PL242331B1 - Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na suszę - Google Patents
Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na suszę Download PDFInfo
- Publication number
- PL242331B1 PL242331B1 PL437298A PL43729821A PL242331B1 PL 242331 B1 PL242331 B1 PL 242331B1 PL 437298 A PL437298 A PL 437298A PL 43729821 A PL43729821 A PL 43729821A PL 242331 B1 PL242331 B1 PL 242331B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- gene
- genes
- barley
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 title claims abstract 8
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 title description 4
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 claims abstract description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 3
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 claims description 2
- 240000007036 Hordeum jubatum Species 0.000 claims description 2
- 241000173698 Hordeum pubiflorum Species 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101000904460 Encephalitozoon cuniculi (strain GB-M1) Probable glycerol-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 claims 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 34
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 102100032252 Antizyme inhibitor 2 Human genes 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 101000798222 Homo sapiens Antizyme inhibitor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 description 2
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 2
- 101710126741 Monodehydroascorbate reductase Proteins 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 2
- 230000025469 response to water deprivation Effects 0.000 description 2
- LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 2-methylamino-1-phenylpropan-1-one Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=CC=C1 LPLLVINFLBSFRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 244000293323 Cosmos caudatus Species 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101000806036 Oryza sativa subsp. japonica Dehydrin DHN1 Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000014075 nitrogen utilization Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005097 photorespiration Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy sekwencji starterów do identyfikacji genów jęczmienia, specyficznych dla genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 umożliwiających analizę poziomu ekspresji tych genów. Przedmiotem wynalazku jest również sposób analizy poziomu ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120, HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090, z użyciem specyficznych par starterów oraz sposób selekcji odmian jęczmienia o podwyższonej tolerancji na stres suszy w oparciu o poziomy ekspresji wymienionych wyżej genów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalających na analizę ekspresji pięciu genów jęczmienia i sposób analizy ekspresji tych genów z użyciem wspomnianych starterów pozwalający na selekcję odmian jęczmienia pod kątem tolerancji na stres suszy. Bardziej szczegółowo ogłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów identyfikatorach HORVU5Hr1G093700;
HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090, kodujących odpowiednio lipoksygenazę 1, dehydrynę 1, białko indukowane jasmonianami, reduktazę monodehydroaskorbinianową oraz dekarboksylazę argininy. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji z użyciem zaproponowanego systemu badania ekspresji genów.
Narastający problem suszy oraz straty w plonach, które są nim wywołane stanowią jedne z najważniejszych wyzwań stojących przed nowoczesnym rolnictwem. W Polsce 45% gleb kwalifikuje się jako optymalnie uwilgocone, natomiast około 38% jest okresowo lub trwale suchych i 17% jedynie okresowo mokrych. Zgodnie z raportami Instytutu Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa - Państwowego Instytutu Badawczego (IUNG-PIB 7/2019) susza rolnicza wystąpiła we wszystkich województwach naszego kraju, a w niektórych z nich (lubuskim, łódzkim, opolskim, wielkopolskim i zachodniopomorskim) zagrożonych suszą było 100% gmin. Susza została odnotowana dla wszystkich upraw, które są monitorowane przez IUNG-PIB. Najbardziej objęte suszą były uprawy kukurydzy na ziarno oraz na kiszonkę (68,31% wszystkich gmin). Następnie krzewy