PL236332B1 - Nowy peptyd do zastosowania jako stymulator chondrogenezy i lek w terapii uszkodzeń chrząstki - Google Patents
Nowy peptyd do zastosowania jako stymulator chondrogenezy i lek w terapii uszkodzeń chrząstki Download PDFInfo
- Publication number
- PL236332B1 PL236332B1 PL431237A PL43123719A PL236332B1 PL 236332 B1 PL236332 B1 PL 236332B1 PL 431237 A PL431237 A PL 431237A PL 43123719 A PL43123719 A PL 43123719A PL 236332 B1 PL236332 B1 PL 236332B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peptide
- agf9
- cells
- ascs
- chondrogenesis
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 87
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 title claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 8
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 title description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 24
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 12
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 claims description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 101000924549 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 6 Proteins 0.000 description 13
- 102100034599 Angiopoietin-related protein 6 Human genes 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- -1 trifluoroacetate ion Chemical class 0.000 description 4
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102100040881 60S acidic ribosomal protein P0 Human genes 0.000 description 2
- 102100022289 60S ribosomal protein L13a Human genes 0.000 description 2
- 102100036601 Aggrecan core protein Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000055007 Cartilage Oligomeric Matrix Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000673456 Homo sapiens 60S acidic ribosomal protein P0 Proteins 0.000 description 2
- 101000681240 Homo sapiens 60S ribosomal protein L13a Proteins 0.000 description 2
- 101000999998 Homo sapiens Aggrecan core protein Proteins 0.000 description 2
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 2
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 208000015100 cartilage disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- CMXXUDSWGMGYLZ-XRIGFGBMSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CMXXUDSWGMGYLZ-XRIGFGBMSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 description 1
- 102000016284 Aggrecans Human genes 0.000 description 1
- 108010019425 Angiopoietin-like Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006501 Angiopoietin-like Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700005376 Cartilage Oligomeric Matrix Proteins 0.000 description 1
- 101710176668 Cartilage oligomeric matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000901248 Homo sapiens Actin-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000964383 Homo sapiens DNA dC->dU-editing enzyme APOBEC-3C Proteins 0.000 description 1
- 101000897042 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 231100000416 LDH assay Toxicity 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin Chemical compound CSCCC(NC=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- FBKIASNRVHFWNA-USHJOAKVSA-N O.O.[Na].[Na].N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O Chemical compound O.O.[Na].[Na].N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O FBKIASNRVHFWNA-USHJOAKVSA-N 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 208000013201 Stress fracture Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- HHGZUQPEIHGQST-UHFFFAOYSA-N [2-[(2-azaniumyl-2-carboxyethyl)disulfanyl]-1-carboxyethyl]azanium;dichloride Chemical compound Cl.Cl.OC(=O)C(N)CSSCC(N)C(O)=O HHGZUQPEIHGQST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229940050560 calcium chloride anhydrous Drugs 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000004139 eicosanoid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- MVFCKEFYUDZOCX-UHFFFAOYSA-N iron(2+);dinitrate Chemical compound [Fe+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O MVFCKEFYUDZOCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229940073640 magnesium sulfate anhydrous Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004796 pathophysiological change Effects 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- RDZTWEVXRGYCFV-UHFFFAOYSA-M sodium 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].OCCN1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 RDZTWEVXRGYCFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 231100000378 teratogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000015 thermotherapy Methods 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy peptyd o działaniu stymulującym chondrogenezę, zwłaszcza poprzez stymulację różnicowania się mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w chondrocyty i stymulator proliferacji, migracji i chemotaksji komórek macierzystych tkanki tłuszczowej. Przedmiotem wynalazku jest również medyczne zastosowanie peptydu jako leku w terapii uszkodzeń chrząstki jako środka pobudzającego chondrogenezę u ludzi i zastosowanie in vitro jako stymulator chondrogenezy, zwłaszcza środek stymulujący różnicowanie się mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w chondrocyty. Aplikacja dostawowa tego wynalazku może stanowić nowy rodzaj terapii uszkodzeń chrząstki u ludzi.
Tkanka chrzęstna potocznie nazwana chrząstką jest delikatnym i plastycznym rodzajem tkanki łącznej zbudowanym z komórek chrzęstnych (chondrocytów) oraz amorficznej bogatej w proteoglikany macierzy międzykomórkowej. Chrząstka jest jednym z kluczowych elementów układu kostnego, w tym stawów. Jej prawidłowe funkcjonowanie jest niezbędne dla utrzymania aktywności motorycznej człowieka. Choroby zwyrodnieniowe, zapalne oraz ubytki chrząstki są dużym wyzwaniem dla chirurgii, ortopedii oraz medycyny regeneracyjnej. Ich efektem są zmiany patofizjologiczne stawów upośledzające funkcjonowanie układu kostno-szkieletowego, co opisano szerzej w Mats Brittberg i wsp, Cartilage repair in the degenerative ageing knee, A narrative review and analysis Acta Orthopaedica 2016; 87, 26-38. Ze względu na dużą urazowość i podatność na degenerację, chrząstka jest jednym z głównych celów medycyny regeneracyjnej. Dodatkowo właściwości endogennej regeneracji i odnowy chrząstki są u człowieka bardzo niskie.
Dane literaturowe wskazują, że wciąż brakuje efektywnych metod regeneracji chrząstki (Rai V. i wsp. J Biomed Mater Res A 2017). W celu złagodzenia objawów chorób zwyrodnieniowych chrząstki można stosować metody niefarmakologiczne (dieta, rehabilitacja, odciążenie stawów czy termoterapia). Leczenie farmakologiczne sprowadza się głównie do uśmierzenia bólu (leki przeciwbólowe i przeciwzapalne) i ograniczenie procesów zapalnych związanych z degeneracją chrząstki. W uzasadnionych wypadkach leki takie mogą być podawane bezpośrednio do wnętrza stawów. Podejmuje się próby wstrzykiwania dostawowego osocza bogatopłytkowego lub kwasu hialuronowego. Efekty tych zabiegów są jednak wciąż niewystarczające.
