PL230337B1

PL230337B1 - Sposób wytwarzania środka przeciwzakrzepowego, środek przeciwzakrzepowy oraz jego zastosowanie

Info

Publication number: PL230337B1
Application number: PL413885A
Authority: PL
Inventors: Izabela Pawlaczyk-Graja; Marta Tsirigotis-Maniecka
Original assignee: Wojewodzki Szpital Specjalistyczny We Wroclawiu; Wojewódzki Szpital Specjalistyczny We Wroclawiu
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2018-10-31
Also published as: PL413885A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania środka przeciwzakrzepowego, roślinny środek przeciwzakrzepowy oraz jego zastosowanie do przeciwdziałania zakrzepicy, w kompozycjach przeznaczonych do profilaktyki i leczenia powikłań zakrzepowo-zatorowych w układzie krwionośnym człowieka.

Zakrzepica, będąca częstym następstwem miażdżycy, chorób serca i zabiegów operacyjnych, jest leczona zasadniczo za pomocą antykoagulantów, leków przeciwpłytkowych i leków trombolitycznych. Leki z dwóch pierwszych grup zapobiegają powstawaniu i powiększaniu się zakrzepów, natomiast leki z trzeciej grupy rozpuszczają powstałe zakrzepy.

W przypadku zakrzepicy postępowanie lecznicze zasadniczo ma na celu zahamowanie układu krzepnięcia, co zapobiega wytwarzaniu zakrzepów, jednocześnie jednak zwiększa skłonność do krwawienia.

Doustne leki przeciwzakrzepowe, zmniejszając krzepliwość krwi, ograniczają ryzyko tworzenia się w naczyniach krwionośnych i sercu szkodliwych zakrzepów. Leki te bywają także stosowane w celu rozpuszczenia już istniejących zakrzepów. Najczęściej doustne leki przeciwzakrzepowe stosuje się, aby zapobiec powiększaniu się zakrzepów w zakrzepicy żylnej lub po przebytej zatorowości płucnej oraz zapobiegawczo, w kardiologii u pacjentów z zaburzeniami rytmu serca, określanymi jako napadowe i utrwalone migotanie przedsionków. Leki te stosuje się również u pacjentów po kardiochirurgicznych zabiegach wszczepienia sztucznych zastawek serca. Doustne leki przeciwzakrzepowe, częściej niż inne grupy leków, powodują powikłania wymagające pobytu w szpitalu, ale są lekami, których często nie da się zastąpić. Nadal brak jest leków zmniejszających skłonność do tworzenia zakrzepów jedynie w wybranych obszarach organizmu, na ogół leczenie upośledza cały układ krzepnięcia.

Jednym ze środków przeciwzakrzepowych, który działa jak antykoagulantjest heparyna, którą od wielu lat próbuje się zmodyfikować, w taki sposób aby poprawić jej właściwości lecznicze, równocześnie redukując skutki uboczne. Cechy te próbowano uzyskać poprzez jej modyfikację, między innymi metodą depolimeryzacji chemicznej, skutkującej zmniejszeniem masy cząsteczkowej fragmentów heparynowych i ulepszeniem biodostępności. Z patentu kanadyjskiego CA 1334081, znana jest modyfikacja heparyny w procesie degradacji łańcuchów polisacharydowych na drodze enzymatycznej depolimeryzacji, przy użyciu heparynazy. W portugalskim zgłoszeniu patentowym PT 76111 A opisano sposób degradacji heparyny klasycznej na drodze hydrolizy w warunkach kwasowych, a następnie depolimeryzacji przez podgrzewanie mieszaniny reakcyjnej w obecności czynnika utleniającego. Z patentu europejskiego EP 0293539 znany jest sposób degradacji heparyny w postaci soli amonowej, w obecności wodorotlenku amonu w środowisku rozpuszczalnika nie posiadającego grup hydroksylowych, a z patentu US 6569840 degradacja w obecności kwasu azotowego. Zastosowanie czynników fizycznych w procesie otrzymywania heparyn małocząsteczkowych znane jest z patentu RU 2133253, w rozwiązaniu tym proces depolimeryzacji prowadzi się mieszaniną nitrującą, a zbyteczne produkty nitryfikacji usuwa przy użyciu promieniowania UV w zakresie 180-350 nm. W rozwiązaniu znanym z europejskiego patentu EP 1641831, do depolimeryzacji glikozaminoglikanów, do których zaliczana jest heparyna, zastosowano promieniowanie UVC, a uzyskane produkty degradacji rozdzielono techniką chromatografii żelowej. Według innego patentu EP 1675875 do depolimeryzacji heparyny, używa się promieniowania gamma. Proces degradacji polisacharydów za pomocą ultradźwięków, w celu uzyskania krótszych fragmentów polimerowych z wielkocząsteczkowych polisacharydów, zastosowano w rozwiązaniu opisanym w patencie CN 101891904, do otrzymywania z wodorostów cząsteczek oligosacharydowych, wykazujących właściwości pestycydowe, znajdujących zastosowanie w środkach ochrony roślin.

Znany jest, z polskiego patentu PL 198837, sposób otrzymywania preparatu hamującego krzepliwość krwi ludzkiej, zawierającego substancje o charakterze polifenolowo-polisacharydowym z części naziemnych przymiotna kanadyjskiego. Sposób ten polega na sporządzeniu ekstraktu wodnego lub wodno-etanolowego o stężeniu 65%, z którego wydziela się frakcję aktywną.

Z innego patentu PL 211520, znany jest sposób wytwarzania środka hamującego krzepliwość krwi, w którym cukry oraz substancje fenolowe, pozyskuje się z roślin wyższych, wybranych z rodziny roślin różowatych (Rosaceae) lub z rodziny roślin astrowatych (Asteraceae). Sposób polega na tym, że korzenie roślin, ziele, liście, kwiaty, kwiatostany, owoce, nasiona lub ich mieszanki, poddaje się ekstrakcji wodą i/lub alkoholem, a następnie z otrzymanych ekstraktów wyodrębnia się substancje o aktywności antykoagulacyjnej wobec krwi, na drodze ekstrakcji rozpuszczalnikami i/lub separacji aktywnych substancji makrocząsteczkowych o masie > 5 000 Da.

PL 230 337 Β1

Znany jest też z polskiego zgłoszenia patentowego nr P. 392257 środek leczniczy do profilaktyki i leczenia powikłań zakrzepowych i zatorowych, pochodzący z przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), który utworzony jest z makrocząsteczkowych koniugatów polifenoli z polisacharydami, o masie cząsteczkowej od 1 000 do 200 000 Da. Ponadto składniki aktywne środka, uzyskiwane są z przymiotna kanadyjskiego (Conyza canadensis), metodą ekstrakcji przy pomocy alkoholu niższego lub małocząsteczkowego ketonu, następnie z użyciem wody lub wodnego roztworu alkalicznego lub roztworu soli alkalicznej oraz wyodrębniania substancji aktywnych ze zobojętnionych wodnych ekstraktów poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych i oddzielania ekstraktu roślinnego, od pozostałych składników poprzez ekstrakcję alkoholem z fazy stałej, a w celu użycia w składzie środka przekształconych w postać soli sodowych lub soli wapniowych.

Otrzymane znanym sposobem koniugaty polifenolowo-polisacharydowe są niejednorodną mieszaniną, w której skład wchodzą zarówno cząsteczki koniugatów o masie 10 000 Da jak też o masie 200 000 Da.

Celem wynalazku jest uzyskanie środka przeciwzakrzepowego, stanowiącego dość jednorodną mieszaninę substancji polimerowych pochodzenia naturalnego o zbliżonych masach cząsteczkowych, nadającego się do stosowania jako skuteczny, biologicznie aktywny składnik kompozycji farmaceutycznych, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyków, o powtarzalnym jednoznacznym składzie chemicznym.

Sposób wytwarzania środka przeciwzakrzepowego, według wynalazku, obejmujący ekstrakcję substancji aktywnych z części naziemnych rzepiku pospolitego (Agrimonia eupatońa), przy pomocy alkoholu niższego lub małocząsteczkowego ketonu, a następnie wody lub wodnego roztworu alkalicznego oraz wyodrębnianie substancji aktywnych ze zobojętnionych wodnych ekstraktów poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych, a po zatężeniu do konsystencji pasty, oddzielenie od pozostałych składników ekstraktu roślinnego, poprzez wytrawianie alkoholem niższym z fazy stałej, polega na tym, że uzyskaną mieszaninę koniugatów polifenolowo-polisacharydowych, o niejednorodnej wielkości cząsteczek, o masie od 60 000 Da do 220 000 Da i współczynniku rozproszenia masy składników polimerowych w przedziale od 3,4 do 3,6 oraz o wartości lepkości względnej (ą_Wz) w zakresie 1,11500-1,11750, poddaje się procesowi częściowej degradacji i homogenizacji przy zastosowaniu ultradźwięków na cząsteczki o mniejszej masie cząsteczkowej, zawierającej się w przedziale 10 000-45 000 Da, przy użyciu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz oraz mocy w zakresie 30-70 W, w roztworze wodnym lub wodnym z dodatkiem nadtlenku wodoru, a otrzymaną mieszaninę poreakcyjną rozdziela się na membranie filtracyjnej, w celu usunięcia małocząsteczkowych produktów degradacji, mniejszych niż 5 000 Da. Przy czym stosuje się dodatek nadtlenku wodoru o stężeniu do 5% w stosunku do objętości mieszaniny reakcyjnej, w której stężenie składników aktywnych, poddawanych degradacji wynosi 1-10%. Ponadto degradację prowadzi się od 90 minut do 240 minut, w temp. 25°C. Uzyskane składniki aktywne, przekształca się w sole sodowe lub sole wapniowe, przy użyciu 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku wapnia, a po uzyskaniu pH roztworu na poziomie 7,2 i po wysuszeniu otrzymuje się środek przeciwzakrzepowy.

