PL235025B1

PL235025B1 - 4'-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl-3-methoxyflavone and method for producing 4'-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl-3-methoxyflavone

Info

Publication number: PL235025B1
Application number: PL421050A
Authority: PL
Inventors: Monika Dymarska; Edyta Kostrzewa-Susłow; Tomasz Janeczko; Czko Tomasz Jane
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-05-18
Also published as: PL421050A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest 4’-O-3-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-3-metoksyflawon i sposób wytwarzania A’-O-3-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-3-metoksyflawonu o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.The present invention relates to 4'-O-3-D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone and the preparation of A'-O-3-D- (4" -O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone of formula 2, shown in the figure.

Związek ten może znaleźć zastosowanie jako antyoksydant w przemyśle spożywczym oraz jako składnik środków farmaceutycznych i kosmetycznych, a także dodatek do pasz.This compound can be used as an antioxidant in the food industry and as a component of pharmaceuticals and cosmetics, as well as a feed additive.

Źródła literaturowe podają, że metoksylowe pochodne flawonoidowe mają zdolność do łatwego penetrowania do wnętrza komórek, co jest cechą bardzo pożądaną przy tworzeniu nowych środków leczniczych. Po przeniesieniu linii komórkowych płuc do medium, w którym znajdowały się dimetoksyflawony, już po pięciu minutach komórki zakumulowały 30-50 razy więcej badanych związków, niż znajdowało się w otaczającym je buforze. Badania dowodzą, że związki te łatwo penetrują również komórki serca, płuc, piersi czy mózgu.Literature sources indicate that methoxy flavonoid derivatives have the ability to easily penetrate into the interior of cells, which is a very desirable feature when creating new therapeutic agents. After lung cell lines were transferred to the medium containing dimethoxyflavones, after just five minutes the cells accumulated 30-50 times more test compounds than was in the surrounding buffer. Research shows that these compounds also easily penetrate the cells of the heart, lungs, breast and brain.

Międzykomórkowy transport 5,7-dimetoksyflawonu był około 10-krotnie wyższy niż chryzyny (5,7-dihydroksyflawonu). Może być to wynikiem faktu, że metoksylowe pochodne flawonoidów nie są tak szybko metabolizowane, jak ich hydroksylowe odpowiedniki. Dzięki temu ich biodostępność w podaniu doustnym przewyższa biodostępność hydroksylowych pochodnych flawonoidów.The intercellular transport of 5,7-dimethoxyflavone was approximately 10 times higher than that of chrysin (5,7-dihydroxy flavone). This may be due to the fact that the methoxy flavonoid derivatives are not as rapidly metabolized as their hydroxyl counterparts. As a result, their oral bioavailability exceeds the bioavailability of hydroxyl derivatives of flavonoids.

5,7,4-trimetoksyflawon około ośmiokrotnie skuteczniej hamował namnażanie komórek płaskonabłonkowego nowotworu jamy ustnej niż jego hydroksypochodna - apigenina (5,7,4'-trihydroksyflawon). W przypadku linii komórkowych nowotworu piersi MCF-7 7-metoksyflawon działał silniej przeciwnowotworowo, niż 7-hydroksyflawon (Walle, T. Methoxylated flavones, a superior cancer chemopreventive flavonoid subclass? Semin. Cancer Biol. 2007, 17, 354-362).5,7,4-trimethoxyflavone was about eight times more effective in inhibiting the multiplication of squamous cell carcinoma of the oral cavity than its hydroxy derivative - apigenin (5,7,4'-trihydroxyflavone). In the MCF-7 breast cancer cell lines, 7-methoxyflavone was more potent antitumor than 7-hydroxyflavone (Walle, T. Methoxylated flavones, a superior cancer chemopreventive flavonoid subclass® Semin. Cancer Biol. 2007, 17, 354-362).

Uważa się, że glikozydy flawonoidowe przed absorpcją w układzie pokarmowym muszą zostać poddane hydrolizie przez mikroflorę jelitową do odpowiednich aglikonów. Dowiedziono jednak, że częściowa absorpcja połączeń cukrowych flawonoidów również jest możliwa.It is believed that the flavonoid glycosides must be hydrolyzed by the intestinal microflora to the appropriate aglycons before being absorbed in the gastrointestinal tract. However, it has been proven that partial absorption of the sugar flavonoid linkages is also possible.

Cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,5,7,3’,4’-pentahydroksyflawon) zwiększała absorpcję tego związku w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobilya, D. J. Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584, Hollman, P. C.; Bijsman, M. N.; van Gameren, Y; Cnossen, E. P.; de Vries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radie. Res. 1999, 31, 569-573).A glucose molecule attached to position 3 of quercetin (3,5,7,3 ', 4'-pentahydroxyflavone) increased absorption of this compound in the small intestine to 52%, compared with 24% absorption of quercetin aglycone and 17% of quercetin rutinoside (Heim, KE ; Tagliaferro, AR; Bobilya, DJ Flavonoid antioxidants: Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 572-584, Hollman, PC; Bijsman, MN; van Gameren, Y; Cnossen, EP ; de Vries, JH; Katan, MB The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radie. Res. 1999, 31, 569-573).

Flawonoidy w roślinach występują wyłącznie w połączeniu z jednostkami cukrowymi. Glikozylacja skutkuje wzrostem rozpuszczalności cząsteczki flawonoidu w wodzie i wzrostem jego stabilności. Dzięki temu zwiększa się przyswajalność przyjmowanych z pokarmem związków flawonoidowych (J. Xiao, T.S. Muzashvili, M.l. Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M.; Pozzo, T.; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 3321-3333).Flavonoids in plants only occur in combination with sugar units. Glycosylation increases the solubility of the flavonoid molecule in water and increases its stability. As a result, the bioavailability of flavonoid compounds taken with food increases (J. Xiao, TS Muzashvili, Ml Georgiev, Biotechnology Advances, 2014, 32, 1145-1156, Plaza, M .; Pozzo, T .; Liu, J .; Gulshan Ara, KZ; Turner, C .; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 3321-3333).

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 4’-O-^-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-3-metoksyflawonu na drodze syntezy chemicznej i biotransformacji.There is no information in the available literature on the preparation of 4'-O - ^ - D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone by chemical synthesis and biotransformation.

W ostatnich latach w leczeniu i prewencji chorób coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego i ich odpowiedniki uzyskane na drodze biotransformacji. Dlatego istotne jest poszukiwanie nowych sposobów wytwarzania związków aktywnych biologicznie, które mogą być wykorzystane w przemyśle farmaceutycznym, ale też kosmetycznym i spożywczym.In recent years, compounds of natural origin and their biotransformation counterparts have become increasingly important in the treatment and prevention of diseases. Therefore, it is important to search for new methods of producing biologically active compounds that can be used in the pharmaceutical, cosmetic and food industries.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3-metoksyflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.The essence of the invention consists in introducing the strain Isaria fumosorosea KCH J2 into a medium suitable for filamentous fungi. After at least 72 hours, the substrate is introduced into the culture, which is 3-methoxy flavone of formula I, dissolved in a water-miscible organic solvent. The transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius with continuous shaking for at least 96 hours. Subsequently, the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.Preferably, the ratio of the weight of the substrate added to the culture volume is 0.1 mg: 1 mL.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.It is also preferred that the process is carried out at a temperature of 25 degrees Celsius.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 168 godzin.Additionally, it is preferable for the transformation to be carried out for 168 hours.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje przyłączenie 4-metoksy-^-D-glukozy przyBy following the invention, 4-methoxy - ^ - D-glucose is attached to the cells of the Isaria fumosorosea KCH J2 strain as a result of the action of the enzyme system.

PL 235 025 B1PL 235 025 B1

C-4'. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).C-4 '. The product obtained in this way is separated from the aqueous culture of the microorganism by a known method by extraction with a water-immiscible organic solvent (ethyl acetate).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 4’-O-3-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-3-metoksyflawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.The main advantage of the invention is the preparation of 4'-O-3-D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone at room temperature and at the natural pH of the strain using a non-human pathogen microorganism.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o wyższej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, W. A. Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).The use of biotransformation, instead of chemical synthesis, allows in an environmentally friendly manner to obtain compounds with higher bioavailability and biological activity than the substrates used (E. Kostrzewa-Susłow, J. Dmochowska-Gładysz, J. Oszmiański, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 49 (1-4), 113-117, WA Loughlin, Bioresource Technology, 2000, 74, 49-62).

