PL236149B1

PL236149B1 - Sposób wytwarzania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, środek przeciwdziałający koagulacji krwi oraz jego zastosowanie

Info

Publication number: PL236149B1
Application number: PL413886A
Authority: PL
Inventors: Izabela Pawlaczyk-Graja
Original assignee: Wojewodzki Szpital Specjalistyczny We Wroclawiu
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2020-12-14
Also published as: PL413886A1

Abstract

Zgłoszenie dotyczy sposobu wytwarzania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, obejmującego ekstrakcję substancji aktywnych z przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), przy pomocy alkoholu lub ketonu, a następnie wody, oraz wyodrębnianie substancji aktywnych poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych, zatężanie do konsystencji pasty i oddzielanie ekstraktu roślinnego od pozostałych składników. Sposób charakteryzuje się tym, że otrzymaną mieszaninę koniugatów polifenolowo-polisacharydowych, o wielkości cząsteczek w zakresie masy od 1 000 Da do 200 000 Da, poddaje się częściowej degradacji i homogenizacji na cząsteczki o masie cząsteczkowej, zawierającej się w przedziale 20 000 - 50 000 Da, przy użyciu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy w zakresie od 90 do 240 W. Otrzymaną mieszaninę poreakcyjną rozdziela się na membranie filtracyjnej, w celu usunięcia mniejszych niż 5 000 Da produktów degradacji. Uzyskane składniki aktywne, przekształca się do postaci soli sodowych lub soli wapniowych, a po uzyskaniu pH roztworu na poziomie 7,2 i po wysuszeniu uzyskuje się środek przeciwdziałający koagulacji krwi. Przedmiotem zgłoszenia jest również środek przeciwdziałający koagulacji krwi, który jest mieszaniną, koniugatów polifenoli z polisacharydami, o makrocząsteczkach częściowo zdegradowanych, a częściowo skondensowanych przy użyciu ultradźwięków, których masa cząsteczkowa wynosi od 20 000 Da do 50 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy składników polimerowych wynosi od 3,5 do 1,1. Zgłoszenie dotyczy też zastosowania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, spowodowanej problemem nadmiernej krzepliwości krwi w układzie krwionośnym człowieka, w stężeniu od 0,005% do 95%, w kompozycjach farmaceutycznych, spożywczych i kosmetycznych, stosowanych do profilaktyki i leczenia w żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej, zakrzepicy żył głębokich, w chorobie niedokrwiennej serca, chorobie aorty i naczyń obwodowych, w powikłaniach zakrzepowych spowodowanych urazem lub zabiegiem operacyjnym.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, roślinny środek przeciwdziałający koagulacji krwi oraz jego zastosowanie do hamowania koagulacji krwi ludzkiej, w kompozycjach przeznaczonych do profilaktyki i leczenia powikłań zakrzepowo-zatorowych, spowodowanych problemem nadmiernej krzepliwości krwi w układzie krwionośnym człowieka.

Powikłania zakrzepowo-zatorowe wynikające z zaburzenia procesów krzepnięcia krwi, takie jak zawał mięśnia sercowego czy udar niedokrwienny mózgu są przyczynami zgonów lub przewlekłych stanów chorobowych, ograniczających w poważnym stopniu jakość życia chorych, generujących duże koszty dalszego leczenia i opieki.

W celu uniknięcia groźnych powikłań zakrzepowych, stosuje się preparaty o właściwościach antykoagulacyjnych, które nie dopuszczają do powstawania skrzeplin, poprzez hamowanie enzymatycznych czynników krzepnięcia krwi. Najczęściej stosowanym antykoagulantem bezpośrednim jest podawana iniekcyjnie lub zewnętrznie, heparyna - polianionowy polisacharyd o charakterze kwasowym, bogaty w reszty siarczanowe oraz kwasy heksuronowe, czyli monosacharydy zawierające grupy karboksylowe, posiadający masę cząsteczkową w przedziale 5 000-30 000 Da. Środki heparynowe stanowiące mieszaninę podobnych strukturalnie polimerów o zróżnicowanej długości łańcuchów są uzyskiwane z błon śluzowych świń oraz płuc bydlęcych, co niesie za sobą pewien stopień ryzyka zakażenia chorobami odzwierzęcymi. Na rynku farmaceutycznym dostępne są produkty na bazie heparyn w postaci soli sodowych oraz soli wapniowych, stosowane w formie iniekcji dożylnych, iniekcji podskórnych, bądź hydrożeli aplikowanych na skórę. Długotrwałe stosowanie heparyny miewa poważne skutki uboczne, takie jak trudne do opanowania krwawienia, bóle w nadbrzuszu i plecach, krwiomocz, reakcje alergiczne, małopłytkowość immunologiczną, osteoporozę, hipoaldosteroizm, czy martwicę skóry w miejscach iniekcji.

Obok preparatów heparynowych, znane są również antykoagulanty doustne, będące pochodnymi kumaryny i pochodnymi fenyloindandionu. Pochodne fenyloindandionu wywołują reakcje uczuleniowe, występowanie granulocytopenii oraz schorzenia nerek, a pochodne dihydroksykumaryny zaburzają w ustroju cykl przemian witaminy K.

Poprawę właściwości leczniczych i równoczesną redukcję skutków ubocznych heparyny próbowano uzyskać poprzez jej modyfikację, między innymi metodą depolimeryzacji chemicznej, skutkującej zmniejszeniem masy cząsteczkowej fragmentów heparynowych i ulepszeniem biodostępności. Z patentu kanadyjskiego CA1334081, znana jest modyfikacja heparyny w procesie degradacji łańcuchów polisacharydowych na drodze enzymatycznej depolimeryzacji, przy użyciu heparynazy. W portugalskim zgłoszeniu patentowym PT76111 A opisano sposób degradacji heparyny klasycznej na drodze hydrolizy w warunkach kwasowych, a następnie depolimeryzacji przez podgrzewanie mieszaniny reakcyjnej w obecności czynnika utleniającego. Z patentu europejskiego EP0293539 znany jest sposób degradacji heparyny w postaci soli amonowej, w obecności wodorotlenku amonu w środowisku rozpuszczalnika nie posiadającego grup hydroksylowych, a z patentu US 6569840 degradacja w obecności kwasu azotowego. Zastosowanie czynników fizycznych w procesie otrzymywania heparyn małocząsteczkowych znane jest z patentu RU2133253, w rozwiązaniu tym proces depolimeryzacji prowadzi się mieszaniną nitrującą, a zbyteczne produkty nitryfikacji usuwa przy użyciu promieniowania UV w zakresie 180-350 nm. W rozwiązaniu znanym z europejskiego patentu EP 1641831, do depolimeryzacji glikozaminoglikanów, do których zalicza się też heparyna, zastosowano promieniowanie UVC, a uzyskane produkty degradacji rozdzielono techniką chromatografii żelowej. Według innego patentu EP1675875 do depolimeryzacji heparyny, używa się promieniowanie gamma.

Proces degradacji polisacharydów za pomocą ultradźwięków, w celu uzyskania krótszych fragmentów polimerowych z wielkocząsteczkowych polisacharydów, zastosowano w rozwiązaniu opisanym w patencie CN101891904, do otrzymywania z wodorostów cząsteczek oligosacharydowych, wykazujących właściwości pestycydowe, znajdujących zastosowanie w środkach ochrony roślin.

Znany jest, z polskiego patentu PL 198837, sposób otrzymywania preparatu hamującego krzepliwość krwi ludzkiej, zawierającego substancje o charakterze polifenolowo-polisacharydowym z części naziemnych przymiotna kanadyjskiego. Sposób ten polega na sporządzeniu ekstraktu wodnego lub wodno-etanolowego o stężeniu 65%, z którego wydziela się frakcję aktywną.

Z innego patentu PL 211520, znany jest sposób wytwarzania środka hamującego krzepliwość krwi, w którym cukry oraz substancje fenolowe, pozyskuje się z roślin wyższych, wybranych z rodziny roślin różowatych (Rosaceae) lub z rodziny roślin astrowatych (Asteraceae). Sposób polega na tym, że

PL 236 149 B1 korzenie roślin, ziele, liście, kwiaty, kwiatostany, owoce, nasiona lub ich mieszanki, poddaje się ekstrakcji wodą i/lub alkoholem, a następnie z otrzymanych ekstraktów wyodrębnia się substancje o aktywności antykoagulacyjnej wobec krwi, na drodze ekstrakcji rozpuszczalnikami i/lub separacji aktywnych substancji makrocząsteczkowych o masie > 5 000 Da.

Znany jest też z polskiego zgłoszenia patentowego nr P. 392257 środek leczniczy do profilaktyki i leczenia powikłań zakrzepowych i zatorowych, pochodzący z przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), który utworzony jest z makrocząsteczkowych koniugatów polifenoli z polisacharydami, o masie cząsteczkowej od 1000 do 200 000 Da. Ponadto składniki aktywne środka, uzyskiwane są z przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), metodą ekstrakcji przy pomocy alkoholu niższego lub małocząsteczkowego ketonu, następnie z użyciem wody lub wodnego roztworu alkalicznego lub roztworu soli alkalicznej oraz wyodrębniania substancji aktywnych ze zobojętnionych wodnych ekstraktów poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych i oddzielania ekstraktu roślinnego, od pozostałych składników poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami z fazy stałej, a w celu użycia w składzie środka przekształconych w postać soli sodowych lub soli wapniowych.

Otrzymane znanym sposobem koniugaty polifenolowo-polisacharydowe są niejednorodną mieszaniną, w której skład wchodzą zarówno cząsteczki koniugatów o masie 1000 Da jak też o masie 200 000 Da. Nie jest znana z literatury patentowej ani naukowej, defragmentacja pozyskiwanych z surowców roślinnych makro-cząsteczkowych koniugatów polifenoli z polisacharydami, przeciwdziałających koagulacji krwi, przy użyciu ultradźwięków.

Celem wynalazku jest uzyskanie środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, stanowiącego jednorodną mieszaninę substancji polimerowych pochodzenia naturalnego o zbliżonych masach cząsteczkowych, nadającego się do stosowania jako skuteczny, biologicznie aktywny składnik kompozycji farmaceutycznych, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyków, o powtarzalnym jednoznacznym składzie chemicznym.

Sposób wytwarzania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, według wynalazku, obejmujący ekstrakcję substancji aktywnych z części naziemnych przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), przy pomocy alkoholu niższego lub małocząsteczkowego ketonu, a następnie wody lub wodnego roztworu alkalicznego, lub roztworu soli alkalicznej oraz wyodrębnianie substancji aktywnych ze zobojętnionych wodnych ekstraktów, poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych, zatężanie do konsystencji pasty oddzielanie ekstraktu roślinnego od pozostałych składników, poprzez wytrawianie alkoholem niższym z fazy stałej, polega na tym, że otrzymaną mieszaninę koniugatów polifenolowo-polisacharydowych, o niejednorodnej wielkości cząsteczek, od masy 1000 Da do masy 200 000 Da, poddaje się częściowej degradacji i homogenizacji na cząsteczki o masie cząsteczkowej, zawierającej się w przedziale 20 000-50 000 Da, przy użyciu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy w zakresie od 90 do 240 W. Proces degradacji i homogenizacji mieszaniny koniugatów polifenolowo-polisacharydowych prowadzi się w roztworze wodnym lub wodnym z dodatkiem nadtlenku wodoru, a otrzymaną mieszaninę poreakcyjną rozdziela się na membranie filtracyjnej, w celu usunięcia małocząsteczkowych produktów degradacji, mniejszych niż 5 000 Da. Przy czym stosuje się dodatek nadtlenku wodoru o stężeniu do 10% w stosunku do objętości mieszaniny reakcyjnej, w której stężenie składników aktywnych, poddawanych degradacji wynosi 1-20%. Ponadto degradację prowadzi się od 60 minut do 5 godzin, sole sodowe lub sole wapniowe, przy użyciu 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku wapnia, a po uzyskaniu pH roztworu na poziomie 7,2 i po wysuszeniu uzyskuje się środek przeciwdziałający koagulacji krwi.

