PL240686B1

PL240686B1 - Amidosiarczanowe N-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)- 1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu, N-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu, zastosowanie tych związków oraz sposób otrzymywania amidosiarczanowych N-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol- -3-ilo]fenolu

Info

Publication number: PL240686B1
Application number: PL433939A
Authority: PL
Inventors: Sebastian DEMKOWICZ; Sebastian Demkowicz; Mateusz Daśko; Karol Biernacki; Janusz RACHOŃ; Janusz Rachoń
Original assignee: Politechnika Gdanska
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2022-05-23
Also published as: PL433939A1

Description

PL 240 686 Β1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki charakteryzujące się strukturą chemiczną przypominającą budowę naturalnego substratu enzymu sulfatazy steroidowej STS dzięki temu imitujące budowę steroidów. Wynalazek to amidosiarczanowe A/-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu oraz A/-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu jako nowe związki. Przedmiotem wynalazku jest pierwsze zastosowanie medyczne amidosiarczanowych A/-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu oraz pierwsze zastosowanie medyczne A/-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu. Przedmiotem wynalazku jest medyczne zastosowanie amidosiarczanowych A/-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu jako leku o właściwościach inhibitora sulfatazy steroidowej (STS) i/lub leku o działaniu modulatora receptora estrogenowego, jak i zastosowanie jako związku do wykorzystania in vitro a właściwościach inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub modulatora receptora estrogenowego. Przedmiotem wynalazku jest medyczne zastosowanie A/-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu jako leku o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, w tym antybakteryjnym oraz jako leku o działaniu selektywnych modulatorów receptora estrogenowego, jak i ich zastosowanie do wykorzystania in vitro jako środka przeciwdrobnoustrojowego i/lub modulatora, receptora estrogenowego. W szczególności przedmiotowe związki - amidosiarczanowe A/-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu znajdują zastosowanie medyczne jako leki w terapii nowotworowej, a w szczególności w terapii hormonalnej w leczeniu hormonozależnych nowotworów zwierząt, zwłaszcza ssaków, w tym ludzi. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania tych nowych związków, przy czym A/-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu stanowią produkt pośredni, z którego bezpośrednio otrzymuje się pochodne amidosiarczanowe.

Z dokumentu EP1608671 znana jest struktura pierścienia steroidowego o ogólnym wzorze:

Każdy z tych pierścieni daje możliwość zastąpienia go pierścieniem heterocyklicznym jak i pierścieniem nieheterocyklicznym. Znane jest również połączenie różnych kombinacji struktury imitującej pierścień steroidowy z grupą amidosiarczanową.

Wśród znanych inhibitorów sulfatazy steroidowej STS zawierających ugrupowanie amidosiarczanowe, w szczególności z dokumentu EP 1193250 znane są inhibitory STS o wzorze ogólnym:

W publikacji 1,4-Diaryl-substituted triazoles as cyclooxygenase-2 inhibitors: Synthesis, biological evaluation and molecular modeling studies, KaurJ. i wsp., Bioorganic & Medicinal Chemistry (2013), 21(14), 4288-4295, ujawniono związki chemiczne zawierające grupę sulfonamidową o wzorze:

a w szczególności:

PL 240 686 Β1

Opisane związki mają właściwości inhibitorów cyklooksygenazy.

Z dokumentu WO2015101670, znane są związki o wzorze ogólnym:

Zwłaszcza:

/ II J-r,

Sue

Związki mają zastosowanie jako inhibitory, dehydrogenazy 17P-hydroksysteroidowej. Enzym dehydrogenazy 17P-hydroksysteroidowej katalizuje redukcję 17P-steroidów, w tym: estronu do estradiolu, siarczanu dehydroepiandrosteronu (DHEAS) do siarczanu androstenediolu czy też dehydroepiandrosteronu (DHEA) do androstenediolu, wykazując działanie w odmiennym szlaku biosyntezy estrogenów oraz androgenów w organizmie w porównaniu ze szlakiem obejmującym działanie sulfatazy steroidowej. Ze względu na odmienną topologię miejsca aktywnego dehydrogenazy 17P-hydroksysteroidowej oraz sulfatazy steroidowej, inhibicja tych enzymów angażuje związki różniące się pod względem strukturalnym oraz mechanizmu działania.

W publikacji pt. Design, Synthesis, Biological Evaluation and Pharmacokinetics of Bis(hydroxyphenyi) substituted Azoles, Thiophenes, Benzenes, and Aza-Benzenes as Potent and Selective Nonsteroidal Inhibitors of 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 (17β-Η8ϋ1), Bey. E. i wsp., J. Med. Chem., 2008, 51 (21), pp 6725-6739 przedstawiono związki o wzorze ogólnym:

R,

W, X, Y, Z = N, S, Sa. C, CH, CCH.,

R_v R_ł=H, OH

Opisane związki mają również zastosowanie jako inhibitory dehydrogenazy 17P-hydroksysteroidowej. Ze względu na odmienną topologię miejsca aktywnego dehydrogenazy 17P-hydroksysteroidowej oraz sulfatazy steroidowej, inhibicja tych enzymów angażuje związki różniące się pod względem strukturalnym oraz mechanizmu działania.

Z publikacji WO2019245393 amidosiarczanowe pochodne 4-(1 -fenylo-1 H-[1,2,3]triazol-4-ylo)-fenolu oraz pochodne 4-(1-fenylo-1 H-[1,2,3]triazol-4-ylo)-fenolu są opisane. Opisano zastosowanie nowych związków jako środka o właściwościach inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub modulatora receptora estrogenowego.

Wciąż poszukuje się związków o wysokiej selektywności oraz możliwości zahamowania aktywności enzymu sulfatazy steroidowej i brakiem efektów ubocznych działania takich inhibitorów. Przedmiotem wynalazku są nowe związki chemiczne o wzorze ogólnym 1:

Wzór I

PL 240 686 Β1 gdzie η = 0, 1; Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH3, albo CH2CH3 albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