owocowe (65,68%), rośliny strączkowe (62,58%), zboża jare (60,44%) i ozime (53,05%) oraz warzywa gruntowe (50,59%). Wpłynęło to na zbiory i obserwuje się ich zauważalny spadek względem okresu 2013-2017. Głębokie susze powodują znaczne straty materialne. Susza w roku 1992 spowodowała wyraźny spadek plonów, problemy z zaopatrzeniem w wodę i duże straty środowiskowe. Podobnie było w przypadku dotkliwego niedoboru opadów od połowy czerwca do końca lipca 2006 r. Szacuje się, że wysoki wzrost temperatury powietrza spowoduje więcej niż dwukrotny wzrost ewapotranspiracji w okresie zimowym brak odbudowania retencji glebowej w tym okresie, natomiast niewielki wzrost opadów w okresie letnim, przy silnym wzroście ewapotranspiracji spowoduje wzrost potrzeb wodnych w rolnictwie (Ryszkowski i Kędziora 1993, Kędziora 1993). Dlatego też zagrożenie suszą wzrasta i będzie stanowiło coraz poważniejsze wyzwanie dla hodowców roślin uprawnych. Stąd od wielu już lat trwają intensywne prace nad poznaniem mechanizmów, które rośliny aktywują w odpowiedzi na stres suszy, a także wyprowadzaniem nowych odmian roślin uprawnych, które na ten stres mają być bardziej tolerancyjne. Poprzez analizę profili ekspresji genów i ich porównanie pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach optymalnych i w warunkach stresu możliwe jest poznanie molekularnych podstaw mechanizmów prowadzących od adaptacji roślin do zmieniających się warunków środowiska (Daszkowska i inni, 2019). Porównując profile ekspresji genów u dwóch genotypów jęczmienia: formy dzikiej Sebastian oraz mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na suszę (Marzec i inni, 2020), zidentyfikowano geny, których podwyższona ekspresja świadczy o lepszym przystosowaniu do stresu suszy. Informacje pochodzące z badań związanych ze zmianami ekspresji genów w odpowiedzi na stresy były wykorzystywane wcześniej w zgłoszeniach patentowych dotyczących różnych gatunków.
W zgłoszeniu patentowym AU2020103038 A4 autorzy opisują sekwencję białka, która może zostać wykorzystana do transformacji roślin, co powinno skutkować zwiększeniem ich tolerancji na stres suszy.
W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US2020347394 A1 ujawniono roślinne czynniki transkrypcyjne i geny kodujące czynniki transkrypcyjne. Ujawniono również metody wzmacniania cech rośliny poprzez regulację w dół genów kodujących czynniki transkrypcyjne. Ulepszone właściwości mogą obejmować wyższe wskaźniki fotosyntezy, zmniejszone wskaźniki fotooddychania, wyższy plon lub zawartość biomasy, wyższy plon nasion, lepszy wskaźnik plonów, wyższą zawartość oleju, lepszy skład odżywczy, lepszą efektywność wykorzystania azotu, odporność na suszę, odporność na powodzie, odporność na choroby, szybciej kiełkowanie nasion i wschody roślin, zwiększona żywotność sadzonek, tolerancja na sól, wyższy współczynnik asymilacji CO2 i niższy wskaźnik transpiracji. Ujawniono również zmodyfikowane rośliny, w których geny kodujące czynniki transkrypcyjne są obniżone. Kompozycje według wynalazku obejmują sekwencje polinukleotydowe, sekwencje polipeptydowe, warianty, ortologi i ich fragmenty. Metody obejmują wprowadzanie do roślin systemów zmniejszających lub eliminujących ekspresję czynników transkrypcyjnych.
Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO2020185849 A1 przedstawia sposób na zwiększenie ekspresji białka z rodziny kinaz MAPKK (mitogen activated protein kinase kinase), co prowadzi do polepszenia tolerancji na stres suszy u roślin i drzew.
Natomiast w zgłoszeniu CN111593058 A autorzy przedstawiają sposób na kontrolę ekspresji genów przez manipulację cząsteczkami miRNA, które regulują ekspresję innych genów, na przykładzie rzepaku (Brassica napus).
W polskim opisie patentowym PL233338 B1 ujawniono dwa geny jęczmienia kodujące dehydryny (HvDHN4 i HvDHN7) oraz dwa geny jęczmienia kodujące peroksydazy (HvPRX6 i HvPRX10), dla których opracowano sekwencje starterów dedykowanych do określania poziomu ekspresji tych genów. W/w opis dotyczy także sposobu analizy poziomu ekspresji genów HvDHN4, HvDHN7, HvPRX6 i HvPRX10 przy zastosowaniu opracowanych par starterów, sposobu identyfikacji odmian jęczmienia tolerancyjnych na suszę, na podstawie analiz poziomu ekspresji wymienionych genów, oraz zastosowanie wspomnianych genów do selekcji odmian tolerancyjnych na suszę.
