PL232016B1 - Sposób genetycznego różnicowania i identyfikacji drobnoustrojów oraz zestaw diagnostyczny do genetycznego różnicowania i identyfikacji wybranych gatunków Acinetobacter - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób genetycznego różnicowania i identyfikacji drobnoustrojów, mający zastosowanie w diagnostyce mikrobiologicznej, opierający się na zastosowaniu układu dwóch enzymów restrykcyjnych, adaptora oligonukleotydowego służącego do typowania genetycznego oraz startera uniwersalnego stosowanego w metodzie ddLMS PCR (ang. double digestion Ligation Mediated Supperssion PCR). Ponadto przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do genetycznego różnicowania i identyfikacji wybranych gatunków z rodzaju Acinetobacter.

Identyfikacja i różnicowanie mikroorganizmów mają ogromne znaczenie w mikrobiologii medycznej oraz epidemiologii środowiskowej. Służą one do wykrywania i kontroli zakażeń szpitalnych i pozaszpitalnych, w budynkach użyteczności publicznej (przedszkolach, szkołach, zakładach pracy), umożliwiają monitoring różnorodności klonalnej drobnoustrojów wśród pacjentów i ich środowisku, a także pozwalają określić heterogenność populacji w dwóch wymiarach - w czasie i na określonej przestrzeni. Wyniki badań mogą być podstawą do wprowadzenia środków zapobiegawczych i działań sanitarnych, mających ograniczyć lub zahamować rozprzestrzenianie się mikroorganizmów patogennych i związanej z nimi lekooporności.

Kluczowym elementem w badaniach epidemiologicznych jest odpowiedni dobór metod, pozwalających na jednoznaczną identyfikację czynnika chorobotwórczego, poznanie dróg rozprzestrzeniania się infekcji oraz potencjalnych rezerwuarów mikroorganizmów patogennych. Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej oraz w badaniach epidemiologicznych stosuje się klasyczne metody diagnostyczne oparte na analizie cech fenotypowych (techniki fenotypowe) oraz metody oparte na analizie materiału genetycznego, wykorzystujące nowoczesne techniki biologii molekularnej (techniki genotypowe).

Metody fenotypowe opierające się głównie na badaniu szeregu cech morfologicznych, biochemicznych i serologicznych, stanowią podstawę w obecnej identyfikacji drobnoustrojów. Identyfikacja metodami fenotypowymi często jest procesem złożonym i długotrwałym. Wymaga zastosowania grupy testów, które stopniowo pozwalają określić rodzinę, rodzaj, a także w większości przypadków gatunek badanego drobnoustroju. Ze względu na zjawisko zmienności fenotypowej (różna ekspresja cech fenotypowych wśród izolatów tego samego poziomu taksonomicznego) właściwa i jednoznaczna identyfikacja mikroorganizmów jest często utrudniona. Metody molekularne, oparte na analizie kwasów nukleinowych stanowią znakomite uzupełnienie klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej. W niektórych przypadkach pozwalają nawet zidentyfikować drobnoustrój bezpośrednio, bez potrzeby prowadzenia wstępnej identyfikacji z wykorzystaniem metod fenotypowych. Metody genotypowe oprócz tego, że skracają czas analizy, pozwalają uzyskać wiarygodne i jednoznaczne wyniki, gdyż opierają się na analizie niezależnych od czynników środowiskowych właściwości kwasów nukleinowych (głównie sekwencji DNA). Poszerzają także zakres możliwości diagnostycznych, pozwalając różnicować szczepy należące do tego samego gatunku (nierozróżnialne klasycznymi metodami diagnostycznymi) i identyfikować szczepy klonalnie zależne (wywodzące się od tej samej komórki).

Techniki diagnostyki molekularnej rozwijają się w dwóch kierunkach:

- techniki służące identyfikacji gatunkowej - techniki wysoce specyficzne, które mają na celu bezpośrednią i jednoznaczną identyfikację drobnoustroju wprost z materiału badanego, z pominięciem bądź maksymalnym zredukowaniem wstępnej identyfikacji klasycznymi technikami fenotypowymi;

- techniki do wewnątrzgatunkowego różnicowania szczepów w analizie sytuacji epidemicznej techniki o wysokim poziomie dyskryminacji, pozwalające różnicować szczepy tego samego gatunku klonalnie niezależne.

Do identyfikacji drobnoustrojów wykorzystuje się markery genetyczne, czyli charakterystyczne sekwencje, typowe dla danej grupy drobnoustrojów (poziomu taksonomicznego), które poddaje się amplifikacji techniką PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) za pomocą specyficznych starterów. Podstawowe układy diagnostyczne wykorzystują typowanie binarne - reakcja PCR z wykorzystaniem rodzajowo lub gatunkowo specyficznych starterów. Obecność produktu PCR o danej długości określa przynależność badanego szczepu do danego rodzaju/gatunku. Układów takich jest jednak stosunkowo mało i są one zaprojektowane tylko dla wybranych drobnoustrojów, np.: układ identyfikujący szczepy Klebsiella oxytoca na podstawie obecności genu pehX, kodującego enzym poligalakturonazę (amplifikacji poddawany jest fragment genu o długości 513 pz). Dla bakterii nienależących do rodzaju Klebsiella oraz dla pozostałych gatunków Klebsiella nie otrzymuje się produktu amplifikacji (wynik negatywny). Do identyfikacji można wykorzystać również sekwencje markerowe typowe dla większości

PL 232 016 B1 drobnoustrojów, które po amplifikacji PCR są poddawane analizie restrykcyjnej (PCR/RFLP). Przykładem tego typu układu diagnostycznego jest analiza restrykcyjna produktu amplifikacji fragmentu genu recA z wykorzystaniem enzymu Tsp509\. Uzyskany polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP - ang. Restriction Fragment Lenght Polymorphism) pozwala na różnicowanie i identyfikację genomogatunków Acinetobacter. Produkty PCR można również poddać sekwencjonowaniu (np.: gen 16SrDNA), co jest wykorzystywane w badaniach taksonomicznych i filogenetycznych drobnoustrojów.

W przypadku, gdy sekwencja markerowa jest charakterystyczna tylko dla jednego rodzaju lub gatunku drobnoustroju, istnieje możliwość jego identyfikacji z mieszaniny DNA wyizolowanej wprost z materiału klinicznego (krwi, moczu), bez konieczności wstępnej izolacji do czystej kultury. Pozwala to maksymalnie skrócić czas analizy i identyfikacji, zmniejszyć koszty, a przede wszystkim w przypadku szczepów patogennych, szybko podjąć decyzję, co do sposobu jego eradykacji.

Wysoka specyficzność metody zazwyczaj jest odwrotnie proporcjonalna do jej możliwości różnicujących (poziomu dyskryminacji). Zmienność genetyczna organizmów jest uwarunkowana procesami rekombinacji i mutacji. Jednak nie wszystkie zmiany w DNA są przekładane na fenotyp danego organizmu. Wiele z nich to drobne zmiany w sekwencji nukleotydowej, decydujące o zmienności genomu, ale nie wpływające na ekspresję genów. Zmiany te jednak stanowią dodatkową informację, pozwalającą badać pokrewieństwo między organizmami i wykazać dywergencję poszczególnych grup i gatunków. Co więcej zmiany te nie kumulują się w jednym miejscu, ale mogą występować z różnym prawdopodobieństwem w całym genomowym DNA. Badanie zmienności genetycznej tylko w obrębie specyficznej sekwencji markerowej jest znacznie ograniczone wielkością (długością) obszaru badanego. Prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji w tym obszarze jest tym niższe, im bardziej zakonserwowana i specyficzna jest sekwencja markerowa. Zatem pozornie identyczne mikroorganizmy mogą w rzeczywistości znacznie różnić się genetycznie poza obszarem sekwencji markerowej.

W dochodzeniach epidemiologicznych stosuje się metody o wysokim potencjale różnicującym, badające zmienność nukleotydową w całym genomowym DNA.