Zgodnie z wynalazkiem ziele, liście, kwiatostany rzepiku pospolitego (Agrimonia eupatońa), zebrane między miesiącem kwietniem, a listopadem, ekstrahuje się metanolem, etanolem lub acetonem, następnie z użyciem wody lub 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu. Substancje aktywne ekstrahuje się z ekstraktu roślinnego rozpuszczalnikami lub ich mieszaninami w układach dwufazowych, w proporcjach faz 1:1, w których pierwszą fazę stanowi uzyskany w pierwszym etapie ekstrakt roślinny, a drugą fazę rozpuszczalnik, taki jak pentan, heksan, heptan, eter dietylowy, chloroform, lub mieszanina rozpuszczalników organicznych, chloroformu z metanolem lub etanolem, korzystnie w proporcjach objętościowych 3:2. Tak otrzymany ekstrakt roślinny zatęża się do konsystencji pasty i poddaje wytrawianiu metanolem lub etanolem, zbierając nierozpuszczalne w alkoholu składniki ekstraktu roślinnego, wytrącone w postaci osadu.

Środek przeciwzakrzepowy otrzymany sposobem według wynalazku z części naziemnych rzepiku pospolitego (Agrimonia eupatońa), będący mieszaniną, koniugatów polifenoli z polisacharydami, o makrocząsteczkach częściowo zdegradowanych, a częściowo skondensowanych przy użyciu ultradźwięków, charakteryzuje się masą cząsteczkową zawartą w przedziale od 10 000 Da do 45 000 Da, współczynnikiem rozproszenia masy składników polimerowych o wartości od 1,2 do 1,5, oraz lepkością względną (ą_Wz) o wartości w zakresie 1,01617-1,02119. Środek przeciwzakrzepowy zawiera polisacharydy w ilości 30-55%, zbudowane z grupy obejmującej monomery połączone ze sobą wiązaniami glikozydowymi monosacharydów, wybranych z grupy obejmującej arabinozę, w ilości 11,5-12% części

PL 230 337 Β1 polisacharydowej i mannozę w ilości 1,5-2,5%, glukozę w ilości 23-28%, galaktozę w ilości 23-37%, ramnozę w ilości 4,5-6,5%, ksylozę w ilości 1,1-2,0% części polisacharydowej, oraz cukry o charakterze kwasowym, takie jak kwas glukuronowy i kwas galakturonowy, których sumaryczna ilość wynosi 19-38% części polisacharydowej środka, ponadto od 45 do 70% polifenoli. Przy czym polifenole są także makromolekułami, w stężeniu 1 750-2 900 μΜ reszt polifenolowych, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego w 1 g środka.

Do oszacowania ciężaru cząsteczkowego produktów degradacji ultradźwiękami, zawartych w środku według wynalazku, zastosowano chromatografię kolumnową (wymiary kolumny 1500 x 15 mm), gdzie fazę ruchomą stanowił żel Sephacryl 300 HR - powszechnie stosowany do szacowania mas cząsteczkowych takich substancji jak białka, polisacharydy, a w szczególności te o rozgałęzionych łańcuchach, w tym dekstrany, oraz inne rozgałęzione makro-molekuły pochodzenia naturalnego. W pierwszym etapie wyznaczono krzywą kalibracyjną dla ww. przygotowanej kolumny, na bazie 8 różnych dekstranów (rozgałęzionych polisacharydów) o znanych masach cząsteczkowych. Na tej podstawie, na tak przygotowanym żelu rozfrakcjonowano i oszacowano masę cząsteczkową środka roślinnego oraz biorąc pod uwagę rozrzut mas cząsteczkowych poszczególnych składników środka, obliczono średnią wartość współczynnika rozproszenia masy składników w mieszaninie polimerowej czyli współczynnik polidyspersji (ang. PolyDispersity lndex, PDI), każdorazowo biorąc pod uwagę profil chromatograficzny ze względu na polisacharydową oraz polifenolową naturę środka roślinnego. Wszystkie pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

Środek według wynalazku, zawierający mieszaninę polifenolowo-polisacharydową odznacza się silnymi właściwościami przeciwzakrzepowymi, posiada właściwości hamowania osoczowego procesu krzepnięcia krwi, z tego względu przeznaczony jest do stosowania w profilaktyce i leczeniu powikłań zakrzepowo-zatorowych w układzie krwionośnym człowieka.

Przedmiot wynalazku dotyczy również zastosowania środka przeciwzakrzepowego określonego powyżej do wytwarzania leku i/lub kompozycji farmaceutycznej do leczenia i profilaktyki chorób zakrzepowo-zatorowych w układzie krwionośnym człowieka, w stężeniu od 0,005% do 95%.

Środek przeciwzakrzepowy według wynalazku stosuje się w kompozycjach farmaceutycznych, w terapeutycznie skutecznych dawkach, przy czym pożądane właściwości przeciwzakrzepowe uzyskuje się przy stężeniu 50-250 pg/mL środka roślinnego we krwi/osoczu. Dawkę środka przeciwzakrzepowego w kompozycji farmaceutycznej, dobiera się do masy ciała i stanu chorobowego pacjenta. Środek przeciwzakrzepowy według wynalazku nadaje się do aplikowania doustnego, podskórnego, dożylnego, donosowego, miejscowego, przezskórnego, dopłucnego lub doodbytniczego.

Badania toksyczności podostrej i przewlekłej, przeprowadzone na zwierzętach doświadczalnych wykazały, że środek podany w formie iniekcji dootrzewnowe, w ilości 50 mg/kg masy ciała w formie jednorazowej dawki nie wykazuje toksyczności wobec narządów wewnętrznych - serca, płuca, nerki, wątroby, śledziony, mózgu i jelita grubego.

Środek według wynalazku może być podawany sam albo połączony z tradycyjnie stosowanym farmaceutycznym nośnikiem, zaróbką lub substancją, taką jak np. mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, talk, celuloza, kroskarmeloza sodu, glukoza, żelatyna, sacharoza lub węglan magnezu. Kompozycja farmaceutyczna może ponadto zawierać mniejsze ilości nietoksycznych środków pomocniczych, takich jak środki zwilżające, środki emulgujące, środki zwiększające rozpuszczalność lub środki buforujące pH. Dopuszczalne farmaceutycznie kompozycje, obejmujące środek przeciwzakrzepowy mają postać stałą, półstałą, płynną; w formie tabletek, kapsułek, proszków, płynów, zawiesin, czopków lub aerozoli. Środek przeciwzakrzepowy może być podawany w postaciach o przedłużonym lub kontrolowanym uwalnianiu, obejmujących wstrzyknięcia wolno uwalnianej postaci leku, pompy osmotyczne, pigułki, plastry do podawania przezskórnego, do przedłużonego i/lub czasowego, pulsowego podawania, przy wcześniej określonej szybkości uwalniania. Kompozycje nadają się do jednostkowych postaci dawkowania odpowiednich do podawania jednorazowo ściśle określonej dawki. Kompozycje w formie pigułki lub tabletki, zawierają oprócz środka przeciwzakrzepowego, rozcieńczalnik taki jak laktoza, sacharoza, fosforan diwapnia, mannitol lub tym podobne; środek smarujący taki jak kwas stearynowy lub stearynian magnezu i środek wiążący taki jak skrobia, żywica akacjowa, poliwinylopirolidyna, żelatyna, celuloza lub pochodne celulozy. Płynne kompozycje dopuszczalne farmaceutycznie uzyskiwane są przez rozpuszczenie, zawieszenie w nośniku, np. w wodzie, solance, wodnym roztworze dekstrozy, glicerolu, glikolach, etanolu lub tym podobnych środka roślinnego i ewentualne farmaceutycznych adiuwantów. Środki do iniekcji wytworzone są jako płynne roztwory lub zawiesiny, jako

PL 230 337 Β1 emulsje, lub w postaci stałej odpowiedniej do rozpuszczenia lub wytworzenia zawiesiny w cieczy przed iniekcją.

Środek przeciwzakrzepowy według wynalazku, znajduje zastosowanie w produktach spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego dla ludzi, wskazanych w profilaktyce osób z ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych klasyfikowanych według skali ryzyka SCORE (ang. Systemie COronary Risk Evaluation), Skala opracowana przez Europejskie Towarzystwo Kardiologiczne, służy ocenie indywidualnego ryzyka zgonu z powodu chorób układu krążenia w ciągu następnych 10 lat życia, na podstawie czynników ryzyka oszacowanych dla danej osoby. Środek według wynalazku stanowiący składnik produktu leczniczego specjalnego przeznaczenia medycznego klasyfikowany jest według Dyrektywy Unii Europejskiej do grupy środków spożywczych niekompletnych pod względem odżywczym, o standardowym składzie lub składzie dostosowanym pod względem odżywczym, specyficznym dla określonej choroby, zaburzenia lub stanu chorobowego, który nie może być stosowany jako wyłączne źródło pożywienia.