Zgodnie z wynalazkiem ziele, liście, kwiaty, kwiatostany przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), zebrane między miesiącem kwietniem, a listopadem, ekstrahuje się alkoholem niższym, wybranym z grupy obejmującej metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol lub małocząsteczkowy keton z grupy obejmującej aceton, keton metylo-etylowy, keton dietylowy, następnie z użyciem wody, 0,1 M lub 0,65 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub 0,1 M lub 0,65 M wodnego roztworu octanu sodu. Substancje aktywne wyodrębnia się z ekstraktu roślinnego na drodze ekstrakcji rozpuszczalnikami lub ich mieszaninami w układach dwufazowych, w proporcjach faz 1:1, w których pierwszą fazę stanowi uzyskany w pierwszym etapie ekstrakt roślinny, a drugą fazę rozpuszczalnik, taki jak pentan, heksan, heptan, eter dietylowy, eter dipropylowy, eter diizopropylowy, chloroform, lub mieszanina rozpuszczalników organicznych, chloroformu z metanolem, etanolem lub 1-propanolem, korzystnie w proporcjach objętościowych 3:2. Otrzymany ekstrakt roślinny zatęża się do konsystencji pasty i poddaje się wytrawianiu alkoholem takim jak metanol, etanol lub propanol, zbierając nierozpuszczalne w alkoholu składniki ekstraktu roślinnego, wytrącone w nim w postaci osadu.

PL 236 149 B1

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi otrzymany sposobem według wynalazku z części naziemnych przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), będący mieszaniną, koniugatów polifenoli z polisacharydami, o makrocząsteczkach częściowo zdegradowanych, a częściowo skondensowanych przy użyciu ultradźwięków, charakteryzuje się masą cząsteczkową zawartą w przedziale od 20 000 Da do 50 000 Da oraz współczynnikiem rozproszenia masy składników polimerowych o wartości od 3,5 do 1,1. Środek przeciwdziałający koagulacji krwi zawiera polisacharydy w ilości 20-90%, zbudowane z grupy obejmującej monomery połączone ze sobą wiązaniami glikozydowymi monosacharydów, wybranych z grupy obejmującej arabinozę, w ilości 5-30% części polisacharydowej i mannozę w ilości 3-10%, glukozę w ilości 10-15%, galaktozę w ilości do 20%, ewentualnie ramnozę w ilości do 20%, ewentualnie fukozę w ilości do 2% w części polisacharydowej, ewentualnie rybozę w ilości do 1 %, ewentualnie ksylozę w ilości do 5% części polisacharydowej, oraz cukry o charakterze kwasowym, takie jak kwas glukuronowy i kwas galakturonowy, których sumaryczna ilość wynosi 10-75% części polisacharydowej preparatu, ponadto od 10 do 80% polifenoli, tworzących glikokoniugaty. Przy czym polifenole są także makromolekułami, w stężeniu 500-3 750 μM reszt polifenolowych, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego, w 1 g środka.

Do oszacowania ciężaru cząsteczkowego produktów degradacji ultradźwiękami, zawartych w środku według wynalazku zastosowano chromatografię kolumnową (wymiary 1500 x 15 mm), gdzie fazę ruchomą stanowił żel Sephacryl 300 HR - powszechnie stosowany do szacowania mas cząsteczkowych takich substancji jak białka, polisacharydy, a w szczególności te o rozgałęzionych łańcuchach, w tym dekstrany, oraz inne rozgałęzione makromolekuły pochodzenia naturalnego. W pierwszym etapie wyznaczono krzywą kalibracyjną dla ww. przygotowanej kolumny, na bazie 8 różnych dekstranów (rozgałęzionych polisacharydów) o znanych masach cząsteczkowych. Na tej podstawie, na tak przygotowanym żelu rozfrakcjonowano i oszacowano masę cząsteczkową środka roślinnego oraz biorąc pod uwagę rozrzut mas cząsteczkowych poszczególnych składników środka obliczono średnią wartość współczynnika rozproszenia masy składników w mieszaninie polimerowej, czyli współczynnik polidyspersji (ang. PolyDispersity Index, PDI), każdorazowo biorąc pod uwagę profil chromatograficzny ze względu na polisacharydową jak i na polifenolową naturę środka roślinnego. Wszystkie pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

Środek według wynalazku, zawierający mieszaninę polifenolowo-polisacharydową efektywnie przeciwdziała koagulacji krwi, posiada właściwości hamowania osoczowego procesu krzepnięcia krwi. z tego względu przeznaczony jest do stosowanie w profilaktyce i leczeniu powikłań zakrzepowo-zatorowych spowodowanych problemem nadmiernej krzepliwości krwi w układzie krwionośnym człowieka.

Przedmiot wynalazku dotyczy również zastosowania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi określonego powyżej do wytwarzania leku i/lub kompozycji farmaceutycznej do leczenia i profilaktyki chorób zakrzepowo-zatorowych spowodowanych problemem nadmiernej koagulacji krwi w układzie krwionośnym człowieka, w stężeniu od 0,005% do 95%.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi według wynalazku stosuje się w kompozycjach farmaceutycznych, w terapeutycznie skutecznych dawkach, przy czym pożądane właściwości antykoagulacyjne uzyskuje się przy stężeniu 50-250 μg/mL środka roślinnego we krwi/osoczu. Dawkę środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, w kompozycji farmaceutycznej, dobiera się do masy ciała i stanu chorobowego pacjenta. Środek przeciwdziałający koagulacji krwi według wynalazku nadaje się do aplikowania doustnego, podskórnego, dożylnego, donosowego, miejscowego, przezskórnego, dopłucnego lub doodbytniczego.

Badania toksyczności podostrej i przewlekłej, przeprowadzone na zwierzętach doświadczalnych wykazały, że środek podany w formie iniekcji dootrzewnowo, w ilości 50 mg/kg masy ciała w formie jednorazowej dawki nie wykazuje toksyczności wobec narządów wewnętrznych - wątroby, nerki, śledziony, mięśnia sercowego, płuca i mózgu.

Środek według wynalazku może być podawany sam albo połączony z tradycyjnie stosowanym farmaceutycznym nośnikiem, zaróbką lub substancją, taką jak np. mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, talk, celuloza, kroskarmeloza sodu, glukoza, żelatyna, sacharoza lub węglan magnezu. Kompozycja farmaceutyczna może ponadto zawierać mniejsze ilości nietoksycznych środków pomocniczych, takich jak środki zwilżające, środki emulgujące, środki zwiększające rozpuszczalność lub środki buforujące pH. Dopuszczalne farmaceutycznie kompozycje, obejmujące środek przeciwdziałający koagulacji krwi mają postać stałą, półstałą, płynną; w formie tabletek, kapsułek, proszków, płynów, zawiesin, czopków lub aerozoli. Środek przeciwdziałający koagulacji krwi może być podawany w postaciach o przedłużonym lub kontrolowanym uwalnianiu, obejmujących wstrzyknięcia wolno

PL 236 149 B1 uwalnianej postaci leku, pompy osmotyczne, pigułki, plastry do podawania przezskórnego, do przedłużonego i/lub czasowego, pulsowego podawania, przy wcześniej określonej szybkości uwalniania. Kompozycje nadają się do jednostkowych postaci dawkowania odpowiednich do podawania jednorazowo ściśle określonej dawki.

Kompozycje w formie pigułki lub tabletki, zawierają oprócz środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, rozcieńczalnik taki jak laktoza, sacharoza, fosforan diwapnia, mannitol lub tym podobne; środek smarujący taki jak kwas stearynowy lub stearynian magnezu i środek wiążący taki jak skrobia, żywica akacjowa, poliwinylopirolidyna, żelatyna, celuloza lub pochodne celulozy. Płynne kompozycje dopuszczalne farmaceutycznie uzyskiwane są przez rozpuszczenie, zawieszenie w nośniku, np. w wodzie, solance, wodnym roztworze dekstrozy, glicerolu, glikolach, etanolu lub tym podobnych środka roślinnego i ewentualne farmaceutycznych adiuwantów. Środki do iniekcji wytworzone są jako płynne roztwory lub zawiesiny, jako emulsje, lub w postaci stałej odpowiedniej do rozpuszczenia lub wytworzenia zawiesiny w cieczy przed iniekcją.

Zastosowanie środka przeciwdziałającego koagulacji krwi według wynalazku, w produktach spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego dla ludzi, wskazanych w profilaktyce osób z ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych klasyfikowanych według skali ryzyka SCORE (ang. Systemie COronary Risk Evaluation). Skala opracowana przez Europejskie Towarzystwo Kardiologiczne, służy ocenie indywidualnego ryzyka zgonu z powodu chorób układu krążenia w ciągu następnych 10 lat życia, na podstawie czynników ryzyka oszacowanych dla danej osoby. Środek według wynalazku stanowiący składnik produktu leczniczego specjalnego przeznaczenia medycznego klasyfikowany jest według Dyrektywy Unii Europejskiej do grupy środków spożywczych niekompletnych pod względem odżywczym, o standardowym składzie lub składzie dostosowanym pod względem odżywczym, specyficznym dla określonej choroby, zaburzenia lub stanu chorobowego, który nie może być stosowany jako wyłączne źródło pożywienia.

Zastosowanie środka przeciwdziałającego koagulacji krwi według wynalazku, jako składnika kompozycji kosmetycznych, przeznaczonych do zewnętrznego kontaktu z ciałem człowieka, stosowanych w wyłącznym lub głównym celu pielęgnowania, upiększania i ochrony skóry.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi ludzkiej, o właściwościach zbliżonych do heparyny, jest bezpieczny, a wieloparametrowe badania na komórkach krwi oraz komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych wykazały, że środek nie jest toksyczny dla komórek, ani nie wykazuje efektu genotoksycznego, nawet w obecności czynnika indukującego ten efekt, dlatego bez przeszkód może być stosowany w kompozycjach farmaceutycznych, w środkach spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego i w kompozycjach kosmetycznych.

Zaletą środka oprócz tego, że otrzymywany jest z taniego surowca roślinnego, jest fakt, że dzięki zmniejszeniu i ujednoliceniu masy cząsteczkowej koniugatów polifenoli z polisacharydami, ma wysoki stopień homogenności, którego współczynnik rozproszenia masy składników w mieszaninie polimerowej wynosi od 3,5 do 1,1, przez co staje się łatwym do standaryzacji składnikiem kompozycji, a także wykazuje bardzo korzystne właściwości biologiczne. Zasadniczą zaletą środka są bardzo dobre właściwości przeciwdziałania koagulacji krwi, wydłużony czasu półtrwania oraz biodostępność.

Sposób wytwarzania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi z zastosowaniem ultradźwięków umożliwia wytworzenie środka roślinnego, którego masa cząsteczkowa zawarta jest w przedziale od 20 000 Da do 50 000 Da. Użyte w sposobie ultradźwięki powodują w pewnym zakresie kondensację mniejszych cząsteczek do utworzenia większych, ale przede wszystkim za pomocą sił mikrokawitacyjnych powodują degradację większych cząsteczek na mniejsze fragmenty. Procesy polimeryzacji oraz degradacji występują jednocześnie i polimery wielkocząsteczkowe formują się podczas stosunkowo krótkiego czasu, ale ciężar cząsteczkowy polimerów maleje, kiedy roztwór jest poddawany działaniu ultradźwięków przez dłuższy czas.