Metody badające zmienność genetyczną tylko w wybranych obszarach genomu stosuje się stosunkowo rzadko i tylko do wybranych drobnoustrojów. W badaniach epidemiologicznych ważne jest, aby wybrana metoda diagnostyczna umożliwiła różnicowanie drobnoustrojów w obrębie gatunku, pozwalała zidentyfikować szczepy klonalnie zależne (wywodzące się od tej samej komórki macierzystej) oraz wskazywała na pokrewieństwo szczepów izolowanych z tego samego środowiska czy grupy pacjentów. Do najczęściej stosowanych metod należą m.in.: REA-PFGE, RAPD oraz metody z grupy LM PCR. Są to techniki określane jako fingerprinting.

W chwili obecnej za „złoty standard” w typowaniu mikroorganizmów uważa się analizę restrykcyjną chromosomowego DNA połączoną z elektroforezą pulsową - REA-PFGE (ang. Restriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Electrophoresis). W metodzie tej, w wyniku trawienia całego genomowego DNA jednym, rzadko tnącym enzymem restrykcyjnym, generuje się od 10 do 30 fragmentów DNA o wielkości od ok. 0,5 kpz do 1000 kpz. Fragmenty rozdziela się w zmiennym polu elektrycznym, uzyskując profil prążków charakterystyczny dla badanego drobnoustroju. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych odzwierciedla polimorfizm sekwencji genomowego DNA. Technika REA-PFGE charakteryzuje się wysokim potencjałem różnicującym, jest uniwersalna i nadaje się do typowania wszystkich bakterii. Dodatkowo ujednolicone i wystandaryzowane kryteria interpretacji wyników zaproponowane przez Tenovera pozwalają porównywać wyniki międzylaboratoryjnie.

Najprostszą techniką do typowania genetycznego jest technika RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA), na którą składa się prosta reakcja PCR oraz elektroforetyczny rozdział produktów PCR. Reakcję PCR prowadzi się z zastosowaniem jednego bądź kilku starterów o dobranej losowo, krótkiej i niespecyficznej sekwencji, przy obniżonej temperaturze przyłączania starterów w pierwszych kilku cyklach, aby umożliwić częściowo niespecyficzne przyłączanie startera do matrycy DNA. Amplifikację fragmentu DNA warunkuje odpowiednia orientacja i odległość starterów na obu niciach (nieprzekraczająca 1500-2000 pz). Polimorfizm długości produktów PCR odzwierciedla polimorfizm sekwencji genomowego DNA i różnicuje drobnoustroje.

W ostatnich latach w badaniach epidemiologicznych coraz szersze zastosowanie znajdują metody oparte na selektywnej amplifikacji fragmentów restrykcyjnych z dołączonymi do nich adaptorami oligonukleotydowymi - LM PCR (ang. Ligation Mediated PCR). Wśród nich wyróżnia się:

- AFLP - (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism),

- ADSRRS - (ang. Amplification of DNA Surrounding Rare Restriction Sites),

- PCR MP - (ang. PCR Melting Profiles),

PL 232 016 B1

- LM PCR/Shifter - (ang. Ligation Mediated Shifter PCR).

Metody LM PCR opierają się na selektywnej amplifikacji fragmentów DNA, które uzyskuje się na drodze trawienia całego genomowego DNA jedną lub dwoma endonukleazami restrykcyjnymi, pozostawiającymi wiszące końce 5' oraz obustronnej ligacji z odpowiednio zaprojektowanymi adaptorami. Adaptor jest to odcinek DNA, składający się z dwóch wzajemnie komplementarnych, dających „wiszące końce”, oligonukleotydowych nici o różnej długości, spełniających określone funkcje. Oligonukleotyd pomocniczy zawiera na wiszącym końcu 5' sekwencję komplementarną do sekwencji wiszącego końca 5' fragmentu restrykcyjnego, zatem umożliwia hybrydyzację adaptora do fragmentu DNA. Oligonukleotyd ligowany tworzy w reakcji ligacji z końcem 5' fragmentu restrykcyjnego właściwe wiązanie fosfodiestrowe, stając się tym samym częścią matrycy DNA i jednocześnie tworząc miejsce hybrydyzacji dla startera w reakcji PCR. W metodach LM PCR w adaptorach stosuje się oligonukleotydy nieufosforylowane na końcu 5' (fig. 1), dzięki czemu nie zachodzi pomiędzy nimi reakcja polimeryzacji podczas reakcji ligacji. Uniemożliwia to także ligację oligonukleotydu pomocniczego do fragmentu restrykcyjnego, który na etapie denaturacji w reakcji PCR ulega oddysocjowaniu.

W wyniku ligacji adaptora do fragmentów restrykcyjnych otrzymuje się dwuniciowe fragmenty DNA o ściśle zdefiniowanych końcach, które mogą być amplifikowane w reakcji PCR, bez konieczności znajomości sekwencji tych fragmentów.

Wszystkie metody LM PCR przebiegają według tego samego schematu, obejmującego enzymatyczne trawienie genomowego DNA, ligację adaptorów do końców fragmentów restrykcyjnych, amplifikację wybranych fragmentów w reakcji PCR oraz elektroforetyczny rozdział produktów amplifikacji. W reakcji trawienia enzymatycznego stosuje się enzymy często tnące lub kombinacje enzymów rzadko i często tnących, aby uzyskać stosunkowo krótkie fragmenty DNA, przez wzgląd na ograniczoną procesywność stosowanych polimeraz DNA. Ze względu na ogromną liczbę generowanych w ten sposób fragmentów DNA, różne metody LM PCR wprowadzają różne metody selekcji ilości amplifikowanych w reakcji PCR fragmentów DNA:

AFLP - Reakcję PCR prowadzi się przy zastosowaniu starterów o sekwencji identycznej z sekwencją oligonukleotydu ligowanego adaptora, wydłużonej na końcu 3' o sekwencję miejsca restrykcyjnego oraz o 2-4 selekcyjne nukleotydy. Amplifikacja fragmentu DNA zachodzi jedynie w przypadku pełnej komplementarności startera na 3' końcu, po obu stronach fragmentu restrykcyjnego. Reakcję PCR można prowadzić z użyciem jednego bądź kombinacji kilku starterów, regulując w ten sposób poziom dyskryminacji i liczbę amplifikowanych fragmentów.

ADSRRS - Ilość amplifikowanych fragmentów ogranicza zjawisko supresji (SSH, ang. Suppression Subtractive Hybridisation) reakcji PCR. Supresja, zwana inaczej wewnątrzcząsteczkową hybrydyzacją fragmentów homologicznych może zajść w przypadku, gdy jednoniciowe fragmenty DNA (ssDNA - powstałe w wyniku denaturacji dsDNA) posiadające na obu końcach komplementarne względem siebie sekwencje, będące jednocześnie miejscem hybrydyzacji startera, utworzą strukturę „rakiety tenisowej”. Struktura ta uniemożliwia wiązanie się startera i hamuje amplifikację fragmentu DNA w reakcji PCR. W metodzie ADSRRS genomowe DNA trawi się dwoma enzymami restrykcyjnymi: rzadko i często tnącym, pozostawiającymi „wiszące końce” o różnej sekwencji. Do utworzonych fragmentów restrykcyjnych dołącza się dwa rodzaje adaptora, w zależności od zastosowanych enzymów. Fragmenty DNA powstałe w wyniku obustronnego trawienia tym samym enzymem są obustronnie ligowane z tym samym adaptorem, zatem zawierają terminalne sekwencje komplementarne. Podczas reakcji PCR fragmenty te nie są amplifikowane, gdyż tworzą stabilną w temperaturze przyłączania starterów strukturę „rakiety tenisowej”. Amplifikacji ulegają natomiast fragmenty DNA trawione dwoma różnymi enzymami i ligowane z dwoma różnymi adaptorami, gdyż ich końce nie są względem siebie komplementarne (struktura „rakiety tenisowej” nie tworzy się).