Środek przeciwzakrzepowy według wynalazku, znajduje również zastosowanie jako składnik kompozycji kosmetycznych, przeznaczonych do zewnętrznego kontaktu z ciałem człowieka, stosowanych w wyłącznym lub głównym celu pielęgnowania, upiększania i ochrony skóry.

Środek przeciwzakrzepowy, o właściwościach zbliżonych do heparyny, jest bezpieczny, co stwierdzono w badaniach nad toksycznością przewlekłą, gdzie w badaniach na zwierzętach laboratoryjnych, szczurach rasy Wistar dopiero bardzo wysokie dawki tego środka, bo aż 300 mg, wykazywały pewne działanie nefrotoksyczne. Z tego względu bez przeszkód może być stosowany w kompozycjach farmaceutycznych, kompozycjach środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego i kompozycjach kosmetycznych.

Zaletą środka oprócz taniego surowca roślinnego, jest fakt, że dzięki zmniejszeniu i ujednoliceniu masy cząsteczkowej koniugatów polifenoli z polisacharydami, ma wysoki stopień homogenności, którego współczynnik rozproszenia masy składników w mieszaninie polimerowej wynosi od 1,2 do 1,5, przez co jest łatwy do standaryzacji jako składnik kompozycji, a także zyskuje bardzo korzystne właściwości biologiczne. Zasadniczą zaletą środka są bardzo dobre właściwości przeciwzakrzepowe, wydłużony czasu półtrwania oraz biodostępność.

Sposób wytwarzania środka przeciwzakrzepowego z zastosowaniem ultradźwięków umożliwia wytworzenie środka, którego masa cząsteczkowa zawarta jest w przedziale od 10 000 Da do 45 000 Da. Użyte w sposobie ultradźwięki powodują w pewnym zakresie kondensację mniejszych cząsteczek do utworzenia większych, ale przede wszystkim za pomocą sił mikrokawitacyjnych powodują degradację większych cząsteczek na mniejsze fragmenty. Procesy polimeryzacji oraz degradacji występują jednocześnie i polimery wielkocząsteczkowe formują się podczas stosunkowo krótkiego czasu, ale ciężar cząsteczkowy polimerów maleje kiedy roztwór jest poddawany działaniu ultradźwięków przez dłuższy czas.

Przedmiot wynalazku jest zilustrowany w przykładach realizacji, które nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład 1

W celu otrzymania środka przeciwzakrzepowego, 200 g wysuszonych i rozdrobnionych liści rzepiku pospolitego poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ metanolem, w temperaturze 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Następnie frakcję alkoholową usuwa się z masy roślinnej, a surowiec ten poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ acetonu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu acetonu z pozostałości roślinnych na drodze sączenia, a następnie suszenia surowca, poddaje się go kolejno ekstrakcji 2000 cm³ 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu, w temperaturze 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa całą mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temp. 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zbiera się alkaliczny roztwór wodny, który równoważy się do pH=7 przy użyciu wodnego 0,1 M roztworu kwasu solnego. Uzyskaną frakcję wodną poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ heksanu, a po 5-krotnej ekstrakcji heksanem, w temp. 69°C, oddziela się frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się następnie ekstrakcji eterem dietylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 godzin, w temp. 34°C. Frakcję wodną ekstraktu roślinnego oddziela się od fazy eterowej i poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ chloroformu, a po 5-krotnej ekstrakcji każdorazowo taką samą porcją chloroformu, przez 6 godzin, w temp. 61°C, oddziela się frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Kolejno frakcję wodną ekstraktu roślinnego poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ mieszaniny chloroformu z etanolem, zmieszanych

PL 230 337 Β1 wcześniej w proporcjach objętościowych 3:2, a po 5-krotnej ekstrakcji jednakowymi porcjami tej mieszaniny, w temp. 70°C, ostatecznie oddziela się frakcję wodną od frakcji rozpuszczalników organicznych i odparowuje się do konsystencji proszku, który poddaje się oczyszczaniu na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu metanolu powtórzonej 10 razy.

Nierozpuszczalną w metanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie zawierającej 5% dodatek nadtlenku wodoru tak aby uzyskać 1% roztwór ekstraktu w cieczy, a następnie tak sporządzony roztwór poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 30 W przez 90 minut w temperaturze 25°C. Otrzymane w tym procesie produkty poddaje się w kolejnym kroku procesowi sączenia na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca do postaci soli sodowych kwasowych komponentów obecnych w tak uzyskanym roztworze, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH=7,2. Po odparowaniu do sucha do postaci proszku, otrzymany środek przeciwzakrzepowy przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwzakrzepowy z liści rzepiku pospolitego, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, o masie cząsteczkowej makromolekularnych składników w zakresie od 10 000- 45 000 Da i współczynniku rozproszenia masy jej składników czyli współczynniku polidyspersji DPI wynoszącym średnio 1,5. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 55% substancji o charakterze cukrów, stanowiących część polisacharydową tego środka, w tym 81% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym, których ilość oceniono kolorymetrycznie, metodą Dubois’a na całkowitą zawartość cukrów (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method fordetermination ofsugars and related substances, AnaL Chem. 1956, 28, 350-355). Monosacharydy obojętne, stanowiące elementy składowe części polisacharydowej środka, oceniono ilościowo techniką GLC-MS, przeprowadzając je wcześniej w acetylowe lotne pochodne, według metody opisanej w książce Bierrmanna C. J., McGinnisa G. D. Analysis of Carbohydrates by GLC and MS, Boca Raton, FL: CRC Press z 1989 roku, to: arabinoza w ilości 11,5% części polisacharydowej, ksyloza w ilości 1,0% części polisacharydowej, mannoza w ilości 2,5% części polisacharydowej, glukoza w ilości 23% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 37% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 6% części polisacharydowej. Natomiast cukry o charakterze kwasowym, czyli mieszanina kwasu glukuronowego oraz kwasu galakturonowego, stanowią 19% części polisacharydowej środka, co oznaczono metodą kolorymetryczną, opisaną przez Dische Z. A new specific color reaction of hexuronic acid, J. BioL Chem., z 1947 roku, 167,189-98. Środek zawiera składniki wielkocząsteczkowe polifenolowe, związane z częścią polisacharydową, w ilości 45%, których stężenie oznaczono za pomocą metody kolorymetrycznej Folin-Ciocalteu, opisanej przez Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventós R.M.: Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by mean of Folin-Ciocalteu reagent. Meth. EnzymoL, 1999, 299, 152-178. Środek zawiera 1 750 μΜ reszt polifenolowych w 1 g tego środka, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego. Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

Przykład 2

W celu otrzymania środka przeciwzakrzepowego 200 g wysuszonego i rozdrobnionego ziela rzepiku pospolitego poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ etanolem, w temperaturze 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu frakcji alkoholowej z masy roślinnej, surowiec ten poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ acetonu, w temperaturze 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu acetonu z pozostałości roślinnych na drodze sączenia, a następnie suszenia surowca poddaje się go ekstrakcji 2000 cm³ wodą, w temperaturze 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa się całą mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temperaturze 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zbiera się roztwór wodny, który z uwagi na kwasowy charakter komponentów równoważy się do pH=7 przy użyciu wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu. Uzyskaną tak frakcję wodną poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ heptanu, a po 5-krotnej ekstrakcji porcją heptanu, każdorazowo przez 6 godzin, w temperaturze 69°C, ostatecznie oddziela się frakcję wodną od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się następnie ekstrakcji eterem dietylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 godzin, w temp. 34°C. Frakcję wodną ekstraktu roślinnego oddziela się od fazy eterowej i poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ chloroformu, a po 5-krotnej ekstrakcji każdorazowo

PL 230 337 Β1 taką samą porcją chloroformu, każdorazowo przez 6 godzin, w temperaturze 61°C, ostatecznie oddziela się frakcję wodną od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Kolejno frakcję wodną ekstraktu roślinnego poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ mieszaniny chloroformu z metanolem, zmieszanych wcześniej w proporcjach objętościowych 3:2, a po 5-krotnej ekstrakcji jednakowymi porcjami tej mieszaniny, każdorazowo przez 6 godzin, w temperaturze 70°C ostatecznie oddziela się frakcję wodną od frakcji rozpuszczalników organicznych i odparowuje do konsystencji proszku, który poddaje się oczyszczaniu na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu etanolu powtórzonej 15 razy.