Związki o wzorze ogólnym 1 charakteryzują się strukturą chemiczną przypominającą budowę naturalnego substratu enzymu sulfatazy steroidowej STS dzięki temu imitującą budowę steroidów. Ponadto związki o wzorze ogólnym 1 zawierają w swojej budowie istotne z punktu widzenia aktywności biologicznej ugrupowanie amidosiarczanowe, biorące bezpośredni udział w reakcji enzymatycznej lub ulegające oddziaływaniom elektrostatycznym w centrum katalitycznym STS. Odejście od klasycznej budowy steroidowej skutkuje znaczną zmianą właściwości fizykochemicznych związków o strukturze ogólnej 1 jak i efektów działania biologicznego, w tym obniżeniem lub całkowitym wyeliminowaniem właściwości estrogenowych związków o strukturze ogólnej 1, które to właściwości są często parametrem limitującym wykorzystanie leków, zwłaszcza inhibitorów sulfatazy steroidowej, w praktyce klinicznej. Związki o strukturze ogólnej 1 wykazują znaczące różnice w stosunku do znanych związków imitujących układ steroidowy, wynikające z obecności pierścienia oksadiazolu oraz A/-acylowanej funkcji zawierającej podstawniki R1-R5. Obecność niniejszych ugrupowań wpływa znacząco na siłę oraz efektywność oddziaływania związków w miejscu katalitycznym sulfatazy steroidowej w wyniku licznych oddziaływań elektrostatycznych stabilizujących kompleks inhibitor-enzym. Ponadto, obecność A/-acylowanego fragmentu struktury związków o wzorze ogólnym 1 zawierającego podstawniki R1-R5 wpływa na zwiększenie właściwości hydrofobowych rdzenia inhibitora, co w konsekwencji prowadzi do poprawy transportu przedmiotowych związków do komórek nowotworowych, w wyniku ułatwionej penetracji i przenikania przez błony biologiczne. Konsekwencją tego jest zdecydowanie wyższa selektywność oraz skuteczniejsze zahamowanie aktywności enzymu sulfatazy steroidowej związków o wzorze ogólnym 1 w porównaniu ze związkami stanowiącymi stan techniki oraz niższe lub brak efektów ubocznych działania tych inhibitorów, jak i wykazują dodatkowe unikalne i oczekiwane właściwości biologiczne i medyczne. Przykładowe, korzystne związki z tej grupy przedstawiono poniżej w tabeli 1. Związki te mają aktywne działanie medyczne i biologiczne, i mają zastosowanie jako leki, a w szczególności jako leki o działaniu inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub o działaniu modulatora receptora estrogenowego, mające, zastosowanie zwłaszcza w przeciwnowotworowej terapii, zwłaszcza przeznaczone do terapii hormonalnej w leczeniu nowotworów hormonozależnych zwierząt, a zwłaszcza ssaków, w tym ludzi. Związki będące przedmiotem wynalazku mają zastosowanie biologiczne, w tym np. w diagnostyce i badaniach in vitro, jako inhibitory sulfatazy steroidowej i/lub modulatory receptora estrogenowego.

Przedmiotem wynalazku są również nowe związki chemiczne, stanowiące związki pośrednie w procesie otrzymywania związków o wzorze ogólnym 1. Związki te stanowią A/-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu, których struktury chemiczne przedstawiono za pomocą wzoru ogólnego 2:

Rs

Wzór 2 gdzie n = 0, 1; R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH3, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

Produkt pośredni oraz produkt końcowy w tym przypadku zawierają ten sam istotny fragment struktury chemicznej - rdzeń cząsteczki na bazie A/-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu imitujący układ steroidowy przy czym produkt końcowy otrzymywany jest bezpośrednio z produktu pośredniego w wyniku funkcjonalizacji grupy hydroksylowej rdzenia ugrupowaniem amidosiarczanowym. Związki o wzorze ogólnym 2 charakteryzują się aktywnymi właściwościami medycznymi i biologicznymi, i znajdują zastosowanie jako leki, zwłaszcza leki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, w tym antybakteryjnym lub leki o działaniu selektywnych modulatorów receptora estrogenowego.

PL 240 686 Β1

Związki o wzorze ogólnym 2 wykazują skuteczniejsze działanie przeciwdrobnoustrojowe, w tym antybakteryjne w porównaniu ze związkami znanymi ze stanu techniki. Ponadto charakteryzują się jednocześnie mniejszą zdolnością indukowania lekoodporności oraz niższą toksycznością dla organizmu. Związki o wzorze ogólnym 2 znajdują zastosowanie również jako środki przeciwdrobnoustrojowe i/lub modulatory receptora estrogenowego, zwłaszcza w diagnostyce i badaniach in vitro. Związki o wzorze ogólnym 2, ze względu na swoją budowę zawierającą rdzeń cząsteczki imitujący ugrupowanie steroidowe oraz A/-acylowane ugrupowania zawierające podstawniki R1-R5, wpływające na właściwości związków, zwłaszcza siłę wiązania się tych związków do receptorów estrogenowych oraz zwiększoną zdolność do przenikania przez błony biologiczne, wykazują wyższe powinowactwo i silniejsze wiązanie się do receptorów estrogenowych w porównaniu ze związkami ujawnionymi w stanie techniki i znajdują zastosowanie zwłaszcza jako selektywne modulatory receptora estrogenowego-zarówno w medycynie jak i ogólnych naukach biologicznych. Przykładowe, korzystne związki o wzorze ogólnym 2 przedstawiono w tabeli 2. Według wstępnych wyników badań, związki te wykazują również działanie przeciwdrobnoustrojowe, zwłaszcza antybakteryjne.

Wynalazek przedstawiono bliżej na wzorach, tabeli 1 i 2 i przykładach w jakich opisano sposób wytwarzania związków oraz opisano ich skuteczność.

Tabela 1

Przykładowe, korzystne amidosiarczanowe ΛΖ-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu:

Amidosiarczan 4-(5-(4 -benzamidofenylo)I,2j4-oksadiazoI-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(4fluorobenzamido)fenylo)-l,2,4-oksadiazol3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3fluorobenzamido)fenylo)-l,2,4-oksadiazol3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,4d i fluoiObenzamido)fenyl o)- i ,2,4-oksadi azol3-ilo)fenylu

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,5difluorobenzamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2,3,4trifluorobenzamido)fenylo)-l,2,4oksadiazol-3-iio)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3(tnfluorometyio)benzamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(4(1 ri fl uorometok sy)benzamido)fenylo )1,2,4-o ksadiazol-3-i lo) fenylu

O

f₃c

Amidosiarczan 4-(5-(4-(4(trifluorometylo)benzamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4(perfluorobenzamido)fenylo)-l ,2,4oksadiazol -3-ikpfenylu

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2,4,5tnfluorobenzamido)fenylo)-l ,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(4-fluoro-2(trifluorometylo)benzamido)fenylo)-l,2,4oksadiazol-3-ilo)fenyiu

Cl

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3chlorobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol 3-ilo)fenytu

Br

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3bromobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol3-ilo)fenylu

Cl

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,5dichlorobenzamido)fenyio)-1,2,4oksadiazo1-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,5dibromobcnzamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

PL 240 686 Β1

OSO₂NH₂(/ N~$ J N ⁰ ίΎ°' ιιί ^H H₃C^^ Amidosiarczan 4-(5-(4-(4metylobenzamido)fenylo)-l ,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu	OSO₂NH₂ Λ N ⁰ li^i^⁰' LJ ^H ch₃ Amidosiarczan 4-(5-(4-(3metylobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol3-ilo)fenylu
OSOjNHi JL N ⁰ [IJ H CHj Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,5dimetylobenzamido)fenylo)-l ,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu	oso₂nh₂ _λ jl N ⁰ i J ^H o₂n^^ Amidosiarczan 4-(5-(4-(4- nitrobenzamido)fenylo)-l,2,4-oksadiazol-3ilo)fenylu
OSO₂NH₂ _ rT A JU ° [II H no₂ Amidosiarczan 4-(5-(4-(3nitrobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol3-ilo)fenylu	OSO₂NH₂ S f/) [\| Ί h CH₂CH3 Amidosiarczan 4-(5-(4-(3etylobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadi azol -3 ilo) fenylu \|

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3izopropylobenzam ido)feny lo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3jodobenzamido)fenylo)-l,2,4-oksadiazoI-3ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3metoksybenzamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenyin

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,5dijodobenzamido)fenyło)-1,2,4-oksadiazo!3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(3,5metoksybenzami do) fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2fenyloacetamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3iJo)fenylu

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3fluorofeny to)acctamido)fenylo)-1,2,4-

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,4difluorofenylo)acetamido)fenylo)-l,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(4fl uorofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,5difluorofenylo)acetam ido)fcnylo)-1,2,4oksadiazol-3 -ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(2,3,4triiluorofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3(trifl uoromety I o)feny lo)acetami do)fenylo)1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(4(trifluorometylo)fenylo)acetamido)fenylo)1,2_t4-oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(4(trifluorometoksy)fenylo)acetamido)fenylo)1,2,4-oksadiazol-3-i1o)feny]u

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(2,4,5trifluorofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2(perfluorofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(4-fluoro*2(tri fi uorometylo)feny lo)acetamido) fenylo)1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3chlorofenyio)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,5dichloro fenylojacetam id o)feny Ιο)-1,2,4oksadiazoI-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3bromofenylo)acetamido) fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,5dibromofenylo)acetamido)fenylo)-l,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(4melylofeny lo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3metylofenylo)acetamido)fenylo)-l,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,5dimetyiofenylo)acetamido)feny lo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3nitrofenylo)acetamido)fenylo)-i,2,4oksadiazol-3-ito)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(4nitrofenylo)acetamido)fenylo)- i ,2,4-

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3etylofenylo)acetamido)fenyło)-1,2,4oksadiazo1-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3izopropy lofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazoi-3-ilo)fenylu

PL 240 686 Β1

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3jodofenylo)acetamido)fenylo)-l,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,5dijodofenylo)acctamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-ilo)fcnylu

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3metoksyfenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4oksadiazol-3-i1o)fenylo

Amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,5dimetoksyfenylo)acetamido)feny lo)- i ,2,4oksadiazol-3-ilo)fenylu

Tabela 2

Przykładowe, korzystne ΛΖ-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu:

PL 240 686 Β1

W-(4-(3<4-hydroksyfenylo)-l,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-4(tri fluorometoksy)benzamid

2,3,4,5,6-pentafluoro-/V-(4-(3-(4hydroksy fenylo)-1,2,4*oksadiazol-5ilo)fenylo)benzamid

2A54rifluoro-Ak(4-(3-(4-hydroksyfenylo)l_t2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamid

4-fluoro-/V-(4-(3-(4-hydroksy fenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2(trifluorometylo)benzamid

3-ch loro-Λ-(4-(3 -(4-hy droksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamid

3,5-dichloro-N-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)l,2,4-oksadiazol-5-i]o)fenylo)benzamid

PL 240 686 Β1

OH (/ _ J? N ⁰ ίΐΊ⁰' LJ ^H Br 3-bromo-jV-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fcnylo)benzamid	OH u (V ΒΤχ^Λ_ΝΛ^ \|\| J H Br 3,5-dibromo-W-(4*(3-(4-hydroksyfenyio}l,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamid
OH θ _Λ N ⁰ II J H h₃c^^ jV-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-4-metylobenzamid	OH Jł N ⁰ Γί °' CHj M(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-l ,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3-metyIobenzamid
OH _Λ Jl N ? ii* Η Ί h ch₃ ;V-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-l,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3,5dimetylobenzamid	OH _Λ Jl N ⁰ ιΓ^ι^^0, AJ ^H jV-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-4-nitrobenzaniid

PL 240 686 Β1

no₂ ^-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiaz.ol-5-ilo)fenyloj-3-nitrobgnzamid

ch₂ch₃

3-etylo-jV-(4-(3-(4-hydroksy fenyle)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamid

jV-(4-(3.(4-hydroksyfenylo> 1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3izopropylobenzamid

^-(4-(3 -(4-hydroksyfeny lo)* 1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3-jodobenzamid

jV-(4-(3-(4-hydroksyfenyio)-l,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3,5dijodobenzamid

OCH₃

ŻV-(4-(3-(4-hydroksyfcnylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3metoksybenzamid

PL 240 686 Β1

A-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-3,5dimetoksybenzamid

A^r-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-fenyloacetamid

2-(3-fluorofenylo)-A'-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5ilo)fenylo)acetamid

OH

2-(4-fluorofenylo)-JV-(4-(3-(4hydroksyfenylo)* 1 _t2,4-oksadiazol-5ilo)fenylo)acelamid

2-(3,4-difluorofenylo)-N-(4-(3-(4hydroksyfenylo)- i ,2,4-oksadiazol-5ilo)fenylo)acetamid

/V-(4-(3 -(4-hydroksy feny lo)-1,2,4oksadiazol-5 -i lo)fenylo)-2-(2,3,4trifluoro fenylo)acetamid

2-(3,5-difluorofenylo)-JV-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5ilo)fenylo)acetamid

A^,-(4-(3-(4-hyd roksyfeny lo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(3(trifluorometylo)fenylo)acetamid

PL 240 686 Β1

(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol5-ilo)fenylo)-2-(4(trifluorometylo)fenylo)acelamid

(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol5-ilo)fenylo)-2-(4(trifluorometoksy)fenylo)acetaniid

A44-(3-(4-hydroksy feny io)-1,2,4oksadiazo!-5-ilo)fenylo)-2(perfluorofenylo)acetamid

#-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(2,4,5iri fluorofenylojacetamid

2-(4-fluoro-2-(trifluorometylo)fenyio)-#(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-l,2,4-oksadiazol5-ilo)fenylo)acetamid

OH

2-(3,5-dichlorofenylo)-#-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-l,2,4-oksadiazol-5ilo)fenylo)acetamid

2-(3-chIorofenylo)-#-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5ilo)fenylo)acetamid

2-(3-bromofenylo)-#-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-1,2,4 -oksadiazo! -5 i lo]fe ny io)acetami d

PL 240 686 Β1

OH Br 1 Jl N 0 ^γ·Ό H 2-(3,5-dibromofenyIo)-V-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-! ,2,4-oksadiazol-5ilo)fcnylo)acetamid	OH ęS N^ΌυυΥ⁰' H iV-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadia2ol-5-ilo)fenylo)-2-(4metylofenyJo)acetamid
OH _Λ 1 ^Npjj 0 Γ*Ί A^4-(3-(4-hydroksyfenylc0-l,2,4oksadiazo!-5-ilo)fenylo)-2-(3mety tofeny 1 o)acetamid	OH ch₃ n-^ H 2-(3,5-dimetylofenylo)-jV-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-l,2,4-oksadiazol*5ilo)fenylo)acetamid
OH Ν-Λ Η ;V-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(4nitrofenylo )acetami d	OH cS ί N O O₂n /V-(4-(3-(4-hydroksy fenyle)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(3nitrofenylo)acctamid
OH _Λ J N O ^^ O' 2-(3-etylofenyk>b¥-(4-(3-(4hydroksyfenylo)-l,2,4-oksadiazol-5- ilo)fenylo)acetamid	OH _{Λ Λ} JL N jOl a JLj ⁰ Π A'-(4-(3-(4-hydroksy feny lo)-1,2,4- oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(3izopropylofenylo)acetamid

PL 240 686 Β1

Η

OH

2V-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(3______jodofenylo)acetamid__

M(4-(3-(4-hydroksyfenylo> 1,2,4oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-(3metoksyfenylojacetamid

OH

Przykład

A) Otrzymywanie związków o wzorze ogólnym 1:

2-(3,5-dijodofenylo)-A44-(3-(4hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazo1-5-

X-(4-(3 -(4-hydroksyfeny Ιο)-1,2,4oksadiazo[-5-ilo)fenylo)-2-(3metoksyfenylo)acetamid

gdzie n = 0, 1; Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH3, albo CH2CH3, albo CH(CH3)2, albo OCH3, albo NO2, zostało przeprowadzone wg sposobu przedstawionego na schemacie 1:

PL 240 686 Β1

Schemat 1. Synteza nowych inhibitorów sulfatazy steroidowej (STS) na bazie amidosiarczanowych A/-acylowanych pochodnych. 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu; Py-pirydyna, A/A/-DMA-dimetyloacetamid, DCM - dichlorometan.