PCR MP - W cyklach reakcji PCR stosuje się niższą niż w standardowej metodzie LM PCR temperaturę denaturacji, w skutek czego amplifikacji ulegają tylko krótsze i mniej stabilne fragmenty DNA. Fragmenty, które nie uległy całkowitej denaturacji, nie mogą być amplifikowane, gdyż miejsca hybrydyzacji starterów są zablokowane przez komplementarną nić.

LM PCR/Shifter - W reakcji trawienia restrykcyjnego stosuje się enzym restrykcyjny klasy IIS, pozostawiający niezdefiniowane 5' wiszące końce. W reakcji ligacji stosuje się jeden adaptor bądź kombinację kilku adaptorów różniących się sekwencją wiszącego końca, które zostają zligowane z fragmentem restrykcyjnym tylko w przypadku pełnej komplementarności wiszących końców. Jedynie fragmenty obustronnie zligowane z adaptorem zawierają miejsce hybrydyzacji starterów, zatem mogą

PL 232 016 Β1 być amplifikowane w reakcji PCR. Czynnikiem selekcyjnym metody jest koniec 5' oligonukleotydu pomocniczego adaptora i koniec 3' startera.

Tabela 1

Porównanie znanych metod LM PCR

Metoda	Czynnik selekcyjny	Stosowane restryktazy	Stosowane adaptory
PCR MP	Obniżona temperatura denaturacji	1 enzym średnio lub często tnący, pozostawiający 5'wiszący koniec	1 krótki adaptor, nieufosforylowany
AFLP	pełna komplementarność startera na 3' końcu	1 lub 2 enzymy często tnącye, pozostawiające 5' wiszące końce	1 lub 2 adaptory zbudowane z krótkiego i długiego, ufosforylowanego oligonukleotydu
ADSRRS	Zjawisko supresji reakcji PCR	1 enzym często i 1 rzadko tnący, pozostawiające 5' wiszące końce	2 adaptory krótki i długi, nieufosforylowane
LM Shifter	Wiszący koniec 5' oligonukleotydu pomocniczego adaptora i koniec 3' startera	1 enzym często tnący klasy IIS, pozostawiający 5' wiszące końce	1-4 adaptory, n ie ufosf ory 1 owa n e

Techniki fingerprinting, opierające się na kompleksowej analizie genomowego DNA, są spośród dostępnych aktualnie genetycznych metod typowania, najbardziej uniwersalne i zarazem wykazują wysoką moc różnicującą. Nie wymagają doboru odpowiedniego markera genetycznego (specyficznej sekwencji DNA) oraz nie wymagają znajomości sekwencji analizowanego DNA, jednakże do analizy wymagają stosowania DNA pochodzącego z czystych kultur bakteryjnych. Są to metody niespecyficzne pod względem amplifikowanej sekwencji, stąd nie mogą być stosowane do identyfikacji gatunkowej. Ze względu na to, że są wysoce uniwersalne, wymagają wstępnego przygotowania materiału do analizy: izolacji czystej kultury bakteryjnej oraz identyfikacji gatunku drobnoustroju.

Jak dotąd nie zaprojektowano metody, która pozwoliłaby wewnątrzgatunkowo różnicować szczepy i jednocześnie je identyfikować. Wysoce specyficzne sekwencje markerowe zazwyczaj są mocno zakonserwowane w obrębie danego poziomu taksonomicznego, gdyż stanowią najczęściej fragment genu odpowiedzialnego za ważne procesy życiowe komórki. Jednakże sekwencje otaczające ten gen mogą wykazywać polimorfizm niezależnie od sekwencji markerowej. Szczepy tego samego gatunku, klonalnie niezależne, identyczne pod względem sekwencji markerowej, mogą wykazywać różnice w sekwencji poprzedzającej sekwencję markerową (znajdującej się w kierunku 5' od tej sekwencji). Amplifikacja i analiza zmiennej sekwencji poprzedzającej wybraną, stałą dla danego gatunku sekwencję markerową, może stanowić doskonałe narzędzie do specyficznego różnicowania danej grupy drobnoustrojów.

Przedstawione metody LM PCR wymagają stosowania do analizy DNA wyizolowanego z czystych kultur bakteryjnych. Są to metody niespecyficzne gatunkowo, zatem mogą być wykorzystane do różnicowania zidentyfikowanych drobnoustrojów, nie zaś do ich identyfikacji.

Nieoczekiwanie okazało się, że sposób genetycznego różnicowania i identyfikacji ddLMS PCR zgodny z wynalazkiem może być wykorzystywany w badaniu polimorfizmu długości fragmentów poprzedzających stałe i znane sekwencje DNA w genomie drobnoustrojów, co stanowi podstawę do ich identyfikacji i różnicowania. Selektywna amplifikacja fragmentów restrykcyjnych, zawierających znaną sekwencję DNA (sekwencję markerową), jest możliwa dzięki częściowo specyficznej reakcji PCR, w której stosuje się starter komplementarny do sekwencji markerowej, zwany dalej „specyficznym” oraz starter komplementarny do sekwencji adaptora, zwany dalej „uniwersalnym”. Ograniczenie amplifikacji fragmentów niespecyficznych zachodzi na etapie reakcji ligacji adaptora oraz na etapie reakcji PCR.

Technika ddLMS PCR powstała na podstawie techniki LMS PCR (ang. Ligation Mediated Supression PCR) i stanowi połączenie prostej, specyficznej reakcji PCR (tzw. simpleks PCR) z techniką LM PCR. Technika LMS PCR po raz pierwszy została zaproponowana przez Siebert w 1995 roku. Została ona wykorzystana do analizy obszarów promotorowych oraz do poznania sekwencji długich

PL 232 016 B1 odcinków DNA (np. całych genów) na podstawie częściowej znajomości sekwencji, do identyfikacji izoform genów wewnątrz danej rodziny genów oraz w połączeniu z metodą „inverse” PCR, do analizy sekwencji otaczającej znany fragment DNA. Brak jest doniesień literaturowych, które wskazywałyby, że metoda ta została zastosowana do różnicowania i identyfikacji drobnoustrojów. LMS PCR jest to metoda złożona, w której w wyniku trawienia genomowego DNA jedną endonukleazą klasy II zostają wygenerowane fragmenty restrykcyjne o jednakowych „wiszących końcach”, do których następnie dołączany jest w reakcji ligacji adaptor oligonukleotydowy. Fragmenty DNA zawierające wewnątrz sekwencję markerową, dzięki zastosowaniu secyficznego startera ulegają amplifikacji w reakcji PCR. Ilość produktów PCR zależy ściśle od ilości kopii sekwencji markerowej w genomie analizowanego drobnoustroju. Supresja amplifikacji produktów niezawierających sekwencji markerowej wynika z braku miejsca wiązania starterów. Specyficzność amplifikacji w technice LMS PCR uzyskano, stosując adaptor zawierający zmodyfikowany na obu końcach oligonukleotyd pomocniczy. Koniec 5' oligonukleotydu pomocniczego jest ufosforylowany i podobnie jak oligonukleotyd ligowany ulega ligacji do fragmentu restrykcyjnego i staje się częścią matrycy DNA w reakcji PCR.

W metodzie LMS PCR koniec 3' oligonukleotydu pomocniczego zawiera dodatkowo grupę aminową, bądź jest niekomplementarny w stosunku do oligonukleotydu ligowanego i tworzy adaptor typu Y-shape. Modyfikacja końca 3' uniemożliwia jego wydłużenie przez polimerazę DNA i odtworzenie miejsca wiązania dla startera komplementarnego do adaptora. Amplifikacja fragmentu restrykcyjnego jest możliwa tylko dla fragmentów zawierających sekwencję markerową. W pierwszym cyklu reakcji PCR, w wyniku hybrydyzacji i wydłużania startera specyficznego, zachodzi amplifikacja liniowa (amplifikacja tylko jednej nici fragmentu DNA) i odtworzenie miejsca wiązania dla startera uniwersalnego. W kolejnych cyklach, na skutek hybrydyzacji obu starterów, zachodzi właściwa reakcja PCR - amplifikacja obu nici fragmentu DNA.