Nierozpuszczalną w etanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie zawierającej 2% dodatek nadtlenku wodoru tak aby uzyskać 5% roztwór ekstraktu w cieczy, a następnie tak sporządzony roztwór poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 50 W przez 120 minut w temperaturze 25°C. Otrzymane w tym procesie produkty poddaje się w kolejnym kroku procesowi sączenia na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca do postaci soli wapniowych kwasowych komponentów obecnych w tak uzyskanym roztworze, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku wapnia do pH=7,2. Po odparowaniu do sucha do postaci proszku, otrzymany środek przeciwzakrzepowy przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwzakrzepowy z ziela rzepiku pospolitego, według wynalazku, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, o masie cząsteczkowej makromolekularnych składników zawartej w przedziale 14 000-37 000 Da i współczynniku rozproszenia masy składników, czyli współczynniku polidyspersji DPI wynoszącym średnio 1,3. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 40% substancji o charakterze cukrów będących polisacharydami, w tym 73% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym, których ilość oceniono kolorymetrycznie, metodą Dubois'a na całkowitą zawartość cukrów (1956). Są to: arabinoza w ilości 11,2% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 6,5% części polisacharydowej, ksyloza w ilości 2,0% części polisacharydowej, mannoza w ilości 1,5% części polisacharydowej, glukoza w ilości 28% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 23% części polisacharydowej, natomiast cukrów o charakterze kwasowym, takich jak kwas glukuronowy oraz kwas galakturonowy jest 27%, co oznaczono metodą kolorymetryczną, opisaną przez Dische Z. (1947). Środek zawiera wielkocząsteczkowe polifenole, związane z częścią polisacharydową, w ilości 60% środka, co w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego dało stężenie 2 550 μΜ reszt polifenolowych w 1 g tego środka, co oznaczono za pomocą metody kolorymetrycznej Folin-Ciocalteu (1999). Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

Przykład 3

W celu otrzymania środka przeciwzakrzepowego, wysuszone i rozdrobnione kwiatostany rzepiku pospolitego w ilości 200 g poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ metanolem, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Następnie frakcję alkoholową usuwa się z masy roślinnej, a surowiec poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ acetonu, w temp. 25°C, w aparacie Soxhleta przez 4 doby. Po usunięciu acetonu z pozostałości roślinnych na drodze sączenia i wysuszeniu surowiec poddaje się ekstrakcji 2000 cm³0,1 M wodnym roztworem wodorotlenku sodu, w temp. 25°C, przez 1 dobę, a następnie ogrzewa mieszaninę pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin w temp. 97°C. Części roślinne po ostudzeniu usuwa się na drodze sączenia i wirowania. Zebrany alkaliczny roztwór wodny, równoważy się do pH=7 wodnym 0,1 M roztworem kwasu solnego. Uzyskaną frakcję wodną poddaje się ekstrakcji 2000 cm³ pentanu, a po 5-krotnej ekstrakcji pentanem, każdorazowo przez 6 godzin, w temp. 69°C, oddziela się frakcję wodną, od frakcji rozpuszczalnika organicznego. Ekstrakt wodny poddaje się następnie ekstrakcji eterem dietylowym, w ilości 2000 cm³, 5-krotnie, przez 6 godzin, w temp. 34°C. Ostatecznie oddziela się frakcję wodną od frakcji rozpuszczalnika organicznego i odparowuje się do konsystencji proszku, który poddaje się oczyszczaniu na drodze ekstrakcji zanieczyszczeń z fazy stałej przy użyciu etanolu powtórzonej 20 razy.

Nierozpuszczalną w etanolu, oddzieloną część ekstraktu suszy się do postaci proszku, a następnie rozpuszcza się w wodzie tak aby uzyskać 10% roztwór ekstraktu w cieczy, a następnie tak sporządzony roztwór poddaje się działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i mocy 70 W przez 240 minut w temperaturze 25°C. Otrzymane w tym procesie produkty poddaje się w kolejnym kroku procesowi

PL 230 337 Β1 sączenia na membranie filtracyjnej, przepuszczającej substancje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 000 Da. Roztwór po działaniu ultradźwiękami i doprowadzeniu do temperatury pokojowej umieszcza się w module membranowym, a w procesie sączenia przez barierę membrany zbiera się osad pozostały na membranie, przez którą nie przeszedł, stanowiący substancje o masie cząsteczkowej > 5 000 Da. Otrzymany osad roztwarza się w wodzie i przekształca do postaci soli sodowych kwasowych komponentów obecnych w tak uzyskanym roztworze, na drodze zrównoważenia roztworu za pomocą wodnego 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do pH=7,2. Po odparowaniu do sucha do postaci proszku, otrzymany środek przeciwzakrzepowy przeznaczony jest do wytwarzania leku, środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego lub kosmetyku.

Środek przeciwzakrzepowy z kwiatostanów rzepiku pospolitego, według wynalazku, stanowią koniugaty polifenolowo-polisacharydowe, o masie cząsteczkowej makromolekularnych składników, zawierającej się w przedziale 12 000-26 000 Da i współczynniku rozproszenia masy jej składników czyli współczynniku polidyspersji DPI wynoszącym średnio 1,2. Środek według wynalazku zawiera w swoim składzie 30% substancji o charakterze cukrów budujących część polisacharydową, co oceniono kolorymetrycznie, metodą Dubois’a na całkowitą zawartość cukrów (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem. 1956, 28, 350-355). W tym 62% całej części polisacharydowej stanowią monosacharydy o charakterze obojętnym, które oceniono ilościowo techniką GLC-MS, według metody opisanej przez Bierrmanna C. J., McGinnisa G. D. Analysis of Carbohydrates by GLC and MS (1989). Są to: arabinoza w ilości 7,9% części polisacharydowej, ramnoza w ilości 4,5% części polisacharydowej, mannoza w ilości 1,5% części polisacharydowej, ksyloza w ilości 1,1% części polisacharydowej, glukoza w ilości 18% części polisacharydowej, galaktoza w ilości 29% części polisacharydowej, natomiast cukrów o charakterze kwasowym, takich jak kwas glukuronowy oraz kwas galakturonowy jest 38%, co stwierdzono na drodze pomiarów kolorymetrycznych, metodą opisaną przez Dische Z. J. Biol. Chem., 1947,167,189-98. Środek zawiera 70% wielkocząsteczkowych polifenoli, związanych z częścią polisacharydową, co można przedstawić w formie stężenia - 2 900 μΜ reszt polifenolowych w 1 g tego środka, w przeliczeniu na ekwiwalent kwasu galusowego (Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventós R.M. Meth. Enzymol., 1999, 299. 152-178). Pomiary wykonano wielokrotnie dla uzyskania średnich wartości, które zapewniają powtarzalność rezultatów.

Ocena lepkości środka według wynalazku

Ze względu na fakt, że środek przeciwzakrzepowy otrzymany według wynalazku w przykładach 1-3 ma charakter kwasowy, ze względu na obecność w jego strukturze chemicznej reszt karboksylowych pochodzących od kwasów uranowych, wszystkie pomiary wykonywano w roztworach 0,1 M cytrynianu sodu, zbuforowanego za pomocą kwasu cytrynowego do wartości pH =7,4. Użycie buforu ma na celu zminimalizowanie zmian w pH roztworów, w których pod wpływem ultradźwięków powstają niewielkie ilości H2O2, które wpływają na zmianę wartości pH badanych roztworów pod kątem ich lepkości, co mogłoby zafałszować rezultaty pomiarów lepkości. W przypadku polimerów posiadających ładunek elektryczny, jak kwasowe polisacharydy, zmiana wartości pH środowiska, w którym prowadzi się pomiary ma ogromny wpływ na parametr lepkościowy.

Do pomiarów wiskozymetrycznych badanych próbek użyto wiskozymetru Ostwalda. Próbki były przed pomiarem termostatowane w temperaturze 25°C, przez 20 minut. W pierwszej kolejności wykonano pomiary do krzywej kalibracyjnej dla środka roślinnego, który uzyskano według wynalazku, zgodnie z przykładem 1, ale nie poddano go działaniu ultradźwięków. Miało to na celu dobranie jednej stałej wartości stężenia badanego w dalszym toku środka według wynalazku. Przygotowano w buforze roztwory środka, który uzyskano według wynalazku, zgodnie z przykładem 1, ale nie poddano go działaniu ultradźwięków, o następujących stężeniach: 3,2 g/dm³, 1,6 g/dm³, 0,8 g/dm³, 0,4 g/dm³ oraz 0,2 g/dm³. Do dalszych pomiarów, na podstawie krzywej kalibracyjnej przygotowano roztwory środka według wynalazku, otrzymanego w przykładach 1-3, o stężeniu 1,60 g/dm³ (40,0 mg tego środka rozpuszczonego w 25.0 mL rozpuszczalnika).

Na podstawie otrzymanych wyników pomiarów obliczono:

lepkość względną ą_Wz, na podstawie zależności:

Gdzie to - czas przepływu rozpuszczalnika, ti - czas przepływu roztwór;

PL 230 337 Β1 lepkość właściwą ą_wi - pozorny względny przyrost lepkości rozpuszczalnika spowodowany obecnością polimeru, na podstawie zależności:

η»ι=η«- 1, lepkość zredukowaną ą_red, na podstawie zależności:

r|red ~ Ί wl /C , gdzie c - stężenie polimeru w próbce badanej.