Pierwszy etap syntezy obejmuje otrzymywanie pochodnej A/’,4-dihydroksybenzimidamidu (2) w reakcji 4-hydroksybenzonitrylu (1) z chlorowodorkiem hydroksyloaminy w obecności węglanu sodu. Otrzymany produkt (2) jest kolejno traktowany chlorkiem kwasu p-nitrobenzoesowego, prowadząc do otrzymania 4-[5-(4-nitrofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (3). Związek (3) w kolejnym etapie syntezy zostaje poddany reakcji uwodornienia w obecności katalizatora palladowego, w wyniku której otrzymywany jest 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenol (4). Kolejny etap syntezy obejmuje reakcje funkcjonalizacji grupy aminowej pochodnej (4). W tym celu 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenol (4) poddawany jest reakcji acylowania na atomie azotu odpowiednią pochodną chlorku kwasu benzoesowego lub fenylooctowego (5), prowadząc do otrzymania rdzenia inhibitora w postaci A/-acylowanej pochodnej 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (6). Ostatni etap syntezy obejmuje otrzymanie, produktu końcowego (7) poprzez traktowanie otrzymanego rdzenia inhibitora (6) generowanym in situ chlorkiem aminosulfurylu.

W zależności od tego jaki produkt końcowy będzie otrzymywany, do rekcji używa się innego substratu, tj. podstawionego w pierścieniu aromatycznym chlorku kwasu benzoesowego lub fenylooctowego o wzorze ogólnym 3:

O

gdzie n = 0, 1; Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH3, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂ albo OCH₃ albo NO2.

PL 240 686 B1

Podstawniki w substracie dobiera się stosownie do otrzymywanych związków pośrednich i produktu końcowego, co jest znane dla osoby biegłej w tej dziedzinie. Poszczególne etapy syntezy, dla wariantów wynalazku, przedstawiono poniżej. Każdy związek otrzymuje się podobnie, dobierając substraty w zależności do danych podstawników.

Etap 1:

Otrzymywanie N’-4-dihydroksybenzimidamidu (2)

Do roztworu 4-hydroksybenzonitrylu (2 g, 16.79 mmol) w 20 mL bezwodnego etanolu wprowadzono chlorowodorek hydroksyloaminy (1.517 g, 21.826 mmol) oraz węglan sodu (2.313 g, 21.826 mmol). Tak przygotowaną mieszaninę reakcyjną doprowadzono do temperatury wrzenia rozpuszczalnika, którą utrzymywano przez 3 godziny. Po tym czasie dodano ponownie chlorowodorek hydroksyloaminy (1.517 g, 21.826 mmol) oraz węglan sodu (2.313 g, 21.826 mmol). Reakcję ogrzewano przez kolejne 20 godzin. Osad przesączono, a rozpuszczalnik odparowano. Otrzymano 2.552 g produktu z wydajnością 96%.

Etap 2:

Otrzymywanie 4-[5-(4-nitrofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (3)

Do roztworu kwasu 4-nitrobenzoesowego (1 eq, 5.48 mmol, 0.915 g) w bezwodnym toluenie (6 mL) wprowadzono chlorek tionylu (1.2 eq, 6.57 mmol, 0.782 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3h. Następnie rozpuszczalnik odparowano i wprowadzono pirydynę (9 mL) oraz N’,4-dihydroksybenzimidaimd (1.2 eq, 6.57 mol). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez noc. Następnie mieszaninę ochłodzono, dodano etanol (3 mL) i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany surowy produkt rekrystalizowano z etanolu.

Wydajność 56%; temperatura topnienia: 259-260°C (rozkład); vmax (ATR)/cm^-1 3419, 1593, 1562, 1516, 1428, 1336, 1276, 1169, 1104, 840, 746, 716; ¹H NMR δH (400 MHz, CD3COCD3) 8.54-8.48 (4H, m, Ar-H), 8.02 (2H, d, J = 8.4 Hz, Ar-H), 7.05 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H); ¹³C NMR δc (101 MHz, DMSO-d6) 173.6, 169.0, 160.6, 150.4, 129.5, 129.3, 129.1, 124.4, 117.6, 115.9; HRMS (m/z) [M - H]calcd: 282.0520, found: 282.0718.

Etap 3:

Otrzymywanie 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]-fenolu (4)

Do zawiesiny 4-(5-(4-nitrofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-iIo)fenolu (1 eq, 13.4 mmol, 3.800 g) w 250 mL bezwodnego metanolu wprowadzono 10% Pd/C (10% masowych substratu, 0.380 g). Reakcję hydrogenolizy prowadzono przez 4 godziny w reaktorze. Następnie roztwór przesączono przez celit, a otrzymany przesącz odparowano. Otrzymano 3.228 g produktu końcowego z wydajnością 95%.

Wydajność 95%; temperatura topnienia: 259-262°C (rozkład); vmax (ATR)/cm^-1 3394, 3320, 3110, 1605, 1565, 1504, 1361, 1234, 1168, 830, 764 ; 1H NMR δκ (400 MHz, DMSO-d₆) 10.17 (1H, S, OH), 7.88 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7:81 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 6.92 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 6.71 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 6.15 (2H, s, NH2); ¹³C NMR δc (101 MHz, DMSO) 176.0, 168.1, 160.5, 153.9, 130.0, 129.2, 117.8, 116.3, 114.0, 110.2; HRMS (m/z) [M - H]^- calcd: 252.0778, found: 252.0889 Etap 4:

Ogólna procedura otrzymywania N -acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (6)

Do roztworu odpowiedniej pochodnej kwasu benzoesowego lub fenylooctowego (1 eq, 1.18 mmol) w bezwodnym toluenie (5 mL) dodano chlorek tionylu (4 eq, 4.72 mmol, 0.560 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3.5 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a do pozostałości dodano bezwodny aceton (6 mL), bezwodny węglan potasu (4 eq, 4.72 mmol, 0.652 g) oraz 4-(5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenol (1 eq, 1.18 mmol, 0.300 g). Całość mieszano w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, dodano wodę destylowaną (50 mL), po czym mieszaninę zakwaszono stężonym kwasem solnym do pH = 2. Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i rekrystalizowano z mieszaniny EtOH : H2O.