Z polskiego opisu patentowego PL 233518 B1 znany jest sposób selekcji genotypów jęczmienia jarego tolerancyjnych względem suszy wiosennej, który polega na tym, że trzy polimorficzne fragmenty DNA sprzężone z rejonami chromosomowymi związanymi z tolerancją suszy amplifikowane są w reakcji PCR, przy czym wykorzystuje się do tego odpowiednie sekwencje starterów.
Polskie zgłoszenie patentowe P.412994 A1 dotyczy sekwencji starterów, sposobu identyfikacji ekspresji genu HvZIP1, sposobu identyfikacji odmian jęczmienia odpornych na warunki deficytu wodnego, zastosowania genu HvZIP1 oraz zestawu testowego do identyfikacji odmian jęczmienia o podwyższonej ekspresji genu HvZIP1. Wynalazek dotyczy dwóch opracowanych par starterów, sposobu identyfikacji ekspresji genu HvZIP1 przy zastosowaniu opracowanych par starterów, sposobu identyfikacji odmian jęczmienia odpornych na warunki deficytu wodnego przy użyciu sposobu wspomnianego powyżej, zastosowania genu HvZIP1 do selekcji odmian jęczmienia charakteryzujących się zwiększoną zdolnością adaptacyjną do warunków braku wody oraz zestawu testowego do identyfikacji odmian jęczmienia o podwyższonej ekspresji genu HvZIP1.
Celem wynalazku było opracowanie nowych sekwencji starterów pozwalających na analizę ekspresji pięciu genów kodujących białka z pięciu różnych rodzin białek: lipoksygenazę, dehydrynę, białko indukowane jasmonianami, reduktazę monodehydroaskorbinianową oraz dekarboksylazę argininy. Dzięki wykorzystaniu tych genów możliwa jest analiza odpowiedzi roślin na stres przez pryzmat różnych mechanizmów związanych z adaptacją rośliny do stresu suszy, stad metoda ta wydaje się bardziej uniwersalna.
Proponowane rozwiązanie techniczne dotyczące analizy poziomów ekspresji pięciu genów jęczmienia (HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090) jest metodą pozwalającą na selekcję odmian jęczmienia tolerancyjnych na stres suszy. Poprzez analizę profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie odmian jęczmienia między sobą i wybranie tych, które będą lepiej adaptowały się do stresu suszy. Podstawa wynalazku to informacje o poziome ekspresji pięciu genów jęczmienia (HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090), w odpowiedzi na stres suszy. Informacje te mogą być wykorzystane do oceny odmian jęczmienia pod kątem tolerancji na stres suszy.
Istotą wynalazku są sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, specyficznych dla genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów charakteryzujące się tym, że mają sekwencję nukleotydową:
a. Dla genu HORVU5Hr1G093700 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2 b. Dla genu HORVU5Hr1G092120 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4 c. Dla genu HORVU4Hr1G087430 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6 d. Dla genu HORVU7Hr1G117880 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8
e. Dla genu HORVU1Hr1G002090 starter F - sekwencja nr 9 starter R - sekwencja nr 10
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób analizy poziomu ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że stosuje się sekwencje starterów opisane powyżej.