Stosowany do tej pory w metodzie LMS PCR ufosforylowany koniec 5' oligonukleotydu pomocniczego w przeciwieństwie do innych metod LM PCR jest ligowany do fragmentu restrykcyjnego i staje się jego integralną częścią. Natomiast modyfikacja na końcu 3' blokuje amplifikację fragmentów DNA niezawierających sekwencji markerowej. Jest to warunek konieczny, aby zaszła selekcja amplifikowanych fragmentów DNA. Niestety, obecność grupy fosforanowej w adaptorze umożliwia także autoligację dwóch cząsteczek adaptora. Fragment DNA utworzony w wyniku autoligacji adaptora nie jest amplifikowany, gdyż nie zawiera miejsca hybrydyzacji dla startera uniwersalnego, jak i startera specyficznego, jednak taki proces powoduje utratę dostępnych cząsteczek adaptora i spadek efektywności reakcji ligacji, a co za tym idzie hamowanie reakcji PCR i obniżenie czułości metody.

W opracowanej metodzie ddLMS PCR, oligonukleotyd pomocniczy jest nieufosforylowany, zatem podczas reakcji ligacji autoligacja adaptora nie zachodzi. Selekcję amplifikowanych fragmentów DNA, zawierających sekwencję markerową uzyskuje się poprzez zastosowanie układu dwóch enzymów restrykcyjnych, generujących fragmenty DNA o różnych końcach.

Proponowany nowy sposób genotypowania drobnoustrojów z wykorzystaniem metody ddLMS PCR, oparty jest o ligację adaptorów do fragmentów restrykcyjnych i amplifikacji techniką PCR. Sposób ten polega na wprowadzeniu do trawienia genomowego DNA dwóch enzymów restrykcyjnych, dających różne końce, jednego rodzaju adaptora, komplementarnego do jednego z końców fragmentu restrykcyjnego oraz dwóch starterów w reakcji PCR: komplementarnego do wybranej „sekwencji markerowej” (starter specyficzny: STs) oraz komplementarnego do adaptora (starter uniwersalny: STu). Metoda ddLMS PCR umożliwia w odróżnieniu od innych metod LM PCR, specyficzną amplifikację fragmentów DNA, ograniczając w ten sposób liczbę amplifikowanych fragmentów do jednego bądź kilku.

Obecność produktu/produktów PCR ma charakter identyfikacyjny - pozwala identyfikować drobnoustrój na danym poziomie taksonomicznym, natomiast długość produktu/produktów ma charakter różnicujący - pozwala różnicować drobnoustroje w obrębie danego poziomu taksonomicznego.

W metodzie ddLMS PCR analizie poddawane jest całe genomowe DNA. W wyniku trawienia restrykcyjnego otrzymuje się bardzo dużą ilość fragmentów restrykcyjnych, z których niewiele (ich liczba zależy od liczby kopii sekwencji markerowej) zawiera wewnątrz sekwencję markerową. Fragmenty te można podzielić na cztery grupy (fig. 4A):

I - fragmenty zawierające sekwencję markerową, uzyskane w wyniku trawienia dwoma enzymami,

II - fragmenty powstałe po trawieniu dwoma enzymami,

III - fragmenty powstałe po trawieniu z obu stron enzymem ERz (enzym „zewnętrzny”),

IV - fragmenty powstałe po trawieniu z obu stron enzymem ERw (enzym „wewnętrzny”).

PL 232 016 B1

Zastosowane enzymy restrykcyjne pozostawiają różne końce. Adaptor zawiera sekwencję komplementarną tylko do końca pozostawionego przez enzym ERz. W wyniku reakcji ligacji adaptor łączy się z fragmentem restrykcyjnym tylko od strony cięcia enzymem ERz. Koniec fragmentu powstały po cięciu enzymem ERw pozostaje wolny (fig. 2).

W reakcji ligacji adaptor przyłącza się z dwóch stron do fragmentów z puli III lub tylko z jednej strony do fragmentów z pluli I i II (fig. 4B). Adaptor zligowany z fragmentem restrykcyjnym tworzy miejsce wiązania dla startera STu. Obecność adaptora z jednej strony fragmentu restrykcyjnego jest warunkiem wystarczającym do amplifikacji fragmentów, które zawierają wewnątrz sekwencję markerową (pula I). Dla pozostałych fragmentów konieczne jest, by adaptor zligowany był po ich obu stronach (pula III). Etap ligacji blokuje amplifikację fragmentów z puli II i IV.

Reakcja PCR w metodzie ddLMS PCR składa się z dwóch etapów (fig. 3):

1. pre-PCR - wstępna reakcja PCR, w której w wyniku oddysocjowania niezligowanego oligonukleotydu pomocniczego i wypełnienia końca 3' przez polimerazę DNA następuje odtworzenie miejsca wiązania dla startera STu; etap ten zachodzi w temperaturze 72°C (optymalnej dla działania polimerazy DNA);

2. właściwa reakcja PCR - amplifikacja fragmentu specyficznego z udziałem startera STu (typu forward) i specyficznego STs (typu reverse).

Do zahamowania amplifikacji fragmentów niespecyficznych, trawionych z obu stron enzymem ERz (pula III), wykorzystano zjawisko supresji w reakcji PCR. Fragmenty z puli III są z obu stron ligowane z adaptorem, zatem na ich końcach znajdują się komplementarne sekwencje, które mogą łączyć się ze sobą tworząc strukturę „rakiety tenisowej”. Sekwencje te jednocześnie są miejscem hybrydyzacji startera, zatem jeśli podczas reakcji PCR dany fragment DNA utworzy taką strukturę, starter nie przyłączy się do matrycy i fragment nie zostanie powielony.

W reakcji PCR ulegają amplifikacji tylko fragmenty z puli I (fig. 4D), trawione z każdej strony innym enzymem (brak terminalnych sekwencji komplementarnych - brak supresji w wyniku wewnątrzcząsteczkowej hybrydyzacji), zawierające sekwencję markerową (obecność miejsca wiązania dla startera STu i STs).

Nowym podejściem zastosowanym w niniejszej metodzie jest sposób selekcji fragmentów, które będą podlegały amplifikacji. Dokonuje się tego poprzez dobór:

- sekwencji markerowej,

- układu dwóch, dających różne końce, enzymów restrykcyjnych: zewnętrznego enzymu restrykcyjnego ERz, trawiącego DNA w kierunku 5' od „sekwencji markerowej” oraz wewnętrznego enzymu restrykcyjnego ERw, trawiącego DNA wewnątrz „sekwencji markerowej”, bądź w kierunku 3' od „sekwencji markerowej”. Zarówno „sekwencja markerowa”, jak i układ enzymów restrykcyjnych oraz częściowa sekwencja oligonukleotydów adaptora to elementy zmienne wynalazku. Elementy te są dobierane indywidualnie, w zależności od grupy badanych drobnoustrojów oraz od celu analizy.

„Sekwencja markerowa” jest to charakterystyczna sekwencja DNA, występująca w jednej lub wielu kopiach w genomowym DNA u wszystkich drobnoustrojów na danym poziomie taksonomicznym. Aby sekwencja ta stanowiła element identyfikujący daną grupę drobnoustrojów, zaleca się stosowanie sekwencji wysoce zakonserwowanych i specyficznych tylko dla badanej grupy drobnoustrojów (sekwencji gatunkowo-specyficznych). Stosowanie sekwencji powszechnie występujących w genomowym DNA drobnoustrojów (np. genów kodujących białka biorące udział w podstawowym metabolizmie komórkowym) ogranicza właściwości identyfikacyjne metody, pozostawiając właściwości różnicujące. Na podstawie „sekwencji markerowej” określa się sekwencję startera STs, komplementarnego do wybranej „sekwencji markerowej”, w reakcji PCR. W przypadku zastosowania specyficznej sekwencji markerowej dla badanej grupy drobnoustrojów, obecność lub brak produktu PCR (pozytywny/negatywny wynik analizy) świadczy odpowiednio o przynależności lub o nieprzynależności badanego szczepu do danej grupy.

