PL239881B1 - Sposób badania właściwości aseptycznych na tkaninie traktowanej substancjami niedyfundującymi - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób badania własności antybakteryjnych i antygrzybiczych na tkaninie traktowanej substancjami niedyfundującymi, w którym bada się aktywność metaboliczną z zastosowaniem soli tetrazolowej oraz przeprowadza się analizę ilościową z zastosowaniem znacznika fluorescencyjnego, dla tkanin stosowanych w przemyśle tekstylnym, a w szczególności w produkcji skarpet, pończoch rajstop, materiałów sportowych i medycznych. Poza producentami tekstyliów, opracowany sposób znajdzie zastosowanie w laboratoriach dokonujących oceny aseptyczności tkanin i przędzy.

Description

PL 239 881 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób badania własności antybakteryjnych i antygrzybiczych na tkaninie traktowanej substancjami niedyfundującymi, dla tkanin stosowanych w przemyśle tekstylnym, a w szczególności w produkcji skarpet, pończoch, rajstop, materiałów sportowych i medycznych. Poza producentami tekstyliów, opracowany sposób znajdzie zastosowanie w laboratoriach dokonujących oceny aseptyczności tkanin i przędzy.

Obecnie na rynku tekstylnym dostępne są różnego rodzaju produkty wykazujące właściwości antygrzybiczne czy antybakteryjne, które mają na celu niszczenie drobnoustrojów na skórze, błonach śluzowych, w zakażonych ranach. Oferowane produkty takie jak skarpety, pończochy, pościel czy getry uszyte są z tkanin o leczniczych właściwościach lub też dodaje się do nich substancje charakteryzujące się antybakteryjnymi czy antygrzybicznymi właściwościami.

W dezynfekcji i antyseptyce znajdują zastosowanie związki z różnych grup chemicznych, można wśród nich wyróżnić: alkohole, aldehydy, fenole, środki utleniające, chlorowce, sole metali ciężkich czy barwniki.

Powszechnie znanym jest zdolność bakterii takich jak Chromobacterium violaceum, Janthinobacterium lividum, Iodobacter fluviatilis i Pseudoalteromonas luteoviolacea, do wytwarzania barwnika wiolaceiny o szeroko opisanych właściwościach antybakteryjnych, antygrzybicznych i przeciwnowotworowych. Produkcja tego barwnika związana jest z odpowiedzią na stres i procesem formowania biofilmu przez bakterie.

Publikacja US6875421 ujawnia niebieski barwnik fluorescencyjny Calcofluor White, tj. kwas (5-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazyn-2-ylo]amino]-2-[(E)-2-[4-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazin-2-ylo]amino]2-sulfofenylo]etenylo]benzenosulfonowy, który jest powszechnie wykorzystywany w szybkiej i czułej metodzie mikroskopowej identyfikacji mikroorganizmów. Barwnik ten wiąże się z β 1-3, β 1-4 polisacharydami ściany komórkowej (chityna i celuloza) barwiąc grzyby, algi (glony) oraz rośliny. Widmo spektralne barwnika charakteryzuje się pasmem absorpcji w zakresie 300-412 nm z maksimum 347 nm, przy czym stosunek maksimum wzbudzenia Ex do maksimum emisji Em wynosi 360/430 nm. Calcofluor White wykorzystywany jest głównie do identyfikacji infekcji grzybiczych w tkankach.

Oferowane produkty tekstylne często używane są podczas nawracających infekcji czy też w medycynie. Dlatego też bardzo ważna jest weryfikacja własności antybakteryjnych i antygrzybicznych przędzy i otrzymywanych z niej tekstyliów.