Jedynym, chodź nie zawsze skutecznym sposobem leczenia stanów patologicznych chrząstki, są zabiegi operacyjne wykorzystujące abrazję i mikrozłamania do pobudzenia ograniczonych zdolności proliferacyjnych tej struktury, zaś nowym orężem w arsenale medycznym są implantacje chondrocytów (Dziedzic K. i wsp. Przeg. Lek. 2014; Gille J. i wspo. Cartilage 2016).
Jednakże sama izolacja i hodowla chondrocytów, jak również stopniowa utrata ich fenotypu-odróżnicowanie powodują, że metody te są dalekie od optymalnych. Najnowszą metodą odbudowy chrząstki jest zastosowanie mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASC) i ich różnicowanie w chondrocyty (Kyriakidis T. i wsp. Acta Orthop Belg. 2018).
Stymulowanie proliferacji i różnicowania chondrocytów w regeneracji chrząstki stawowej jest obiecującą strategią, jednakże obecnie stosowana metodologia tych procesów jest mało skuteczna.
Mezenchymalne komórki macierzyste tkanki tłuszczowej (ASCs) są doskonałym materiałem do badań nad regeneracją tkanek ze względu na swoje liczne zalety, m.in. potencjał do różnicowania (komórki chrząstki, kości), dostępność czy możliwość pobrania ich z organizmu podczas operacji chirurgicznych lub liposukcji. ASCs nie są obciążone problemami etycznymi związanymi z ich pozyskiwaniem ani zagrożeniem teratogennym.
W ostatnich latach obserwuje się szybki wzrost liczby potencjalnych zastosowań komórek ASCs, w tym do leczenia zdegenerowanej chrząstki. Znany jest sposób różnicowania in vitro komórek ASCs w kierunku chondrocytów (chondrogeneza), jednak przy użyciu mało specyficznych i nie zawsze efektywnych stymulatorów jak kwas askorbinowy, TGF-β i dexametazon (Bajpayee AG. i wsp. Nature Reviews Rheumatology 2017; Dziedzic K. i wsp. Przeg. Lek. 2014). Dotychczasowe badania pokazały pozytywny wpływ wielu czynników chemicznych, takich jak rozpuszczalne czynniki wzrostu, chemokiny i morfogeny, na chondrogenezę. W szczególności wykazano, że transformujące czynniki wzrostu (takie jak TGF-β) i białka morfogenetyczne kości (BMP) odgrywają kluczową rolę w indukcji i stymulacji chondrogenezy. Chociaż te czynniki wzrostu mają potencjał terapeutyczny dla regeneracji uszkodzonej chrząstki, oparte na nich terapie wykazują poważne skutki uboczne i powikłania kliniczne. Do towarzyszących im problemów należą m.in. wysokie dawki terapeutyków, niestabilność białka i związany z tym
PL 236 332 B1 krótki okres półtrwania (Dziedzic K. i wsp. Przeg. Lek. 2014). Suplementy i leki wspomagające stosowane obecnie, nie przynoszą zadawalających efektów klinicznych w leczeniu uszkodzeń chrząstki (Kornicka K. i wsp. J Clin Med. 2019). Dane literaturowe wskazują, że obecnie nie ma klinicznie w pełni efektywnych metod regeneracji chrząstki i związanego z tym leczenia chorób zwyrodnieniowych chrząstki. Stosowane dotychczas procedury jedynie spowalniają rozwój choroby oraz łagodzą jej skutki. Objawy chorób zwyrodnieniowych chrząstki nasilają się wraz z czasem, doprowadzając do niepełnosprawności i chronicznego przewlekłego bólu oraz pogorszenia się jakości życia pacjenta. Choroby zwyrodnieniowe stawów oraz ubytki chrząstki są dużym wyzwaniem dla chirurgii, ortopedii i medycyny regeneracyjnej.
Celem wynalazku jest opracowanie nowego sposobu regeneracji chrząstki - nowego stymulatora chondrogenezy, a w szczególności jako czynnik działający na różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs) w chondrocyty. Innym celem było opracowania środka do zastosowania in vitro jako stymulatora chondrogenezy, np. zastosowania diagnostycznego.
Twórcy opisywanego wynalazku zainteresowali się komórkami macierzystymi tkanki tłuszczowej (ASCs) jako narzędzia do badań nad regeneracją tkanek. Znany jest angiopoetynopodobny czynnik wzrostu (AGF, ARP5, ANGPTL6) czyli białko należące do rodziny białek angiopoetynopodobnych (Angptls) o działaniu plejotropowym. Znane są liczne właściwości proangiogenne czynnika, bowiem wykazano, że AGF przyspiesza gojenie się ran skóry, stymulując proliferację, remodelowanie i regenerację komórek naskórka, wspomaga adhezję, rozprzestrzenianie się i migrację keratynocytów, fibroblastów i komórek nabłonka oraz angiogenezę oraz bierze udział w regulacji rozwoju układu sercowo-naczyniowego i metabolicznych procesów energetycznych (Zhang Y. i wsp. Biochem Biophys Res Commun, 2006).