Przedmiot wynalazku jest zilustrowany w przykładach realizacji, które nie ograniczają zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

W celu otrzymania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, 200 g wysuszonych i rozdrobnionych kwiatostanów i liści przymiotna kanadyjskiego, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ metanolu, w temperaturze 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Następnie usuwa się z masy roślinnej frakcję alkoholową, a surowiec poddaje ekstrakcji 2000 cm³ acetonu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu acetonu z pozostałości roślinnych na drodze sączenia i wysuszeniu poddaje się je kolejno ekstrakcji 2000 cm³ 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu, w temperaturze 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa całą mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temp. 97°C.

PL 236 149 B1

Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zebrany alkaliczny roztwór wodny, doprowadza się do pH=7 przy użyciu wodnego 0,1 M roztworu kwasu solnego. Uzyskaną frakcję wodną poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ heksanu, a po 5-krotnej ekstrakcji heksanem, w temp. 69°C, oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się następnie ekstrakcji eterem dietylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 godzin, w temp. 34°C. Frakcję wodną ekstraktu roślinnego oddzieloną od fazy eterowej poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ chloroformu, a po 5-krotnej ekstrakcji każdorazowo taką samą porcją chloroformu, przez 6 godzin, w temp. 61°C, oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Kolejno frakcję wodną ekstraktu roślinnego poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ mieszaniny chloroformu z etanolem, zmieszanych wcześniej w proporcjach objętościowych 3:2, a po 5-krotnej ekstrakcji jednakowymi porcjami tej mieszaniny, w temp. 70°C, ostatecznie oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalników organicznych i odparowuje do konsystencji proszku, który oczyszcza się na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu metanolu powtórzonej 10 razy.

Nierozpuszczalną w metanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie zawierającej 10% dodatek nadtlenku wodoru tak aby uzyskać 1% roztwór ekstraktu w cieczy, a następnie tak sporządzony roztwór poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 90 W przez 5 godzin w temperaturze 40°C. Otrzymane w tym procesie produkty poddaje się w kolejnym kroku procesowi sączenia na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca do postaci soli sodowych kwasowych komponentów obecnych w tak uzyskanym roztworze, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH=7,2. Po odparowaniu do postaci proszku środek przeciwdziałający koagulacji krwi przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi z przymiotna kanadyjskiego, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, których masa cząsteczkowa makromolekularnych składników zawiera się w przedziale 30 000-50 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy jej składników, czyli współczynnik polidyspersji DPI wynosi średnio 3,5. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 36% substancji o charakterze cukrów, stanowiących część polisacharydową środka, w tym 30% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym, których ilość oceniono kolorymetrycznie, metodą Dubois’a na całkowitą zawartość cukrów (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem. 1956, 28, 350-355). Monosacharydy obojętne, stanowiące elementy składowe części polisacharydowej środka, oceniono ilościowo techniką GLC-MS, przeprowadzając je wcześniej w acetylowe lotne pochodne, według metody opisanej w książce Bierrmanna C. J., McGinnisa G. D. Analysis of Carbohydrates by GLC and MS, Boca Raton, FL: CRC Press z 1989 roku, to: arabinoza w ilości 10% części polisacharydowej, ksyloza w ilości 1% części polisacharydowej, mannoza w ilości 5% części polisacharydowej, glukoza w ilości 11% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 2% części polisacharydowej, fukoza w ilości 1% części polisacharydowej. Natomiast cukry o charakterze kwasowym, czyli mieszanina kwasu glukuronowego oraz kwasu galakturonowego, stanowią 70% części polisacharydowej środka, co oznaczono metodą kolorymetryczną, opisaną przez Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acid, J. Biol. Chem., z 1947 roku, 167, 189-98. Środek zawiera składniki wielkocząsteczkowe polifenolowe, związane z częścią polisacharydową, w ilości 64%, których stężenie oznaczono za pomocą metody kolorymetrycznej Folin-Ciocalteu, opisanej przez Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventós R.M.: Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by mean of Folin-Ciocalteu reagent. Meth. Enzymol., 1999, 299, 152-178. Środek zawiera 1 650 μM reszt polifenolowych w 1 g tego środka, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego. Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

P r z y k ł a d 2

W celu otrzymania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, 200 g wysuszonych i rozdrobnionych liści przymiotna kanadyjskiego, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ etanolu, w temperaturze 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu frakcji alkoholowej z masy roślinnej, surowiec poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ ketonu metylowo-etylowego, w temperaturze 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu ketonu z pozostałości roślinnych na drodze sączenia, i wysuszeniu, surowiec pod

PL 236 149 B1 daje się ekstrakcji 2000 cm³ wodą, w temperaturze 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa całą mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temperaturze 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zebrany roztwór wodny, z uwagi na kwasowy charakter komponentów doprowadza się do pH=7 przy użyciu wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu. Uzyskaną frakcję wodną poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ heptanu, a po 5-krotnej ekstrakcji porcją heptanu, każdorazowo przez 6 godzin, w temperaturze 69°C, ostatecznie oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się ekstrakcji eterem dipropylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 godzin, w temperaturze 34°C. Frakcję wodną ekstraktu roślinnego oddziela się od fazy eterowej i poddaje ekstrakcji 2000 cm³ chloroformu, a po 5-krotnej ekstrakcji każdorazowo taką samą porcją chloroformu, każdorazowo przez 6 godzin, w temperaturze 61°C, ostatecznie oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Kolejno frakcję wodną ekstraktu roślinnego poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ mieszaniny chloroformu z metanolem, zmieszanych wcześniej w proporcjach objętościowych 3:2, a po 5-krotnej ekstrakcji jednakowymi porcjami tej mieszaniny, każdorazowo przez 6 godzin, w temperaturze 70°C, ostatecznie oddzieloną frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalników organicznych, odparowuje się do konsystencji proszku, który oczyszcza się na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu etanolu powtórzonej 15 razy.

Nierozpuszczalną w etanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie zawierającej 5% dodatek nadtlenku wodoru tak aby uzyskać 5% roztwór ekstraktu w cieczy, a następnie roztwór poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 120 W przez 4 godziny w temperaturze 30°C. Otrzymane w tym procesie produkty poddaje się sączeniu na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca do postaci soli wapniowych kwasowych komponentów, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku wapnia do pH=7,2. Po odparowaniu do postaci proszku, otrzymany środek przeciwdziałający koagulacji krwi przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi z liści przymiotna kanadyjskiego, według wynalazku, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, których masa cząsteczkowa zawiera się w przedziale 34 000-40 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy jej składników, czyli współczynnik polidyspersji DPI wynosi średnio 3,2. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 90% substancji o charakterze cukrów będących polisacharydami, w tym 25% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym, których ilość oceniono kolorymetrycznie, metodą Dubois’a na całkowitą zawartość cukrów (1956). Są to: arabinoza w ilości 5% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 3% części polisacharydowej, ksyloza w ilości 1% części polisacharydowej, mannoza w ilości 5% części polisacharydowej, glukoza w ilości 10% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 10% części polisacharydowej, natomiast cukrów o charakterze kwasowym, takich jak kwas glukuronowy oraz kwas galakturonowy jest 75%, co oznaczono metodą kolorymetryczną, opisaną przez Dische Z. (1947). Środek zawiera wielkocząsteczkowe polifenole, związane z częścią polisacharydową, w ilości 10% środka, co w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego dało stężenie 500 μM reszt polifenolowych w 1 g tego środka, co oznaczono za pomocą metody kolorymetrycznej Folin-Ciocalteu (1999). Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

P r z y k ł a d 3

W celu otrzymania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, wysuszone i rozdrobnione kwiaty przymiotna kanadyjskiego, w ilości 200 g, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ 1-propanolu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu frakcji alkoholowej z masy roślinnej, poddaje się ją ekstrakcji 2000 cm³ ketonu dietylowego, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu ketonu z pozostałości roślinnych na drodze sączenia i wysuszeniu surowiec poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ 0,65 M wodnym roztworem wodorotlenku sodu, w temp. 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temp. 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zebrany alkaliczny roztwór wodny, doprowadzony do pH=7 wodnym 0,1 M roztworem kwasu solnego, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ pentanu, a po 5-krotnej ekstrakcji pentanem, każdorazowo przez 6 godzin, w temp. 69°Coraz oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się ekstrakcji eterem diizopropylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 godzin, w temp. 34°C. Ostatecznie oddzieloną frakcję wodną, od frakcji

PL 236 149 B1 rozpuszczalnika organicznego odparowuje się do konsystencji proszku, który oczyszcza się na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu propanolu powtórzonej 20 razy.

Nierozpuszczalną w propanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza w wodzie zawierającej 2% dodatek nadtlenku wodoru do uzyskania 10% roztwór ekstraktu w cieczy, który poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 150 W przez 3 godziny w temperaturze 20°C. Otrzymane produkty sączy się na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca w sole sodowe kwasowe komponenty, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH=7,2. Po odparowaniu do postaci proszku, otrzymany środek przeciwdziałający koagulacji krwi przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi z kwiatów przymiotna kanadyjskiego, według wynalazku, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, których masa cząsteczkowa zawiera się w przedziale 28 000-30 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy jej składników, czyli współczynnik polidyspersji DPI wynosi średnio 2,2. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 20% substancji o charakterze cukrów budujących część polisacharydową, co oceniono kolorymetrycznie, metodą Dubois’a na całkowitą zawartość cukrów (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem. 1956, 28, 350-355). W tym 35% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym, które oceniono ilościowo techniką GLC-MS, według metody opisanej przez Bierrmanna C. J., McGinnisa G. D. Analysis of Carbohydrates by GLC and MS (1989). Są to: arabinoza w ilości 10% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 5% części polisacharydowej, fukoza w ilości 2% części polisacharydowej, ryboza w ilości 1% części polisacharydowej, mannoza w ilości 3% części polisacharydowej, glukoza w ilości 12% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 2% części polisacharydowej, natomiast cukrów o charakterze kwasowym, takich jak kwas glukuronowy oraz kwas galakturonowy jest 65%, co stwierdzono na drodze pomiarów kolorymetrycznych, metodą opisaną przez Dische Z. J. Biol. Chem., 1947, 167, 189-98. Środek zawiera 80% wielkocząsteczkowych polifenoli, związanych z częścią polisacharydową, co można przedstawić w formie stężenia - 1256 μM reszt polifenolowych w 1 g tego środka, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego (Singleton V.L., Orthofer R., LamuelaRaventós R.M. Meth. Enzymol., 1999, 299, 152-178). Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

P r z y k ł a d 4

W celu otrzymania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, wysuszone i rozdrobnione kwiatostany przymiotna kanadyjskiego, w ilości 250 g, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ 2-propanolu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu frakcji alkoholowej z masy roślinnej, poddaje się ją ekstrakcji o 2000 cm³ ketonu metylo-etylowego, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po odsączeniu ketonu z pozostałości roślinnych i wysuszeniu, surowiec poddaje się ekstrakcji 2000 cm³0,1 M wodnego roztworu octanu sodu, w temp. 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temp. 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zebrany roztwór wodny, doprowadzony do pH=7, przy użyciu wodnego 0,1 M roztworu kwasu solnego, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ heksanu, a po 5-krotnej ekstrakcji porcją heksanu, w temp. 69°C, oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się następnie ekstrakcji eterem dietylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 h, w temp. 34°C. Frakcję wodną ekstraktu roślinnego oddzieloną od fazy eterowej, poddaje się ekstrakcji 2000 cm³mieszaniny chloroformu z 1-propanolem, zmieszanych w proporcjach objętościowych 3:2, a po 5-krotnej ekstrakcji jednakowymi porcjami tej mieszaniny, w temp. 70°C oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalników organicznych i odparowuje do konsystencji proszku, który oczyszcza się na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu etanolu powtórzonej 10 razy.