Znane są metody oceny jakościowej tkanin poprzez hodowlę mikroorganizmów traktowanych tekstyliami. Zatem znane metody pozwalają na zbadanie aktywności komórek mikroorganizmów w zawiesinie, w której umieszczone były próbki tkanin. Metody zawiesinowe wzbudzają jednak największe wątpliwości przez brak uwzględnienia roli adsorpcji komórek mikroorganizmów na włóknach tkanin. Metody te nie pozwalają np. na rozróżnienie, czy spadek liczby mikroorganizmów jest wynikiem wzrostu ich śmiertelności, czy też wyższej adsorpcji na tkaninie. Ponadto stosowane metody zakładają uwalnianie (dyfuzję) analizowanego czynnika z tkaniny. Z kolei znane metody badania przez zahamowanie wzrostu na próbce bardziej wskazują na odporność materiału na działanie mikroorganizmów niż charakter biobójczy badanej substancji na tkaninie, poza tym badania te prowadzone są bez zewnętrznego źródła węgla, co w przypadku tkanin kontaktujących się w czasie ich użytkowania ze skórą jest bezzasadne.

W publikacji pt.: „Comparison of methods for determining the effectiveness of antibacterial functionalized textiles”, Haase i wsp., 2017, PLoS ONE 12(11): e0188304, opisano badanie aktywności metabolicznej komórek w zawiesinie, w której umieszczone były próbki tkanin. Takie rozwiązanie sprawdza się, ale tylko w przypadku substancji dyfundującej od tkaniny, lub wskazuje wpływ samej zanurzonej w zawiesinie mikroorganizmów tkaniny. W tym drugim przypadku mówi o żywotności komórek w pożywce w obecności tkaniny, ale nie uwzględnia np. stopnia dyfuzji badanego czynnika od tkaniny czy własności fizycznych badanego ośrodka, takich np. jak gęstość, lepkość itp.

Znane i powszechnie dostępne do oceny żywotności (aktywności metabolicznej) komórek są testy z zastosowaniem soli tetrazolowej, tj. bromkiem 3,[4,5-dimetylotiazolo-2-yl]-2,5-difenytetrazolowym (MTT) i soli sodowej 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolio-5-karboksyanilidu (XTT).

Stosując test MTT i pomiary gęstości optycznej (OD) w zawiesinie, w której była wcześniej inkubowana tkanina, a więc tak jak to analizowano w publikacji D1, wynik dotyczący liczby żywych komórek jest zdecydowanie mniej jednoznaczny, m.in. dlatego, że metoda pomiaru OD jest metodą pośrednią

PL 239 881 B1 i znacznie mniej dokładną (szczególnie gdy mikroorganizmy produkują dużo śluzu zawyżającego wartości OD, a liczebność i różnorodność metaboliczna komórek mierzona MTT w całym podłożu hodowlanym jest znacznie większa niż w pomiarach na tkaninie). Ponadto na kondycję metaboliczną komórek w całej pożywce hodowlanej wpływa więcej czynników (np. dostępność składników odżywczych, zawartość produktów przemiany materii) niż w przypadku testu MTT tylko mikroorganizmów związanych z włóknem tkaniny. Należy też pamiętać, że na zawartość składników odżywczych, czy produktów przemiany materii wpływa przede wszystkim tempo podziałów komórkowych, a te są inne w kontroli i różne w zależności od stężenia badanego czynnika. Dlatego też badania mikroorganizmów w pożywkach, po usunięciu tkaniny, są prowadzone w znacznie słabiej zdefiniowanych warunkach i tym samym wyniki otrzymane z zastosowaniem metod opisanych są mniej wiarygodne.

Ponadto znana jest również metoda dysków dyfuzyjnych, ale ona podobnie jak pomiar OD i test MTT dają wiarygodne wyniki, tylko w przypadku substancji dobrze dyfundującej od tkaniny.

Znana jest również metoda wymywania (elucji) bakterii z tkanin zanurzonych w pożywce i ich analiza ilościowa przez zliczanie wyrosłych kolonii. Wymywanie bakterii ze skrawków tkanin uprzednio zanurzonych w zawiesinie bakterii jest czasochłonne i obarczone znacznym błędem m.in. ze względu na trudności w ocenie czy rzeczywiście wszystkie bakterie zostały wymyte. Czynności dodatkowe niezbędne do wiarygodnej oceny wyników uzyskanych tą metodą to np. określenie dla każdego rodzaju tkaniny i barwnika stopnia adhezji mikroorganizmów do tkaniny. Z kolei analiza ilościowa przez zliczanie wyrosłych kolonii wiąże się z czasochłonną i mało dokładną metodą seryjnych rozcieńczeń. Dlatego też konieczna jest w przypadku tej metody częsta modyfikacja protokołów tych oznaczeń.