W dalszym toku wykonano serię pomiarów dla środka według wynalazku otrzymanego w przykładach 1-3. W każdym przypadku przygotowano roztwór w buforze, przy czym produkt był w stężeniu 1,60 g/dm³. Wykonano dla każdego produktu kilkukrotne pomiary lepkościowe, a wyniki, wraz z obliczeniami zebrano w tabeli poniżej.

czas procesu jmin\|	moc procesu [W\|	t\|$\|	t\|s\|	t [$\|	t śr \|s\|	η wz	η w\|	Π red
0	0	97.55	97.53	97.56	97.547	1.11610	0.1 1610	0.07260
90	30	99.57	99.73	99.54	99.613	1.02119	0.02119	0.013242
120	50	99.16	99.20	99.17	99.177	1 01671	0.01671	0.010444
240	70	99.36	99.24	99.24	99.280	1.01777	0.01777	0.011106

Jak wynika z przedstawionych rezultatów, im dłużej trwał proces degradacji środka według wynalazku, wraz ze wzrostem mocy ultradźwięków, zaobserwować można obniżenie i ustabilizowanie na jednym poziomie wartości lepkości właściwej. Stabilność tego efektu pojawia się po 120 minutach prowadzenia eksperymentów, gdzie moc jest większa niż 50 W. Wartość lepkości dla środka według wynalazku, otrzymanego w przykładach 1-3 jest mniejsza o około rząd od wartości lepkości środka przed zastosowaniem ultradźwięków.

Badania przeciwzakrzepowe na modelu zwierzęcym

Doświadczenia na zwierzętach laboratoryjnych przeprowadzono zgodnie z zaleceniami ujętymi wGuidelinesforthe use of animals in biomedical research (Giles A.R., Thromb. Haemost., 1987,18(58), 1078-1084). Na wykonanie doświadczeń otrzymano stosowne pozwolenie od Lokalnej Komisji Etyki, przy Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu (nr 18.2009). Zwierzęta pozyskane ze Zwierzętami Akademii Medycznej we Wrocławiu, gdzie były hodowane zgodnie z przepisami prawa polskiego (Dz.LJ. 2005, nr 33 poz. 289).

Badania antykoagulacyjne in vivo wykonano na modelu zwierzęcym - szczurach rasy Wistar, samcach o masie 350-400 g, pochodzących z chowu wsobnego. Do doświadczeń wybrano dawkę środka według wynalazku otrzymanego w przykładach 1-3, o stężeniu 30 mg/mL, podawaną jednorazowo w ilości 1 mL, o pH fizjologicznym, którą podano zwierzęciu w postaci wlewki dotętniczej, bezpośrednio do serca, przez wypreparowaną wcześniej tętnicę dogłowową. Zwierzę przez cały czas trwania doświadczenia było znieczulone.

W doświadczeniu oceniano czas krzepnięcia krwi tętniczej pełnej, pobieranej w określonych odstępach czasu. Zastosowana tu została metoda mikroskopowa czasu krzepnięcia krwi pełnej. Naczynie tętnicze zdrenowano na stałe cewnikiem polietylenowym. Zwolnienie zacisku powodowało wypływ krwi kroplami. Po każdym pobraniu porcji krwi do badań cewnik przepłukiwano 3,8% roztworem cytrynianu sodu, aby nie dopuścić do zamknięcia naczynia i drenu zakrzepami. Kropla krwi tętniczej, wypływającej z drenu, upuszczana była na szkiełko nakrywkowe, oczyszczone wcześniej alkoholem etylowym. Szkiełko następnie obracane było do wydrążenia szklanej płytki podstawowej i dociśnięte, aż do wystąpienia pierścieni interferencyjnych. Tak tworzyła się wilgotna komora, która umieszczana była na nie ogrzewanym stoliku mikroskopu (temperatura pokojowa), po przechyleniu stolika pod kątem 45°, spływała po brzegu komory. Tworzyła się przejściowa warstwa spływających po powierzchni szkiełka nakrywkowego krwinek, które były obserwowane pod 100-krotnym powiększeniem.

Metoda ta pozwala na oznaczanie czasu krzepnięcia krwi pełnej z dokładnością do około ± 20 sekund. Moment podania wlewki ustalony został jako czas 0 (w sekundach). Pomiary kontrolne wykonane przed podaniem dawki środka według wynalazku to czas liczony jako czas ujemny.

PL 230 337 Β1

Środek otrzymany zgodnie ze sposobem opisanym w wynalazku, który nie został poddany działaniu ultradźwięków, podawany zwierzęciu laboratoryjnemu w postaci jednorazowej wlewki dotętniczej, w ilości 1 mL, o stężeniu 30 mg/mL, wykazywał w poprzednio prowadzonych eksperymentach badawczych, w około połowie zdokumentowanych przypadków efekt toksyczności. W udanych eksperymentach wykazywał dość sporą aktywność przeciwzakrzepową. Zasadne było wykonanie badań dla środka przeciwzakrzepowego według wynalazku, otrzymanego w przykładach 1-3, który okazał się być nietoksyczny dla badanych zwierząt. Każdorazowo środek według wynalazku przygotowano do eksperymentu w stężeniu 30 mg/mL, a w każdym eksperymencie podawano go zwierzęciu w formie jednorazowej wlewki o objętości 1 mL, do tętnicy dogłowowej, w kierunku serca.

Otrzymano następujące rezultaty:

Przykład 1 Rasa szczura	90'30W Wistar	W30W Wistar	90’ 30W Wistar	90'30W Wistar	90’30W Wistar
	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas
	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.
	[minj	[s]	[min]	[s]	[min]	[s]	[min]	[s]	[min]	(sj
	-20	187	-20	180	-20	173	-20	183	-20	174
	-15	201	-15	182	-15	171	-15	188	-15	187
pomiary kontrolne	-10	189	-10	189	-10	181	-10	191	-10	181
	-5	191	-5	180	-5	179	-5	189	.5	179
nastrzyk środka	0		0		0		0		0
przeciwzakrzep.
pomiary	10	276	5	252	5	277	5	324	5	270
20	289	10	266	15	296	15	309	15	277
ckspcrym.
	30	295	20	271	25	301	25	300	25	286
	40	304	30	287	35	333	35	311	35	289
	50	297	40	299	45	311	45	301	45	280
	60	272	50	269	55	298	55	287	55	269
	70	254	60	254	65	275	65	263	65	261
	80	211	70	201	75	261	75	242	75	250
	90	196	80	179	85	222	85	220	85	221
	100	187	90	183	95	197	95	189	95	199
					100	183	105	187	105	181

Przykład 2 Rasa szczura	120’SOW Wistar	120’50W Wistar	120’50W Wistar	I20'50W Wistar	120’50W Wistar
	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas
	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn. :	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.
	[min]	[S]	[min]	[S]	[min]	[S]	[min]	[S]	[min]	[S]
	-20	186	-20	181	-20	169	-20	186	-20	168
	-15	201	-15	183	-15	175	-15	186	-15	171
pomiary kontrolne	-10	196	-10	191	-10	171	-10	194	-10	181
	*5	191	-5	183	-5	186	-5	186	-5	174
nastrzyk środka przeciwzakrzep.	0	0	0	0	0
pomiary eksperym.	10	305	5	274	5	284	5	324	5	258
20	310	10	299	15	298	15	309	15	274
	30	317	20	322	25	299	25	300	25	296
	40	329	30	331	35	288	35	339	35	301
	50	307	40	334	45	324	45	304	45	279
	60	297	50	305	55	267	55	298	55	287
	70	280	60	293	65	254	65	270	65	268
	80	271	70	263	75	266	75	265	75	209
	90	241	80	199	85	197	85	237	85	184
	100	211	90	188	95	177	95	205	95	188
	110	199	100	185	105	183	105	196
	115	186					115	178
							120	186 _

PL 230 337 Β1

Przykład 3 Rasa szczura	240^,70W Wis tar	240’70W Wistar	240’70W Wistar	240*70W Wistar	240'70W Wistar
	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas	czas
	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.	eksperym.	krzepn.
	[min]	(sj	[min]	[s]	[min]	[S]	[min]	[S]	[min]	[s]
	-20	188	-20	170	-20	179	-20	193	-20	178
	-I5	200	-15	179	-15	178	-15	182	-15	188
pomiary kontrolne	-10	192	-10	185	-10	188	-10	191	-10	185
	-5	187	-5	172	-5	183	-5	187	-5	182
nastrzyk środka przeciwzakrzep.	0	0	0	0	0
	10	286	5	252	5	305	5	289	5	272
pomiary eksperym.	20	288	10	273	15	312	15	303	15	286
	30	296	20	261	25	330	25	314	: 25	299
	40	281	30	252	35	344	35	323	^s 35	305
	50	277	40	248	45	301	45	300	45	302
	60	252	50	231	55	288	55	287	55	287
	70	233	60	217	65	271	65	268	65	276
	80	213	70	205	75	262	75	233	75	252
	90	210	80	189	85	241	85	213	85	202
	100	192	90	182	95	212	95	197	95	192
	HO	197	100	174	105	198	105	194	105	184
	115		1 15		115	181	1 15	189
	120				120	182

Zastosowanie procesu z wykorzystaniem ultradźwięków zgodnie z rozwiązaniem w wynalazku spowodowało znaczną poprawę aktywności środka przeciwzakrzepowego, znosząc przy tym efekt toksyczności. Zdecydowana większość eksperymentów zakończyła się powodzeniem, a zwierzęta podczas każdego eksperymentu były stabilne oddechowo i przeżywały do samego końca badań. Uzyskane rezultaty wskazują, że środek według wynalazku, otrzymany w przykładach 1-3 wykazał właściwości przeciwzakrzepowe, wydłużając czas formowania się zakrzepów we krwi pełnej, tuż po podaniu zwierzęciu wlewki. Środek według wynalazku osiągnął maksimum swojego działania średnio w 35-tej minucie od iniekcji, a efekt wydłużenia czasu formowania się skrzepu ex vivo, utrzymywał się średnio przez 75 minut.