Istotę wynalazku stanowi również sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na suszę obejmujący następujące etapy:
a. Prowadzi się wzrost siewek jęczmienia, przy czym dla siewek kontrolnych prowadzi się wzrost w warunkach optymalnego nawodnienia, natomiast siewki narażone na stres suszy wzrastają w warunkach optymalnego nawodnienia, po czym zostają poddane stresowi niedoboru wody,
b. Izoluje się RNA z liści siewek jęczmienia,
c. Przeprowadza się syntezę cDNA,
d. Analizuje się poziom ekspresji genów HORVU5Hr1G093700, HORVU5Hr1G092120,
HORVU4Hr1G087430, HORVU7Hr1G117880, HORVU1Hr1G002090 metodą qPCR, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów określone powyżej,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU5Hr1G093700, HORVU5Hr1G092120, HORVU4Hr1G087430, HORVU7Hr1G117880, HORVU1Hr1G002090, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy siewkami kontrolnymi rosnącymi w warunkach optymalnego nawodnienia oraz siewkami narażonymi na stres suszy dla każdego z genotypów.
f. Wybiera się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do genotypów analogicznych, hodowanych w warunkach optymalnego nawodnienia, poziom ekspresji genów HORVU5Hr1G093700, HORVU5Hr1G092120, HORVU4Hr1G087430, HORVU7Hr1G117880, HORVU1Hr1G002090, wskazujący na podwyższoną tolerancję na stres suszy.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 i/lub GPDH.
Korzystnie, wzrost siewek narażonych na stres suszy prowadzi się przez 11 dni w warunkach optymalnego nawodnienia, po czym zostają poddane stresowi niedoboru wody na 10 kolejnych dni, co prowadzi do spadku OZW poniżej 4%.
Korzystnie, wzrost siewek kontrolnych prowadzi się przez 21 dni.
Korzystnie, hodowla w warunkach optymalnego nawodnienia występuje przy wilgotności od 16 do 20% OZW, najkorzystniej 18% OZW.
Korzystnie, etap poddawania siewek stresowi suszy prowadzi się przy wilgotności < 4% OZW.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku który: przedstawia przykładową analizę ekspresji genów u dwóch genotypów po stresie suszy. Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na stres suszy, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na suszę. Ekspresja genów badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach optymalnego nawodnienia (18% OZW) do roślin narażonych na niedobór wody (10-dniowy wzrost w glebie o wilgotności mniejszej niż 4% OZW). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na figurze zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów pod wpływem suszy w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1.
Wynalazek został przedstawiony w przykładach wykonania, które nie mają charakteru ograniczającego. Jak wynika z uzyskanych przez Twórców wyników, dla celów wynalazku identyfikację odmian jęczmienia o lepszej tolerancji na stres suszy w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880;
HORVU1Hr1G002090 można przeprowadzić na trzytygodniowych siewkach jęczmienia, które rosną w warunkach optymalnego nawodnienia oraz tych poddanych stresowi suszy. Przez optymalne warunki nawodnienia rozumie się poziom wilgotności na poziomie 18% OZW, natomiast niedobór wody otrzymuje się przez zaprzestanie podlewania na 10 dni, co prowadzi do spadku wilgotności gleby poniżej 4% OZW. Selekcję odmian o podwyższonej tolerancji na stres suszy prowadzi się w oparciu o analizę poziomu ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; ‘ HORVU4Hr1G087430;
HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 w tkankach liści trzytygodniowych siewek jęczmienia.
Przykład 1. Analiza poziomu ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090.
RNA wyizolowano z liści 3-tygodniowych siewek jęczmienia, które rosły w warunkach optymalnego nawodnienia (18% OZW) oraz narażonych na 10-dniowy stres suszy (zaprzestanie podlewania na 10 dni, co prowadzi do spadku wilgotności gleby poniżej 4% OZW), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
1. Dla genu HORVU5Hr1G093700 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2
2. Dla genu HORVU5Hr1G092120 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4
3. Dla genu HORVU4Hr1G087430 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6 4. Dla genu HORVU7Hr1G117880 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8
5. Dla genu HORVU1Hr1G002090 starter F - sekwencja nr 9 starter R - sekwencja nr 10
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-α) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) (Rapacz et al., 2012).
Przykład 2. Metoda selekcji odmian jęczmienia tolerancyjnych na stres suszy w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1 G117880; HORVU1 Hr1 G002090.