Nierozpuszczalną w etanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie zawierającej 1% dodatek nadtlenku wodoru tak, aby uzyskać 15% roztwór ekstraktu w cieczy, a następnie roztwór poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 180 W przez 2 godziny w temperaturze 15°C. Otrzymane w tym procesie produkty sączy się na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da.

PL 236 149 B1

Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca w sole sodowe kwasowe komponenty, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH=7,2. Odparowany do postaci proszku, środek przeciwdziałający koagulacji krwi przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi z kwiatostanów przymiotna kanadyjskiego, według wynalazku, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, których masa cząsteczkowa zawiera się w przedziale 25 000-28 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy jej składników, czyli współczynnik polidyspersji DPI wynosi średnio 2,1. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 30% substancji o charakterze polisacharydów, co zostało zmierzone kolorymetrycznie, w metodzie Dubois’a (1956), w tym 90% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym: arabinoza w ilości 30% części polisacharydowej, fukoza w ilości 2% części polisacharydowej, ryboza w ilości 1% części polisacharydowej, mannoza w ilości 8% części polisacharydowej, glukoza w ilości 15% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 20% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 9% części polisacharydowej, które oceniono ilościowo techniką GLC-MS (Analysis of Carbohydrates by GLC and MS, Boca Raton, FL: CRC Press, 1989). Cukrów o charakterze kwasowym, takich jak kwas glukuronowy oraz kwas galakturonowy w części polisacharydowej jest 10,0%, co zmierzono stosując metodę m -hydroksybifenylową (Dische Z., J. Biol. Chem., 1947, 167, 189-98). Środek zawiera 70% wielkocząsteczkowych polifenoli, związanych z częścią polisacharydową, które zawierają 2 850 μM wolnych grup fenolowych w 1 g tego środka, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego (Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventós R.M. Meth. Enzymol., 1999, 299, 152-178). Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

P r z y k ł a d 5

W celu otrzymania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, wysuszone i rozdrobnione ziele przymiotna kanadyjskiego, w ilości 200 g poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ acetonu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Następnie frakcję acetonową usuw się z masy roślinnej, a surowiec ekstrahuje 2000 cm³ etanolu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu alkoholu z pozostałości roślinnych i wysuszeniu, surowiec poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ 0,65 M wodnego roztworu octanu sodu, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 h w temp. 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zebrany roztwór wodny, doprowadza się do pH=7 przy użyciu wodnego 0,1 M roztworu kwasu solnego i poddaje ekstrakcji 2000 cm³ pentanu, a po 5-krotnej ekstrakcji pentanem, w temp. 69°C, oddziela frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się ekstrakcji każdorazowo taką samą porcją chloroformu, w temp. 61°C, ostatecznie oddzieloną frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego, odparowaną do konsystencji proszku, oczyszcza się na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu etanolu, powtórzonej 15 razy.

Nierozpuszczalną w etanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie do uzyskania 20% roztworu ekstraktu w cieczy, który poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 240 W przez 60 minut w temperaturze 10°C. Otrzymane w tym procesie produkty sączy się na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca w sól wapniową kwasowych komponentów obecnych w tak uzyskanym roztworze, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku wapnia do pH=7,2. Odparowany do postaci proszku, otrzymany środek przeciwdziałający koagulacji krwi przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwdziałający koagulacji krwi z ziela przymiotna kanadyjskiego, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, których masa cząsteczkowa zawiera się w przedziale 20 000-24 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy jej składników, czyli współczynnik polidyspersji DPI wynosi średnio 1,1. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 55% substancji o charakterze cukrów, stanowiących część polisacharydową środka, co oceniono kolorymetrycznie (Dubois et ah, 1956), w tym 45% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym: arabinoza w ilości

PL236 149 Β1

12% części polisacharydowej, ksyloza w ilości 2% części polisacharydowej, mannoza w ilości 10% części polisacharydowej, glukoza w ilości 11% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 20% części polisacharydowej, które oznaczono techniką GLC-MS, w postaci acetylowych lotnych pochodnych. Natomiast cukrów o charakterze kwasowym, takich jak kwas glukuronowy oraz kwas galakturonowy jest 55% w części polisacharydowej środka. Ilość tą wyznaczono kolorymetrycznie, w metodzie m-hydroksybifenylowej (Dische Z., 1947). Środek zawiera 45% wielkocząsteczkowych polifenoli związanych z częścią polisacharydową. Jest to odpowiednikiem 1 750 μΜ reszt fenolowych w 1 g tego środka, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego, co oceniono metodą Folin-Cicalteu (Singleton V.L. et ah, 1999). Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

Badania antykoagulacyjne środka według wynalazku na osoczu krwi ludzkiej

Właściwości skutkujące przeciwdziałaniu koagulacji krwi związane są z hamowaniem procesu krzepnięcia osocza krwi, a w wyniku tego powstaje biały fibrynowy skrzep. Proces ten śledzony jest za pomocą trzech testów diagnostycznych: testu aktywowanego czasu kefalinowego (aPTT - ang. activated partial thromboplastin time), testu czasu protrombinowego (PT - ang. prothrombin time) oraz testu czasu trombinowego (TT - ang. thrombin time) - standardowych metod in vitro, powszechnie stosowanych w placówkach medycznych do monitorowania stanu zdrowia pacjentów, poddawanych kuracji lekami wydłużającymi czas krzepnięcia.

1. Przygotowanie roztworów

Do każdego z testów środek roślinny otrzymany w przykładach 1-5 naważono i rozpuszczono w wodzie dejonizowanej, mikrobiologicznie czystej, uzyskując stężenie wyjściowe 28 mg/mL, co odpowiada stężeniu 4 mg/mL w mieszaninie reakcyjnej, a następnie przygotowano kolejne rozcieńczenia środka, tak aby stężenie w mieszaninie reakcyjnej wynosiło: 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL, 500 g/mL, 250 g/mL, 125 g/mL, 62,50 g/mL, 31,25 g/mL, 15,62 g/mL oraz 7,81 g/mL. Pomiary zostały wykonane przy użyciu koagulometru.

2. Badanie właściwości antykoagulacyjnych na osoczu krwi ludzkiej testem aktywowanego czasu kaolinowo-kefalinowego (PTT)

Każdorazowo w kubeczku reakcyjnym z mieszadełkiem umieszczono 25 μί roztworu badanego środka roślinnego i 50 μί spulowanego osocza ludzkiego, a następnie inkubowano mieszaninę w temperaturze 37°C przez 3 minuty. Kolejno dodano 50 μί odczynnika aPTT, roztwór wymieszano i inkubowano przez kolejne 3 minuty w temperaturze 37°C. Następnie dodano 50 μί 0,025 M roztworu chlorku wapnia i natychmiast rozpoczęto pomiar czasu krzepnięcia. Dla każdego stężenia wykonano kilkukrotne pomiary. Dla każdej serii, wykonano także pomiary kontrolne, w których zamiast próbki środka użyto 25 μί wody dejonizowanej, mikrobiologicznie czystej. Odczynnik aPTT oraz 0,025 M roztwór chlorku wapnia inkubowano w bloku grzewczym w temperaturze 37°C przez cały czas trwania doświadczenia. Otrzymano następujące wyniki czasu formowania skrzepu, które podano w sekundach:

Stężenie środka w osoczu \|gg/ml[	Przykład 1* 0H-0W	środek wg. Przykładu 1 5H-90W	środek wg. Przykładu? 4H-120W	środek wg. Przykładu3 3H-150W	środek wg. Przykładu4 2H-180W	środek wg. Przykład u5 1H-240W
4000,.00	>600	>600	>600	>600	>600	>600
2000,00	>600	>600	>600	>600	>600	>600
1000,00	>600	>600	>600	>600	>600	>600
500,00	557	553	583	>600	>600	>600
250,00	178	195	160	253	295	285
125,00	92	98	102	110	125	124
62,50	41	46	42	43	46	66
31,20	31	34	30	33	33	32
0 (kontrola)	30	32	31	32	33	31

W tabeli przykład 1* obrazuje aktywność środka, który nie został poddany działaniu ultradźwięków.

PL236 149 Β1

Pomiary prowadzono maksymalnie do 600 s, a po tym czasie uznawano, że skrzep nie powstaje, czyli środek w danym stężeniu całkowicie hamuje proces krzepnięcia osocza krwi ludzkiej torem wewnątrzpochodnym enzymatycznej kaskady krzepnięcia krwi. Zaobserwowano poprawę cechy wydłużania czasu formowania skrzepu, kiedy zastosowano proces modyfikacji składników środka za pomocą ultradźwięków, w porównaniu z aktywnością środka znanego.

3. Badanie właściwości antykoagulacyjnych na osoczu krwi ludzkiej testem czasu protrombinowego (PT)

Każdorazowo w kubeczku reakcyjnym z mieszadełkiem umieszczono 25 μΙ_ roztworu badanego środka roślinnego i 50 μΙ_ spulowanego osocza ludzkiego, a następnie inkubowano mieszaninę w temperaturze 37°C przez 2 minuty. Kolejno dodano 100 μΙ_ odczynnika PT i natychmiast rozpoczęto pomiar czasu krzepnięcia. Dla każdego stężenia środka wykonano kilkukrotne pomiary. Dla każdej serii, wykonano także pomiary kontrolne, w których zamiast roztworu środka użyto 25 μΙ_ wody dejonizowanej, mikrobiologicznie czystej. Odczynnik PT inkubowano w bloku grzewczym w temperaturze 37°C przez cały trwania doświadczenia. Otrzymano następujące wyniki czasu formowania skrzepu, podane w sekundach:

Stężenie środka w osoczu [gg/ml\|	Przykład 1* 0H-0W	środek wg. Przykładu 1 5H-90W	środek wg. Przykładu 2 4H-120W	środek wg. Przykładu 3 3H-150W	środek wg. Przykładu 4 2H-180W	środek wg. Przykładu 5 1H-240W
4000,00	> 300,0	>300,0	>300,0	>300,0	> 300,0	101,2
2000,00	49,6	51,4	55,8	61,8	51,0	42,2
1000,.00	33,8	39,3	42,8	40,9	37,2	41,6
500,00	33,5	35,6	38,6	35,8	33,8	30,7
250,00	19,3	30,3	29,6	29,1	28,4	12,9
125,00	12,5	12,9	13,0	12,9	12,4	13,2
62,50	13,0	12,5	12,5	12,7	12,8	12,9
31,20	13,0	13,0	12,9	13,0	13,0	12,9
0 (kontrola)	12,5	12,7	13,0	12,0	13,1	13,3
W tabeli	przykład 1 *	obrazuje aktywność środka,	który nie	został poddany działaniu

ultradźwięków.

Pomiary prowadzono maksymalnie do 300 s, a po tym czasie uznawano, że skrzep nie powstaje, czyli środek w danym stężeniu całkowicie hamuje proces krzepnięcia osocza krwi ludzkiej torem zewnątrzpochodnym enzymatycznej kaskady krzepnięcia krwi. Zaobserwowano brak zmiany lub pogorszenie cechy wydłużania czasu formowania skrzepu, kiedy zastosowano proces modyfikacji składników środka za pomocą ultradźwięków, w porównaniu z aktywnością środka znanego. Nadmierne hamowanie krzepnięcia tym torem enzymatycznym może doprowadzać do skutków ubocznych w postaci niekontrolowanych krwotoków.