Badanie toksyczności przewlekłej na modelu zwierzęcym

Zastosowano metodę klas toksyczności ostrej nr 423 wg Wytycznych OECD do Badań Substancji Chemicznych (Metoda Blter- Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 31.05.2005). Zasada metody polega na procedurze etapowej, w której na każdym etapie wykorzystuje się 3 zwierzęta obu płci, przewiduje się podanie następujących ustalonych dawek badanego środka według wynalazku: 5,50,300,2000 mg/kg masy ciała. Od wystąpienia śmiertelności zwierząt bądź jej braku zależy czy dalsze badania są zbyteczne czy podaje się wyższą lub niższą dawkę następnym 3 zwierzętom.

Do badań przygotowano 12 samców o masie ciała 243-256 g oraz 12 samic o masie ciała 172— -179 g. Zwierzęta przebywały w pomieszczeniach o temp 21 ± 2°C, wilgotność 50%, wentylacja 15 wymian powietrza na godzinę, ze sztucznym oświetleniem 12 godz. jasno/ciemno, w klatkach poliwęglanowych, 4 zwierzęta w klatce. Otrzymywały paszę granulowaną Labofeed H (ISO22000). Woda do picia, klatki oraz ściółka były poddawane procesowi sterylizacji.

Do badanego środka przeciwzakrzepowego według wynalazku, otrzymanego w przykładach 1-3 dodawano wody destylowanej, a po 24 godzinach mieszano mieszadłem magnetycznym do uzyskania jednolitej zawiesiny. Zawiesinę podawano szczurom dootrzewnowe w formie iniekcji, w dawce o objętości nie przekraczającej 1 mL.

Wyniki śmiertelności zwierząt przedstawiono w tabeli poniżej.

PL 230 337 Β1

Środek według wynalazku otrzymany:	Dawka (mg/kg m.c.)	SAMCE (nie przeżyły/ wszystkie)	Dawka (mg/kg m.c.)	SAMICE (nie przeżyły/ wszystkie)
	300	2/3	300	3/3
Przykład 1	50*	0/3	50*	0/3
	50	0/3	50	0/3
	300	2/3	300	3/3
Przykład 2	300	2/3	50*	0/3
	50*	0/3	300	3/3
	300	2/3	300	3/3
Przykład 3	50*	0/3	50*	0/3
	300	2/3	300	2/3

*) Wg metodyki najwyższa dawka nie powodująca śmiertelności jest powtarzana.

Śmierć zwierząt nastąpiła w ciągu 24 godz., nie obserwowano żadnych charakterystycznych objawów klinicznych poprzedzających zejście śmiertelne. Od martwych zwierząt pobrano następujące narządy: mózg, płuca, serce, wątroba, nerki, jelito cienkie, śledziona. U zwierząt, które otrzymały środek przeciwzakrzepowy w dawce 300 mg/kg masy ciała obserwowano brunatne zabarwienie powłok i narządów wewnętrznych. Zwierzęta, które przeżyły obserwowano przez 14 dni dokonując dwukrotnie pomiarów masy ciała. Nie stwierdzono żadnych zakłóceń w przyroście masy ciała. Po 14 dniach zwierzęta usypiano i pobierano wymienione wyżej narządy. Pobrane narządy umieszczono w płynie Bouin’a i przekazano do badań histopatologicznych.

Na podstawie rozkładu śmiertelności zwierząt obu płci, badany środek roślinny otrzymany według wynalazku podany drogą dootrzewnową należy zaklasyfikować do kategorii 3, zakres dawek śmiertelnych >50-300 mg/kg masy ciała (wg Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji).

Badania histopatologiczne pobranych wycinków tkanek

Z uwagi na różnorodność tkanek będących główną komponentą pobieranych narządów dokonano modyfikacji rutynowych procedur utrwalania w celu zachowania jak najlepszej kondycji struktur analizowanych tkanek. Modyfikacje te obejmowały nie tylko zastosowanie różnorodnych związków służących do utrwalania tkanek (stosowano zarówno utrwalacze proste jak i złożone), ale również różnego czasu penetracji utrwalacza, procedury odwadniania oraz przeprowadzania tkanek przez płyny pośrednie.

Prace związane z przygotowaniem materiału biologicznego do analiz histologicznych obejmowały procesy:

• utrwalanie w płynie Bouin’a oraz przeprowadzenie przez szereg alkoholi (70%, 85%, 96% i alkohol absolutny, ksylen), • zatapianie w parafinie Sugipath® Paraplast Plus®, co spowodowało otrzymanie kostek parafinowych, • krojenie kostek parafinowych, • barwienie tkanek hematoksyliną i eozyną.

Oceniono i porównano toksyczność niskich (50 mg) i wysokich (300 mg) dawek środka przeciwzakrzepowego według wynalazku na narządy wewnętrzne szczurów rasy Wistar obojga płci, którym podano ten środek dootrzewnowo. Ocenie histologicznej poddano następujące narządy szczurów: serce, płuca, nerki, wątrobę, śledzionę, mózg, jelito grube.

Ocena histologiczna przeprowadzona została przez dwóch obserwatorów, za pomocą dwustanowiskowego mikroskopu świetlnego Olympus ΒΧ-41 (Olympus, Japonia).

Do oceny narządów stosowano punktację będącą sumą ocen zawartych w poniższych skalach:

1. SERCE;

2. ŚLEDZIONA;

• Nacieki komórek zapalnych:

0	-	< 1 / HPF
1	-	<5/HPF
²	-	< 10/HPF
3	-	< 20 / HPF
4	-	> 20 / HPF

• Martwica:

- brak

- pojedyncze, małe ogniska

- liczne małe ogniska

- ogniska martwicy

- duże ogniska martwicy

PL 230 337 Β1

WĄTROBA;

- Nacieki komórek zapalnych:

- <l/HPF

- < 5 i HPF

- <10/HPF

- < 20 / HPF

- >20/HPF . NERKI:

- Nacieki komórek zapalnych:

- <I/HPF

- < 5 /HPF

- <8/HPF

- <10/HPF

- >10/HPF

JELITO GRUBE:

- Nacieki komórek zapalnych:

- < 1 /HPF

- < 5 /HPF

- <10/HPF

- <20/HPF

- >20/HPF

- Wylewy krwi:

- brak ] - pojedyncze

- liczniejsze

- liczne

- duże liczne wylewy

- Obrzęk:

- brak obrzęku

- płyn w pojedynczych pęcherzykach

- płyn w liczniejszych pęcherzykach

- płyn w licznych pęcherzykach

- masywny obrzęk

4. PŁUCA:

- Nacieki neutrofili:

0	-	<3 /HPF
1	-	<15/HPF
2	-	<30/HPF
Λ	-	<50/HPF
4	-	> 50 / HPF

6. MÓZG:

- Nacieki komórek zapalnych: 0 - <]/HPF

I - <5/HPF

- <10/HPF

- <20/HPF

- >20/HPF

- Martwica:

- brak l - pojedyncze, małe ogniska

- liczne małe ogniska

- ogniska martwicy

- duże ogniska martwicy

- Obrzęk i martwica kłębuszków:

- brak zmian

- obrzęk kłębuszków bez martwicy “ średnio zwiększona komórkowość duża komórkowość z małą martwicą

- duża komórkowość z ogniskową martwicą kłębuszków

Zastosowana skala dotyczy tylko trzech narządów (wątroba, płuca, nerki), ale została zapożyczona do oceny pozostałych. Zrezygnowano jednak z oceny niektórych cech, gdy nie miały one odniesienia do narządu. Kryterium oceny był obraz tkanki wybarwionej, które uwidoczniło podstawowe struktury komórki (jądro oraz cytoplazmę), a także macierz zewnątrzkomórkową (np. włókna kolagenowe). Za jego pomocą oraz wiedzy na temat struktur poszczególnych tkanek i narządów obserwatorzy byli w stanie stwierdzić czy w tkance znajduje się naciek komórek zapalnych, wylewy krwi oraz martwica czy obrzęk, ponieważ cechy te mają swój charakterystyczny obraz morfologiczny zmienionej patologicznie tkanki. Cechy te nie występują we wszystkich narządach toteż obserwatorzy rezygnowali z tych, których ocena nie była obiektywnie możliwa (np. naciek komórek zapalnych nie byłoceniany w śledzionie, która jest narządem limfatycznym i komórki zapalne rezydują tam w olbrzymiej ilości niejako „z definicji”).

Na podstawie oględzin badanych wycinków tkanek podsumowano uzyskane punkty, dla każdego badanego wycinka tkanki, dla każdego rodzaju tkanki, dla środka według wynalazku, otrzymanego w przykładach 1-3, a wyniki te zsumowano i uśredniono, aby otrzymać obraz ogólnej tendencji. Porównano wpływ wysokich i niskich stężeń środka według wynalazku na toksyczność poszczególnych narządów (Test Manna Whitneya).