Przedmiotem wynalazku jest wybrany w wyniku badań doświadczalnych jedynie fragment dużego białka AGF, dalej oznaczany jako peptyd AGF9, który zawiera w swojej sekwencji konserwatywny element i element biologicznie aktywny czyli sekwencję -Arg-Gly-Asp-(-RGD-). Wynalazek stanowi zatem peptyd oznaczony jako AGF9 o sekwencji Thr-Ser-Arg-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Leu-NH2 lub stosując skróty jednoliterowe TSRGDHELL-amid będący amidem wybranego według wynalazku fragmentu 337-346 fibrynogeno-podobnej domeny ludzkiego białka AGF (ANGPTL6). Peptyd ten został zsyntezowany metodą chemiczną w postaci C-końcowego amidu fragmentu 337-346 białka AGF, jako czynnik stymulujący różnicowanie komórek ASCs w chondrocyty, którego zastosowanie przebadano doświadczalnie. Peptyd AGF9 zawiera między innymi sekwencję RGD. RGD jest obecna w wielu integrynach, białkach będących ligandami białek ECM. Sekwencje RGD mają wiele funkcji m.in. biorą udział w kontroli ścieżek sygnałowych odpowiedzialnych za różnicowanie wielu komórek.
Według wynalazku, peptyd o sekwencji aminokwasowej Thr-Ser-Arg-Gly-Asp-His-Glu-Leu-LeuNH2 ma zastosowanie diagnostyczne lub medyczne jako stymulator chondrogenezy, zwłaszcza stymulator in vitro, a zwłaszcza stanowi stymulator różnicowania się mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs) w chondrocyty. Według wynalazku peptyd można zastosować jako stymulator proliferacji, migracji, chemotaksji komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs). Dodatkowo, według wynalazku zaproponowano zastosowanie peptydu jako lek w terapii uszkodzeń chrząstki jako stymulator chondrogenezy. Peptyd zwłaszcza stanowi środek aplikowany lokalnie dostawowo.
Prace doświadczalne dotyczące zastosowania nowego peptydu, które wykazały biologiczne działanie peptydu według wynalazku były prowadzone w dwóch niezależnych modelach.
1) Model różnicowania - komórki hodowane w pożywce różnicującej z dodatkiem AGF9 oraz komórki kontrolne hodowane tylko w pożywce różnicującej (standardowej) bez AGF9.
2) Modele stymulacji komórek wyłącznie przez AGF9 w pożywce podstawowej (kontrola - tylko pożywka podstawowa).
Ad. 1) Wyniki badań pokazały samodzielne działanie peptydu, który przyspieszał i stymulował in vitro różnicowanie komórek ASCs w komórki chrząstki - chondrocyty w porównaniu do hodowli w standardowych warunkach różnicowania komórek - bez dodatku peptydu według wynalazku. Standardowe warunki komórkowe indukowały różnicowanie jedynie w małym stopniu i efektywność tego procesu była znacząco niższa w porównaniu do warunków z dodatkiem AGF9. Na tej podstawie wykazano zatem biologiczne działanie peptydu do zastosowania medycznego lub środka in vitro - peptyd ten może stanowić środek stymulujący chondrogenezę, jeden ze składników, służących do przekształcania (różnicowania) komórek ASCs w chondrocyty. W badaniach doświadczalnych na zwierzętach potwierdzono możliwość zastosowania peptydu według wynalazku w terapiach dedykowanych regeneracji chrząstki.
PL 236 332 B1
Ad 2) Peptyd ten dodawany do pożywki bazalnej (podstawowej) samodzielnie bez innych związków (stymulatorów) przyspieszał proliferację i migrację komórek macierzystych ASCs. W warunkach in vivo/in vitro może on zatem indukować mobilizację komórek mezenchymalnych obecnych w chrząstce, które mają również potencjał do różnicowania w chondrocyty. Peptyd ten jednocześnie charakteryzuje się niską toksycznością i bezpieczeństwem immunologicznym, co świadczy o możliwości jego zastosowania medycznego zwłaszcza u ludzi jako środek leczniczy.
W dalszej części opisu stosuje się termin peptyd AGF9 jako peptyd według wynalazku o sekwencji: Thr-Ser-Arg-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Leu-NH2 lub stosując skróty jednoliterowe TSRGDHELL-amid.
Wyniki badań dotyczących otrzymania peptydu i działania peptydu przedstawiono na rysunku, czyli:
Fig. 1 - przedstawia chromatogram HPLC peptydu AGF9
Fig. 2 - przedstawia widmo ESI MS AGF9
Fig. 3 - przedstawia stabilność peptydu AGF9 w ludzkim osoczu krwi oznaczoną metodą elektroforezy kapilarnej (CE)
Fig. 4 - przedstawia cytotoksyczność AGF9 wobec ASCs po 48. godzinach inkubacji, oznaczona metodą uwalniania enzymu dehydrogenazy mleczanowej (test LDH). Wykres przedstawia średnią ± SEM z 4. niezależnych doświadczeń (w każdym po 4. powtórzenia).
* brak statystycznie znamiennej cytotoksyczności ASCs pod wpływem peptydu AGF9 w porównaniu z grupą kontrolną (Kontrola) p<0,05, test U Manna-Whitneya z poprawką na ciągłość.
Fig. 5 - przedstawia wpływ peptydu AGF9 na proliferację komórek ASCs po 48. i 72. godzinach inkubacji. Wykres przedstawia średnią ± SEM z 4. niezależnych doświadczeń (każde w 4. powtórzeniach).
* statystycznie znamienny wzrost proliferacji ASCs pod wpływem peptydu AGF9 w porównaniu z grupą kontrolną (Kontrola) p<0,05, test U Manna-Whitneya z poprawką na ciągłość.