4. Badanie właściwości antykoagulacyjnych na osoczu krwi ludzkiej testem czasu trombinowego (TT)

Każdorazowo w kubeczku reakcyjnym z mieszadełkiem umieszczono 25 μΙ_ roztworu badanego środka roślinnego i 100 μΙ_ spulowanego osocza ludzkiego, a następnie inkubowano mieszaninę w temperaturze 37°C przez 2 minuty. Kolejno dodano 50 μΙ_ odczynnika TT i natychmiast rozpoczęto pomiar czasu krzepnięcia. Dla każdego stężenia wykonano kilkukrotne pomiary. Dla każdej serii, wykonano także pomiary kontrolne, w których zamiast 25 μΙ_ roztworu środka użyto 25 μΙ_ wody dejonizowanej, mikrobiologicznie czystej. Odczynnik TT inkubowano w bloku grzewczym w temp. 37°C przez cały czas trwania doświadczenia. Otrzymano następujące wyniki czasu formowania skrzepu, które podano w sekundach:

PL236 149 Β1

Stężenie środka w osoczu [pg/ml\|	Przykład 1* 0H-0W	środek wg. Przykładu 1 5H-90W	środek wg. Przykładu 2 4H-120W	środek wg. Przykładu 3 3H-150W	środek wg. Przykładu 4 2H-180W	środek wg. Przykładu 5 1H-240W
4000,00	>300	>300	>300	>300	>300	>300
2000,00	224	188	195	223	212	>300
1000,00	51	44	53	60	54	29
500,00	25	22	24	28	29	16
250,00	16	15	16	18	18	12
125,00	12	12	11	12	12	11
62,50	12	11	11	11	11	11
31,20	12	11	11	11	11	11
0 (kontrola)	12	12	11	12	12	12
W tabeli	przykład 1 *	obrazuje aktywność środka,	który nie	został poddany	działaniu

ultradźwięków.

Pomiary prowadzono maksymalnie do 300 s, a po tym czasie uznawano, że skrzep nie powstaje, czyli środek w danym stężeniu całkowicie hamuje proces krzepnięcia osocza krwi ludzkiej na ostatnim etapie enzymatycznej kaskady krzepnięcia krwi. Zaobserwowano brak istotnej zmiany cechy wydłużania czasu formowania skrzepu, kiedy zastosowano proces modyfikacji składników środka za pomocą ultradźwięków, w porównaniu z aktywnością środka znanego.

Badanie mechanizmów aktywności antykoagulacyjnej

Do najważniejszych rodzajów aktywności antykoagulacyjne wobec osocza krwi należą: zdolność do tworzenia kompleksu z antytrombiną, który hamuje aktywność czynnika lla (trombiny) - tzw. aktywność anty-lla, albo hamuje aktywność czynnika Xa - tzw. aktywność anty-Xa, bądź zdolność do tworzenia kompleksu z kofaktorem heparyny II (HC II), który hamuje aktywność czynnika lla. Metodyka stosowana do określenia sprawności mechanizmów osoczowego układu krzepnięcia dla opiera się na pomiarach absorbancji p-nitroaniliny wydzielonej z substratu chromogennego, podczas wiązania z wolną, nieprzereagowaną trombiną lub czynnikiem Xa lub czynnika lla. Badania przeprowadzono modyfikując znaną metodykę badawczą, opisaną w literaturze przez autorów Pereira M.S., Mulloy B., Mourao P.A.S., „Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans. Comparison between the regular, repetitive, and linear fucans from echinoderms with the morę heterogeneous and branched polymers from brown algae”, J. Biol. Chem., 1999, 274, 656-67.

1. Badania nad aktywnością anty-lla

Odczynniki:

AT - antytrombina - do badania użyto roztworu, który w mieszaninie reakcyjnej miał aktywność 2U/mL, w tym celu 125 pg białka rozpuszczono w 1,875 buforu TRIS o pH=8,4, lla - trombiną - do badania użyto roztworu, który w mieszaninie reakcyjnej miał aktywność 0,3 NIH/mL, w tym celu rozpuszczono fiolkę preparatu w 6,67 ml buforu TRIS o pH=8,4, S-2238 substrat chromogenny dla trombiny - do badań użyto roztworu o stężeniu 1,0 mM, w tym celu rozpuszczono 25,0 mg substratu w 16,78 mL buforu TRIS o pH=8,4, bufor TRIS - 0,05 M TRIS, 0,175 M NaCI, 0,0075 M EDTA, pH=8,4, 0,1% glikolu polietylenowego (PEG-400), 0,02% azydku sodu, STOP - 50% roztwór kwasu octowego, próbka - 8 mg środka roślinnego otrzymanego w przykładach 1-5 rozpuszczonego w 1,0 mL H2O. Z tak przyrządzonego roztworu pobiera się 1 mL i rozcieńcza w buforze TRIS uzyskując kolejno rozcieńczenia 800,0 pg/mL, 400,0 pg/mL, 200,0 pg/mL, 100,0 pg/mL, 50,0 pg/mL, 25,0 pg/mL, 12,5 pg/mL, 6,25 pg/mL, 3,12 pg/mL, 1,56 pg/mL, 0,78 pg/mL, 0,39 pg/mL, 0,20 pg/mL, 0,10 pg/mL oraz 0,05 pg/mL.

Pomiar wykonano przy wykorzystaniu czytnika mikropłytek. Przed rozpoczęciem pomiarów oddziaływań środka roślinnego otrzymanego w przykładach 1—5 z kompleksem anty-lla w celu sprawdzenia poprawności aktywności białek należy oznaczyć aktywność trombiny oraz kompleksu trombina-antytrombina według następującej procedury:

PL 236 149 B1

a) Aktywność trombiny

Aby wyzerować aparat do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 105 μL roztworu substratu S-2238. Kolejno roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się następnie 50 μL roztworu IIa i roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 55 μL buforu TRIS, a następnie aparat zeruje się na długość fali 405 nm. W celu wykonania pomiaru do kuwety dodaje się 55 μL buforu TRIS. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się kolejno 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 105 μL roztworu substratu S-2238. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 60 sek. Do kuwety dodaje się 40 μL roztworu STOP. Pomiar wykonuje się przy długości fali 405 nm.

b) Aktywność kompleksu trombina-antytrombina

W celu wyzerowania urządzenia do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 105 μL roztworu substratu S-2238. Roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór następnie inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 5 μL roztworu AT oraz 50 μL buforu TRIS. Aparat zeruje się na długość fali 405 nm. Aby wykonać pomiar do kuwety dodaje się 5 μL roztworu AT oraz 50 μL buforu TRIS i roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 105 μL roztworu substratu S-2238 i całość inkubuje się w 37°C przez dokładnie 60 sek. Do kuwety dodaje się kolejno 40 μL roztworu STOP, a pomiar wykonuje się przy długości fali 405 nm.

c) Pomiary właściwe

Każdy pomiar był poprzedzany zerowaniem aparatu, które przebiega według następującej procedury: do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 105 μL roztworu substratu S-2238. Roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Następnie do kuwety dodaje się 50 μL próbki oraz 5 μL roztworu AT. Aparat zeruje się a długość fali 405 nm. Po wyzerowaniu aparatu wykonano pomiar według następującej procedury: do kuwety dodaje się 50 μL próbki oraz 5 μL roztworu AT. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Kolejno do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety następnie dodaje się 105 μL roztworu substratu S-2238 i roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 60 sek. Po tym do kuwety dodaje się 40 μL roztworu STOP. Pomiar wykonuje się przy długości fali 405 nm.

2. Badania nad aktywnością anty-HC II

Odczynniki:

- HCII - kofaktor heparyny II - o stężeniu 0,6 μΜ, aby uzyskać roztwór o takim stężeniu rozpuszczono fiolkę w 505 μL buforu TRIS;

- IIa - trombina - wołowa o aktywności 10 NIH - do badań użyto roztworu, który w mieszaninie reakcyjnej miał aktywność 0,3 NIH/mL, w tym celu rozpuszczono fiolkę preparatu w 6,67 ml buforu TRIS o pH=8,4,

- S-2238 substrat chromogenny dla trombiny - do badań użyto roztworu o stężeniu 2,0 mM, w tym celu rozpuszczono 15,0 mg substratu w 11,99 mL buforu TRIS o pH=8,4,

- bufor TRIS - 0,05 M TRIS, 0,175 M NaCl, 0,0075 M EDTA, pH=8,4, 0,1% glikolu polietylenowego (PEG-400), 0,02% azydku sodu,

- STOP - 50% roztwór kwasu octowego,

- próbka - 8 mg środka roślinnego otrzymanego w przykładach 1-5 rozpuszczonego w 1,0 ml H2O. Z tak przyrządzonego roztworu pobiera się 1 ml i rozcieńcza w buforze TRIS uzyskując kolejno rozcieńczenia 800,0 μg/mL, 400,0 μg/mL, 200,0 μg/mL, 100,0 μg/mL, 50,0 μg/mL, 25,0 μg/mL, 12,5 μg/mL, 6,25 μg/mL, 3,12 μg/mL, 1,56 μg/mL, 0,78 μg/mL, 0,39 μg/mL, 0,20 μg/mL, 0,10 μg/mL oraz 0,05 μg/mL.

Pomiar był wykonany przy użyciu czytnika mikropłytek. Przed rozpoczęciem pomiarów oddziaływań środka roślinnego otrzymanego w przykładach 1-5 z kompleksem anty-HC II oznaczono aktywność trombiny oraz kompleksu trombina-kofaktor heparyny II według następującej procedury:

PL 236 149 B1

a) Aktywność trombiny

Aby wyzerować aparat do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 105 μL roztworu substratu S-2238. Kolejno roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się następnie 50 μL roztworu IIa i roztwór inkubuje się w 37°C przez 60 sek. Do kuwety dodaje się 55 μL buforu TRIS, a następnie aparat zeruje się na długość fali 388 nm. W celu wykonania pomiaru do kuwety dodaje się 55 μL buforu TRIS. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się kolejno 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 105 μL roztworu substratu S-2238. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 60 sek. Do kuwety dodaje się 40 μL roztworu STOP. Pomiar wykonuje się przy długości fali 388 nm.

b) Aktywność kompleksu trombina-kofaktor heparyny II

W celu wyzerowania urządzenia do kuwety „półmikro” dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 105 μL roztworu substratu S-2238. Roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór następnie inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 5 μL roztworu HC II oraz 50 μL buforu TRIS. Aparat zeruje się na długość fali 388 nm. Aby wykonać pomiar do kuwety dodaje się 5 μL roztworu HC II oraz 50 μL buforu TRIS i roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 105 μL roztworu substratu S-2238 i całość inkubuje się w 37°C przez dokładnie 60 sek. Do kuwety dodaje się kolejno 40 μL roztworu STOP, a pomiar wykonuje się przy długości fali 388 nm.

c) Pomiary właściwe

Każdy pomiar jest poprzedzany zerowaniem aparatu, które przebiega według następującej procedury: do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 105 μL roztworu substratu S-2238. Roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Następnie do kuwety dodaje się 50 μL próbki oraz 5 μL roztworu HC II. Aparat zeruje się na długość fali 388 nm. Po wyzerowaniu aparatu wykonano pomiar według następującej procedury: do kuwety dodaje się 50 μL próbki oraz 5 μL roztworu HC II. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Kolejno do kuwety dodaje się 50 μL roztworu IIa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety następnie dodaje się 105 μL roztworu substratu S-2238 i roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 600 sek. Po tym do kuwety dodaje się 40 μL roztworu STOP. Pomiar wykonuje się przy długości fali 388 nm.

