PL236834B1

PL236834B1 - 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo-6,19- oksidoandrostan-17-on i sposób wytwarzania 3β,11α-dihydroksy- 5α-chloro-17a-oksa-D-homo-6,19-oksidoandrostan-17-onu

Info

Publication number: PL236834B1
Application number: PL426022A
Authority: PL
Inventors: Ewa Kozłowska; Agata Matera; Edyta Kostrzewa-Susłow; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2018-06-22
Publication date: 2021-02-22
Also published as: PL426022A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest związek o nazwie 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo-6,19-oksidoandrostan-17-on o wzorze 2 i sposób jego wytwarzania. Powyższy sposób polega na tym, że w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh BBT, następuje hydroliza grupy acetylowej przy C-3, regioselektywna hydroksylacja w pozycji 11α i utlenieniu typu Baeyera-Villigera pierścienia D. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (chloroform).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 3β ,11 a-dihydroksy-5a-chloro-17a- oksa-D-homo-6,19-oksidoandrostan-17-on i sposób wytwarzania 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo-6,19-oksidoandrostan-17-onu.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym jako prekursor leków antykoncepcyjnych.

Wprowadzenie mostka 6,19-oksiranowego w strukturze związków steroidowych powoduje ugięcie szkieletu pomiędzy pierścieniami A i B. (G. Burton, M. Galigniana, S. de Lavallaz, A. L. BrachetCota, E. M. Sproviero, A. A. Ghini, C. P. Lantos and M. C. Damasco, Mol. Pharmacol., 1995, 47, 535543). Wykazano, że niektóre związki posiadające takie ugrupowanie mają interesujące aktywności biologiczne. Analog 21-hydroksyprogesteronu jest selektywnym antyglukokortykoidem pozbawionym mineralokortykoidowych i progestagenowych aktywności (G. P. Vicent, M. C. Monteserin, A. S. Veleiro, G. Burton, C. P. Lantos and M. D. Galigniana, Mol. Pharmacol., 1997, 52, 749-753), a analog 2 pregnanolonu jest silnym środkiem przeciwdrgawkowym (A. S. Veleiro, R. Rosenstein, M. L. Grilli, C. Jaliffa, F. Speroni and G. Burton, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 343-346; M. Joselevich, A.A. Ghini, G. Burton 6,19-Carbon-bridged steroids. Synthesis of 6,19-methanoprogesterone. Org. Biomol. Chem. 2003, 1,939-943). Istnieją również doniesienia dotyczące działania zapobiegającego migotaniu komór serca C-19 steroidów posiadających mostek 6,19-oksiranowy. Z opisu patentowego US 3,001,989 znane są właściwości przeciwbólowe i są bakteriostatyczne wobec bakterii Gram-dodatnich. Związki steroidowe posiadające mostek 6,19-oksiranowy są prekursorami posiadających właściwości antykoncepcyjne 19-norsteroidów (B. Berkoz, E. Denot, A. Bowers. Steroids CCXXX. Conversion of 6β, 19oxides and lactones into 19-nor steroids. Steroids. 1,1963, 251-270).

Szczep Beauveria bassiana KCh BBT nie był do tej pory ujawniony.

W literaturze nie ma doniesień dotyczących 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo6,19-oksidoandrostan-17-onu.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh BBT. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3β-acetyloksyy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-on o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 3 dni. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku hydrolizy grupy acetylowej przy C-3, regioselektywnej hydroksylacji w pozycji 11α i utlenieniu pierścienia D typu Baeyera-Villigera, otrzymuje się 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-Dhomo-6,19-oksidoandrostan-17-on, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Beauveria bassiana KCh BBT.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 6 dni.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCh BBT, następuje hydroliza grupy acetylowej przy C-3, regioselektywna hydroksylacja w pozycji 11α i utlenieniu typu Baeyera-Villigera pierścienia D. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (chloroform).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo6,19-oksidoandrostan-17-onu, z wydajnością izolowaną na poziomie 10% (konwersja według GC = 30%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Metoda izolowania szczepu Beauveria bassiana KCh BBT.