Dotychczas opisane metody analizują to, co ma miejsce w hodowli po usunięciu tkaniny, a więc np. liczebność mikroorganizmów, ich aktywność metaboliczną, zawartość substancji czynnej pochodzącej z tkaniny w pożywce. Metody te nie odwołują się więc bezpośrednio do interakcji mikroorganizmów z tkaniną, nie uwzględniają parametrów fizykochemicznych i etapów hodowli, co jest istotne przy analizie mikroorganizmów pozostałych po usunięciu tekstyliów, a dodatkowo, w większości przypadków wymagają dyfuzji czynnika aseptycznego od tkaniny.

Należy zatem uznać, że opisane dotychczas techniki i metody nie pozwalają na wiarygodną ocenę własności przeciwustrojowych tkanin zawierających biobójczy czy biostatyczny składnik niedyfundujący lub trudno dyfundujący do otoczenia.

Celem wynalazku jest dostarczenie skutecznego i dokładnego sposobu oceny własności antybakteryjnych i antygrzybiczych tekstyliów zawierających biobójczy czy biostatyczny składnik niedyfundujący lub trudno dyfundujący do otoczenia. Opracowanie uniwersalnej metody badania własności aseptycznych substancji silnie zaadsorbowanych na tkaninie, takich jak np. barwniki, jest oczekiwaną innowacją w przemyśle włókienniczym, szczególnie specjalizującym się w produkcji tzw. odzieży antybakteryjnej i antygrzybiczej. Obecnie, własności aseptyczne przypisywane są takiej odzieży najczęściej tylko na podstawie faktu, że zawiera ona działający aseptycznie dodatek. Istnieją natomiast trudności w ocenie własności aseptycznych samej tkaniny, szczególnie gdy jest ona traktowana substancją aseptyczną niedyfundującą lub trudno dyfundującą do otoczenia, a to z kolei w przemyśle włókienniczym cecha powszechna, bo pożądana.

Istotą wynalazku jest sposób badania właściwości antygrzybicznych i/lub antybakteryjnych bezpośrednio na tkaninie, polegający na sprzężeniu dwóch metod następujących po sobie:

- aktywności metabolicznej z zastosowaniem soli tetrazolowej,

- ilościowej z zastosowaniem znacznika fluorescencyjnego Calcofluor White, tj.:

w etapie badania aktywności metabolicznej:

- przenosi się tkaninę do roztworu soli tetrazolowej w płynnej pożywce RPMI,

- inkubuje się w około 37°C przez 3-4 godziny przy stałym mieszaniu,

- wiruje się i dodaje się DMSO,

- mierzy się absorbancję przy długości fali 570 nm, a następnie w etapie badania metodą ilościową z zastosowaniem znacznika fluorescencyjnego Calcofluor White, inaczej kwasu (5-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazyn-2-ylo]amino]-2-[(E)-2-[4-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazin-2-ylo]amino]-2-sulfofenylo]etenylo]benzenosulfonowego:

- przenosi się tkaninę do roztworu Calcofluor White w PBS rozcieńczonego zgodnie z wymogami producenta,

- inkubuje się przez czas wskazany przez producenta Calcofluor White,

- przenosi się próbki do studzienek płytki wielodołkowej,

- mierzy się rozkład intensywności fluorescencji na powierzchni płytki przy użyciu czytnika mikropłytek.

PL 239 881 B1

Korzystnie, zastosowaną solą tetrazolową jest bromek 3,[4,5-dimetylotiazolo-2-yl]-2,5-difenytetrazolowy (MTT) lub sól sodowa 2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolio-5-karboksyanilidu (XTT).