PL 240 686 Β1

Przykład 1 - Etap 4

Otrzymywanie A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamidu (6)

Do roztworu kwasu benzoesowego (1 eq, 1.18 mmol, 0.144 g) w bezwodnym toluenie (5 mL) dodano chlorek tionylu (4 eq, 4.72 mmol, 0.560 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3.5 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a do pozostałości dodano bezwodny aceton (6 mL), bezwodny węglan potasu (4 eq, 4.72 mmol, 0.652 g) oraz 4-(5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenol (1 eq, 1.18 mmol, 0.300 g). Całość mieszano w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, dodano wodę destylowaną. (50 mL), po czym mieszaninę zakwaszono stężonym kwasem solnym do pH = 2. Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i rekrystalizowano z mieszaniny EtOH : H2O.

Wydajność 36%; temperatura topnienia: 277-278°C (rozkład); v_max (ATR)/cm'¹ 3116, 1661, 1599, 1503, 1357, 1319, 1274, 837, 764, 709; ¹H NMR6h (400 MHz, DMSO-de) 10.67 (1H, s, NH), 10.17 (1H, s, OH), 8.18 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 8.10 (2H, d, J= 8.8 Hz, Ar-H), 8.00 (2H, d, J= 7.1 Hz, Ar-H), 7.94 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ar-H), 7.67-7.61 (1H, m, Ar-H), 7.60-7.54 (2H, m, Ar-H), 6.96 (2H, d, J = .8.7 Hz, Ar-H); ¹³C NMR 8c (101 MHz,. DMSO-de) 175.2, 168.6, 166.6, 160.8, 144.1, 135.0, 132.4, 129.4, 129.2, 129.0, 128.3, 120.8, 118.7, 117.4, 116.4; HRMS (m/z) [Μ - H]^_ calcd: 356.1040, found: 356.1217. Przykład 2 - Etap 4 Otrzymywanie 3-fluoro-A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamidu (6)

F

Do roztworu kwasu 3-fluorobenzoesowego (1 eq, 1.18 mmol, 0.165 g) w bezwodnym toluenie (5 mL) dodano chlorek tionylu (4 eq, 4.72 mmol, 0.560 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia, przez 3.5 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a do pozostałości dodano bezwodny aceton (6 mL), bezwodny węglan potasu (4 eq, 4.72 mmol, 0.652 g) oraz 4-(5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenol (1 eq, 1.18.mmol, 0.300 g). Całość mieszano w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, dodano wodę destylowaną (50 mL), po czym mieszaninę zakwaszono stężonym kwasem solnym do pH = 2. Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i rekrystalizowano z mieszaniny EtOH : H2O.

Wydajność 22%; temperatura topnienia: 291-292°C (rozkład); v_max (ATR)/cm·¹ 3288, 1658, 1574, 1500, 1412, 1359, 1271, 1167, 843, 763; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DMSO-de) 10.71 ,(1H, s, NH), 10.17 (1H, s, OH) 8.19 (2H, d, J= 8.8 Hz, Ar-H), 8.08 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H). 7.93 (2H, d, J=8.7 Hz, Ar-H), 7.88-7.79 (2H, m, Ar-H), 7.67-7.60 (1H, m, Ar-H), 7.5-7.46 (1H, m, Ar-H),-6.96 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ar-H); ¹³C NMR 8c (101 MHz, DMSO-de) 175.1, 168.6, 165.1 (d, ⁴Jc-f = 2.5 Hz), 162.4 (d, ¹Jc-f = 244.6 Hz)

PL 240 686 Β1

160.8 , 143.8 137.2 (d, ³Jc-f = 6.9 Hz), 131.2 (d, ³Jc-f = 8.0 Hz), 129.4, 129.3, 124.6 (d, ⁴Jc-f = 2.8 Hz), 120.9 119.3 (d, ²Jc-f = 21.1 Hz) 118.9, 117.4, 116.4, 115.2 (d, ²Jc-f = 23.0 Hz); HRMS (m/z) [Μ - H]^_calcd: 374.0946, found: 374.1128.

Przykład 3 - Etap 4

Otrzymywanie A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-fenyloacetamidu (6)

Do roztworu kwasu fenylooctowego (1 eq, 1.18 mmol, 0.161 g) w bezwodnym toluenie (5 mL) dodano .chlorek tionylu (4 eq, 4.72 mmol, 0.560 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3.5 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a do pozostałości dodano bezwodny aceton (6 mL), bezwodny węglan potasu (4 eq, 4.72 mmol, 0.652 g) oraz 4-(5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenol (1 eq, 1.18.mmol, 0.300 g). Całość mieszano w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, dodano wodę destylowaną (50 mL), po czym mieszaninę zakwaszono stężonym kwasem solnym do pH = 2. Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i rekrystalizowano z mieszaniny EtOH : H2O.

Wydajność 42%; temperatura topnienia: 204-206°C (rozkład); v_max (ATR)/cm·¹ 3315, 1663, 1611, 1501, 1438, 1365, 1330, 1247, 1170, 842, ,762; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DMSO-de) 10.62 ( 1H, s, NH), 10.16 (1H, s, OH), 8.12 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7.92 (2H, d, J = 8.9 Hz, Ar-H), 7.88 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7.38-7.32 (4H, m, Ar-H), 7.30-7.24 (1H, m, Ar-H), 6.95 (2H, d, J = 8.9 Hz, Ar-H), 3.72 (2H, s, CH₂); ¹³C NMR6c (101 MHz, DMSO-de) 175.1,170.3, 168.5,160.8 144.0, 136.0,129.6,129.4, 129.3,128.8, 127.1, 119.7, 118.3, 117.4, 116.4, 43.8; HRMS (m/z) [M- HF calcd: 370.119,7, found: 370.1412.

Przykład 4 - Etap 4

Otrzymywanie 2-(3,4-difluorofenylo)-A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)acetamidu (6)

Do roztworu kwasu 3,4-difluorofenylooctowego (1 eq, 1.18 mmol, 0.203 g) w bezwodnym toluenie (5 mL) dodano chlorek tionylu (4 eq, 4.72 mmol, 0.560 g). Reakcję prowadzono w temperaturze wrzenia przez 3.5 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a do pozostałości dodano bezwodny aceton (6 mL), bezwodny węglan potasu (4 eq, 4.72 mmol, 0.652 g) oraz 4-(5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenol (1 eq, 1.18 mmol, 0,300 g). Całość,, mieszano w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, dodano wodę destylowaną, (50 mL), po czym mieszaninę zakwaszono stężonym kwasem solnym do pH = 2. Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i rekrystalizowano z mieszaniny EtOH : H2O.