Owad przerośnięty grzybnią został zebrany na Teneryfie (Hiszpania) za pomocą jałowej pęsety i umieszczony w jałowej plastikowej probówce. Następnie próba została przetransportowana na teren Zakładu Fitopatologii i Mykologii Katedry Ochrony Roślin UP we Wrocławiu. Truchło owada zostało wyjęte za pomocą świeżo wyjałowionych narzędzi (pęseta oraz eza mikrobiologiczne) i umieszczone na

PL 236 834 B1 jałowej szklanej szalce w sterylnym pomieszczeniu. Za pomocą jałowej ezy mikrobiologicznej z powierzchni trucheł owadów zostały zebrane tkanki grzyba (nalot zarodników oraz strzępki) i umieszczony na zakwaszonym podłożu PDA (potato dextrose agar). Wzrost był obserwowany przez okres 2 tygodni. Po pojawieniu się wzrostu grzybni został on przeszczepiony na świeże podłoża PDA. Po oznaczeniu jako Beauveria bassiana KCh BBT o sekwencji 1, został zdeponowany w kolekcji Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, 50-375 Wrocław i jest przechowywany w temperaturze +4°C.

Dostępny jest również w:

- Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk, ul. Strzeszyńska 34, 60-479 Poznań,

- Katedra Ochrony Roślin, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, pl. Grunwaldzki 24a, 53-363

Wrocław.

P r z y k ł a d

Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh BBT o sekwencji 1. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 33-acetyloksyy-5a-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ DMSO. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksan i aceton 2:1.

Na tej drodze otrzymuje się 10 mg 33,11a-dihydroksy-5a-chloro-17a-oksa-D-homo-6,19-oksidoandrostan-17-onu (konwersja według GC = 30%).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (600MHz) (ppm) (CDCI3) δ: 1.36 (s, 3H, 18-H); 1.41 (dd, 1H, J = 11.4, 5.8 Hz, 8-H); 1.43-1.49 (m, 1H, 7-Ha); 1.52 (tt, 1H, J = 13.4, 8.7 Hz, 15-Κβ); 1.66 (ddd, 1H, J = 13.1, 11.4, 4.4 Hz, 14-H); 1.731.82 (m, 2H, 1-Ha, 2-Ha, 12-Ha); 1.89 (tdd, 1H, J = 10.6, 4.3, 2.3 Hz, 15-Ha); 1.91-1.98 (m, 3H, 2-Hβ, 7-Hβ, 9-H); 2.03 (dd, 1H, J = 13.7, 11.4 Hz, 4-Ha); 2.20 (dt, 1H, J = 11.3, 3.4 Hz, 1-Hβ); 2.22 (ddd, 1H, J = 13.5, 4.1,2.4 Hz, 4-Hβ); 2.31 (dd, 1H, J = 12.2, 4.6 Hz, 12-Hβ); 2.59 (dt, 1H, J = 19.1, 9.1 Hz, 16Ha); 2.68 (ddd, 1H, J = 19.1,8.8, 2.1 Hz, 16-Hβ); 3.59-3.65 (m, 1H, 11-Hβ); 3.76 (d, 1H, J = 9.0 Hz, one of 19-H); 4.01 (d, 1H, J = 4.8 Hz, 6-Ha); 4.02-4.07 (m, 2H, one of 19-H and 3-Ha). ¹³C NMR (151 MHz) (ppm) (CDCI3) δ: 25,88 (C-1); 30,87 (C-2); 66,03 (C-3); 44,44 (C-4); 75,83 (C-5); 81,62 (C-6); 31,22 (C7); 33,37 (C-8); 52,50 (C-9); 81,41 (C-10); 68,72 (C-11); 50,39 (C-12); 47,45 (C-13); 44,10 (C-14); 19,59 (C-15); 28,58 (C-16); 170,90 (C-17); 21,41 (C-18); 69,21 (C-19).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo-6,19-oksidoandrostan-17-on o wzorze 2.

2. Sposób wytwarzania 3β,11α-dihydroksy-5α-chloro-17a-oksa-D-homo- 6,19-oksidoandrostan17-onu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCh BBT o sekwencji 1, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3β-acetyloksyy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najwyżej 3 dni, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 6 dni.