Korzystnie, tkanina wybrana jest z bawełny, wiskozy, poliamidu, wełny, akrylu i poliestru. Korzystnie, zastosowany barwnik do tkanin to barwnik niedyfundujący od tkaniny do otoczenia. Opracowany według wynalazku sposób opiera się na ocenie żywotności i liczebności mikroorganizmów, dzięki której możliwe jest określenie faktycznego wpływu tkaniny na aktywność metaboliczną i liczebność mikroorganizmów. Jest to możliwe, ponieważ analizie poddana jest aktywność metaboliczna i liczebność organizmów związanych bezpośrednio z tkaniną. Rozwiązanie według wynalazku pozwala na bezpośrednią ocenę przeciwustrojowych własności tkanin potraktowanych substancjami niedyfundującymi, bądź bardzo słabo dyfundującymi z tkaniny do otoczenia.

W opisanym w wynalazku rozwiązaniu sprzężono dwie metody, tj. oceny żywotności i liczebności, bezpośrednio na tekstyliach, a nie jak znane jest ze stanu techniki, w hodowli mikroorganizmów traktowanych tekstyliami. Wynalazek opiera się na analizie stanu na granicy tkanina-mikroorganizmy, tym samym umożliwia faktyczną analizę wpływu tekstyliów i zaadsorbowanych na nich substancji, nawet wówczas, gdy te substancje, tak jak np. barwniki nie dyfundują z tkaniny do otoczenia. Ponadto opracowany sposób eliminuje wpływy wspomnianych wcześniej własności fizykochemicznych pożywki, etapu hodowli czy stężenia uwolnionej z tkaniny substancji do pożywki.

Niniejsze rozwiązanie jest zasadniczo różne od tych znanych w stanie techniki, ponieważ test z MTT/XTT nie jest prowadzony w zawiesinie komórek, w której była umieszczona tkanina, ale na tkaninie, a dokładnie przędzy budującej tkaninę. Po inkubacji przędzy z mikroorganizmami, przędza jest usuwana, ale analizie nie jest poddana zawiesina komórek mikroorganizmów, tak jak jest to znane ze stanu techniki, ale przędza, która jest przepłukiwana, a oceniany stopień żywotności dotyczy komórek, bezpośrednio kontaktujących się z przędzą (tkaniną).

W ten sposób opisany w niniejszym zgłoszeniu sposób rozwiązuje problem: (1) braku konieczności dyfuzji czynnika, którym traktowana jest przędza, a który potencjalnie ma jej zapewnić własności przeciwdrobnoustrojowe, a ponadto (2) stanowi sposób na bezpośrednie wskazanie badanych własności aseptycznych tkaniny, tzn. eliminuje nieścisłości otrzymanych efektów wynikające ze zmiennych własności fizykochemicznych ośrodka, tj. pożywki, takich jak np. lepkość, co z kolei wpływa np. na szybkość dyfuzji w ośrodku.

Sam test z MTT/XTT nie dostarczy informacji na temat liczby żywotnych bakterii, ponieważ nie można przy jego pomocy odróżnić redukcji wynikającej z mniejszej liczby bakterii o niezmienionej aktywności metabolicznej, od redukcji wynikającej z obecności tej samej całkowitej liczby bakterii, które mają inną aktywność metaboliczną, ale analizując tylko mikroorganizmy związane z przędzą i dodatkowo zliczając je dzięki zastosowaniu barwnika Calcofluor dostajemy dokładne informacje o: a) liczbie komórek związanych z tkaniną,

b) stosunku związanych komórek żywych do martwych, co pozwala oznaczyć dokładnie stałą przeżywalności komórek pozostających w bezpośrednim kontakcie z tkaniną, czego nie zapewnia żadna ze znanych nam opisanych metod.