Metoda selekcji odmian jęczmienia tolerancyjnych na stres suszy opiera się na porównaniu poziomów ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430;
HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090, z użyciem wspomnianych starterów. Ocena poziomu ekspresji genów wykonywana jest z użyciem reakcji qPCR i obejmuje:
1. Wzrost siewek kontrolnych jęczmienia prowadzi się przez 3-tygodnie w warunkach optymalnego nawodnienia (wilgotność 18% OZW), natomiast wzrost siewek narażonych na stres suszy prowadzi się przez 11 dni w warunkach optymalnego nawodnienia, po czym zostają poddane stresowi niedoboru wody na 10 kolejnych dni, co prowadzi do spadku OZW poniżej 4%.
2. Izolację RNA z liści jęczmienia, z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub innym, pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności.
3. Syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA.
4. Reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym.
5. Reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1-α) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) (Rapacz et al., 2012) dla każdej próby cDNA.
6. Bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 oraz genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów wykorzystu jąc zwyczajowo przyjęte metody obliczeniowe. Poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach optymalnego nawodnienia (18% OZW) oraz roślin narażonych na 10-dniowy stres suszy (wilgotność gleby poniżej 4% OZW), dla każdego z genotypów.
7. Genotypy z najwyższym poziomem ekspresji genów HORVU5Hr 1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G1178809; HORVU1Hr1G002090 są genotypami o podwyższonej tolerancji na stres suszy. Stąd dla każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji każdego z badanych genów pomiędzy kontrolą a roślinami narażonymi na stres suszy. Im wyższa ekspresja genów u roślin stresowanych tym silniejsza odpowiedź na stres, co przekłada się na wyższą tolerancję rośliny na stres suszy. Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do porównania ich wrażliwości na stres suszy jest krotność wzrostu ekspresji u roślin stresowanych. Rośliny o najwyższych wskaźnikach są najbardziej tolerancyjne.
Otrzymane wyniki porównuje się pomiędzy dwiema bądź większą liczbą genotypów. Im wyższy poziom ekspresji tym większa tolerancja na stres suszy. Wynik porównania dwóch genotypów o zróżnicowanej tolerancji na stres suszy przedstawiono na Figurze 2.
Literatura:
Daszkowska-Golec, A., Collin, A., Sitko, K., Janiak, A., Kalaji, H. M., & Szarejko, I. (2019). Genetic and physiological dissection of photosynthesis in barley exposed to drought stress. International journal of molecular sciences, 20(24), 6341.
IUNG-PIB (2019) Komunikat odnośnie wystąpienia warunków suszy w Polsce, Rok: 2019; okres: 07 (21.V - 20.VII).
Kędziora A. 1993. Klimat a stosunki wodne w środowisku przyrodniczym Wielkopolski. Kronika Wielkopolski, Nr 1(64), str. 46-54.
Marzec, M., Daszkowska-Golec, A., Collin, A., Melzer, M., Eggert, K., & Szarejko, I. (2020). Barley strigolactone signalling mutant hvd14.d reveals the role of strigolactones in abscisic acid-dependent response to drought. Plant, Cell & Environment, 43(9), 2239-2253.
OECD/FAO (2019), OECD-FAO Agricultural Outlook 2019-2028, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/agr_outlook-2019-en.
Rapacz, M., Stępień, A., & Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RT-PCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
Ryszkowski L., Kędziora A. 1993. Rolnictwo a efekt szklarniowy. Kosmos, 42(1), str. 123-149.
