, każda roślina i jej część były ważone osobno na wadzie laboratoryjnej Sartorius A120S Sartorius AG, Goettingen, Niemcy, korzenie zostały wcześniej oczyszczone z substratu torfowego, suchą masę określono po wysuszeniu próbek w temperaturze 92-95°C); 4) średnicę łodyżki (między liścieniami a pierwszymi liśćmi) za pomocą elektronicznej suwmiarki; 5) po zważeniu odcinano z rośliny największy wizualnie liść (15 sztuk) do pomiarów wykonywanych systemem obrazowania WinDIAS, Delta-T Devices, Wielka Brytania, którym określono najważniejsze parametry liścia, m.in. powierzchnię, obwód, długość, szerokość, współczynnik kształtu i inne.
Stwierdzono statystycznie istotny pozytywny wpływ szczepionki na parametry wzrostowe roślin. W szczególności pozytywny wpływ zaobserwowano w odniesieniu do kontroli (nieinokulowane rośliny): Dla Mizuny - powierzchnia liścia (ok. 6%), obwód liścia (ok. 7%), świeża masa części nadziemnych (ok.7%).
Dla Kalafiora fioletowego - powierzchnia liścia (ok. 16%), obwód liścia (ok. 9%), długość liścia (ok. 8%), świeża masa części nadziemnych (ok.20%).
Dla Kalafiora zielonego - obwód liścia (ok. 7%), świeża masa części nadziemnych (ok. 23%)
Dla Jarmużu wysokiego - powierzchnia liścia (ok. 10%), obwód liścia (ok. 6%), długość liścia (ok. 12%), sucha masa części nadziemnych (ok. 9%).
Dla Kapusty pekińskiej - powierzchnia liścia (ok. 15%), długość liścia (ok. 7%), świeża masa części nadziemnych (ok. 28%).
Ponadto w eksperymencie porównawczym w stosunku do nawożenia tradycyjnego za pomocą soli nieorganicznych przeprowadzonym dla kapust (Kapusta pekińska, Kapusta głowiasta biała i kapusta głowiasta czerwona) zaobserwowano pozytywny efekt stosowania (Ryc. 1) szczepionki w przypadku stosowania jej dla:
- Kapusty pekińskiej - świeża masa: dla roślin nienawożonych, roślin nawożonych 0,5% (m/m) soli w podłożu oraz 1% (m/m) soli w podłożu; sucha masa: roślin nawożonych 0,5% (m/m) soli,
- Kapusty głowiastej białej - świeża masa: roślin nawożonych 0,5% (m/m) soli w podłożu; sucha masa: roślin nawożonych 0,5% (m/m) soli,
- Kapusty głowiastej czerwonej - świeża masa: roślin nawożonych 1,0% (m/m) soli w podłożu.
Etap II
Zbadano skutki zastąpienia standardowo stosowanych nawozów dolistnych do zasilania rozsady szczepionkami jak w etapie I. Wykorzystano następujące rośliny: kapustę pekińską, kapustę głowiastą białą, kapustę głowiastą czerwoną, które inokulowano szczepionką T4; kapustę pekińską, kalafiora zielonego, rukolę, kapustę głowiastą białą, kapustę głowiastą czerwoną, które to rośliny stanowiły obiekt kontrolny. Inokulację prowadzono bezpośrednio po siewie nasion oraz po 1 tygodniu od siewu. Każdy z bloków doświadczenia obejmujący dane warzywo kapustowate z grupy szczepionej i kontroli nawożono pełnym stężeniem nawozu dolistnego (obiekt 100%), połową stężenia (obiekt 50%) oraz wodą destylowaną (obiekt 0%). Po 2,5 tygodniach od siewu rośliny zostały nawiezione za pomocą nawozu Kristalon Zielony 18-18-18 firmy YARA Poland Sp. z o.o. (1%, 0,5% i 0% roztwór, ilość roztworu/wody: 60 mL wody/roztworu na 1 tacę 96-komórkową). Doświadczenie założono w 3 powtórzeniach, w 1 powtórzeniu znajdowały się 32 rośliny.