Sposób genetycznego różnicowania i identyfikacji drobnoustrojów charakteryzuje się według wynalazku tym, że genomowe DNA poddaje się trawieniu, przy użyciu zewnętrznego enzymu restrykcyjnego ERz, trawiącego DNA w kierunku 5' od „sekwencji markerowej” oraz wewnętrznego enzymu restrykcyjnego ERw), trawiącego DNA wewnątrz „sekwencji markerowej” bądź w kierunku 3' od „sekwencji markerowej”. Użyte enzymy restrykcyjne pozostawiają po trawieniu różne od siebie końce. W następnym etapie przeprowadza się ligację z adaptorem komplementarnym do jednego z końców fragmentu restrykcyjnego oraz amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy z wykorzystaniem dwóch różnych starterów, przy czym jeden starter jest komplementarny do wybranej „sekwencji markerowej” STs, a drugi starter jest komplementarny do sekwencji adaptora STu. W wyniku reakcji otrzymuje się fragmenty DNA

PL 232 016 B1 zawierające wewnątrz „sekwencję markerową” identyfikującą daną grupę drobnoustrojów, przy czym „sekwencję markerową” wybiera się z grupy sekwencji wysoce zakonserwowanych dla badanej grupy drobnoustrojów.

Korzystnie, starter komplementarny do adaptora (STu) ma sekwencję 5' - GCATGGTAGACGAAG - 3'.

Korzystnie, adaptor składa się z oligonukleotydu ligowanego i oligonukleotydu pomocniczego, gdzie oba nukleotydy zawierają sekwencję stałą oraz sekwencję zmienną uzależnioną od zastosowanego enzymu.

Korzystnie, zewnętrzny enzym restrykcyjny ERz jest częściej tnący analizowane DNA oraz nie tnie DNA w obrębie „sekwencji markerowej” i pozostawia „lepkie końce” 5' lub 3' o znanej sekwencji, a wewnętrzny enzym restrykcyjny ERw jest rzadziej tnący analizowane DNA oraz tnie DNA w obrębie „sekwencji markerowej” i pozostawia „tępe końce” lub „lepkie końce” o sekwencji różnej od sekwencji „lepkich końców” pozostawionych przez zewnętrzny enzym ERz.

Korzystnie, część stała oligonukleotydu ligowanego w adaptorze ma sekwencję 5' - GCATGGTAGACGAAGCCGTGAGTAGCGACCGCAG - 3'.

Korzystnie, część stała oligonukleotydu pomocniczego w adaptorze ma sekwencję 5' - CTGCGGTCGCTACTCACG - 3'.

Zestaw diagnostyczny do genetycznego różnicowania i identyfikacji bakterii z rodzaju Acinetobacter charakteryzuje się według wynalazku tym, że zawiera dwa enzymy restrykcyjne, zewnętrzny enzym ERz MaeII oraz wewnętrzny enzym ERw RsaI, adaptor zawierający na końcu 3' sekwencję komplementarną do „wiszącego końca” fragmentu restrykcyjnego pozostawionego przez zewnętrzny enzym ERz oraz dwa startery, gdzie jeden jest komplementarny do sekwencji markerowej genu recA - STs, a drugi starter jest komplementarny do sekwencji adaptora - STu.

Korzystnie, starter komplementarny do „sekwencji markerowej” STs ma sekwencję 5' - GCATGGTAGACGAAG - 3'.

Według wynalazku dostępne są dwa sposoby typowania drobnoustrojów w zależności od ilości kopii sekwencji markerowej w genomie badanych drobnoustrojów: w układzie pojedynczym (jedna kopia, fig. 5) lub w układzie fingerprinting (dwie i więcej kopii, fig. 6). W układzie pojedynczym typowanie drobnoustroju odbywa się na podstawie długości jednego produktu PCR, natomiast w układzie fingerprinting, na postawie elektroforetycznego profilu prążków, odzwierciedlającego kilka produktów PCR o różnej długości.

Wynalazek przedstawiono bliżej na rysunku, na którym:

na fig. 1 przedstawiono schemat ligacji adaptora do fragmentu restrykcyjnego w metodach LM PCR; P - grupa fosforanowa;

na fig. 2 przedstawiono schemat ligacji adaptora do fragmentu restrykcyjnego, trawionego różnymi enzymami;

na fig. 3 przedstawiono schemat reakcji PCR w metodzie ddLMS PCR;

na fig. 4 przedstawiono schemat przedstawiający sposób selekcji amplifikowanych fragmentów w metodzie ddLMS PCR;

na fig. 5 przedstawiono układ pojedynczy typowania według wynalazku; zaznaczono sekwencję markerową oraz adaptor - przykładowy obraz elektroforogramu pokazuje sposób różnicowania szczepów;

na fig. 6 przedstawiono układ typowania typu fingerprinting według wynalazku; zaznaczono sekwencję markerową oraz adaptor. Przykładowy obraz elektroforogramu pokazuje sposób różnicowania szczepów;

na fig. 7 przedstawiono fragment genomowego DNA A. baumannii ATCC 17978 przedstawiający gen recA, położenie sekwencji markerowej ograniczonej starterami rA1 i rA2 oraz położenie miejsc cięcia enzymu wewnętrznego i specyficznego w układzie recA-ddLMS PCR;

na fig. 8 przedstawiono elektroforetyczny rozdział produktów PCR, uzyskanych w wyniku analizy szczepów Acinetobacter sp. metodę recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/Rsal; ramką zaznaczono szczep wzorcowy A. baumannii ATCC 17978; Ml - marker wielkości DNA 100-1000;

na fig. 9 przedstawiono elektroforetyczny rozdział produktów PCR uzyskanych w wyniku analizy metodę recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/Rsal dla 1'-10' klinicznych, 11 i 23 referencyjnych szczepów A. baumannii oraz dla I-X różnych gatunków bakterii nie należących do rodzaju Acinetobacter, ramką zaznaczono szczep referencyjny wzorcowy A. baumannii ATCC 17978; Ml - marker wielkości DNA 100-1000;

na fig.10 przedstawiono fragment DNA faga lambda przedstawiający sekwencję analizowaną, ograniczoną starterami 1F i 1R, wewnątrz której znajduje się sekwencja markerowa oraz położenie miejsc cięcia enzymów ERw i ERz w układzie A-ddLMS PCR;

PL 232 016 Β1 na fig. 11 przedstawiono rozdział elektroforetyczny produktów PCR, z wykorzystaniem różnych starterów oraz matrycy DNA faga lambda na różnych etapach analizy w układzie 5'ddLMS PCR;

Ml - marker wielkości DNA 100-1000;

na fig. 12 przedstawiono elektroforetyczny rozdział produktów PCR w metodzie 5' A-ddLMS PCR, z zastosowaniem matrycy lambda DNA (1) czystej lub (2) zanieczyszczonej bakteryjnym DNA, (3) bakteryjnego DNA; Ml - marker wielkości DNA 100-1000.

Układ restrykcyjny, jako drugi element zmienny wynalazku to para dwóch enzymów restrykcyjnych klasy II, zwanych dalej: „enzym zewnętrzny” ERz i „enzym wewnętrzny” ERw. Wybór enzymu ERw ściśle zależy od „sekwencji markerowej”, natomiast wybór enzymu ERz od poziomu dyskryminacji metody. Kryteria doboru enzymów restrykcyjnych przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Kryteria wyboru enzymów restrykcyjnych

	Enzym zewnętrzny	Enzym wewnętrzny
Warunki konieczne (niezbędne)	Nie tnie DNA w obrębie „sekwencji markerowej	Tnie DNA w obrębie sekwencji markerowej lub w kierunku 3’ od „sekwencji markerowej
* Dopuszcza się by enzym zewnętrzny ciął DNA w obrębie sekwencji markerowej jedynie w przypadku, gdy miejsce to znajduje się w kierunku 3' od miejsca trawienia enzymu wewnętrznego.
Enzvm cześciei* tnacv analizowane DNA	Enzvm rzadziej* tnący analizowane DNA
* Stosunek częstości cięcia jest względny i opiera się na porównaniu teoretycznej ilości miejsc cięcia enzymu ERz i ERw, który powinien być >1
Pozostawia lepkie końce 5' lub 3' o znanej, zdefiniowanej sekwencji	Pozostawia tępe lub 'lepkie końce o sekwencji, różnej od sekwencji lepkich końców pozostawionych przez enzym ERz
Warunki dodatkowe (nie są niezbędne)	Istnieje możliwość dobrania wspólnych warunków buforowych i/lub temperaturowych dla obu enzymów, w których uzyskuje się maksymalną wydajność i specyficzność trawienia.