PL 242331 Β1
Wykaz sekwencji:
<110> Uniwersytet Śląski w Katowicach < 120> Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zw iększonej tolerancji na suszę <130> 593 <140> P.437298 <141> 2022-11-05 <160> 10 < 170> Patentln version 3.5 < 210> 1 < 211> 23 < 212> DNA < 213> Hordeum vulgare <400> 1 gtgatcttca gtttgggcgt tgc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 2
PL 242331 Β1 tgagcttgac ccagaaacag agg
| <210> | 3 |
| <211> | 23 |
| <212> | DNA |
| <213> | Hordcum vulgarc |
| <400> | 3 |
tcgcaacaga tcagcacact tcc <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Hordcum vulgarc <400> 4 tgtggtgcta cgaagtacga acag 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Hordcum vulgarc <400> 5 acglcttgtl ggtglcaatg atgc <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Hordcum vulgare
PL 242331 Β1 <400> 6 tcacatgggt gtctaccaag gg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Hordcum vulgarc <400> 7
| agtgcgacga gggtgtcatt tg | 22 |
<210> 8 <211> 22 <2I2> DNA <213> Hordcum vulgare <400> 8
| aagcttcacc tggtcactcg ac | 22 |
<2IO> 9 <211> 22 <212> DNA <2I3> Hordcum vulgarc <400> 9
| aagcacctct tcccgatgat gc | 22 |
<210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Hordcum vulgarc <400> 10
| atgagcgtgc ccatttgagt cg | 22 |
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, specyficznych dla genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880;HORVU1Hr1G002090 umożliwiające analizę poziomu ekspresji tych genów znamienne tym, że mają sekwencję nukleotydową:a. Dla genu HORVU5Hr1G093700 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2b. Dla genu HORVU5Hr1G092120 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4c. Dla genu HORVU4Hr1G087430 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6d. Dla genu HORVU7Hr1G117880 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8e. Dla genu HORVU1Hr1G002090 starter F - sekwencja nr 9 starter R - sekwencja nr 10
- 2. Sposób analizy poziomu ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120;HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 metodą qPCR, znamienny tym, że stosuje się startery:a. Dla genu HORVU5Hr1G093700 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2b. Dla genu HORVU5Hr1G092120 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4c. Dla genu HORVU4Hr1G087430 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6d. Dla genu HORVU7Hr1G117880 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8e. Dla genu HORVU1Hr1G002090 starter F - sekwencja nr 9 starter R - sekwencja nr 10
- 3. Sposób selekcji odmian jęczmienia o podwyższonej tolerancji na stres suszy, obejmujący następujące etapy:a. Prowadzi się wzrost siewek jęczmienia, przy czym dla siewek kontrolnych prowadzi się wzrost w warunkach optymalnego nawodnienia, natomiast siewki narażone na stres suszy wzrastają w warunkach optymalnego nawodnienia, po czym zostają poddane stresowi niedoboru wody,b. Izoluje się RNA z liści siewek jęczmienia,c. Przeprowadza się syntezę cDNA,d. Analizuje się poziom ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120;HORVU4Hr1G087430; HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 metodą qPCR, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się startery:i. Dla genu HORVU5Hr1G093700 starter F - sekwencja nr 1 starter R - sekwencja nr 2 ii. Dla genu HORVU5Hr1092120 starter F - sekwencja nr 3 starter R - sekwencja nr 4 iii. Dla genu HORVU4Hr1G087430 starter F - sekwencja nr 5 starter R - sekwencja nr 6 iv. Dla genu HORVU7Hr1G117880 starter F - sekwencja nr 7 starter R - sekwencja nr 8v. Dla genu HORVU1 Hr1 G002090 starter F - sekwencja nr 9 starter R - sekwencja nr 10e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU5Hr1G093700, HORVU5Hr1G092120, HORVU4Hr1G087430, HORVU7Hr1G117880, HORVU1Hr1G002090, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy siewkami kontrolnymi rosnącymi w warunkach optymalnego nawodnienia oraz siewkami narażonymi stres suszy dla każdego z genotypów,f. Wybiera się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy, w porównaniu do genotypów analogicznych, hodowanych w warunkach optymalnego nawodnienia, poziom ekspresji genów HORVU5Hr1G093700; HORVU5Hr1G092120; HORVU4Hr1G087430;HORVU7Hr1G117880; HORVU1Hr1G002090 wskazujący na podwyższoną tolerancję na stres suszy.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 i/lub GPDH.