Fig. 6 - przedstawia A. wpływ peptydu AGF9 na migrację ASCs po 24. godzinach inku- bacji w teście zarastania rysy. Wykres przedstawia średnią ± SEM z 4. niezależnych doświadczeń (każde w 4. powtórzeniach). B. ocenę chemotaktycznych właściwości pochodnych AGF9 wobec ASCs. Wykres przedstawia średnią ± SEM z 4. niezależnych doświadczeń (każde w 4. powtórzeniach).
* statystycznie znamienne różnice w porównaniu z grupą kontrolną (Kontrola) p<0,05, test U Manna-Whitneya z poprawką na ciągłość.
Fig. 7 - przedstawia ocenę immunogenności peptydu AGF9. Przy użyciu cytometrii prze- pływowej oceniano ilość (jako procent limfocytów) i poziom aktywacji wybranych komórek immunokompetentnych. Wykresy przedstawiają wartości średnie ± SEM.
Fig. 8 - przedstawia ocenę potencjału alergizującego peptydu AGF9 przy pomocy testu
BAT (na wykresie % zaktywowanych bazofili).
Fig. 9 - przedstawia ocenę wpływu AGF9 na różnicowanie komórek ASCs w chondrocyty.
Na rysunku przedstawiono reprezentatywne zdjęcia komórek zróżnicowanych (barwienie Alcian blue uwidacznia wydzielane przez chondrocyty GAG).
Fig. 10 - przedstawia wyniki oceny wpływu peptydu AGF9 na chondrogenezę przeprowa- dzonej przy pomocy komputerowej analizy zdjęć histologicznych w programie ImageJ v. 1.52.
Fig. 11 - przedstawia wyniki oznaczania tkankowo specyficznych markerów dla chondro- cytów za pomocą układu doświadczalnego qPCR. Graficzne przedstawienie danych uzyskanych z Real-time PCR na podstawie analizy Andvanced Relative Quantification (Target/Ref) znormalizowanej do trzech genów referencyjnych: RPL13A, RPLP0 i HPRT1 dla dwóch pacjentów (A) i (B) „K” próba kontrolna po 6-tygodniowej hodowli, „E” próba eksperymentalna po 6-tygodniowej hodowli po stymulacji związkiem AGF.
PL 236 332 B1
P r z y k ł a d 1
Synteza chemiczna peptydu AGF9
Peptyd AGF9 został zsyntezowany na nośniku stałym, metodą Fmoc za pomocą syntezatora automatycznego Quartet Protein Technologies z użyciem żywicy TentaGel S RAM o osadzeniu 0.24 mmol/g. Po syntezie peptydy odszczepiono z peptydylożywicy za pomocą 98% kwasu trifluorooctowego (TFA) i wytrącono zimnym eterem dietylowym. Surowe peptydy oczyszczano za pomocą preparatywnego chromatografu HPLC Spot Prep II 250 firmy Armen z kolumną Maisch C-18 o wymiarach (250 x 40) mm, wielkość ziaren 10 μm stosując liniowy gradient acetonitrylu (ACN) z 0.08% dodatkiem TFA. Szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 25 ml/min. Poszczególne frakcje analizowano przy pomocy analitycznego chromatografu HPLC firmy Shimadzu z kolumną Phenomenex Kinetex XB-C18, o wymiarach 150 x 4.6, wielkość ziaren 5 μm. Dla wszystkich peptydów stosowano gradient 0-20% ACN (z 0.08% dodatkiem TFA) w 30 min z przepływem 1 ml/min. Po oczyszczaniu peptydy zliofilizowano, a następnie umieszczono je w roztworze 0.01 M HCl w celu wymiany jonów z trifluorooctanowych na jony chlorkowe. Oczyszczone peptydy scharakteryzowano przy pomocy analitycznego chromatografu HPLC oraz spektrometrii mass ESI wykorzystując spektrometr mas SCIEX QTOF 5600+. Charakterystykę uzyskanych peptydów pokazują Fig. 1-3. Chromatogram HPLC pokazuje czystość peptydu AGF9 (>95%). Natomiast spektrometria mas ESI MS pokazuje prawidłową tożsamość struktury peptydu oraz jego homogenność. Na widmach masowych widać sygnały odpowiadające jonom pseudomolekularnym (M+H)- lub naładowanym w różnym stopniu (+2,+3, +4) danego peptydu.
P r z y k ł a d 2
Badanie stabilności peptydu AGF9 w ludzkim osoczu
Przy pomocy elektroforezy kapilarnej (CE) oceniono stabilność peptydu AGF9 w ludzkim osoczu. Wyniki wykonanej analizy pokazały, że peptyd AGF9 jest stabilny w ludzkim osoczu krwi. Po 21 godzinach inkubacji ok. 80% peptydu AGF9 pozostało niezhydrolizowane.
Badania biologiczne.
P r z y k ł a d 3
Ocena cytotoksyczności peptydu AGF9 wobec komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs) Przy pomocy kolorymetrycznego testu LDH, polegającego na ocenie aktywności dehydrogenazy mleczanowej w medium hodowlanym, sprawdzono cytotoksyczność peptydu AGF9 wobec komórek macierzystych tkanki tłuszczowej. Test ten jest oparty na reakcjach enzymatycznych, w wyniku których powstaje barwny produkt, oznaczany spektrofotometrycznie. Dehydrogenaza mleczanowa jest enzymem cytozolowym, który w warunkach fizjologicznych nie jest uwalniany na zewnątrz komórki. Uszkodzenie (dezintegracja) błony komórkowej oraz śmierć komórki spowodowana działaniem czynników szkodliwych, np. substancji chemicznych czy też czynników fizycznych, powoduje uwolnienie LDH z komórek do środowiska. Oznaczenie aktywności LDH w supernatancie jest miarą toksyczności badanej substancji względem komórek w hodowli.