Warunki mikroklimatyczne i metody produkcji roślin tego etapu doświadczenia były porównywalne do etapu I. W etapie II wykonano następujące pomiary i analizy (według metodyki opisanej wyżej), określając: liczbę liści podczas zbioru (po 30-35 dniach od siewu), świeżą i suchą masę części nadziemnej oraz parametry liści za pomocą systemu obrazowania WinDIAS.
Nieoczekiwanie okazało się również, po wykonaniu analizy statystycznej, że stosowanie szczepionki daje taki sam efekt jak stosownie tradycyjnego nawozu. Nie ma statystycznie istotnych różnic pomiędzy roślinami biotyzowanymi a nawożonymi solami wg podanej powyżej matrycy wariantów za wyjątkiem świeżej masy dla kapusty głowiastej czerwonej w wariancie nawożenia 1% soli oraz kapusty głowiastej białej w wariancie nawożenia 0,5% na nieznaczną korzyść soli nieorganicznej. Tym niemniej, w większości przypadków szczepionka jest skuteczna i zwiększa biomasę samodzielnie lub w kosuplementacji (co również ogranicza stosowanie chemikaliów), a jej zastosowanie wymaga jedynie optymalizacji w początkowej fazie wdrażania.
Nieoczekiwanie, pozytywny efekt zaobserwowano dla szczepionki T4, natomiast w przypadku innych testowanych szczepionek (np. T3) lub pojedynczych szczepów wchodzących w skład szczepionki T4 korzystny efekt był znacznie niższy lub w ogóle nie występował.
Na figurach 2-5 przedstawiono wyniki testowania wpływu pojedynczych szczepów bakterii - komponentów szczepionki T4 na wzrost kapustowatych. Żaden z komponentów szczepionki T4 nie oddziaływał pozytywnie na świeżą masę pędu. W przypadku kapusty głowiastej i kalafiora zielonego stwierdzono istotnie mniejszą masę roślin inokulowanych w porównaniu z kontrolnymi (Fig. 2). Szczep 5 OP280 oddziaływał negatywnie na pole powierzchni liścia kalafiora zielonego. Szczep 287 oddziaływał pozytywnie na pole powierzchni liścia kapusty pekińskiej (Fig. 3). Żaden z komponentów szczepionki T4 nie oddziaływał pozytywnie na świeżą masę korzeni. Zdecydowana większość szczepów bakterii obniżyła świeżą masę korzeni kalafiora zielonego i kapusty głowiastej (Fig. 4). Wszystkie szczepy bakterii wykazały negatywny wpływ na suchą masę kalafiora zielonego i kapusty głowiastej (Fig. 5).
Natomiast na figurze 6 przedstawiono wyniki testów pokazujące brak pozytywnego wpływu szczepionki T3 na świeżą masę wybranych gatunków roślin.
Literatura:
[1] J. Poveda, R. Hermosa, E. Monte, C. Nicolas, Trichoderma harzianum favours the access of arbuscular mycorrhizal fungi to non-host Brassicaceae roots and increases plant productivity, Sci. Rep. 9 (2019) 1-11. https://doi.org/10.1038/s41598-019-48269-z.
[2] S. Turner, K.M. Pryer, V.P.W. Miao, J.D. Palmer, Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis, J. Eukaryot. Microbiol. 46 (1999) 327-338. https://doi.org/10.1111/j.1550-7408.1999.tb04612.x.
Claims (5)
1. Kompozycja bakterii zawierająca następujące szczepy bakterii: Chryseobacteriumlathyrizdeponowany w PCM pod numerem B/00412, Lysinibacillus fusiformis zdeponowany w PCM pod numerem B/00414, Bacillus cereus zdeponowany w PCM pod numerem B/00413 oraz Pseudomonas protegens zdeponowany w PCM pod numerem B/00415.
2. Szczepionka do biotyzacji roślin kapustnych zawierająca kompozycję określoną w zastrz. 1.
3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że jest przeznaczona do przyśpieszania wzrostu roślin kapustnych, korzystnie poprawy przyrostu masy części zielonych lub korzeni roślin.
4. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że ma postać zawiesiny bakterii w roztworze wodnym.