- 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wzrost siewek narażonych na stres suszy prowadzi się przez 11 dni w warunkach optymalnego nawodnienia, po czym zostają poddane stresowi niedoboru wody na 10 kolejnych dni, co prowadzi do spadku OZW poniżej 4%.
- 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wzrost siewek kontrolnych prowadzi się przez 21 dni.
- 7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hodowla w warunkach optymalnego nawodnienia występuje przy wilgotności od 16 do 20% OZW.
- 8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że hodowla w warunkach optymalnego nawodnienia występuje przy wilgotności 18% OZW.
- 9. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że etap poddawania siewek stresowi suszy prowadzi się przy wilgotności < 4% OZW.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437298A PL242331B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na suszę |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL437298A PL242331B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na suszę |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL437298A1 PL437298A1 (pl) | 2022-09-19 |
| PL242331B1 true PL242331B1 (pl) | 2023-02-13 |
Family
ID=83724208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL437298A PL242331B1 (pl) | 2021-03-15 | 2021-03-15 | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na suszę |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242331B1 (pl) |
-
2021
- 2021-03-15 PL PL437298A patent/PL242331B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL437298A1 (pl) | 2022-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zegaoui et al. | Variation in relative water content, proline accumulation and stress gene expression in two cowpea landraces under drought | |
| Upadhyay et al. | Global transcriptome analysis of grapevine (Vitis vinifera L.) leaves under salt stress reveals differential response at early and late stages of stress in table grape cv. Thompson Seedless | |
| CN116426673A (zh) | 水稻耐盐相关分子标记及其应用 | |
| CN118684748A (zh) | 一种微肽及其应用 | |
| Chetto et al. | Assessment of elite faba bean lines for enhanced productivity and resilience in contrasting challenging environments using phenotypic and molecular markers | |
| Amanov et al. | Dependence of growth period, yield elements and grain quality of winter bread wheat varieties and lines on different soil and climate conditions | |
| US10349611B2 (en) | Heat-tolerant tomato mutant and method for producing the same | |
| CN119242700B (zh) | 一种水稻OsBBX3基因的应用 | |
| CN109371041B (zh) | 一种增加穗粒数的水稻基因OsHGN及其应用 | |
| PL242332B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o obniżonej tolerancji na suszę | |
| CN114231557B (zh) | 水稻种子休眠性调控基因及其用途 | |
| KR102530404B1 (ko) | 내염성 토마토 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 선별방법 | |
| Sabry et al. | Assessing drought tolerance of some Faba bean (Vicia faba L.) cultivars using genetic variability, tolerance indices and ISSR markers | |
| Tiwari et al. | Genetic variability and genetic divergence for seed yield and its components characters in grain amaranth (Amaranhus hypochondriacus L.) germplasm | |
| Khan et al. | Identification of elite sugarcane clones through TRAP | |
| CN106034659A (zh) | 一种室内快速鉴定小麦冬春性的方法 | |
| Makhramova et al. | Development and application of Secale cereale L. cultivation technology based on optimal physiological parameters for arid conditions. | |
| Maroufi et al. | Differential expression of fructan 1-exohydrolase genes involved in inulin biodegradation in chicory ('Cichorium intybus') cultivars | |
| CN121249777B (zh) | 油菜BnaALaAT1基因在培育抗逆性、高产植物品种中的应用 | |
| CN112851780B (zh) | OsLPS1基因及其突变体在响应外源激素中的应用 | |
| CN117737086A (zh) | 一种水稻稻瘟病抗性基因PibH8及其应用 | |
| Javaid et al. | Germination and Seedling Characteristics of Camelina sativa L. under Abiotic Stress Conditions. | |
| Di Fenza | Examining the physiological and genetic response of maize to low temperature conditions | |
| Keller-Przybyłkowicz et al. | The Impact of Seasonal Temperature Fluctuations on Genotype x Phenotype Interactions in Malus domestica Borkh. | |
| CN118460578A (zh) | 一个豌豆熟性性状关联的编码异分支酸合酶基因及应用 |