3. Badania nad aktywnością anty-Xa

Odczynniki:

- AT - antytrombina - do badania użyto roztworu, który w mieszaninie reakcyjnej miał aktywność 0,026 IU/ml, w tym celu rozpuszczono antytrombinę w buforze TRIS o pH=8,4 do uzyskania aktywności 1,5 IU/mL;

- Xa - czynnik Xa, aktywowany - wołowy, o aktywności w mieszaninie reakcyjnej 0,037 IU/mL; w tym celu rozpuszczono czynnik Xa w buforze TRIS o pH=8,4 do uzyskania aktywności 0,233 lU/mL;

- S-2765 substrat chromogenny dla czynnika Xa - do badań użyto roztworu, którego stężenie w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 1,56 mM, w tym celu rozpuszczono substrat w buforze TRIS o pH=8,4 do stężenia 2,36 mM,

- bufor TRIS - 0,05 M TRIS, 0,175 M NaCl, 0,0075 M EDTA, pH=8,4, 0,1% glikolu polietylenowego (PEG-400), 0,02% azydku sodu;

- STOP - 50% roztwór kwasu octowego,

Pomiar był wykonany przy użyciu czytnika mikropłytek. Przed rozpoczęciem pomiarów oddziaływań preparatów roślinnych z kompleksem anty-Xa oznaczyć należy aktywność czynnika Xa oraz kompleksu czynnik Xa-antytrombina według następującej procedury:

a) Aktywność czynnika Xa

Aby wyzerować aparat do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μL roztworu STOP oraz 165 μL roztworu substratu S-2765. Kolejno roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się następnie 40 μL roztworu Xa i roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 45 μL

PL236 149 Β1 buforu TRIS, a następnie aparat zeruje się na długość fali 405 nm. W celu wykonania pomiaru do kuwety dodaje się 45 μΙ_ buforu TRIS. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się kolejno 40 μΙ_ roztworu Xa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 165 μΙ_ roztworu substratu S-2765. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 40 μΙ_ roztworu STOP. Pomiar wykonuje się przy długości fali 405 nm.

b) Aktywność kompleksu czynnik Xa-antytrombina

W celu wyzerowania urządzenia do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μΙ_ roztworu STOP oraz 165 μΙ_ roztworu substratu S-2765. Roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 40 μΙ_ roztworu Xa. Roztwór następnie inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 5 μΙ_ roztworu AT oraz 40 μΙ_ buforu TRIS. Aparat zeruje się na długość fali 405 nm. Aby wykonać pomiar do kuwety dodaje się 5 μΙ_ roztworu AT oraz 40 μΙ_ buforu TRIS i roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 40 μΙ_ roztworu Xa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się 165 μΙ_ roztworu substratu S-2765 i całość inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety dodaje się kolejno 40 μΙ_ roztworu STOP, a pomiar wykonuje się przy długości fali 405 nm.

c) Pomiary właściwe

Każdy pomiar jest poprzedzany zerowaniem aparatu, które przebiega według następującej procedury: do dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 40 μΙ_ roztworu STOP oraz 165 μΙ_ roztworu substratu S-2765. Roztwór inkubuje się w 37°C przez 120 sek. Do kuwety dodaje się 40 μΙ_ roztworu Xa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Następnie do kuwety dodaje się 40 μΙ_ próbki oraz 5 μΙ_ roztworu AT. Aparat zeruje się na długość fali 405 nm. Po wyzerowaniu aparatu wykonano pomiar według następującej procedury: do kuwety dodaje się 40 μΙ_ próbki oraz 5 μΙ_ roztworu AT. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Kolejno do kuwety dodaje się 40 μΙ_ roztworu Xa. Roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Do kuwety następnie dodaje się 165 μΙ_ roztworu substratu S-2765 i roztwór inkubuje się w 37°C przez dokładnie 120 sek. Po tym do kuwety dodaje się 40 μΙ_ roztworu STOP. Pomiar wykonuje się przy długości fali 405 nm.

Minimalne stężenie środka wywołujące inhibicję w 50% określone jest jako wartość IC50. Podsumowując, wartości IC50 aktywności otrzymanych w eksperymentach anty-Xa, anty-lla oraz anty-HC II, zebrane one zostały w poniższej tabeli:

IC₅₀ [pg/mL]
Środek wg. wynalazku otrzymany w:	anty-IIa	anty-Xa	anty-HCH
Przykładzie 1*	3	80	45
Przykładzie 1	2	90	50
Przykładzie!	1,1	100	120
Przykładzie3	6	130	80
Przykładzie4	5	60	110
Przykładzieó	1	70	95
kontrola pozytywna: heparyna / siarczan dermatanu	0,10	0,35	0,75

Z powyższego zestawienia wynika, że środek otrzymany w przykładach 1-5 wykazuje wysoce selektywną aktywność antykoagulacyjną działając na konkretny szlak enzymatycznej kaskady krzepnięcia krwi - anty Ha.

Ocena cytotoksyczności

Test cytotoksyczności, wykonany metodą biologiczną w warunkach in vitro, polega na obserwacji zdolności przeżycia komórek oraz ich cech morfologicznych w medium zawierającym badany środek według wynalazku otrzymany w przykładach 1-5, w różnych jego stężeniach. Oznaczenie cytotoksyczności środka na liniach komórkowych L929 oraz A549 wykonano zgodnie z normą PN-EN-ISO 10993-5 „Biologiczna ocena wyrobów medycznych:: Badania cytotoksyczności: in vitro. - 2001 oraz normą

PL236 149 Β1

PN-EN ISO 10993-12 „Biologiczna ocena wyrobów medycznych. Część 12: Przygotowanie próbki i materiały odniesienia” - 2009. Norma Europejska EN ISO 10993-12:2007 ma status Polskiej Normy.

Badania wykonano w kilku powtórzeniach, dla każdego terminu badawczego dla prób badanych i kontrolnych, powtarzalność otrzymanych wyników wynosiła 95%, co oznaczało różnice w ilości komórek w każdym z trzech eksperymentów rzędu kilku liczonych komórek.

W tym celu użyto następujące linie komórkowe: L929 - linia komórek fibroblastopodobnych otrzymanych z podskórnej tkanki tłuszczowej myszy C3H (ATCC CCL 1), A549 - linia komórek nabłonkopodobnych ludzkiego raka płuc (ATCC CCL 185).

Hodowlę komórek L929 prowadzono w płynie hodowlanym Eagle'a, natomiast komórek A549 w płynie hodowlanym Dulbecco, z dodatkiem 10% inaktywowanej (30 min, 56°C) surowicy cielęcej oraz 100 j/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2mM/ml L-glutaminy w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Na podstawie zmian morfologicznych obserwowanych w mikroskopie odwróconym, określano efekt cytotoksyczny poszczególnych stężeń środka roślinnego dla komórek linii L929. Minimalne stężenie badanego środka, toksyczne dla ~50% komórek, określane jest jako 1 TCCD50 (ang. Tissue Culture Cytotoxic Dose). Żywotność komórek określono metodą barwienia błękitem trypanu. Na 24-godzinną hodowlę linii komórkowej L929 lub A549 nanoszono, przygotowane wcześniej, stężenie środka roślinnego z zakresie 1,9-2000 μg/mL, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 dni. Każdego dnia pod mikroskopem odwróconym określano zmiany morfologiczne. Żywotność komórek określano metodą barwienia błękitem trypanu. Martwe komórki wybarwiały się na granatowo, podczas gdy żywe pozostawały niezabarwione.

Wyniki przedstawiono w tabeli:

stężenie środka roślinnego [pg/mL]

2000

1000

500

250

125

62,5

31,2

15,6

7,8

3,9

1,9

Przykład 1*

n

Przykład 1

n

Przykład 2

n

Linia

Przykład 3

n

L929

Przykład 4

n

Przykład 5

π

n

kontrola

n

π

kontrola negatywna (1 N HC1)

t

Przykład 1*

n

Przykład 1

n

Przykład 2

n

π

n

Linia

Przykład 3

n

A549

Przykład 4

n

Przykład 5

n

kontrola A549

n

kontrola negatywna (1 N HC1)

t

n- związek nietoksyczny; t- związek toksyczny

PL 236 149 B1

Efekt toksyczny, oceniany na komórkach obu linii zależał od stężenia środka według wynalazku otrzymanego w przykładach 1-5. Komórki potraktowane 1 N roztworem HCl - kontrola negatywna, ulegały obkurczeniu, zaokrągleniu, odklejeniu od podłoża, obserwowano dużo martwych komórek o ziarnistej cytoplazmie w odniesieniu do komórek traktowanych środkiem roślinnym lub w przypadku kontroli negatywnej. Podsumowując, nie obserwowano efektu toksycznego środka według wynalazku w badanym zakresie stężeń, na obu liniach komórkowych.

Ocena genotoksyczności

Genotoksyczność polega na powodowaniu przez substancję mutacji - trwałych, dziedziczących się zmian substancji dziedzicznej (DNA). Niektóre mutacje mogą indukować powstawanie nowotworów, dlatego przed wprowadzeniem środków do stosowania poddaje się je badaniom określającym ich genotoksyczność. Jednym z biotestów, określających aktywność mutagenną badanych próbek jest test Amesa. Ze względu na wiarygodność i krótki czas oznaczania, relatywnie niską pracochłonność, jest on rekomendowany do badania genotoksyczności leków i materiałów medycznych [PN-EN ISO 10993-3 PN-EN ISO 10993-12].

Genotoksyczność bioszkieł badano mikropłytkowym testem Amesa firmy Xenometrix by Endotell z zastosowaniem szczepów Salmonella typhimurium TA 98 i TA 100 (Ames MPF™ 98/100). W skład zestawu wchodziły: szczepy Salmonella typhimurium TA 98 i TA 100, płynne podłoża mikrobiologiczne: wzrostowe, ekspozycyjne i indykacyjne, ampicylina, frakcja mikrosomalna wątroby szczurów aktywowana Aroclor 1254 oraz kontrolne mutageny pozytywne: 2-nitrofluorenon (2-NF), N-tlenek 4-nitrochinoliny (4-NQ), 2-aminoantracen (2-AA) oraz mikropłytki 24, 96 i 384-dołkowe. Wykonano testy bez i z aktywacją metaboliczną 30% frakcją mikrosomalną wątroby szczurów S9 mix. Stosowano procedurę opisaną w instrukcji producenta testu, opartą na pracach Maron i Ames (1983) oraz Mortelmans i Zeiger (2000), z uwzględnieniem różnic procedury spowodowanych wykonaniem testu w podłożach płynnych na mikropłytkach, a nie na szalkach Petriego ze zagaryzowanym podłożem Vogel-Bonnera. Środek według wynalazku otrzymany w przykładach 1-5 wprowadzano do testu w postaci roztworów wodnych. Rozcieńczano go połowicznie, tak aby w czasie ekspozycji uzyskać stężenia 15,5625-500 μg/mL. Bakterie testowe były eksponowane na działanie 6 stężeń badanej próbki przez 90 minut w mikropłytkach 24-dołkowych w 3 powtórzeniach dla każdego stężenia. Wynik testu, zgodnie z instrukcją producenta testu, uznawano za dodatni, gdy liczba dołków zawierających rewertanty była co najmniej trzykrotnie większa niż w kontroli negatywnej. Do analizy statystycznej wyników wykorzystywano arkusz kalkulacyjny Excel producenta testu. Statystyczną istotność różnic liczby rewertantów między badanymi próbkami a kontrolami negatywnymi badano jednostronnym testem t-studenta. Różnice uznawano za statystycznie istotne przy p < 0,05. Wyniki testu uznawano za wiarygodne, gdy średnia liczba dołków pozytywnych (z rewertantami) w kontroli negatywnej nie przekraczała 8 dla szczepu Salmonella typhimurium TA 98 i 12 dla szczepu Salmonella typhimurium TA 100 a w kontroli pozytywnej wynosiła co najmniej 25.