W teście LDH nie zaobserwowano cytotoksyczności peptydu AGF9 wobec komórek ASCs. Wyniki przedstawiono na Fig. 4.
P r z y k ł a d 4
Ocena wpływu peptydu AGF9 na proliferację komórek macierzystych tkanki tłuszczowej
Do oceny wpływu peptydu AGF9 na proliferację komórek ASCs wykorzystano kolorymetryczny test XTT. Test ten oparty jest na zdolności enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcania soli tetrazolowej (XTT) do formazanu będącego kolorowym produktem reakcji. Zdolność do produkcji formazanu mają tylko żywe komórki, co pozwala na szybkie i dokładne określenie udziału procentowego żywych komórek oraz wpływu badanego czynnika na ich żywotność. Peptyd rozpuszczano w sterylnej, destylowanej wodzie.
AGF9 istotnie statystycznie stymulował proliferację ASCs we wszystkich badanych stężeniach od 0,001 do 150 μg/ml. Efekt ten obserwowany był zarówno po 48. jak i po 72. godzinach inkubacji. W porównaniu z grupą kontrolą, największy wzrost liczby komórek (o około 25% względem kontroli) zaobserwowano przy stężeniu 0,01 μg/ml po 48. godzinach inkubacji. Wyniki przedstawiono na Fig. 5.
P r z y k ł a d 5
Ocena wpływu peptydu AGF9 na migrację i chemotaksję komórek macierzystych tkanki tłuszczowej Ocena migracji
Przy ocenie zdolności do migracji pod wpływem peptydu AGF9 wykonano test zarastania rysy. Wykorzystano szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierających dwukomorowe inserty o określonej szerokości szczeliny międzykomorowej, która stanowiły rysę o powierzchni 500 μm2. Po wyhodowaniu
PL 236 332 B1
ASCs na brzegu rysy, usuwano insert, płukano komórki i inkubowano z inhibitorem proliferacji (mitomycyną C), a następnie płukano i dodawano znaną pożywkę DMEM z wysoką zawartością glukozy (4,5 g/l), zawierającą odpowiednie stężenie peptydu AGF9 (0,1 i 1 ąg/ml), uprzednio rozpuszczonego w sterylnej wodzie. Po 24. godzinach oceniano zarastanie rysy opierając się wyłącznie na migracji ASCs. DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium) zawiera: wapnia chlorek bezwodny, żelaza azotan dziewięciowodny, potasu chlorek, magnezu siarczan bezwodny, sodu chlorek, sodu wodorowęglan, potasu fosforan jednozasadowy jednowodny, D-glukoza, L-argininy chlorowodorek, L-cystyny dichlorowodorek, L-glutamina, glicyna, L-histydyny chlorowodorek jednowodny, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyny chlorowodorek, L-metionina, L-fenyloalanina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, disodu L-tyrozyna dwuwodna, L-walina, wapnia D-pantotenian, choliny chlorek, kwas foliowy, i-inozytol, niacynamid, ryboflawina, tiaminy chlorowodorek, pirydoksyny chlorowodorek) z solą sodową kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego.
Peptyd AGF9 w obu badanych stężeniach (0,1 oraz 1 ąg/ml) istotnie statystycznie zmniejszył pole powierzchni rysy w porównaniu z grupą kontrolną (p<0.05). Wyniki przedstawiono na Fig. 6A. Na tej podstawie można stwierdzić, że peptyd AGF9 stymuluje migrację komórek macierzystych tkanki tłuszczowej.
Ocena chemotaksji
Przy ocenie właściwości chemotaktycznych peptydu AGF9 wykorzystano test przechodzenia komórek przez membranę. W tym celu komórki wysiewano do insertów, które za pomocą porowatej membrany PET przedzielały, przestrzenie na górną i dolną. Komórki wysiane do insertu (przestrzeń górna) zostały pobudzone do aktywnej migracji przez błonę do przestrzeni dolnej pod wpływem chemoatraktantu - AGF9 w stężeniu ostatecznym 1 ąg/ml. Oceny liczby komórek, które „przemigrowały” przez insert dokonano fluorymetrycznie (barwienie kalceiną).
Peptyd AGF9 wykazał istotny statystycznie efekt chemotaktyczny w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,05). Wyniki przedstawiono na Fig. 6B.
Wyniki badań zaś wskazują na zastosowanie peptydu AGF9 jako stymulatora chondrogenezy i sugerują zastosowanie lecznicze jak również użycie jako środek użyty in vitro w diagnostyce, badaniach doświadczalnych. Wykazano bowiem stymulacja migracji oraz chemotaksji ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez peptyd AGF9 w warunkach in vitro, z prawdopodobieństwem może świadczyć o możliwości mobilizacji mezenchymalnych komórek macierzystych obecnych w chrząstce in vivo.
P r z y k ł a d 6
Ocena immunogenności peptydu AGF9
Aspekt ten jest istotny z uwagi na możliwe działania niepożądane peptydów, które potencjalnie mogą powodować aktywację układu odpornościowego oraz indukcję zapalenia (limfocyty) i reakcji alergicznej (bazofile/komórki tuczne).