Enzym „zewnętrzny” ERz wpływa na poziom dyskryminacji metody. W układzie gatunkowo-identyfikującym odległość miejsca trawienia od „sekwencji markerowej” dla enzymu ERz powinna być stała dla szczepów tego samego gatunku i jednocześnie różna dla szczepów różnych gatunków. Natomiast w układzie różnicującym wewnątrzgatunkowo, odległość miejsca trawienia od „sekwencji markerowej” powinna być różna dla różnych szczepów tego samego gatunku. W układzie typu fingerprinting odległość miejsca trawienia od sekwencji markerowej powinna być różna dla kolejnych kopii „sekwencji markerowej” w genomie drobnoustroju.

Adaptor oraz częściowa sekwencja oligonukleotydu pomocniczego, jako trzeci element zmienny wynalazku, zależą od wybranego enzymu „zewnętrznego” ERz. Głównym kryterium wyboru adaptora są „wiszące końce” fragmentu restrykcyjnego utworzone przez enzym ERz. W przypadku, gdy są to 5' wiszące końce, wymagane jest zastosowanie „5'-adaptora” składającego się z dwóch częściowo komplementarnych oligonukleotydów: ligowanego i pomocniczego. Oligonukleotyd ligowany jest elementem stałym adaptora, a jego sekwencja podana jest w wykazie sekwencji, natomiast oligonukleotyd pomocniczy zawiera na końcu 5' 2-4 nukleotydowy odcinek zmienny, komplementarny do „wiszącego końca” fragmentu restrykcyjnego (fig. 1). W przypadku, gdy enzym ERz pozostawia 3' wiszące końce, wymagane jest zastosowanie „3'-adaptora”, składającego się tylko z jednego oligonukleotydu ligowanego, który oprócz sekwencji stałej zawiera również na 3' końcu sekwencję komplementarną do „wiszącego końca” fragmentu restrykcyjnego.

PL 232 016 Β1

Zastosowanie oligonukleotydu pomocniczego, składającego się tylko z sekwencji stałej, nie jest konieczne. Kryteria wyboru i charakterystykę adaptorów przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Kryteria wyboru i charakterystyka adaptora w metodzie ddLMS PCR

	Cecha analizowana	5' - adaptor	3' - adaptor
Kryterium wyboru adaptora	Końce fragmentu DNA, utworzone przez enzym ERz	Wiszące końce 5'	Wiszące końce 3'
Charakterystyka budowy adaptora	Liczba oligonukleotydów tworzących adaptor	Dwa częściowo komplementarne oiigonukleotydy: ligowany (stały) i pomocniczy (częściowo zmienny na końcu 53	Jeden oiigonukleotyd (częściowo zmienny na końcu 3)
	sekwencja oligonukleotydów tworzących adaptor	oiigonukleotyd ligowany: 5' GCATGGTAGACGAAGGTAGCGACCG CAG -3' oiigonukleotyd pomocniczy: 5' NNNNCTGCGGTCGCTACTCACG NNNN - część zmienna sekwencji oligonukleotydu	oiigonukleotyd ligowany: 5' GCATGGTAGACGAAGGTAGCGACCGCA GNNNN -3' NNNN - część zmienna sekwencji oligonukleotydu
	Schemat poglądowy
	* ..........r -T -		*»**** tfłpw -/asl*· + ...... ( 1
’ · ' Λ *

Starter uniwersalny 5' - GCATGGTAGACGAAG - 3' jest elementem stałym układu bez względu na zastosowany typ adaptora.

Podczas typowania metodą ddLMS PCR uzyskuje się fragmenty specyficzne rodzajowo/gatunkowo. Obecność produktu PCR/wzoru fingerprint klasyfikuje badany drobnoustrój do danego poziomu taksonomicznego. Różnice w długości produktu PCR/wzoru fingerprint obrazują zmienność genetyczną drobnoustroju w obrębie badanego poziomu taksonomicznego. Nowa metoda specyficznego typowania genetycznego może byćwykorzystana w różnych aspektach badań epidemiologicznych, tj. do śledzenia procesu szerzenia się infekcji, identyfikacji potencjalnych rezerwuarów mikroorganizmów patogennych lub w przypadku badania indywidualnych pacjentów, określenia czy dana infekcja jest nawrotowa czy nowa. Typowanie można wykorzystać w bioprzemyśle do kontroli stabilności genetycznej szczepów przemysłowych, w identyfikacji szczepów w walce z bioterroryzmem czy medycynie sądowej. Ze względu na specyficzność metody, może być ona również wykorzystana w badaniach taksonomicznych, do identyfikacji drobnoustrojów, w badaniach stwierdzających podobieństwo genetyczne.

Nowy sposób genotypowania drobnoustrojów z wykorzystaniem metody ddLMS PCR:

- nie wymaga stosowania genomowego DNA, izolowanego z czystej kolonii bakteryjnej,

- nie wymaga znajomości sekwencji genomowego DNA analizowanego szczepu, jedynie fragmentu sekwencji charakterystycznej dla danego poziomu taksonomicznego („sekwencji markerowej”).

Ponadto charakteryzuje się:

- prostotą wykonania,

- brakiem wrażliwości na kontaminację innym DNA na każdym etapie procedury,

PL 232 016 Β1

- mniejszymi wymaganiami co do aparatury (nie jest konieczne posiadanie termocyklera z gradientem temperatury oraz nie istnieje niebezpieczeństwo braku powtarzalności wyników będących następstwem niewielkich wahań temperatury),

- niskimi kosztami analizy, przez co możliwe jest przebadanie dużej ilości izolatów,

- krótkim czasem wykonania (ok. 1 dnia roboczego),

- prostym sposobem detekcji amplikonów (elektroforeza w żelu agarozowym i wybarwianie bromkiem etydyny)

- możliwością regulacji poziomu różnicującego w zależności od potrzeb,

- możliwością regulacji poziomu specyficzności w zależności od potrzeb,

- powtarzalnością metody.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia. Przykład 1

Układ diagnostyczny oparty na metodzie ddLMS PCR do identyfikacji i różnicowania wybranych bakterii z rodzaju Acinetobacter - układ recA-ddLMS PCR:

Wybór sekwencji markerowej: gen recA

Gen recA występuje u wszystkich drobnoustrojów z rodzaju Acinetobacter, występuje w genomie Acinetobacter sp. tylko w jednej kopii, co daje możliwość utworzenia układu diagnostycznego binarnego - identyfikującego przynależność badanego szczepu do rodzaju Acinetobacter na podstawie obecności produktu PCR oraz różnicująco-identyfikującego na podstawie długości otrzymanego produktu PCR. Długość „sekwencji markerowej” ograniczonej starterami rA1 i rA2 jest stała dla wszystkich Acinetobacter sp (425 pz).

Wybór enzymu wewnętrznego ERw - Rsal

Enzym Rsal rozpoznaje cztero-nukleotydową sekwencję, znajdującą się w obrębie sekwencji markerowej w stałym miejscu dla wszystkich drobnoustrojów z rodzaju Acinetobacter, generuje „tępe końce”.

Wybór enzymu zewnętrznego ERz - MaeW

Enzym MaeW rozpoznaje cztero-nukleotydową sekwencję DNA, znajdującą się w różnej odległości w kierunku 5' od sekwencji genu recA, generuje „wiszące końce” 3'.

Typowanie genetyczne Acinetobacter sp

Układ recA-ddLMS PCR MaeW/Rsa\ wykorzystano do typowania 23 referencyjnych szczepów Acinetobacter (20 genomogatunków), 10 klinicznych szczepów A. baumannii 10 szczepów innych rodzajów bakterii.