Wydajność 50%; temperatura topnienia: 217-220°C (rozkład); v_max. (ATR)/cm'¹ 3393, 1603, 1500, 1412, 1358, 1277, 1208, 1114, 844, 763; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DMSO-de) 10.62 (1H, s, NH), 10.16 (1H, s, OH), 8.13 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7.92 (2H, d, J= 8.7 Hz, Ar-H), 7.87 (2H, d, J=8.8 Hz, Ar-H), 7.46-7.36 (2H, m, Ar-H), 7.21-7.16 (1H, m, Ar-H), 6.95 (2H, d, J= 8,7 Hz, Ar-H) 3.75 (2H, s, CH₂); ¹³CNMR6c(101 MHz, DMSO-de) 175.1, 169.7, 168.5, 160.8, 149.6 (dd, ¹Jc-f = 245.0 Hz, ²Jc-f = 12.6 Hz),

PL 240 686 Β1

148.9 (dd, ¹Jc-f = 244.4 Hz, ²Jc-f = 12.3 Hz), 143.8, 133.6 (dd, ³Jc-f = 6.3 Hz, ⁴Jc-f = 3.8 Hz), 129.4, 129.3, 126.6 (dd, ³Jc-f = 6.3 HZ, ⁴Jc-f = 3.4 Hz), 119.8, 118.8 (d, ²Jc-f = 17.1 Hz), 118.4, 117.7 (d, ²Jc-f = 16.9 Hz), 117.4, 116.4, 42.5; HRMS (m/z) [Μ - H]^_ calcd: 406.1008, found: 406.1250.

Etap 5:

Ogólna procedura otrzymywania amidosiarczanowych A/-acylowanych pochodnych 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (7)

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1,5 eq, 1.5 mmol) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1,5 mmol) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol). Całość mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny. Następnie roztwór odpowiednich pochodnych A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamidu lub A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-fenyloacetamidu (1 eq, 1 mmol) w A/,A/-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z acetonitrylu.

Przykład 1 - Etap 5

Otrzymywanie amidosiarczanu 4-(5-(4-benzamidofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu (7)

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1,5 eq, 1.5 mmol, 0.212 g) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.069 g) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol, 0.00139 g). Całość mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny. Następnie roztwór A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamidu (1 eq, 1 mmol, 0.357 g) w A/,A/-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, mieszaninę reakcyjną wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z acetonitrylu.

Wydajność 45%; temperatur topnienia: 241-243°C (rozkład); v_max (ATR)/cm·¹ 3305, 3199, 1663, 1523, 1365, 1317, 1155, 873, 844, 771; ¹H NMR8h (400 MHz, DMSO-de) 10.69 (1H,.s, NH), 8.25-8.16 (6H, m, Ar-H), 8.12 (2H, d, J = 8.7 Hz, Ar-H), 8.00 (2H, d, J = 8.6 Hz, Ar-H), 7.67-7.62 (1H, m, Ar-H), 7.61-7.55 (2H, m, Ar-H),7.52 (2H, d, J= 8.6 Hz); ¹³CNMR8c(101 MHz, DMSO-de) 175.8, 168.0, 166.6, 152.9, 144.3, 135.0, 132.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.3, 125.0, 123.4, 120.8, 118.4; HRMS (m/z) [Μ - H]calcd: 435.0768, found: 435.1004.

Przykład 2 - Etap 5

Otrzymywanie amidosiarczanu 4-(5-(4-(3-fluorobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu (7)

PL 240 686 Β1

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.212 g) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.069 g) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol, 0.00139 g). Całość mieszano w temperaturze 40°C przez 3,5 godziny. Następnie roztwór 3-fluoro-A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)benzamidu (1 eq, 1 mmol, 0376 g) w A/,A/-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, mieszaninę reakcyjną wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z acetonitrylu.

Wydajność 48%; temperatura topnienia: 251-253°C (rozkład); v_max (ATR)/cm'¹ 3332, 3224, 1668, 1589, 1503, 1365, 1320, 1271,1157, 873, 844, 772; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DMSO-de) 10.72 (1H, s, NH), 824-814 (6H, m, Ar-H, NH₂), 8.10 (2H, d, J= 8.8 Hz, Ar-H), 7.86 (1H, d, J = 7.9 Hz, Ar-H), 7.84-8.79 (1H, m, Ar-H), 7.67-7.60 (1H, m, Ar-H), 7.52 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7.50-7.46 (1H, m, Ar-H); ,¹³C NMR δο (101 MHz, DMSO-de) 175.8, 168.0, 165.2 (d, ⁴Jc-f = 2.6 Hz), 162.4 (d, ¹Jc-f = 244.6 Hz), ,152.9, 144.0, 137.2 (d, ³Jc-f = 6.9 Hz),131.2 (d, ³Jc-f = 8.0 Hz), 129.4, 129.3, 124.9, 124.6 (d, ⁴Jc-f = 2.7 Hz), 123.4, 120.9, 119.4 (d, ²Jc-f = 21.1 Hz), 118.7, 115.2 (d, ²Jc-f = 23.0. Hz); HRMS (m/z) [M-H]calcd: 453.0674, found: 453.0927.

Przykład 3 - Etap 5

Otrzymywanie amidosiarczanu 4-(5-(4-(2-fenyloacetamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu (7)

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.212 g) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.069 g) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol, 0.00139 g). Całość mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny. Następnie roztwór A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)-2-fenyloacetamidu (1 eq, 1 mmol, 0.371 g) w A/,A/-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, mieszaninę reakcyjną wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z acetonitrylu.

Wydajność 39%; temperatura topnienia: 217-220°C (rozkład); v_max (ATR)/cm·¹ 3263, 3062,1671, 1604, 1504, 1416, 1353, 1154, 870, 848, 759; ¹H NMR δΗ (400,MHz, DMSO-de) 10.64 (1H, s, NH), 8.22-8.13 (6H, m, Ar-H, NH2), 7.90 (2H, d, J = 8.9 Hz, Ar-H), 7.51 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7.39-7.31 (4H, m, Ar-H), 7.29-7.24 (1H, m, Ar-H), 3.72 (2H, s, CH2); ¹³C NMR δο (101 MHz, DMSO-d6)-175.8, 170.3, 168.0, 152.9, 144.2, 136.0, 129.6, 129.5, 129.3, 128.8, 127.1, 124.9, 123.4, 119.7, 118.1, 43.9; HRMS (m/z) [Μ - H]- calcd: 449.0925, found: 449.1170.

Przykład 4 - Etap 5

Otrzymywanie amidosiarczanu 4-(5-(4-(2-(3,4-difluorofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu (7)

H

PL 240 686 Β1

Do roztworu izocyjanianu chlorosulfurylu (1.5 eq, i.5 mmol, 0.212 g) w bezwodnym dichlorometanie dodano mieszaninę kwasu mrówkowego (1.5 eq, 1.5 mmol, 0.069 g) i A/,A/-dimetyloacetamidu (0.016 eq, 0.016 mmol, 0.00139 g). Całość mieszano w temperaturze 40°C przez 3.5 godziny. Następnie roztwór 2-(3,4-difluorofenylo)-A/-(4-(3-(4-hydroksyfenylo)-1,2,4-oksadiazol-5-ilo)fenylo)acetamidu (1 eq, 1 mmol, 0.407 g) w A/,A/-dimetyloacetamidzie (5 mL) wprowadzono do mieszaniny reakcyjnej i mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, mieszaninę reakcyjną wylano na wodę (50 mL). Powstały osad odsączono, wysuszono na powietrzu i krystalizowano z acetonitrylu.