5. Szczep bakterii wybrany spośród: Chryseobacterium lathyri zdeponowanego w PCM pod numerem B/00412, Lysinibacillus fusiformis zdeponowanego w PCM pod numerem B/00414, Bacillus cereus zdeponowanego w PCM pod numerem B/00413 oraz Pseudomonas protegens zdeponowanego w PCM pod numerem B/00415.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442045A PL245315B1 (pl) | 2022-08-19 | Kompozycja bakterii, zawierająca ją szczepionka do biotyzacji gatunków roślin kapustnych oraz zawarte w niej szczepy bakterii | |
| PCT/PL2023/050069 WO2024039254A1 (en) | 2022-08-19 | 2023-08-19 | Bacterial composition, an inoculum for brassicaceae plants biotization containing the said composition and bacterial strains contained therein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442045A PL245315B1 (pl) | 2022-08-19 | Kompozycja bakterii, zawierająca ją szczepionka do biotyzacji gatunków roślin kapustnych oraz zawarte w niej szczepy bakterii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442045A1 PL442045A1 (pl) | 2024-02-26 |
| PL245315B1 true PL245315B1 (pl) | 2024-06-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2645083T3 (es) | Uso de microorganismos y nutrientes sinérgicos para producir señales que facilitan la germinación y la colonización de raíces vegetales por hongos micorrizales en ambientes ricos en fósforo | |
| ES2730767T3 (es) | Métodos y composiciones para aumentar las cantidades de fósforo disponible para su absorción por las plantas a partir de los suelos | |
| US8252720B2 (en) | Use of Gluconacetobacter with reduced use of nitrogen fertilizer to improve beet crop production | |
| EP3251512A1 (en) | Compositions comprising bacillus strains and methods of use to suppress the activities and growth of fungal plant pathogens | |
| JP5714603B2 (ja) | 植物の出芽および生長を増強するためのシュードモナス・アゾトフォルマンス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）種の新規蛍光シュードモナス菌 | |
| CN109679884B (zh) | 一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用 | |
| Susilowati et al. | Indole-3-acetic acid producing bacteria and its application on the growth of rice | |
| JP2005500413A (ja) | 土壌を処理するための微生物及びそれらを獲得する方法 | |
| MX2011013261A (es) | Composicion para obtener fungicida y bactericida biologico. | |
| Riviezzi et al. | Improved nodulation and seed yield of soybean (Glycine max) with a new isoflavone-based inoculant of Bradyrhizobium elkanii | |
| CN110892805B (zh) | 一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素的应用 | |
| CN108795797B (zh) | 一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用 | |
| Kontopoulou et al. | Responses of hydroponically grown common bean fed with nitrogen-free nutrient solution to root inoculation with N2-fixing bacteria | |
| US20190208789A1 (en) | Compositions and methods for enhancing plant growth | |
| US20200385670A1 (en) | PGPR Compositions and Methods for Improved Cultivation of Tomato and Potato Species | |
| Mutalib et al. | Effect of nitrogen fertilizer on hydrolytic enzyme production, root colonisation, N metabolism, leaf physiology and growth of rice inoculated with'Bacillus' sp.(Sb42). | |
| PL245315B1 (pl) | Kompozycja bakterii, zawierająca ją szczepionka do biotyzacji gatunków roślin kapustnych oraz zawarte w niej szczepy bakterii | |
| Cruz et al. | Enhancement of growth and yield of upland rice (Oryza sativa L.) var. NSIC Rc 192 by actinomycetes. | |
| Mihalache et al. | Synergistic effect of Pseudomonas lini and Bacillus pumilus on runner bean growth enhancement. | |
| JP2015142547A (ja) | 植物成長強化剤及びそれを用いた植物栽培方法 | |
| ES2534626B1 (es) | Microorganismo con capacidad para producir compuestos que inducen respuesta sistémica en plantas y sus aplicaciones como promotor del crecimiento vegetal | |
| ES2891354T3 (es) | Método para mejorar el desarrollo de las plantas | |
| WO2024039254A1 (en) | Bacterial composition, an inoculum for brassicaceae plants biotization containing the said composition and bacterial strains contained therein | |
| WO2021133218A1 (ru) | Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур | |
| CN117586931B (zh) | 一种木糖氧化无色杆菌ivf-wk240及其用途 |