Materiałem do badań były tzw. kożuszki leukocytarne, z których izolowano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wykorzystując wirowanie w gradiencie gęstości (histopaque, Sigma). Po dwukrotnym płukaniu PBMC w PBS, lizie erytrocytów i zliczeniu (licznik komórek Bio-Rad), komórki wysiewano na płytkę 24-dołkową w ilości 1 min kk/ 1 ml RPMI 1640 (P/S, 10% FBS)/dołek. Następnie komórki adaptowały się do nowych warunków przez 24 godziny (tzw. resting). Po tym czasie dodawano badanego związku - peptyd AGF9 w stężeniu końcowym: 1,0 ąg/ml i inkubowano w cieplarce przez 48 h. Kontrolę negatywną stanowiły komórki niestymulowane, natomiast pozytywną - komórki stymulowane LPS (1 ąg/ml) i PHA (2,5 ąg/ml). Komórki zbierano z dołków po zakończeniu inkubacji, płukano w PBS, zliczano i przygotowywano do analizy cytometrycznej: 100 tys kk/100 ąl wybarwiano przeciwciałami, a po 30 minutowej inkubacji w temp pokojowej w ciemności analizowano z wykorzystaniem cytometru przepływowego - LSRFortessa, BD.
Uzyskane wyniki wskazują na brak właściwości immunogennych peptydu AGF9 w badanym stężeniu. Poziom wybranych subpopulacji komórek układu immunologicznego (CTL - komórki cytotoksyczne, Th, komórki NK) zachowywał wartości zbliżone do kontrolnych Fig. 7). Wyniki te świadczą, iż peptyd AGF9 nie indukuje zapalenia i posiada wysoki profil bezpieczeństwa immunologicznego.
P r z y k ł a d 7
Ocena potencjału alergizującego peptydu AGF9
Do oceny aktywacji bazofili pod wpływem peptydu AGF9 zastosowano zestaw komercyjny Flow CAST® highsens (Buhlmann Laboratories, Switzerland). Test ten (BAT, Basophil Activation Test) służy
PL 236 332 B1 do oceny potencjału alergicznego różnego rodzaju związków chemicznych, w tym leków. Badanie wykonano na próbkach krwi pobranych od zdrowych ochotników i przeprowadzono w ciągu 24 godzin od pobrania, zgodnie z instrukcją producenta. 100 gL krwi pełnej inkubowano z badanym związkiem peptyd AGF9 w stężeniu końcowym 1 gg/ml. Następnie próbki barwiono roztworem przeciwciał (CD63, CD203c, CCR3) i inkubowano przez 15 min w łaźni wodnej w temp 37°C. Po zakończeniu inkubacji, lizie erytrocytów i płukaniu, próby były analizowane cytometrycznie (BD FACSCanto II). Dla każdej próby przygotowano również kontrole: negatywną i pozytywną (anti-FcsRI mAb i fMLP).
Uzyskane wyniki wskazują na brak aktywacji granulocytów w obecności AGF9 (1 gg/ml) - wartości niższe niż w kontroli negatywnej (Fig. 8). Wyniki wskazują na bardzo niskie prawdopodobieństwo wywołania reakcji alergicznej przez peptyd AGF9, co świadczy o możliwości jego zastosowania u ludzi.
P r z y k ł a d 8
Ocena wpływu peptydu AGF9 na różnicowanie komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w chondrocyty
Proces różnicowania do chondrocytów przeprowadzono poprzez hodowle in vitro za pomocą zestawu różnicującego StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit. Komórki hodowano w postaci zagęszczonej grudki komórek, którą otrzymano po zwirowaniu 500 tys. komórek przy obrotach 1500/min w probówce typu Falcon. W tej postaci zagęszczony osad komórkowy hodowano w pożywce różnicującej z dodatkiem AGF9 w stężeniu ostatecznym 1 gg/ml przez 6. tygodni, wymieniając pożywkę co 3 dni. Po zróżnicowaniu, powstały osad komórkowy utrwalono 3,7% paraformaldehydem przez 24. godziny, odwodniono w rosnących stężeniach alkoholu etylowego, zatopiono w parafinie. Otrzymane bloczki parafinowe skrawano o grubości 5 gm i barwiono 1% błękitem alcjańskim przez 30 minut.
Przy pomocy komputerowej analizy obrazu odczytano średnie wartości szarości zdjęć analizowanych przez ImageJ v. 1.52 (US National Institutes of Health; http://rsb.info.nih.gov/ij/). Próg odcięcia został ustalony na podstawie obrazów kontrolnych (średnia wartość szarości z obrazów kontrolnych). Ostateczne wartości dla komórek od każdego pacjenta przedstawiono jako średnią z 4 odczytów (4 zdjęcia kontrolne i 4 zdjęcia preparatów po stymulacji AGF). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą sparowanego testu t-Studenta. Zaobserwowano statystycznie istotną różnicę pomiędzy kontrolą i komórkami różnicowanymi w obecności peptydu AGF9, co oznacza, że peptyd AGF9 wykazuje działanie biologiczne i stanowi stymulator chondrogenezy.
P r z y k ł a d 9
Oznaczanie tkankowo specyficznych markerów dla chondrocytów
Całkowite RNA (z miRNA) zostało wyizolowane z pelletów ASC zestawem miRNeasy QIAGEN, pomiar stężenia i wartości RIN wykonany został z użyciem 2100 Bioanalyzer AGILENT RNA 6000 Nano Kit. Odwrotna transkrypcja przeprowadzona została z użyciem Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). Real-time PCR zrealizowany został na LightCycler 480 SW 1.5 (Roche), analizę Advanced Relative Quantification wykonano z normalizacją do trzech genów referencyjnych (RPL13A, RPLP0, HPRT1), wybranych na podstawie wyników RNA-seq, potwierdzających ich stabilność.
Za pomocą układu doświadczalnego qPCR zmierzono ekspresję Col2A1, ACAN, COMP i SOX9 będącymi tkankowo specyficznymi markerami chondrogenezy. Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig. 11.