Opisany sposób jest jednoznaczny i dedykowany do badania wszystkich rodzajów tkanin traktowanych czynnikami niedyfundującymi od tkaniny. Znane w stanie techniki metody analizują liczbę bakterii wymytych z tkaniny. Ujawniona zaś w zgłoszeniu metoda analizuje liczbę bakterii na włóknach tkaniny, dzięki czemu korzystne jest jej stosowanie w badaniach porównawczych, w tym ilościowych, szczególnie w badaniach własności aseptycznych tkanin nie wykazujących aktywności dyfuzyjnej ich składników. Jednocześnie zawiera też mniej etapów, przez co jest m.in. mniej czasochłonna i kosztowna.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania został uwidoczniony na rysunku, na którym: fig. 1 to wykres przedstawiający wpływ stężenia wiolaceiny na liczebność komórek C. albicans na podłożu agarowym, fig. 2 to wykres przedstawiający wpływ stężenia wiolaceiny na przeżywalność komórek C. albicans mierzoną testem MTT, fig. 3, to wykres przedstawiający wpływ barwienia tkaniny na przeżywalność komórek C. albicans mierzoną testem MTT, fig. 4 to wykres przedstawiający wpływ barwienia różnych typów tkaniny na przeżywalność komórek C. albicans mierzony poprzez intensywność fluorescencji barwnika Calcofluor White, zaś fig. 5. to wykres przedstawiający wpływ barwienia różnych typów tkanin na przeżywalność komórek bateryjnych mierzonych testem XTT.

PL 239 881 B1

Przykład 1

Badanie właściwości aseptycznych tkanin traktowanych ekstraktami J. lividum wobec Candida albicans

1.1. Wpływ ekstraktu barwnej bakterii J. lividum na rozwój C. albicans

Odważono liofilizat barwny bakterii J. lividum tak, aby otrzymać 440 μg wiolaceiny na 1 ml wodnej zawiesiny. Zawiesinę ogrzano i homogenizowano przy pomocy sonikatora.

1.1.1. Wpływ stężenia wiolaceiny na C. albicans na podłożu stałym

Zawiesinę wiolaceiny dodawano do gorącego roztworu podłoża agarowego (agar wzbogacony) tak, by końcowe stężenie wiolaceiny wynosiło 0; 7,5; 15 i 30 μg/ml, a następnie wylewano na szalki i pozostawiano do zestalenia. Następnie na podłoże naniesiono i równomiernie rozprowadzano komórki C. albicans (ok. 1000 komórek/szalkę) pochodzące z płynnej hodowli. Szalki inkubowano przez 2 doby w temperaturze 30°C. Następnie policzono widoczne, uformowane kolonie określając liczbę jednostek tworzących kolonię (CFU). Zaobserwowano silne działanie grzybobójcze co pokazano na wykresie na fig. 1.

Uzyskane wyniki potwierdzają grzybobójcze działanie wiolaceiny względem C. albicans i stanowią potwierdzenie, że stosowany w badaniach ekstrakt bakterii J. lividum produkującej wiolaceinę zachowuje grzybobójcze własności oczyszczonej wiolaceiny.

1.1.2. Test żywotności C. albicans w pożywce płynnej

W celu weryfikacji możliwości stosowania testu żywotności z MTT w badaniach wpływu barwnego liofilizatu bakterii J. lividum na C. albicans przeprowadzono poniższy eksperyment.

Zawiesinę wiolaceiny dodawano do pożywki bogatosojowej (YPD) tak, by końcowe stężenie barwnika w próbce wynosiło 0; 7,5; 15 i 30 μg/ml w probówkach typu eppendorf. Następnie do probówek wprowadzano zawiesinę komórek C. albicans w ilości 106 komórek/ml i inkubowano przez noc w temperaturze 30°C ciągle wytrząsając. Po nocy komórki żwirowano, zawieszono w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) wraz z solą tetrazolową, tj. bromkiem 3,[4,5-dimetylotiazolo-2-yl]-2,5-difenytetrazolowym (MTT) i inkubowano przez 4 godz. Następnie do probówek dodano dimetylosulfotlenek (DMSO), wymieszano i żwirowano. Nadsącz przeniesiono do studzienek płytki 96-dołkowej i mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm. Wyniki testu zostały przedstawione na wykresie na fig. 2 i świadczą o tym, że wraz ze wzrostem stężenia zaobserwowano znaczny spadek absorbancji świadczący o spadku przeżywalności komórek C. albicans. Powyższy wynik oprócz potwierdzenia, że stosowany w badaniach ekstrakt bakterii J. lividum produkującej wiolaceinę zachowuje grzybobójcze własności oczyszczonej wiolaceiny, dowodzi również możliwości zastosowania testu MTT dla badania komórek traktowanych tymi ekstraktami.