PL236 149 Β1

Otrzymano następujące rezultaty:

Liczby dołków pozytywnych w teście Amesa - szczep Salmonella typhimurium TA 98 oraz szczep
	Salmonella iyphimurium'[A 100,	bez aktywacji metabolicznej frakcją S9.
szczep S.typhimur ium bez aktywacji metabolicz nej frakcja S9	Środek roślinny	stężenie środka roślinnego [gg/mLJ rewersja spontaniczna _ιςςζ-._{? ΊΙ} 15,5625 31,125 62_s5	125	250	500	kontrola pozytywna
	Przykład 1*	l,67±2,06	2,00±0,00	l,67±0,58	2,33±1,15	0,67±0,58	3,67±3,06	47,00±l,00
	Przykład 1	l.67±l,15	l,00±0,00	2,67±2,08	3,33±2,08	0,67±l,15	3,33±1,53	46,67±1,15
	Przykład 2	l,00±l,00	O,67±1,I5	0,67±l,15	l,33±0,58	2,00±0,00	2,00±1,00	47,00±1,00
TA 98		l,33±l,50
	Przykład 3	l,33±0,58	2,00±2,65	2,33±0,58	l,33±0,58	1,33±1,I5	2,0fttl,00	46,00±1,73
	Przykład 4	1,00±0,00	l,00±l,00	0,67±l,15	O,67±1,I5	ł,00±l,00	3,33±3,51	46,67±1,15
	Przykład 5	0,67±0,58	0,33±0,58	1,67±1,15	3,00±I,73	2,6 7± 1,53	2,00±I,00	47,00±l,00
	Przykład 1 *	l,33±l,53	0,67±l,15	0,33±0,58	0,00±0,00	0,67±l,15	0,00±0,00 34,33±2,08
	Przykład 1	0,00±0,58	0,33±0,58	1,33±2,31	0,00±0,00	0,33±0,58	0,00±0,00	27,33±3,51
	Przykład 2	0,67±0,58	0,00±0,00	0,67±0,58	0,33±0,58	0,00±0,00	0,00±0,00	35,33±2,52
TA 100	Przykład 3	0,33±0,49 0,67±0,58	0,00±0,00	0,67±0,58	0,33±0,58	0,00±0,00	0,00±0,00	34,67±5,86
	Przykład 4	0,33±0,58	l,00±l,00	1,00±1,00	0,33±0,58	0,67±0,58	1,33±1,15	27,33±3,51
	Przykład 5	0,00±0,00	0,67±0,58	0,00±0,00	0,67±l,15	0,67±0,58	0,67±l,l5	35,33±2,52

PL236 149 Β1

Liczby dołków pozytywnych w teście Amesa - szczep Salmonella typhimurium TA 98 oraz szczep

Salmonella typhimurium TA 100, z aktywacją metaboliczną frakcją S9.

szczep stężenie środka roślinnego [pg/mL]

S.lyphimuri Środek

um bez aktywacji metabolicz nej frakcją S9	roślinny	rewersja spontanic zna	15,5625	31,125	62,5	125	250	500	kontrola pozytywna
	Przykład 1*		1,6741,15	1,3341,15	1,3341,53	3,0042,65	3,6741,15	4,0046,08	48,0040,0
	Przykład 1		l,00±l,00	2,6741,15	2,67=2,52	2,3342,08	2,3340,58	1,3341,58	48,00±0,0
	Przykład 2		1,00±1,00	1,3340,58	2,3341,15	1,3340,58	2,0040,00	1,6742,08	48,0040,0
TA 98	Przykład 3	2,0841,63	2,0041,00	1,0041,00	2,3341,15	1,3340,58	2,0040,00	1,6742,08	48,0040,0
	Przykład 4		1,0041,00	3,0042,00	1,6741,53	2,6741,15	1,0041,00	1,0040,00	48,0040,0
	Przykład 5		1,3340,58	1,0041,73	2,33±3,21	0.6740,58	2,00±l,73	1,3340,58	48,0040,0
	Przykład 1*		7,67±1,15	10,3346,35	8,0043,00	7,6742,52	7,6743,06	8,6743,51	45,6742,3
	Przykład 1		8,6744,04	9,3345,86	7,6744,73	8,3341,53	7,3344,33	11,0046,08	43,6743,0
	Przykład 2		13,0048,19	8,6743,06	11,6743,51	8,67±4,93	9,6742.08	10,3341,15	43,6743,0
TA 100	Przykład 3	8,0043,30	5,0041,00	5,0040,00	4,6742,31	5,3340,58	4,6741,53	5,0040,00	43,6743,0
	Przykład 4		7,6742,08	8,0041,73	5,0042,00	10,0045,29	7,3343,79	10,0042,65	40,3343,0
	Przykład 5		11,6744,51	12,00410,44	7,0040,00	11,3345,51	10,3345,51	10,0041,00	43,6743,0

W tabeli przykład l* obrazuje aktywność środka, który nie został poddany działaniu ultradźwięków.

Środek roślinny według wynalazku otrzymany w przykładach 1-5 nie wykazywał genotoksyczności wobec Salmonella typhimurium TA 98 i TA 100 w teście bez aktywacji metabolicznej frakcją S-9 jak też w teście z aktywacją metaboliczną frakcją S9. Pozwala to wnioskować, że nie zawiera on mutagenów bezpośrednich, powodujących powstawanie mutacji zmiany fazy odczytu i podstawiania par zasad, na wykrywanie których pozwalają zastosowane szczepy testowe.

Przykłady kompozycji farmaceutycznych

Przykład 6

Kompozycję farmaceutyczną w postaci tabletki uzyskano przez zmieszanie 20 g dobrze rozdrobnionego środka przeciwdziałającego koagulacji krwi otrzymanego jak w przykładzie I z 30 pg etynyloestradiolu w mieszalniku mechanicznym z dodatkiem około 10% mannitolu. Po przesianiu przez sito o średnicy oczek 250,mieszankę zmieszano z resztą mannitolu, który stanowi dopełnienie masy tabletki do 65 g i z 1,30 g glikolami skrobiowo-sodowego. Następnie do mieszalnika ze wstępnie utworzoną masą tabletkową dodano 1,5% kwasu stearynowego (< 250 pm) i mieszano z dodatkiem 0,5% stearynianu magnezu. Mieszankę tabletkowano wtabletkarce uzyskując tabletki o masie 650 mg, każda zawierająca jednorazową dawkę 200 mg środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, czyli nie mniej niż 30,7% masy tabletki.

Forma podania: lek do stosowania wewnętrznego, przyjmowany jest doustnie.

Działanie: składnik biologicznie aktywny tabletki w postaci środka według wynalazku, po rozpuszczeniu tabletki i przedostaniu się składników środka z przewodu pokarmowego do krwioobiegu pacjenta wiąże się w krwioobiegu z czynnikiem Ha (trombiną) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko

PL 236 149 B1 antytrombinie, co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

Zastosowanie:

- wspomagająco w zapobieganiu żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej, szczególnie u pacjentów poddanych zabiegom chirurgicznym ortopedycznym i ogólnym,

- wspomagająco w zapobieganiu żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej u pacjentów unieruchomionych z powodu schorzeń takich jak ostra niewydolność serca, ostra niewydolność oddechowa, ciężkie infekcje,

- wspomagająco w leczeniu zakrzepicy żył głębokich powikłanej bądź niepowikłanej zatoro- wością płucną.

Dawkowanie: dostosowane do potrzeb pacjenta i stopnia zaawansowania ryzyka choroby lub choroby, przez specjalistę w dziedzinie.

P r z y k ł a d 7

Kompozycję farmaceutyczną w postaci kapsułki żelatynowej twardej, otrzymano przez zmieszanie 1 części sacharozy z 1 częścią dobrze rozdrobnionego środka roślinnego otrzymanego jak w przykładzie 2, który stanowił dawkę 250 mg tego środka. Precyzyjnie odważoną dawkę suchej mieszaniny, zachowując sterylność, zamknięto w 2 częściach twardej kapsułki żelatynowej.

Forma podania: lek do stosowania wewnętrznego, przyjmowany doustnie.

Działanie: składnik biologicznie aktywny kapsułki w postaci środka według wynalazku, po rozpuszczeniu kapsułki i przedostaniu się składników środka z przewodu pokarmowego do krwioobiegu pacjenta wiąże się w krwioobiegu z czynnikiem IIa trombiną) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko antytrombinie, co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

Zastosowanie:

- wspomagająco w leczeniu zakrzepicy żył głębokich powikłanej bądź niepowikłanej zatorowością płucną.

P r z y k ł a d 8

Kompozycję farmaceutyczną w postaci czopka doodbytniczego, uzyskano ze środka przeciwdziałającego koagulacji krwi otrzymanego jak w przykładzie 3, do którego dodano wodę tak aby środek roślinny stanowił 92% tej mieszaniny. Całość dobrze utarto na gładką masę, a następnie do 1 części otrzymanej mieszaniny dodano 1 część masła kakaowego dobrze ucierając wszystkie składniki, do momentu uzyskania gładkiej masy. Następnie uformowano postać czopków, każdy o masie 600 mg, które schłodzono do kompletnego zestalenia. Opcjonalnie można wykonać czopki metodą wylewania przy pomocy unguatora i odpowiednich form. Każdy czopek zawiera dawkę 250 mg środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, co stanowi 41,67% całej masy czopka.

Forma podania: lek do stosowania wewnętrznego, przyjmowany doodbytniczo.

Działanie: składnik biologicznie aktywny czopka w postaci środka według wynalazku, po przedostaniu się składników środka przez ukrwioną ściankę odbytu do krwioobiegu pacjenta wiąże się w krwioobiegu z czynnikiem IIa (trombiną) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko antytrombinie, co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

Zastosowanie:

PL 236 149 B1

P r z y k ł a d 9

Kompozycję farmaceutyczną w postaci maści, uzyskano z 1 część środka roślinnego otrzymanego jak w przykładach 4, którą rozpuszczono w 36 częściach wody, dodano 12 części glikolu propylenowego, 0,025 części hydroksybenzoesanu metylowego i 0,015 części hydroksybenzoesanu propylowego. Całość dobrze wymieszano, a następnie dodano mieszaninę złożoną z 25 części alkoholu stearynowego, 25 części białej wazeliny i 1 części laurylosiarczanu sodu, tak aby powstała jednolita emulsja, aż do zastygnięcia. W ten sposób uzyskano maść hydrofilową z zawartością 1% środka przeciwdziałającego koagulacji krwi.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania zewnętrznego na skórę.

Działanie: składnik biologicznie aktywny maści w postaci środka według wynalazku wykazuje działanie miejscowe przeciwzakrzepowe, przeciwobrzękowe i przeciwzapalne.

Zastosowanie:

- wspomagająco w leczeniu chorób żył powierzchownych takich, jak zapalenia żył, zakrzepowe zapalenie żył, w leczeniu żylaków kończyn dolnych,

- wspomagająco w leczeniu krwiaków podskórnych, w stłuczeniach, obrzękach.