W próbach eksperymentalnych 6-tygodniowej hodowli komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w pożywce różnicującej (StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit) z dodatkiem AGF9 (1 gg/ml) zaobserwowano wzrost transkryptu markera ACAN (Aggrecan), odpowiadającego za kodowanie białka będącego składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki chrzęstnej, którego głównym zadaniem jest oporność na ściskanie w chrząstce oraz wzrost ekspresji transkryptu markera SOX9 zaangażowanego w różnicowanie komórek mezynchymalnych do chondrocytów w każdym z rozwijającym się elementów kostnych. Marker COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein) odgrywający ważną rolę w integralności chrząstki stawowej poprzez oddziaływanie z innymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej takimi jak kolageny i fibronektyny nie wykazywał spójnej tendencji u przykładowych dwóch pacjentów.
Analiza jakościowa (barwienie błękitem alcianu - wybarwianie wydzielanych przez chondrocyty GAG) oraz ilościowa analiza transkryptomiczna wskazuje na korzystny wpływ związku AGF na różnicowanie ASCs w kierunku chondrocytów.
Wyniki badań wskazują zatem na medyczne i diagnostyczne zastosowanie peptydu jako stymulatora chondrogenezy in vitro lub środka pobudzającego chondrogenezę in vivo.
PL 236 332 B1
P r z y k ł a d 10
Ocena profilu transkryptomicznego komórek macierzystych tkanki tłuszczowej pod wpływem peptydu AGF9
Sprawdzono wpływ dodatku peptydu AGF9 na profil transkryptomiczny mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ang. ASCs - Adipose Derived Stem Cells). Podskórną tkankę tłuszczową pozyskano od trzech zdrowych pacjentów Kliniki Chirurgii Plastycznej GUMed (zgoda nr NKBBN/387/2014 Niezależnej Komisji Bioetycznej ds. Badań Naukowych GUMed). Izolację komórek ASCs przeprowadzono wg standardowego protokołu (Gerlach i wsp. Tissue Eng. Part C Methods 2012) w pożywce DMEM low glucose (Dulbecco’s modified Eagle medium) z dodatk iem 10% surowicy bydlęcej (FBS - Fetal Bovine Serum). Wpływ peptydu AGF9 badano po drugim pasażu, w taki sposób, że po zmianie pożywki komórki były hodowane przez 24 h z dodatkiem 10% FBS, kolejne 24 h z 5% FBS, a następnie przez 48 h wyłącznie z dodatkiem peptydu AGF9 w stężeniu 0.1 gg/ml. Jako kontroli użyto komórek ASCs, które przez ostatnie 48 h były hodowane bez żadnych czynników stymulujących (kontrola bez dodatku FBS). Po etapie stymulacji komórki poddano trypsynizacji, płukaniu, a z zamrożonych pelletów komórkowych izolowano RNA do badań transkryptomicznych (dla prób o współczynniku RNA Integrity Number > 7). Dla prób pozyskanych od trzech pacjentów przeprowadzono wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA w celu profilowania całego transkryptomu. Otrzymane fragmenty po sekwencjonowaniu zmapowano do genomu referencyjnego człowieka (edycja hg19, reprezentatywny przykład zestawu genów, Human Genome 19- GRCh37, wydanie z roku 2019) z użyciem oprogramowania TopHat. Analizy porównawcze profili transkryptomicznych ASCs traktowanych peptydem AGF przeprowadzono w odniesieniu do kontroli FBS Min (komórki ASCs hodowane bez dodatku czynników stymulujących) z wykorzystaniem pakietu Cufflinks według procedury opisanej przez twórców oprogramowania (workflow for Cufflinks version 2.2.0 and higher - http://cole-trapnell-lab.gi- thub.io/cufflinks/manual/). Wyniki badań porównawczych dla poszczególnych prób pojedynczo oraz dla triplikatu w postaci matryc DGE (ang. Differential Gene Expression) poddawano analizie funkcjonalnej w pakiecie Ingenuity Pathway Analysis (IPA).
IPA pozwala na analizę zmian transkryptów w badanym zestawie danych i powiązanie ich ze zmianami regulatorów „upstream” oraz zjawiskami biologicznymi zachodzącymi w wyniku tych zmian (tzw. „downstream effects”). Współczynnik, który opisuje dopasowanie tych danych to „consistency score”. Po stymulacji komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs) peptydem AGF9 (0,1 gg/ml) zaobserwowano aktywację zjawisk świadczących o mobilizacji tych komórek, m.in. ruchy i migrację komórek, przy jednoczesnym zahamowaniu apopotozy.
PL 236 332 Β1
Tabela 1. Lista zjawisk biologicznych zachodzących w ASCs (linie pierwotne z trzech pacjentów Kliniki Chirurgii Plastycznej) w wyniku stymulacji peptydem AGF (0,1 pg/ml). Z-score to algorytm w EPA, który pozwala na identyfikację zjawisk i funkcji aktywowanych (> 2) lub hamowanych (< -2) w wyniku zmian ekspresji obserwowanych w badanym zestawie danych. Za istotne statystycznie uznaje się dane w p < 0,05.