PL 230 337 Β1

Narząd	środek wg. wynalazku - 50 mg: średnia ocena( ± SD)	środek wg, wynalazku - 300 mg: średnia ocena{± SD)	P
serce	0.500 ± 1,732	0 = 0	0.5557
śledziona	0±0	0±0	Ns
wątroba	0,9167 ± 0,9962	1,333 ±2,422	0.7240
płuca	1,417 ± 1,379	0,8333 ±0,9832	0.4348
nerki	0,0833 ± 0,2887	2,333 = 1,033	0,0002
mózg	0±0	0 = 0	Ns
jelito grube	0±0	0±0	Ns

Analiza statystyczna uzyskanych rezultatów wykazała brak istotnej różnicy w toksyczności środka przeciwzakrzepowego otrzymanego według wynalazku dla poszczególnych narządów szczurów rasy Wistar, którym podawano dootrzewnowo badany środek według wynalazku (Test Manna Whitneya). Poddając analizie grupy szczurów poddanych działaniu niskich (50 mg) oraz wysokich (300 mg) dawek środka roślinnego odnotowano, iż szczury otrzymujące wyższe dawki środka miały silniej zaznaczone cechy zniszczenia nerek w porównaniu ze stężeniami niższymi (odpowiednio 0,0833 przy stężeniu 50 mg; a 2,333 przy stężeniu 300 mg test Manna Whitney'a w skali 4 stopniowej). Ponadto porównano działanie środka według wynalazku otrzymanego w przykładach 1-3, w stężeniu 50 mg, wykazując, iż płuca zwierząt poddanych jego działaniu są silniej narażone na szkodliwe działanie przy tej dawce (1,417, test Manna Whitneya w skali 4-stopniowej). W przypadku pozostałych narządów nie wykazano różnic w toksyczności, Z kolei analizując grupy tkanek pochodzących od zwierząt otrzymujących środek według wynalazku w stężeniu 300 mg ujawniono, że środek ten działał nefrotoksycznie (2,333 rzepik, test Manna Whitneya w skali 4-stopniowej).

Przykłady kompozycji farmaceutycznych

Przykład 4

Kompozycję farmaceutyczną w postaci tabletki uzyskano przez zmieszanie 20 g dobrze rozdrobnionego środka przeciwzakrzepowego otrzymanego jak w przykładzie 1 z 30 pg etynyloestradiolu w mieszalniku mechanicznym z dodatkiem około 10% mannitolu. Po przesianiu przez sito o średnicy oczek 250 mieszankę zmieszano z resztą mannitolu, który stanowi dopełnienie masy tabletki do 65 g i z 1,30 g glikolanu skrobiowo-sodowego. Następnie do mieszalnika ze wstępnie utworzoną masą tabletkową dodano 1,5% kwasu stearynowego (<250 pm) i mieszano z dodatkiem 0,5% stearynianu magnezu. Mieszankę tabletkowano w tabletkarce uzyskując tabletki o masie 650 mg, każda zawierająca jednorazową dawkę 200 mg środka przeciwzakrzepowego, czyli nie mniej niż 30,7% masy tabletki.

Forma podania: lek do stosowania wewnętrznego, przyjmowany doustnie.

Działanie: składnik biologicznie aktywny tabletki w postaci środka według wynalazku, po rozpuszczeniu tabletki i przedostaniu się składników środka z przewodu pokarmowego do krwioobiegu pacjenta wiąże się w krwioobiegu z ko faktorem heparyny II (HC II) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko trombinie (czynnikowi lla), co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

Zastosowanie:

- wspomagająco w zapobieganiu żylnej chorobie za krze po wo-zatorowej,

- wspomagająco w leczeniu zakrzepicy żył głębokich powikłanej bądź niepowikłanej zatorowością płucną.

Dawkowanie: dostosowane do potrzeb pacjenta i stopnia zaawansowania ryzyka choroby lub choroby, przez specjalistę w dziedzinie.

PL 230 337 Β1

Przykład 5

Kompozycję farmaceutyczną w postaci kapsułki żelatynowej twardej, otrzymano przez zmieszanie 1 części sacharozy z 1 częścią dobrze rozdrobnionego środka roślinnego otrzymanego jak w przykładzie 2, który stanowił dawkę 250 mg tego środka. Precyzyjnie odważoną dawkę suchej mieszaniny, zachowując sterylność, zamknięto w 2 częściach twardej kapsułki żelatynowej.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania wewnętrznego, przyjmowany doustnie.

Zastosowanie:

- wspomagająco w zapobieganiu żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej,

Przykład 6

Kompozycję farmaceutyczną w postaci czopka doodbytniczego, uzyskano ze środka przeciwzakrzepowego otrzymanego jak w przykładzie 3, do którego dodano wodę tak aby środek ten stanowił 92% tej mieszaniny. Całość dobrze utarto na gładką masę, a następnie do 1 części otrzymanej mieszaniny dodano 1 część masła kakaowego dobrze ucierając wszystkie składniki, do momentu uzyskania gładkiej masy. Następnie uformowano postać czopków, każdy o masie 600 mg, które schłodzono do kompletnego zestalenia. Opcjonalnie można wykonać czopki metodą wylewania przy pomocy unguatora i odpowiednich form. Każdy czopek zawiera dawkę 250 mg środka według wynalazku, co stanowi 41,67% całej masy czopka.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania wewnętrznego, przyjmowany doodbytniczo.

Działanie: składnik biologicznie aktywny tabletki w postaci środka według wynalazku, po rozpuszczeniu tabletki i przedostaniu się składników środka z przewodu pokarmowego do krwioobiegu pacjenta wiąże się w krwioobiegu z kofaktorem heparyny II (HC II) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko trombinie (czynnikowi lla), co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

Zastosowanie:

- wspomagająco w zapobieganiu żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej,

Przykład 7

Kompozycję farmaceutyczną w postaci maści, uzyskano z 1 część środka przeciwzakrzepowego otrzymanego jak w przykładzie 1, którą rozpuszczono w 36 częściach wody, dodano 12 części glikolu propylenowego, 0,025 części hydroksybenzoesanu metylowego i 0,015 części hydroksybenzoesanu propylowego. Całość dobrze wymieszano, a następnie dodano mieszaninę złożoną z 25 części alkoholu stearynowego, 25 części białej wazeliny i 1 części laurylosiarczanu sodu, tak aby powstała jednolita emulsja, aż do zastygnięcia. W ten sposób uzyskano maść hydrofitową z zawartością 1 % środka według wynalazku.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania zewnętrznego, na skórę.

Działanie: składnik biologicznie aktywny maści w postaci środka według wynalazku wykazuje działanie miejscowe przeciwzakrzepowe, przeciwobrzękowe i przeciwzapalne.

Zastosowanie:

- wspomagająco w leczeniu chorób żył powierzchownych takich, jak zapalenia żył, zakrzepowe zapalenie żył, w leczeniu żylaków kończyn dolnych.

Dawkowanie: lek należy stosować od 1 do 3 razy na dobę, nakładając 3-10 cm maści na powierzchnię skóry i delikatnie wmasować aż do wchłonięcia maści. W przypadku ostrych obrzęków po tępych urazach zaleca się stosowanie leku przez okres do 10 dni, a w przypadku leczenia chorób żył powierzchownych od 1 do 2 tygodni.

PL 230 337 Β1

Przykład 8

Kompozycję farmaceutyczną w postaci hydrożelu uzyskano z połączenia zmieszanych 15 części glinokrzemianu w postaci bentonitu z 10 częściami 86% glicerolu, oraz 70 części wody, w której rozpuszczono 5 części środka przeciwzakrzepowego otrzymanego jak w przykładzie 2. Oba roztwory mieszano aż do spęcznienia bentonitu, czyli do zgęstnienia mieszaniny. W ten sposób uzyskano hydrożel z bentonitu z 5% środka roślinnego.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania zewnętrznego, na skórę.

Działanie: składnik biologicznie aktywny żelu w postaci środka według wynalazku wykazuje działanie miejscowe przeciwzakrzepowe, przeciwobrzękowe i przeciwzapalne.

Zastosowanie:

Dawkowanie: lek należy stosować od 1 do 2 razy na dobę, nakładając 2-4 cm żelu na powierzchnię skóry i delikatnie wmasować aż do wchłonięcia żelu. W przypadku ostrych obrzęków po tępych urazach zaleca się stosowanie leku przez okres do 10 dni, a w przypadku leczenia chorób żył powierzchownych od 1 do 2 tygodni.

Przykład 9

W celu uzyskania kompozycji farmaceutycznej do podania dożylnego, odpowiednie naczynie wypełniono wodą w przybliżeniu 5% objętości roztworu. Odważono kwas cytrynowy w ilości 10,51 g, dodano do naczynia do przygotowywania kompozycji i mieszano do wytworzenia roztworu 1 M kwasu cytrynowego. Następnie 10,00 g środka przeciwzakrzepowego, otrzymanego jak w przykładzie 3 rozpuszczono w 1 M roztworze kwasu cytrynowego. Do otrzymanego roztworu dodano wodę do iniekcji do w przybliżeniu 85% objętości roztworu. Zmierzono pH roztworu i jego wartość doprowadzono do 5,0, stosując 1 N roztwór wodorotlenku sodu. Roztwór rozcieńczono wodą do iniekcji do końcowej objętości 1 litra uzyskując 1,0% roztwór do iniekcji. Lek zapakowano w szklane ampułki o objętości 10 mL każda, w warunkach wysokiej sterylności, gdzie każda ampułka zawierała dawkę środka w ilości 100 mg.