Przykład 2

Wpływ tkanin traktowanych barwnymi ekstraktami J. lividum na rozwój C. albicans

Włókna tkanin barwionych ekstraktami J. lividum przenoszono w sterylnych warunkach do studzienek płytki 24-dołkowej lub probówek typu eppendorf, w których zakładano hodowle C. albicans tak jak opisano poniżej.

Metodę opracowano opierając się na analizie własności biobójczych i biostatycznych 6 rodzajów tekstyliów, niebarwionych i barwionych barwnikiem z grupy barwników indolowych, na żywotność i liczebność jednokomórkowych grzybów chorobotwórczych Candida albicans. Stosowany barwnik był barwnikiem niedyfundującym od przędzy, o wykazanych uprzednio własnościach biobójczych m.in. względem C. albicans, które potwierdzono w naszych badaniach w ramach opracowywanej metody bez stosowania przędzy (kontrola pozytywna). Przędza niebarwiona stanowiła kontrolę negatywną.

2.1. Test rozwoju C. albicans na włóknach

Komórki C. albicans w ilości 10⁶/ml RPMI przenoszono do studzienek płytki 24-dołkowej z umieszczonymi badanymi włóknami barwionymi ekstraktem bakterii barwnej lub niebarwionymi (kontrola). Płytki inkubowano przez 24-godziny w temp. 37°C, a następnie włókna przenoszono do kolejnych studzienek zawierających czysty PBS w celu przepłukania (2-krotne) i analizowano testem MTT i z zastosowaniem barwnika fluorescencyjnego wiążącego się do chityny wchodzącej w skład ściany komórkowej C. albicans. Im wyższa intensywność fluorescencji tym więcej komórek.

2.2. Analiza z wykorzystaniem testu MTT

Włókna po płukaniu przenoszono do probówek typu eppendorf zawierających roztwór MTT w płynnej pożywce RPMI i inkubowano przez 4 godziny. Następnie probówki wirowano, dodawano DMSO, ponownie wirowano i przenoszono nadsącz do studzienek płytki 96-dołkowej. Mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm.

PL239 881 Β1

W przypadku tkanin barwionych ekstraktem bakterii barwnej zaobserwowano wyraźny spadek absorbancji świadczący o grzybobójczym działaniu barwnika na C. albicans (fig. 3).

2.3. Analiza z wykorzystaniem Calcofluor White

Włókna przenoszono do probówek typu eppendorf zawierających roztwór Calcofluor White w PBS (10 000x rozcieńczony) i inkubowano przez 5 minut. Włókna po 1-krotnym przepłukaniu przenoszono do studzienek płytki 24-dołkowej i mierzono rozkład intensywności fluorescencji na powierzchni płytki przy użyciu czytnika mikropłytek. W przypadku wszystkich testowanych tkanin zaobserwowano znacznie niższy sygnał w tkaninach barwionych barwnym ekstraktem bakterii w stosunku do kontroli, co świadczy o znacznie niższej liczbie komórek patogenu w hodowlach zawierających nitki wybarwionej tkaniny w porównaniu do hodowli z nitkami tkanin niebarwionych (fig. 4).