| Zjawisko | P | Kierunek zmiany | z-score | Ilość zaangażowanych transkryptów |
| ruchy komórek | 0,0000155 | Akty wacj a | 3,673 | 29 |
| waskulogeneza | 0,000011 | Aktywacj a | 3,395 | 13 |
| migracj a komórek | 0,0000306 | Aktywacja | 2,939 | 26 |
| transport molekuł | 0,0000154 | Aktywacj a | 2,439 | 22 |
| ruchy komórek embrionalnych linii komórkowych | 0,000153 | Aktywacja | 2,236 | 6 |
| transport aminokwasów | 0,00000274 | Aktywacj a | 2,228 | 6 |
| metabolizm eikozanoidu | 0,00553 | Aktywacja | 2,177 | 5 |
| metabolizm kwasów tłuszczowych | 0,000484 | Aktywacja | 2,139 | 10 |
| wzrost tkanki nabłonkowej | 0,00599 | Aktywacj a | 2,105 | 8 |
| synteza reaktywnych form tlenu | 0,00414 | Aktywacja | 2,020 | 7 |
| sekrecja białek | 0,00186 | Aktywacj a | 2,000 | 4 |
| migracj a komórek linii emrionalnych | 0,00214 | Aktywacj a | 2,000 | 4 |
| Egzocytoza | 0,00306 | Aktywacja | 2,000 | 4 |
| Apoptoza | 0,0011 | Zahamowanie | -2,014 | 29 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Peptyd o sekwencji aminokwasowej Thr-Ser-Arg-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Leu-NH2.
- 2. Peptyd o sekwencji aminokwasowej Thr-Ser-Arg-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Leu-NH2 do zastosowania jako stymulator chondrogenezy.
- 3. Peptyd do zastosowania według, zastrz. 2, znamienny tym, że stanowi stymulator różnicowania się mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs) w chondrocyty.
- 4. Peptyd do zastosowania według, zastrz. 2 lub 3, znamienny tym, że stanowi stymulator proliferacji, migracji, chemotaksji komórek macierzystych tkanki tłuszczowej (ASCs).PL 236 332 Β1
- 5. Peptyd o sekwencji aminokwasowej Thr-Ser-Arg-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Leu-NH2 do zastosowania jako lek w terapii uszkodzeń chrząstki jako stymulator chondrogenezy.
- 6. Peptyd do zastosowania według, zastrz. 5, znamienny tym, że stanowi środek aplikowany lokalnie dostawowo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431237A PL236332B1 (pl) | 2019-09-21 | 2019-09-21 | Nowy peptyd do zastosowania jako stymulator chondrogenezy i lek w terapii uszkodzeń chrząstki |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431237A PL236332B1 (pl) | 2019-09-21 | 2019-09-21 | Nowy peptyd do zastosowania jako stymulator chondrogenezy i lek w terapii uszkodzeń chrząstki |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431237A1 PL431237A1 (pl) | 2020-07-13 |
| PL236332B1 true PL236332B1 (pl) | 2020-12-28 |
Family
ID=71512457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431237A PL236332B1 (pl) | 2019-09-21 | 2019-09-21 | Nowy peptyd do zastosowania jako stymulator chondrogenezy i lek w terapii uszkodzeń chrząstki |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236332B1 (pl) |
-
2019
- 2019-09-21 PL PL431237A patent/PL236332B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431237A1 (pl) | 2020-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Myokine IL-15 regulates the crosstalk of co-cultured porcine skeletal muscle satellite cells and preadipocytes | |
| TWI720333B (zh) | 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 | |
| KR102246582B1 (ko) | 올리고펩타이드를 이용한 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법 | |
| KR101885122B1 (ko) | 분화촉진 및 지속형 스페로이드 형태의 편도 유래 줄기세포의 배양 방법 | |
| Humenik et al. | Canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells: genomics, proteomics and functional analyses of paracrine factors | |
| US20100112031A1 (en) | Compositions And Methods For Regulating Extracellular Matrix Production In Adipose Derived Cells | |
| Brambilla et al. | Human platelet lysate stimulates neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells better than Schwann cell-like cells | |
| Hashemibeni et al. | Investigation and comparison of the effect of TGF-β3, kartogenin and avocado/soybean unsaponifiables on the in-vitro and in-vivo chondrogenesis of human adipose-derived stem cells on fibrin scaffold | |
| Zhou et al. | Repair of mechanical cartilage damage using exosomes derived from deer antler stem cells | |
| KR20190112668A (ko) | 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화방법 | |
| JP2021520351A (ja) | 皮膚を治療するための組成物 | |
| WO2018235899A1 (ja) | 筋サテライト細胞の培養方法 | |
| Chen et al. | The function of mechanical loading on chondrogenesis | |
| PL236332B1 (pl) | Nowy peptyd do zastosowania jako stymulator chondrogenezy i lek w terapii uszkodzeń chrząstki | |
| CN115698262A (zh) | 用于控制细胞身份的组合物和方法 | |
| JP6700182B2 (ja) | 軟骨及び椎間板組織病理の治療のためのポリペプチド及び組成物 | |
| CA2702376A1 (en) | Markers of matrix gene expression and cellular differentiation in chondrocytes | |
| US9982232B2 (en) | Methods of generating cells with multilineage potential | |
| Lin et al. | Unveiling the dynamic drivers: phase separation’s pivotal role in stem cell biology and therapeutic potential | |
| JP2019076008A (ja) | 骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または神経細胞に分化可能な前駆細胞、その作製方法、およびその使用方法 | |
| KR101927073B1 (ko) | 메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법 | |
| KR20120095580A (ko) | 신장 보호 효과를 갖는 제대혈 다분화능 줄기세포 유래의 세포활성화물질을 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 | |
| Garcés | Molecular mechanisms modulating chondrogenesis | |
| Wu et al. | Blocking calcium-MYC regulatory axis inhibits early dedifferentiation of chondrocytes and contributes to cartilage regeneration | |
| Tarasova et al. | THERAPEUTIC POTENTIAL OF PERINATAL MESENCHYMAL STROMAL CELLS DERIVED EXTRACELLULAR VESICLES ON INFLAMED CHONDROCYTES IN VITRO |