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.The invention is explained in more detail using an exemplary embodiment.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996. Po 96 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 3-metoksyflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 7 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 9:1.Example d. To the Erlenmeyer flask with a capacity of 2,000 cm ^3, which is 500 cm ^{3 of} a sterile medium containing 10 g aminobaku and 30 g of glucose, the strain is introduced Isaria fumosorosea MSDS J2 disclosed in Patent Application P.416996. After 96 hours of growth, 50 mg of 3-methoxyflavone of formula 1, dissolved in 1 cm ^{3 of} tetrahydrofuran, are added. The transformation is carried out at 25 degrees Celsius with continuous shaking for 7 days. Then, the reaction mixture was extracted three times with ethyl acetate, dried with anhydrous magnesium sulfate and the solvent was evaporated. The extract obtained is purified by chromatography using a 9: 1 mixture of chloroform and methanol as eluent.

Na tej drodze otrzymuje się 25.5 mg 4'-O-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-3-metoksyflawonu (wydajność 29%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.In this way, 25.5 mg of 4'-O- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone are obtained (29% yield). Substrate conversion by HPLC> 99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.The obtained product is characterized by the following spectral data.

Opis sygnałów pochodzących z widma 1H NMR (600 MHz, Aceton-d6): δ = 8,19 ppm (1H, d, J5,6 = 7,7 Hz, H-5); δ = 8,16 ppm (2H, d, J2-,3-,(6-,5·) = 8,4 Hz, H-2' H-6'); δ = 7,83 ppm (1H, t, J = 7,8 Hz, H-7); δ = 7,73 ppm (1H, d, Jej = 8,4 Hz, H-8); δ = 7,51 ppm (1H, t, J = 7,4 Hz, H-6); δ = 7,27 ppm (2H, d, J3-,2-,(5-,6·) = 8,2 Hz, H-3', H-5'); δ = 5,13 ppm (1H, d, J = 7,36 Hz, H-1”); δ = 3,93 ppm (3H, s, C3-OCH3); δ = 3,90 ppm (1H m, H-6”a); δ = 3,76 ppm (1H, m. H-6”b); δ = 3,71 ppm (1H, t, J = 9,36 Hz, C-3”); δ = 3,62 ppm (3H, s,C-4”- OCH3); δ = 3,56 ppm (2H, m, C-2”, C-5”); δ = 3,29 ppm (1H, t, J = 8,63 Hz, H-4”).Description of signals derived from the 1H NMR spectrum (600 MHz, Acetone-d6): δ = 8.19 ppm (1H, d, J5.6 = 7.7 Hz, H-5); δ = 8.16 ppm (2H, d, J2-, 3-, (6-, 5 ·) = 8.4 Hz, H-2 'H-6'); δ = 7.83 ppm (1H, t, J = 7.8 Hz, H-7); δ = 7.73 ppm (1H, d, Jec = 8.4 Hz, H-8); δ = 7.51 ppm (1H, t, J = 7.4 Hz, H-6); δ = 7.27 ppm (2H, d, J3-, 2 -, (5-, 6 ·) = 8.2 Hz, H-3 ', H-5'); δ = 5.13 ppm (1H, d, J = 7.36 Hz, H-1 ”); δ = 3.93 ppm (3H, s, C3-OCH3); δ = 3.90 ppm (1H m, H-6 ”a); δ = 3.76 ppm (1H, m. H-6 ”b); δ = 3.71 ppm (1H, t, J = 9.36 Hz, C-3 ”); δ = 3.62 ppm (3H, s, C-4 "- OCH3); δ = 3.56 ppm (2H, m, C-2 ", C-5"); δ = 3.29 ppm (1H, t, J = 8.63 Hz, H-4 ”).

Claims

1. 4'-O - ^ - D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone of formula 2.

2. The method of producing 4'-O - ^ - D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -3-methoxyflavone, characterized in that the Isaria fumosorosea KCH J2 strain is introduced into a medium suitable for filamentous fungi, then after at least 72 hours the substrate is introduced into the culture, which is 3-methoxyflavone of formula 1, dissolved in a water-miscible organic solvent, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking, for at least 96 hours, then the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography.

3. The method according to p. 2. The method of 2, characterized in that the ratio of the weight of the added substrate to the culture volume is 0.1 mg: 1 mL.

4. The method according to p. 2., characterized in that the temperature of the process is 25 degrees Celsius.

5. The method according to claim 2, characterized in that the transformation is carried out for 168 hours.