W przypadku tkanin barwionych, test MTT wykazał wyraźny spadek absorbancji przy długości fali 570 nm świadczący o grzybobójczym działaniu tkanin wybarwionych wiolaceiną na C. albicans. W badaniach z zastosowaniem barwnika fluorescencyjnego Calcofluor White w przypadku wszystkich testowanych tkanin barwionych zaobserwowano znacznie niższą intensywność fluorescencji niż w przypadku tkanin niebarwionych, co świadczy o znacznie niższej liczbie komórek patogenu w hodowlach zawierających nitki wybarwionej tkaniny w porównaniu do hodowli z nitkami tkanin niebarwionych. Otrzymane wyniki wskazują, że zastosowana metoda pozwala na jednoznaczną weryfikację własności ograniczających wzrost patogenu przez badane tekstylia, nawet wówczas, gdy czynnik modyfikujący tekstylia, w tym wypadku barwnik, nie dyfunduje z przędzy do otoczenia.

Przykład 3

Wpływ tkanin traktowanych barwnymi ekstraktami J. Iividum na rozwój komórek bakteryjnych

W badaniu zastosowano tekstylia traktowane (barwione) wiolaceiną, jako przykładem antyseptycznej niedyfundującej od tkaniny substancji i te same tekstylia, ale nietraktowane badaną substancją. Z przeznaczonych do badania tekstyliów przygotowano nić lub przędzę długości 1 cm. Otrzymane włókna poddano sterylizacji (można też poddać sterylizacji tekstylia, ale wówczas proces pozyskiwania nici (przędzy) musi przebiegać w warunkach sterylnych i z tego względu taka kolejność postępowania nie jest zalecana).

Zakładano hodowlę płynną bakterii, względem których badane miały być własności biobójcze nitek, tj. odpowiednio Escherichia coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus i Bacillus subtilis. a) hodowlę prowadzono w temperaturze 30°C przez 16 godzin z wytrząsaniem, w pożywce TBS.

W przypadku szczepów nietypowych czas i temperatura hodowli muszą zostać zoptymalizowane, tak aby pozwoliły na uzyskanie wartości gęstości optycznej przy długości fali 650 nm (OD) wymaganej w niżej opisanym postępowaniu.

W celu uzyskania co najmniej 10 probówek typu eppendorf po 0,5 ml zawiesiny bakterii o wartości OD = 1,0, każda:

b) sterylnie pobrano po 1 ml homogennej otrzymanej hodowli i sterylnie oznaczono OD. Homogenność hodowli uzyskano przez zastosowanie wytrząsarki typu worteks;

c) po oznaczeniu OD próbki wirowano przez 15 minut przy obrotach 300 χ g (jeżeli niemożliwy jest sterylny pomiar OD, to z homogennej hodowli ponownie pobrać sterylnie 1 ml i sterylnie żwirować);

d) otrzymane osady zawieszono w sterylnym TBS, tak aby powstała zawiesina miała OD =1,0.

OD w każdym przypadku oznaczać względem sterylnego podłoża, traktowanego jako odniesienie.

W probówkach typu eppendorf z tak przygotowanymi hodowlami umieszczono sterylnie fragmenty nici niebarwionych (dla prób kontrolnych) i barwionych (dla prób badanych). Eppendorfy zamknięto i inkubowano z wytrząsaniem w 30°C przez 4 godziny.

Fragmenty nici sterylnie pobierano z hodowli, przepłukiwano dwukrotnie buforem PBS, zanurzając nić w buforze, a następnie wykonywano test ΧΤΤ.

a) w celu wykonania testu ΧΤΤ umieścić przepłukaną nić w 0,100 ml roztworu ΧΤΤ o stężeniu końcowym 0,3 mg/ml (0,1 ml aktywatora PMS + 5 ml roztworu ΧΤΤ) i inkubować w 37°C przez 3 godziny ciągle mieszając/wytrząsając; po tym czasie próbki żwirować przy obrotach 6000 χ g przez 20 minut i pobrać po 60 μΙ barwnych nadsączy, umieścić w płytce 96-dołkowej i mierzyć absorpcję przy długości fali 450 nm.

Na podstawie uzyskanych wyników oblicza się % bójczości, stosując wzór:

% bójczości = * 100% lub uzyskuje informację o % żywych komórek, jeżeli w powyższym wzorze pominie się „1

Claims (4)

1. PL 239 881 B1

   Uzyskane wyniki potwierdzają bakteriobójcze działanie barwionych tkanin, nawet gdy czynnik modyfikujący tekstylia nie dyfunduje z przędzy do otoczenia (fig. 5).