Dawkowanie: lek należy stosować od 1 do 3 razy na dobę, nakładając 3-10 cm maści na powierzchnię skóry i delikatnie wmasować aż do wchłonięcia maści. W przypadku ostrych obrzęków po tępych urazach zaleca się stosowanie leku przez okres do 10 dni, a w przypadku leczenia chorób żył powierzchownych od 1 do 2 tygodni.

P r z y k ł a d 10

Kompozycję farmaceutyczną w postaci hydrożelu uzyskano z połączenia zmieszanych 15 części glinokrzemianu w postaci bentonitu z 10 częściami 86% glicerolu, oraz 70 części wody, w której rozpuszczono 5 części środka roślinnego otrzymanego jak w przykładzie 5. Oba roztwory mieszano aż do spęcznienia bentonitu, czyli do zgęstnienia mieszaniny. W ten sposób uzyskano hydrożel z bentonitu z 5% środka przeciwdziałającego koagulacji krwi.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania zewnętrznego na skórę.

Działanie: składnik biologicznie aktywny żelu w postaci środka według wynalazku wykazuje działanie miejscowe przeciwzakrzepowe, przeciwobrzękowe i przeciwzapalne.

Zastosowanie:

- wspomagająco w leczeniu krwiaków podskórnych, w stłuczeniach, obrzękach.

Dawkowanie: lek należy stosować od 1 do 2 razy na dobę, nakładając 2-4 cm żelu na powierzchnię skóry i delikatnie wmasować aż do wchłonięcia żelu. W przypadku ostrych obrzęków po tępych urazach zaleca się stosowanie leku przez okres do 10 dni, a w przypadku leczenia chorób żył powierzchownych od Ido 2 tygodni.

P r z y k ł a d 11

W celu uzyskania kompozycji farmaceutycznej do podania dożylnego, odpowiednie naczynie wypełniono wodą w przybliżeniu 5% objętości roztworu. Odważono kwas cytrynowy w ilości 10,51 g, dodano do naczynia do przygotowywania kompozycji i mieszano do wytworzenia roztworu 1 M kwasu cytrynowego. Następnie 10,00 g środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, otrzymanego jak w przykładzie 3 rozpuszczono w 1 M roztworze kwasu cytrynowego. Do otrzymanego roztworu dodano wodę do iniekcji w przybliżeniu 85% objętości roztworu. Zmierzono pH roztworu i jego wartość doprowadzono do 5,0, stosując 1 N roztwór wodorotlenku sodu. Roztwór rozcieńczono wodą do iniekcji do końcowej objętości 1 litra uzyskując 1,0% roztwór do iniekcji. Lek zapakowano w szklane ampułki o objętości 10 mL każda, w warunkach wysokiej sterylności, gdzie każda ampułka zawierała dawkę środka w ilości 100 mg.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania wewnętrznego, przyjmowany w formie iniekcji dożylnych.

Działanie: składnik biologicznie aktywny leku w postaci środka według wynalazku, po przedostaniu się składników środka do krwioobiegu pacjenta na drodze bezpośredniej iniekcji dożylnej wiąże się w krwioobiegu z czynnikiem IIa (trombiną) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko antytrombinie, co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

PL 236 149 B1

Zastosowanie:

P r z y k ł a d 12

W celu otrzymania kompozycji środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego, w 90 częściach wody rozpuszczono 5 części chlorku sodu oraz 5 części cytrynianu sodu. Roztwór dokładnie wymieszano, a następnie do otrzymanego roztworu dodano środek przeciwdziałający koagulacji krwi otrzymany jak w przykładzie 1, zachowując stężenie 5 pg/mL, stanowiące 0,005% roztwór wodny. Roztwór jako produkt spożywczy przeznaczony jest do użytku wewnętrznego, do stosowania doustnego, nie zaspokajający potrzeb żywieniowych człowieka, a jedynie stanowiący uzupełnienie zrównoważonej diety. Z tego względu na etykiecie opakowania będzie zawierał szczegółową informację żywieniową, w przeliczeniu na opakowanie oraz w przeliczeniu na 100 g produktu, dotyczącą składu chemicznego z uwzględnieniem ilości białek, tłuszczy, cukrów, pierwiastków oraz wartości energetycznej podanej w kcal oraz w kJ.

Zastosowanie:

- profilaktycznie w celu zmniejszenia ryzyka żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej, i wynikających z niej powikłań

- profilaktycznie w celu zmniejszenia ryzyka zakrzepicy żył głębokich.

P r z y k ł a d 13

W celu otrzymania kompozycji kosmetycznej, w naczyniu umieszczono odpowiednie ilości składników fazy oleistej: 1 g lanoliny, 4 g oleju arachidowego, 0,5 g wosku pszczelego oraz 0,5 g alkoholu cetylowego, a następnie podgrzewano do temperatury 70-75°C w łaźni wodnej. Po wymieszaniu do uzyskania całkowitego stopienia się składników, w oddzielnym naczyniu pod przykryciem ogrzewano 4 mL wody różanej z dodatkiem 0,005 g środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, otrzymanego jak w przykładzie 4 do uzyskania temperatury 70-75°C. Naczynie ze stopioną fazą tłuszczową wyjęto z łaźni wodnej i umieszczono w nim mieszadło mechaniczne. Stopniowo dodawano fazę wodną do fazy tłuszczowej, mieszając aż do ostygnięcia emulsji i ustabilizowania się konsystencji kremu przeznaczonego do użytku zewnętrznego, w którym środek według wynalazku stanowił 0,05% zawartości.

Zastosowanie do użytku zewnętrznego, do smarowania na skórę.

Właściwości:

- działanie upiększające, zapobiegające powstawaniu widocznych podskórnych naczynek krwionośnych, tzw. „pajączków”,

- działanie upiększające, redukujące widoczność podskórnych naczynek krwionośnych, tzw. „pajączków” poprzez zmniejszanie ich średnicy,

- działanie upiększające, redukujące miejscowe obrzęki skóry.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania środka przeciwdziałającego koagulacji krwi, obejmujący ekstrakcję substancji aktywnych z części naziemnych przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), przy pomocy alkoholu niższego lub małocząsteczkowego ketonu, a w następnym etapie wody lub wodnego roztworu alkalicznego, lub roztworu soli alkalicznej oraz wyodrębnianie substancji aktywnych ze zobojętnionych wodnych ekstraktów poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych, zatężanie do konsystencji pasty i oddzielanie ekstraktu roślinnego od pozostałych składników poprzez wytrawianie alkoholem niższym z fazy stałej, znamienny tym, że otrzymaną mieszaninę koniugatów polifenolowo-polisacharydowych, o niejednorodnej wielkości cząsteczek, w zakresie masy od 1 000 Da do 200 000 Da, poddaje się częściowej

PL 236 149 B1 degradacji i homogenizacji na cząsteczki o masie cząsteczkowej, zawierającej się w przedziale 20 000-50 000 Da, przy użyciu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy w zakresie od 90 do 240 W, w roztworze wodnym lub wodnym z dodatkiem nadtlenku wodoru, a otrzymaną mieszaninę poreakcyjną rozdziela się na membranie filtracyjnej, w celu usunięcia małocząsteczkowych produktów degradacji, mniejszych niż 5 000 Da, przy czym stosuje się dodatek nadtlenku wodoru o stężeniu do 10% w stosunku do objętości mieszaniny reakcyjnej, w której stężenie składników aktywnych, poddawanych degradacji wynosi 1-20%, ponadto degradację prowadzi się od 60 minut do 5 godzin, w temperaturze od 10 do 40°C, a uzyskane składniki aktywne przekształca się do postaci soli sodowych lub soli wapniowych, przy użyciu 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku wapnia, a po uzyskaniu pH roztworu na poziomie 7,2 i po wysuszeniu uzyskuje się środek przeciwdziałający koagulacji krwi.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ziele, liście, kwiaty, kwiatostany przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), zebrane między miesiącem kwietniem a listopadem, ekstrahuje się alkoholem niższym, wybranym z grupy obejmującej metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol lub małocząsteczkowy keton z grupy obejmującej aceton, keton metylo-etylowy, keton dietylowy, następnie z użyciem wody, 0,1 M lub 0,65 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub 0,1 M lub 0,65 M wodnego roztworu octanu sodu, a następnie w celu wyodrębnienia substancji aktywnych z ekstraktu roślinnego, poddaje ekstrakcji rozpuszczalnikami lub ich mieszaninami w układach dwufazowych, w proporcjach faz 1:1, w których pierwszą fazę stanowi uzyskany w pierwszym etapie ekstrakt roślinny, a drugą fazę rozpuszczalnik, taki jak pentan, heksan, heptan, eter dietylowy, eter dipropylowy, eter diizopropylowy, chloroform, lub mieszanina rozpuszczalników organicznych chloroformu z metanolem, etanolem lub 1-propanolem, korzystnie w proporcjach objętościowych 3:2.
3. Środek przeciwdziałający koagulacji krwi, otrzymany z części naziemnych przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), zawierający polisacharydy w ilości 20-90%, zbudowane z grupy obejmującej monomery połączone ze sobą wiązaniami glikozydowymi monosacharydów, wybranych z grupy obejmującej arabinozę w ilości 5-30% części polisacharydowej i mannozę w ilości 3-10%, glukozę w ilości 10-15%, galaktozę w ilości do 20%, ewentualnie ramnozę w ilości do 20%, ewentualnie fukozę w ilości do 2% w części polisacharydowej, ewentualnie rybozę w ilości do 1%, ewentualnie ksylozę w ilości do 5% części polisacharydowej, oraz cukry o charakterze kwasowym, takie jak kwas glukuronowy i kwas galakturonowy, których sumaryczna ilość wynosi 10-75% części polisacharydowej preparatu, ponadto od 10 do 80% polifenoli, znamienny tym, że jest mieszaniną koniugatów polifenoli z polisacharydami, o makrocząsteczkach częściowo zdegradowanych, a częściowo skondensowanych przy użyciu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy w zakresie od 90 do 240 W, gdzie proces ten prowadzi się od 60 minut do 5 godzin w roztworze wodnym lub wodnym z dodatkiem nadtlenku wodoru o stężeniu do 10% w stosunku do objętości mieszaniny reakcyjnej, w której stężenie składników aktywnych, poddawanych degradacji wynosi 1-20%, a otrzymaną mieszaninę poreakcyjną rozdziela się na membranie filtracyjnej, w celu usunięcia małocząsteczkowych produktów degradacji, uzyskując koniugaty, których masa cząsteczkowa zawarta jest w przedziale od 20 000 Da do 50 000 Da, a współczynnik rozproszenia masy składników polimerowych wynosi od 3,5 do 1,1.
4. Zastosowanie środka przeciwdziałającego koagulacji krwi określonego w zastrz. 3 do wytwarzania leku i/lub kompozycji farmaceutycznej do leczenia i profilaktyki chorób zakrzepowo-zatorowych spowodowanych problemem nadmiernej krzepliwości krwi w układzie krwionośnym człowieka, w stężeniu od 0,005% do 95%.
5. Zastosowanie, według zastrz. 4, znamienne tym, że środek przeciwdziałający koagulacji krwi stosowany jest w kompozycji farmaceutycznej, w terapeutycznie skutecznych dawkach, korzystnie w stężeniu 50-250 μg/mL środka roślinnego we krwi/osoczu, przystosowanych do aplikowania doustnego, dożylnego, miejscowego, przezskórnego, lub doodbytniczego.