Tabela 4

Wyniki genotypowania szczepów bakteryjnych metodą recA-ddLMS PCR oraz recA-PCR/Tsp509l. W nawiasach podano spodziewaną długość produktu PCR

		Genotyp
ip	Gatunek	recA- PCR/7sp509l	recA-ddLMS PCR Moell/ffsol
1	Acinetobacter junii	A	-
2	Acinetobacter Iwoffii	B	-
3	Acinetobacter parvus	C	-
4	Acinetobacter radioresistens	D	-
5	Acinetobacter schindleri	E	-
6	Acinetobacter soli	F	-
7	Acinetobacter tandoii	G	A (~700pz)
8	Acinetobacter tjernbergiae	H	-
9	Acinetobacter towneri	1	-
10	Acinetobacter ursingii	J	-
11	Acinetobacter baumannii (2)	K	B (280pz)
12	Acinetobacter baylyi	L	C(~730pz)

PL 232 016 Β1

c.d. tabeli 4

13	Acinetobocter beijerinckii	M
14	Acinetobocter bouvetii	N	D(~1700pz)
15	Acinetobocter calcoaceticus (1)	O	E (~700pz)
16	Acinetobocter genomospecies 3	P	F (~380pz)
17	Acinetobocter guillouiae	R	-
18	Acinetobocter gerneri	S	-
19	Acinetobocter gyllenbergii	T	-
20	Acinetobocter haemolyticus	υ	-
21	Acinetobocter calcoaceticus (2)	0	E (~700pz)
22	Acinetobocter venetianus	w
23	Acinetobocter baumannii (1)	K	B (280pz)
1'	Acinetobocter baumannii 4	K	B (280pz)
2'	Acinetobocter baumannii 8	K	B (280pz)
3'	Acinetobocter baumannii 9	K	B (280pz)
4’	Acinetobocter baumannii 13	K	B (280pz)
5'	Acinetobocter baumannii 15	K	B (280pz)
6'	Acinetobocter baumannii 16	K	B (280pz)
7'	Acinetobocter baumannii 23	K	B (280pz)
8'	Acinetobocter baumannii 27	K	B (280pz)
9'	Acinetobocter baumannii 60	K	B (280pz)
10'	Acinetobocter baumannii 61	K	B (280pz)
1	Klebsiella oxytoca 1
II	Klebsiei'a pneumoniae
III	Escherichra coli 1
IV	Escherichra coli 2	-
V	Escherichic coli K12 MG 1655
VI	Staphylococcus aureus MRSA	-
VII	Staphylococcus MSSA	-
VIII	Serratia marcescens	-
IX	Streptococcus agaluctiae	-
X	Enterococcus faecium	-

Analizę przeprowadzono wg procedury zamieszczonej w tabeli 5. W pierwszym etapie analizy następuje trawienie restrykcyjne wyizolowanego genomowego DNA w ilości 0,1-0,1 μg enzymem ERw Rsal (1U), w warunkach buforowych optymalnych dla obu enzymów (określanych przez producenta), w środowisku wodnym w całkowitej objętości 24,5 μΙ. Następnie prowadzi się inkubację mieszaniny restrykcyjnej przez 60 minut w temperaturze optymalnej dla enzymu ERw Rsal (37°C). W drugim etapie sposobu do mieszaniny restrykcyjnej dodaje się 1U enzymu ERz - MaeW (1U) i prowadzi się inkubację w temperaturze optymalnej dla enzymu ERz MaeW (65°C) przez 60 min. W trzecim etapie sposobu do

PL 232 016 Β1 mieszaniny reakcyjnej dodaje się 10-20 pmoli adaptora (oligonukleotyd ligowany, zawierający na końcu 3' sekwencję komplementarną do „wiszącego końca” fragmentu restrykcyjnego, pozostawionego przez enzym ERz 5' - GCATGGTAGACGAAGGTAGCGACCGCAGACGT - 3'), 1U ligazy DNA faga T4, bufor do ligacji zawierający ATP i w optymalnej dla ligazy temperaturze prowadzi reakcję ligacji adaptora do fragmentów restrykcyjnych przez 60 minut. W kolejnym etapie prowadzi się selektywną amplifikację w reakcji PCR, poprzez dodanie przygotowanych mieszanin ligacyjnych w ilości 1 μΙ do mieszanin reakcyjnych zawierających 1U polimerazy DNA, korzystnie DNA polimerazy Taq lub polimerazy Pwo, 2,5 μΙ roztworu dNTP 8 mM (równomolowy roztwór deoksyrybonukleozydów: ATP, GTP, TTP i CTP, 2 mM każdego), 20-40 pmoli odpowiednio zaprojektowanego startera STs, (5' - GTTTTACCAGAAGATTCAGG - 3'), 10-20 pmoli startera STu, (5' - GCATGGTAGACGAAG - 3') oraz bufor do reakcji PCR i dopełnia się wodą do objętości 25 μΙ. Następnie wypełnia się 3' końce przez polimerazę DNA w temperaturze 72°C przez 5 minut. Właściwą reakcję PCR prowadzi się w dwudziestu pięciu cyklach, gdzie odpowiednio następuje po sobie denaturacja w temperaturze 94°C przez 30 sekund, przyłączanie starterów w temperaturze 60°C przez 30 sekund i wydłużanie w temperaturze 72°C przez 120 sekund. Wydłużanie końcowe odbywa się w temperaturze 72°C przez 5 minut. Ostatnim etapem jest rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny i detekcja w świetle UV.

W poniższej tabeli 5 zestawiono procedurę postępowania podczas analizy wykonywanej przy zastosowaniu sposobu według wynalazku, czyli metody recA-ddLMS PCR.

Tabela 5

Procedura postępowania w metodzie recA-ddLMS PCR

Etap	Parametr	Warunki prowadzonego etapu
1 etap trawienia enzymatycznego	Ilość genomowego DNA [pg]	0,1 -1
Temperatura [°C]	37°C
Czas trwania [min]	60 min
Aktywność restryktazy Rsal [U]	1
Objętość końcowa [μΙ]	24,5
II etap trawienia enzymatycznego	Temperatura [°C]	65°C
Czas trwania [min]	60 min
Aktywność restryktazy Ma&l [U]	1
Objętość końcowa [μΙ]	25
Reakcja ligacji adaptora	Temperatura [°C]	18-22
Czas trwania etapu [min]	60
Aktywność ligazy [U]	1
Ilość adaptora [pmol]	40
Reakcja PCR	Ilość mieszaniny ligacyjnej [pl]	1
Aktywność polimerazy [U]	1
Ilość (stężenie) startera [pmol (pM) uniwersalnego STu	15
Ilość (stężenie) startera [pmol (pM) specyficznego STs	15
Stężenie roztworu dNTP [mM]	0,8
Profil temperaturowo- czasowy	72°C	300 sek
94°C	60 sek
		94°C	30sek	25 cykli
72°C	135 sek
72°C	300sek
4°C	00
Elektroforeza w żelu agarozowym	Czas trwania etapu [min]	60 min
Stężenie żelu	1%
Warunki elektroforezy [V/cm]	5
Detekcja i Wizualizacja	Bromek etydyny [mg/ml]	0,5
Czas trwania etapu [min]	40

PL 232 016 Β1

Układ diagnostyczny recA-ddLMS PCR Mae\\/Rsa\

- jest układem specyficznym względem rodzaju Acinetobacter-analiza drobnoustroju należącego do innego rodzaju prowadzi do uzyskania wyniku negatywnego (brak produktu PCR). Wynik pozytywny analizy wskazuje, że badanym szczepem jest szczep z gatunku Acinetobacter sp.

- jest gatunkowo specyficzny - analiza szczepów tego samego gatunku (dla których układ jest typowalny) prowadzi do uzyskania produktu PCR o tej samej długości.