Forma podania: lek przeznaczony do stosowania wewnętrznego, przyjmowany w formie iniekcji dożylnych.

Działanie: składnik biologicznie aktywny tabletki w postaci środka według wynalazku, po rozpuszczeniu tabletki i przedostaniu się składników środka z przewodu pokarmowego do krwioobiegu pacjenta wiąże się w krwioobiegu z kofaktorem heparyny II (HC II) tworząc skuteczny kompleks inhibitorowy przeciwko trombinie (czynnikowi Ha), co w efekcie powoduje zatrzymanie procesu tworzenia skrzepu poprzez zahamowanie formowania się włókien fibryny.

Zastosowanie:

- wspomagająco w zapobieganiu żylnej chorobie zakrzepowo-zatorowej,

Przykład 10

W celu otrzymania kompozycji środka spożywczego specjalnego przeznaczenia medycznego, w 90 częściach wody rozpuszczono 5 części chlorku sodu oraz 5 części cytrynianu sodu. Roztwór dokładnie wymieszano, a następnie do otrzymanego roztworu dodano się środek przeciwzakrzepowy otrzymany jak w przykładzie 1, zachowując stężenie 5 pg/mL, stanowiące 0,005% roztwór wodny. Roztwór jako produkt spożywczy przeznaczony jest do użytku wewnętrznego, do stosowania doustnego, nie zaspokajający potrzeb żywieniowych człowieka, a jedynie stanowiący uzupełnienie zrównoważonej diety. Z tego względu na etykiecie opakowania będzie zawierał szczegółową informację żywieniową, w przeliczeniu na opakowanie oraz w przeliczeniu na 100 g produktu, dotyczącą składu chemicznego z uwzględnieniem ilości białek, tłuszczy, cukrów, pierwiastków oraz wartości energetycznej podanej w kcal oraz w kJ.

Zastosowanie:

- profilaktycznie w celu zmniejszenia ryzyka żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej, i wynikających z niej powikłań

- profilaktycznie w celu zmniejszenia ryzyka zakrzepicy żył głębokich.

PL 230 337 Β1

Przykład 11

W celu otrzymania kompozycji kosmetycznej, w naczyniu umieszczono odpowiednie ilości składników fazy oleistej: 1 g lanoliny, 4 g oleju arachidowego, 0,5 g wosku pszczelego oraz 0,5 g alkoholu cetylowego, a następnie podgrzewano do temperatury 70-75°C w łaźni wodnej. Po wymieszaniu do uzyskania całkowitego stopienia się składników, w oddzielnym naczyniu pod przykryciem ogrzewano 4 mL wody różanej z dodatkiem 0,005 g środka przeciwzakrzepowego, otrzymanego jak w przykładzie 2 do uzyskania temperatury 70-75°C. Naczynie ze stopioną fazą tłuszczową wyjęto z łaźni wodnej i umieszczono w nim mieszadło mechaniczne. Stopniowo dodawano fazę wodną do fazy tłuszczowej, mieszając aż do ostygnięcia emulsji i ustabilizowania się konsystencji kremu przeznaczonego do użytku zewnętrznego, w którym środek według wynalazku stanowił 0,05% zawartości.

Zastosowanie do użytku zewnętrznego, do smarowania na skórę.

Właściwości:

- działanie upiększające, zapobiegające powstawaniu widocznych podskórnych naczynek krwionośnych, tzw. „pajączków”,

- działanie upiększające, redukujące widoczność podskórnych naczynek krwionośnych, tzw. „pajączków” poprzez zmniejszanie ich średnicy.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania środka przeciwzakrzepowego, obejmujący ekstrakcję substancji aktywnych surowca roślinnego, przy pomocy alkoholu niższego lub małocząsteczkowego ketonu, a następnie wody lub wodnego roztworu alkalicznego oraz wyodrębnianie substancji aktywnych ze zobojętnionych wodnych ekstraktów poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami w układach dwufazowych, a po zatężeniu do konsystencji pasty, oddzielenie składników aktywnych od pozostałych składników ekstraktu roślinnego, poprzez wytrawianie alkoholem niższym z fazy stałej, znamienny tym, że jako surowiec roślinny stosuje się rzepik pospolity (Aghmonia eupatoha), z którego wyekstrahowane składniki aktywne, stanowiące mieszaninę koniugatów polifenolowo-polisacharydowych o niejednorodnej wielkości cząsteczek, w zakresie od masy 60 000 Da do 220 000 Da, u współczynniku rozproszenia masy składników polimerowych w przedziale od 3,4 do 3,6 oraz o wartości lepkości względnej (ą_Wz) w przedziale 1.11500-1.11750, poddaje się częściowej degradacji i homogenizacji przy zastosowaniu ultradźwięków na cząsteczki o niniejszej masie cząsteczkowej, zawierającej się w przedziale 10 000-45 000 Da, przy użyciu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz oraz mocy w zakresie 30-70 W, w roztworze wodnym lub wodnym z dodatkiem nadtlenku wodoru, a otrzymana mieszaninę poreakcyjną rozdziela sic na membranie filtracyjnej, w celu usunięcia małocząsteczkowych produktów degradacji, mniejszych niż 5 000 Da, przy czym stosuje się dodatek nadtlenku wodoru o stężeniu do 5% w stosunku do objętości mieszaniny reakcyjnej, w której stężenie składników aktywnych, poddawanych degradacji wynosi 1-10%, ponadto degradację prowadzi się od 90 minut do 240 minut, w temp, od 25°C,a uzyskane składniki aktywne, przekształca się w sole sodowe lub sole wapniowe, przy użyciu 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku wapnia, a po uzyskaniu pH roztworu na poziomie 7,2 i po wysuszeniu otrzymuje środek przeciwzakrzepowy.
2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że ziele, liście, kwiatostany rzepiku pospolitego (Agrimonia eupatoria), zebrane między miesiącem kwietniem a listopadem, ekstrahuje się metanolem, etanolem lub acetonem, następnie z użyciem wody lub 0,1 M wodnego roztworu wodorotlenku sodu, po czym substancje aktywne ekstrahuje się z ekstraktu roślinnego rozpuszczalnikami lub ich mieszaninami w układach dwufazowych, w proporcjach faz 1:1, w których pierwszą fazę stanowi uzyskany w pierwszym etapie ekstrakt roślinny, a drugą fazę rozpuszczalnik, taki jak pentan, heksan, heptan, eter dietylowy, chloroform, lub mieszanina rozpuszczalników organicznych, chloroformu z metanolem lub etanolem, korzystnie w proporcjach objętościowych 3:2, a otrzymany ekstrakt roślinny zatęża się do konsystencji pasty i poddaje się wytrawianiu metanolem lub etanolem, zbierając nierozpuszczalne w alkoholu składniki ekstraktu roślinnego, wytrącone w postaci osadu.

PL 230 337 Β1
3. Środek przeciwzakrzepowy, zawierający polisacharydy w ilości 30-55%, zbudowane z grupy obejmującej monomery połączone ze sobą wiązaniami glikozydowymi monosacharydów, wybranych z grupy obejmującej arabinozę, w ilości 11,5-12% części polisacharydowej i mannozę w ilości 1,5-2,5%, glukozę w ilości 23-28%, galaktozę w ilości 23-37%, ramnozę w ilości 4,5— -6,5%, ksylozę w ilości 1,1-2,0% części polisacharydowej, oraz cukry o charakterze kwasowym, takie jak kwas glukuronowy i kwas galakturonowy, których sumaryczna ilość wynosi 19-38% części polisacharydowej środka, ponadto od 45 do 70% polifenoli, znamienny tym, że otrzymany jest z części naziemnych rzepiku pospolitego (Agrimonia eupatoha) oraz stanowi mieszaninę, koniugatów polifenoli z polisacharydami, o makrocząsteczkach częściowo zdegradowanych, a częściowo skondensowanych przy użyciu ultradźwięków, których masa cząsteczkowa wynosi od 10 000 Da do 45 000 Da, współczynnik rozproszenia masy składników polimerowych ma wartość od 1,2 do 1,5, oraz wykazuje lepkość względną (ą_Wz) w zakresie 1,01617-1,02119.
4. Zastosowanie środka przeciwzakrzepowego określonego w zastrz. 3 do wytwarzania leku i/lub kompozycji farmaceutycznej do leczenia i profilaktyki chorób zakrzepowo-zatorowych w układzie krwionośnym człowieka, w stężeniu od 0,005% do 95%.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że środek przeciwzakrzepowy stosowany jest w kompozycji farmaceutycznej, w terapeutycznie skutecznych dawkach, korzystnie w stężeniu 50-250 pg/mL środka roślinnego we krwi/osoczu, przystosowanych do aplikowania doustnego, dożylnego, miejscowego, przezskórnego, lub doodbytniczego.