Wydajność 38%; temperatura topnienia: 228-229°C (rozkład); v_max (ATR)/cm'¹ 3398, 3239, 1667, 1603, 1515, 1411, 1376, 1179, 1151, 862, 768; ¹H NMR δ_Η (400 MHz, DMSO-de) 10.64 (1H, s, NH), 8.21-8.13 (6H, m, Ar-H, NH₂), 7.88 (2H, d, J = 8.9 Hz, Ar-H), 7.51 (2H, d, J = 8.8 Hz, Ar-H), 7.46-7.36 (2H, m, Ar-H), 7.22-7.16 (1H, m, Ar-H), 3.76 = (2H, s, CH₂); ¹³C NMR δο (101 MHz, DMSO-de) 175.8, 169.7, 168.0, 152.9, 150.0 (dd, ¹Jc-f = 245,0 Hz, ²Jc-f = 12.7 Hz) 148.9 (dd, Vc-f = 244.4 Hz, ²Jc-f = 12.6 Hz) 144.0, 133.6 (dd, ³Jc-f = 6.3 Hz, ⁴Jc-f = 3.8 Hz), 129.6, 129.3,126.6 (dd, ³Jc-f = 6.3, Hz, ⁴Jc-f = 3.3 Hz), 124.9, 123.4, 119.8, 118.8 (d, ²Jc-f = 17.1 Hz), 118.2, 117.7 (d, ²Jc-f = 16.9 Hz), 42.5; HRMS (m/z) [Μ - H]^_calcd: 485.0736, found: 485.1138.

W podobny, sposób otrzymuje się pozostałe związki o wzorze ogólnym 1 i 2.

B) Badania aktywności biologicznej i medycznej otrzymanych pochodnych' w teście radioizotopowym z wykorzystaniem linii komórkowej MCF-7 jako źródła enzymu sulfatazy steroidowej.

Badania aktywności in vitro otrzymanych nowych związków o wzorze ogólnym 1:

gdzie n = 0, 1; Ri, R₂, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH3, albo CH₂CH₃, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO₂

Aktywność medyczna i biologiczna związków o wzorze ogólnym 1, mających zastosowanie jako związki aktywne - leki lub środki do wykorzystania in vitro, np. w diagnostyce, wykazujące działanie jako inhibitory sulfatazy steroidowej STS, została oznaczona w teście radioizotopowym z wykorzystaniem linii komórkowej MCF-7 jako źródła enzymu sulfatazy steroidowej według następującejprocedury opisanej poniżej.

Komórki MCF-7 zawieszono w zmodyfikowanej pożywce Eagle Dulbecco zawierającej 10% bydlęcej surowicy płodowej i hodowano do uzyskania 80% konfluencji.

Uzyskane komórki wysiano w 24-komorowych mikropłytkach (Nest Biotechnology) przy gęstości 10⁵ komórek w komorze.

Ilość komórek określono przy pomocy Burker Counting Chamber.

Inkubację komórek prowadzono przez 20 godzin w 37°C w, wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ oraz 95% powietrza w pożywce bez surowicy (0.5 mL) z dodatkiem znakowanego radioizotopowo siarczanu estronu ([3H]E1S) wraz z inhibitorem lub bez.

Po przeprowadzonej inkubacji pożywkę (0.45 mL) usunięto z komory, a utworzony produkt w postaci estronu ekstrahowano za pomocą toluenu (4 mL).

- Aktywność sulfatazy steroidowej mierzono za pomocą radioluminometru MicroBeta (Perkin Elmer), Każdy test wykonano w trzech powtórzeniach.

Aktywność biologiczną i medyczną inhibitorów STS, tj. związków według wzoru 1, została oznaczona poprzez analizę przebiegu reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem znakowanego radioizotopowo siarczanu estronu ([3H]E1S). Powyższa reakcja polegała na hydrolizie pochodnej ([3H]E1S) do estronu w wyniku działania enzymu STS. Uwolniony estron został oznaczony. W końcowym etapie wyznaczono stopień zahamowania aktywności enzymu sulfatazy steroidowej (%) po inkubacji z odpowiednim inhibitorem, tj. związkiem o wzorze ogólnym 1. Badania wykonano z wykorzystaniem dedykowanego

Claims

PL 240 686 B1 dla tego typu oznaczeń testu, w którym dane pozyskiwano za pomocą pomiaru radioluminom etrem. Dla wszystkich możliwych związków o wzorze ogólnym 1, które szczegółowo przedstawiono w tabeli 1 jako korzystne amidosiarczanowe N-acylowane pochodne 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu, poprzez analizę danych zarejestrowanych radioluminometrem, obliczono poziom aktywności enzymu sulfatazy steroidowej, który kształtował się w przedziale od 0.6 do 43.8% oraz od 30.5 do 100% przy stężeniu inhibitora równym odpowiednio 1 oraz 10 nM. Wykazano, że stopień inhibicji enzymu sulfatazy steroidowej (wyrażony w procentach) dla poszczególnych przykładów związków o wzorze ogólnym 1 kształtował się w następujący sposób: amidosiarczan 4-(5-(4-benzamidofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu 96.1%, amidosiarczan 4-(5-(4-(3-fluorobenzamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu 97%, amidosiarczan 4-(5-(4-(2-fenyloacetamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu 99.4%, amidosiarczan 4-(5-(4-(2-(3,4-difluorofenylo)acetamido)fenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenylu 56.2%.

Z tego względu związki o wzorze ogólnym 1 wykazują działanie biologiczne jak i medyczne, i mają zastosowanie medyczne jako leki. Potwierdzono, że nowe związki według wzoru ogólnego 1, jako jeden z możliwych mechanizmów działania biologicznego, wykazują silne działanie hamujące aktywność enzymu sulfatazy steroidowej w niskim nanomolowym stężeniu, co jest wystarczające, aby związki działały jako leki zaliczane do inhibitorów sulfatazy steroidowej lub też jako związki znajdujące zastosowanie jako inhibitory sulfatazy steroidowej w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych, badaniach klinicznych in vivo. W szczególności związki o wzorze ogólnym 1 mają zastosowanie jako leki w terapii nowotworowej, a w szczególności w terapii hormonozależnych nowotworów zwierząt, zwłaszcza ssaków, w tym ludzi.