   Opracowana metoda pozwala na bezpośrednią analizę własności aseptycznych tkanin. Dotychczas opisane metody analizują to, co ma miejsce w hodowli po usunięciu tkaniny, a więc np. liczebność mikroorganizmów, ich aktywność metaboliczną, zawartość substancji czynnej pochodzącej z tkaniny w pożywce. Nie odwołują się więc bezpośrednio do interakcji mikroorganizmów z tkaniną, nie uwzględniają parametrów fizykochemicznych i etapów hodowli, co jest istotne przy analizie mikroorganizmów pozostałych po usunięciu tekstyliów, a dodatkowo, w większości przypadków wymagają dyfuzji czynnika aseptycznego od tkaniny.

   Metoda według wynalazku pokazuje faktyczny wpływ tkaniny na aktywność metaboliczną i liczebność mikroorganizmów - analizie poddana jest aktywność metaboliczna i liczebność organizmów związanych z tkaniną. Nie ma więc konieczności uwzględniania wpływu parametrów fizykochemicznych i etapów hodowli, dzięki czemu czynniki te nie zafałszowują otrzymanych wyników.

   Co więcej przedmiotowy wynalazek jako jedyny pozwala na bezpośrednią ocenę przeciwdrobnoustrojowych własności tkanin potraktowanych substancjami niedyfundującymi, bądź bardzo słabo dyfundującymi z tkaniny do otoczenia.

   W opisanej metodzie sprzężono dwie metody, tj. oceny żywotności i liczebności, ale nie w hodowli mikroorganizmów traktowanych tekstyliami, ale bezpośrednio na tekstyliach, tzn. metoda ta w badaniach analizuje stan na granicy tkanina-mikroorganizmy, tym samym umożliwia faktyczną analizę wpływu tekstyliów i zaadsorbowanych na nich substancji, nawet wówczas, gdy te substancje, tak jak np. barwniki nie dyfundują z tkaniny do otoczenia. Ponadto opracowana metoda eliminuje wpływy wspomnianych wcześniej własności fizykochemicznych pożywki, etapu hodowli czy stężenia uwolnionej z tkaniny substancji do pożywki.

   Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób badania właściwości antygrzybicznych i/lub antybakteryjnych bezpośrednio na tkaninie obejmujący badanie aktywności metabolicznej oraz wykonanie analizy ilościowej ze znacznikiem, w którym:

   - umieszcza się tkaninę w roztworze soli tetrazolowej w płynnej pożywce RPMI,

   - inkubuje się w około 37°C przez 3-4 godziny przy stałym mieszaniu,

   - wiruje się i dodaje się DMSO,

   - mierzy się absorbancję przy długości fali 570 nm, a następnie

   - przenosi się tkaninę do rozcieńczonego zgodnie z wymogami producenta roztworu Calco- fluor White (kwasu (5-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazyn-2-ylo]amino]-2-[(E)-2-[4-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazin-2-ylo]amino]-2-sulfofenylo]etenylo]-benzenosulfonowego) w PBS,

   - inkubuje się przez czas wskazany przez producenta Calcofluor White (kwasu (5-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazyn-2-ylo]amino]-2-[(E)-2-[4-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-1,3,5-triazin-2-ylo]amino]-2-sulfofenylo]etenylo]-benzenosulfonowego),

   - przenosi się próbki do studzienek płytki wielodołkowej.

   - mierzy się rozkład intensywności fluorescencji na powierzchni płytki przy użyciu czytnika mikropłytek.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że solą tetrazolową jest bromek 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolowy (MTT) lub sól sodowa (2,3-bis-[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazoilo-5-karboksyanilidu) (XTT).
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że tkaniną jest bawełna, wiskoza, poliamid, wełna, akryl lub poliester.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że tkanina przed badaniem jest traktowana barwnikiem do tkanin niedyfundującym z tkaniny do otoczenia lub bardzo słabo dyfundującym z tkaniny do otoczenia.