Zbadano również działanie biologiczne i medyczne związków o wzorze ogólnym 2 mające zastosowanie jako leki; o działaniu modulatora receptora estrogenowego (SERM) lub też jako związki do zastosowania in vitro znajdujące zastosowanie w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych jako modulatory receptora estrogenowego (SERMs). Badanie to przeprowadzono za pomocą wstępnej analizy powinowactwa związków do receptorów estrogenowych w znanych testach in vitro. W tym teście oczyszczone ludzkie receptory estrogenowe α i β inkubowano przez 4 godziny w 23°C z różnymi stężeniami związków w obecności 5 nM [2,4,6,7,16,17-3 H )-ęstradiolu w objętości całkowitej 150 μl. Roztwory testowanych związków przygotowano w DMSO. Wszystkie związki, w tym [2,4,6,7,16,17-3 H]-estradiol i receptory, rozcieńczono w buforze Tween/PBS (99.85: 0.15 w/v). Po inkubacji niezwiązany [2,4,6,7,16,17-3 H]-estradiol usunięto przez dodanie mieszaniny 10% DCC i 2% albuminy z surowicy bydlęcej, inkubując przez 15 min w 4°C, a następnie wirowano przy 6000 g przez 5 minut w 4°C. 150 μl supernatantu dodano do 4 cm³ cieczy scyntylacyjnej i radioaktywność związanego estradiolu zmierzono przy użyciu licznika ciekłoscyntylacyjnego. Potwierdzono działanie biologiczne i medyczne związków przedstawionych w tabeli 2 charakteryzujących się wysokim stopniem wiązania do receptorów estrogenowych. Ze względu na fakt, iż związki o wzorze ogólnym 1 mogą być hydrolizowane do związków o wzorze ogólnym 2, zbadano również działanie biologiczne i medyczne związków o wzorze ogólnym 1 mających zastosowanie jako leki o działaniu modulatora receptora estrogenowego (SERM) lub też jako związki znajdujące zastosowanie w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych jako modulatory receptora estrogenowego (SERMs). We wstępnych badaniach z wykorzystaniem standardowego testu in vitro zaobserwowano wysoki stopień powinowactwa związków o wzorze ogólnym 1 do receptorów estrogenowych.

We wstępnych badaniach mikrobiologicznych na podstawie antybiogramów potwierdzono również działanie biologiczne i medyczne - przeciwdrobnoustrojowe związków o wzorze ogólnym 2. Wstępne testy właściwości przeciwdrobnoustrojowych przeprowadzono przy użyciu metody krążkowo-dyfuzyjnej, W testowanej metodzie złoża zostały zaszczepione powierzchniowo inokulum szczepów testowych, przygotowanym z hodowli bakteryjnej w płynnym podłożu, odwirowanej i zamieszczonej w sterylnej soli fizjologicznej. Na przygotowane podłoże nałożono krążki bibuły nasączonej roztworem testowanych związków w odpowiednich stężeniach. Po 24 godzinne inkubacji mierzono strefy zahamowania wzrostu [mm]. Wstępne wyniki badań właściwości przeciwdrobnoustrojowych wykazały wysoką skuteczność związków przedstawionych w tabeli 2 charakteryzujących się znaczącym zahamowaniem rozrostu drobnoustrojów testowych w badaniach in vitro.

Zastrzeżenia patentowe

1. Związki chemiczne imitujące układ, steroidowy i zawierające ugrupowanie amidosiarczanowe o wzorze ogólnym 1:

PL 240 686 Β1

gdzie η = 0, 1; Ri, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH₃, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃ albo NO2.
2. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 1:

do zastosowania jako leki, gdzie n = 0, 1; R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH₃, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO2.
3. Związki chemiczne do zastosowania według zastrz. 2 jako leki o działaniu inhibitora sulfatazy steroidowej i/lub jako leki o działaniu modulatora receptora estrogenowego.
4. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 1:

do zastosowania jako inhibitor sulfatazy steroidowej /lub modulator receptora estrogenowego, gdzie n = 0, 1; R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH₃, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO2.
5. Związki chemiczne imitujące układ steroidowy o wzorze ogólnym 2:

H

PL 240 686 Β1 gdzie η = 0, 1 ; R-i, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH₃, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO2.
6. Związki chemiczne o worze ogólnym 2:

do zastosowania jako leki, gdzie n = 0, .1; R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF₃, albo OCF₃, albo CH₃, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO2.
7. Związki chemiczne do zastosowania według zastrz. 6 jako leki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, korzystnie przeciwbakteryjnym i/lub jako leki o działaniu modulatorów receptora estrogenowego.
8. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 2:

do zastosowania jako środek przeciwdrobnoustrojowy i/lub modulator receptora estrogenowego, gdzie n = 0,1; R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH₃ albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO2.
9. Sposób otrzymywania związków o wzorze ogólnym 1:

gdzie n = 0, 1; R1, R2, R3, R4, Rs = H albo F, albo Br, albo Cl, albo I, albo CF3, albo OCF3, albo CH₃, albo CH2CH3, albo CH(CH₃)₂, albo OCH₃, albo NO2, przy czym sposób przeprowadza się kilkuetapowo według schematu 1:

PL 240 686 Β1

gdzie w pierwszym etapie otrzymuje się pochodną A/’,4-dihydroksybenzimidamidu (2) w reakcji 4-hydroksybenzonitrylu (1) z chlorowodorkiem hydroksyloaminy w obecności węglanu sodu, zaś otrzymany produkt (2) jest kolejno traktowany chlorkiem kwasu p-nitrobenzoesowego prowadząc do otrzymania 4-[5-(4-nitrofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo)fenolu (3), zaś związek (3) w kolejnym etapie syntezy zostaje poddany reakcji uwodornienia w obecności katalizatora (najkorzystniej palladowego) w celu otrzymania pochodnej 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (4), która następnie zostaje poddana reakcji funkcjonalizacji grupy aminowej odpowiednią pochodną chlorku kwasu benzoesowego lub fenylooctowego (5), prowadząc do otrzymania rdzenia inhibitora w postaci A/-acylowanej pochodnej 4-[5-(4-aminofenylo)-1,2,4-oksadiazol-3-ilo]fenolu (6), przy czym otrzymuje się produkt końcowy (7) poprzez traktowanie otrzymanego rdzenia inhibitora (6) generowanym in situ chlorkiem aminosulfurylu.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że pierwszy etap przeprowadza, się w czasie minimum 30 minut, korzystnie w czasie od 2 do 24 godzin.
11. Sposób według zastrz. 9 lub 10, znamienny tym, że w pierwszym etapie po upływie minimum 1 godziny, najkorzystniej 3 godzin, dodaje się kolejny ekwiwalent chlorowodorku hydroksyloaminy oraz soli węglanu lub wodorowęglanu, najkorzystniej węglanu sodu i całość ogrzewa się najkorzystniej w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez kolejne 20 godzin.
12. Sposób według zastrz. 9 lub 10, lub 11, znamienny tym, że drugi etap przeprowadza się traktując A/-hydroksy-4-metoksybenzimidamid (2) odpowiednią reaktywną pochodną kwasu karboksylowego (najkorzystniej chlorkiem kwasowym) lub odpowiednim kwasem karboksylowym w obecności odczynnika kondensującego.
13. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-12, znamienny tym, że trzeci etap obejmujący reakcję redukcji przeprowadza się, stosując uwodornienie w obecności katalizatora, najkorzystniej katalizatora palladowego lub odczynników redukujących, najkorzystniej podsiarczynu sodu Na2S2O4.
14. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-13, znamienny tym, że czwarty etap przeprowadza się in situ bez izolacji lub z izolacją produktów pośrednich.
15. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-14, znamienny tym, że czwarty etap prowadzi się przez co najmniej 12 godzin, korzystnie w czasie od 12 do 48 godzin.

PL 240 686 B1 33
16. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-15, znamienny tym, że piąty etap przeprowadza się w warunkach bezwodnych w temperaturze w zakresie od 15 do 40°C, korzystnie 30-40°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.
17. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-16, znamienny tym, że piąty etap przeprowadza się w czasie minimum 6 godzin.