Przedstawiony układ diagnostyczny może być zastosowany do identyfikacji szczepów należących do kompleksu ABC (Acinetobacter baumannii - calcoaceticuś), do którego należy również genomogatunek 3. Są to szczepy ważne pod względem klinicznym, wielolekooporne, będące przyczyną zakażeń szpitalnych. Szczepy te w układzie Mae\\/Rsa\ są typowalne, a różnice w długości produktu PCR są wystarczająco duże, aby mocje prawidłowo identyfikować.

Przykład 2

Weryfikacja mechanizmu molekularnego metody ddLMS PCR

Mechanizm molekularny metody ddLMS PCR został poddany weryfikacji na DNA faga lambda. DNA faga lambda jest całkowicie zsekwencjonowane, pozwala zatem w drodze analizy sekwencyjnej przewidzieć długość oraz sekwencję produktów uzyskanych metodą ddLMS PCR. Zaprojektowano układ modelowy λ-ddLMS PCR, sprawdzający specyficzność amplifikacji fragmentów zawierających sekwencję markerową, a także zdolność eliminacji fragmentów niespecyficznych na etapie ligacji i reakcji PCR.

Układ modelowy jest układem typu simpleks. Wybrana losowo sekwencja markerowa występuje w jednej kopii w obrębię DNA faga lambda. W wyniku analizy metodą λ-ddLMS PCR otrzymuje się jeden produkt charakterystycznej długości.

Enzymem „zewnętrznym” ERz jest enzym restrykcyjny Bfa\, pozostawiający 5' wiszące końce, natomiast enzymem „wewnętrznym” ERw jest enzym Rsal, pozostawiający tępe końce.

Adaptor składa się z oligonukleotydu ligowanego (5' - GCATGGTAGACGAAGGTAGCGACCGCAG - 3') oraz oligonukleotydu pomocniczego (5' - TACTGCGGTCGCTAC - 3'), zawierającego na końcu 5' sekwencję komplementarną do „wiszącego końca” fragmentu restrykcyjnego utworzonego przez enzym Bfa\.

Starter specyficzny STs, komplementarny do końca 5' „sekwencji markerowej”, nazwano 3R (5' - CTGGGGAATGAGTTGCAATTATTGC - 3').

Fragment DNA ograniczony od strony 5' miejscem cięcia enzymu ERz (Stal), a od strony 3' sekwencją 3R nazwano „fragmentem specyficznym”. Produkt amplifikacji „fragmentu specyficznego” oraz ligowanego z nim adaptora to produkt specyficzny PCR1. Produkt ten stanowi wynik analizy metodą λ-ddLMS PCR.

Wewnątrz „produktu specyficznego” znajduje się „sekwencja wewnętrzna”, ograniczona starterami 2F i 4R, stanowiąca tzw. „sekwencję kontrolną”. Produkt amplifikacji „sekwencji wewnętrznej” (PCR2) na matrycy „produktu specyficznego” PCR1 stanowi potwierdzenie specyficzności produktu PCR1.

„Sekwencja analizowana” jest to sekwencja, w obrębię której znajduje się „fragment specyficzny”. Sekwencja ta została ograniczona starterami 1F i 1R na potrzeby analizy sekwencyjnej produktów trawienia, ligacji i reakcji PCR w metodzie λ-ddLMS PCR.

Starter STu (stADP8: 5' - GCATGGTAGACGAAG - 3') jest komplementarny do adaptora ligowanego do końca 5' fragmentu restrykcyjnego pozostawionego przez enzym ERz Bfa\ (fig. 10).

Przeprowadzono pełną analizę DNA faga lambda metodą ddLMS PCR w układzie λ-ddLMS PCR. Specyficzność metody potwierdzono za pomocą szeregu reakcji PCR z zastosowaniem jako matrycy: całkowitego DNA faga lambda, trawionego DNA oraz DNA ligowanego z adaptorem oraz starterów podanych w tabeli 6.

Tabela 6

Sekwencje starterów stosowanych w układzie λ-ddLMS PCR do weryfikacji specyficzności metody ddLMS PCR

1F	GTTTAGTGCATTTGATCCTTTTACTCCTCC
IR	TCAGGTTACCAACTACTAAGGTTGTAGG
2F	CCACAGATTCAAGTGGACGATG
3R	CTGGGGAATGAGTTGCAATTATTGC
4R	CCATTGCGTGCATCGAGTAAGTC
StAD8z	GCATGGTAGACGAAG

PL 232 016 Β1

Teoretycznie obliczone długości produktów PCR (tabela 7) porównano z wynikami otrzymanymi w drodze prowadzenia doświadczenia. Obecność lub brak produktu PCR świadczy o specyficzności trawienia wybranymi enzymami restrykcyjnymi, selekcji na etapie ligacji i reakcji PCR. Specyficzność amplifikacji produktu PCR1 potwierdzono na drodze reamplifikacji sekwencji PCR2 na matrycy oczyszczonego produktu PCR1. Wyniki przedstawiono na fig 11.

Tabela 7

Teoretyczna długość produktów amplifikacji, jakie można otrzymać w reakcji PCR z zastosowaniem różnych starterów na matrycy DNA faga lambda uzyskanej na różnych etapach analizy w metodzie 5' λ-ddLMS PCR.

	startery	Matryca DNA	Długość produkt u [pz]	uwagi
	1F - IR	Genomowe DNA lambda	1060	Amplifikacja „sekwencji markerowej
	2F - 4R	236	PCR2 - Amplifikacja „sekwencji kontrolnej wewnętrznej
	stADP8 - 3R	-	Brak amplifikacji ze względu na brak miejsca PCR2 - Amplifikacja „sekwencji kontrolnej
	1F- IR	Genomowe DNA lambda	-	Brak amplifikacji „sekwencji markerowej ze względu na trawienie wewnątrz tej sekwencji
	2F-4R	trawione Meatt i Rsal	236	PCR2 - Amplifikacja „sekwencji kontrolnej wewnętrznej (brak miejsc trawienia wewnątrz sekwencji)
	stADPS - 3R	-	Brak amplifikacji ze względu na brak miejsca wiązania startera STu
	1F- IR	Genomowe DNA lambda trawione Bfel/ Rsal i ligowane z oligonukleotyd em LIG8	-	Brak amplifikacji „sekwencji markerowej ze względu na trawienie wewnątrz tej sekwencji
	2F-4R	236	PCR2 - Amplifikacja „sekwencji kontrolnej wewnętrznej (brak miejsc trawienia wewnątrz sekwencji)
	stADP8 - 3R	463	Produkt PCR 1 (specyficzny)
0	StADP8	-	Brak amplifikacji, supresja w reakcji PCR fragmentów zawierających po obu stronach adaptor (trawionych po obu stronach enzymem BfaTjwewnątrz cząsteczkowa hybrydyzacja końcowych sekwencji komplementarnych brak miejsca wiązania startera dla fragmentów trawionych po obu lub po jednej stronie enzymem Rsal (brak zligowanego adaptera)
1	2F- 4R	Produkt PCR 1	236	PCR2 - Amplifikacja „sekwencji kontrolnej znajdującej się wewnątrz produktu PCR 1
1-	stADP8 - 3R	Brak	-	Brak kontaminacji odczynników
2-	2F-4R	Brak		Brak kontaminacji odczynników

PL 232 016 Β1

Amplifikacja „sekwencji analizowanej” (1F-1R) zachodzi tylko na matrycy nietrawionego DNA faga lambda (próba 1). Brak produktu 1F-1R amplifikowanego z mieszaniny restrykcyjnej świadczy o 100% wydajności trawienia (próba 4), natomiast brak produktu amplifikowanego z mieszaniny ligacyjnej (próba 7), świadczy o specyficzności ligacji fragmentów z adaptorem (nie zaszła autoligacja fragmentów, w wyniku której doszłoby do odtworzenia „sekwencji analizowanej” (1F-1R).

„Sekwencja wewnętrzna” 2F-4R zgodnie z założeniem jest amplifikowana na matrycy DNA na każdym etapie analizy (próba 2, 5, 8), także na matrycy oczyszczonego produktu PCR1, co potwierdza specyficzność tego produktu (próba 9).

Produkt specyficzny PCR1 otrzymano tylko na matrycy trawionego i ligowanego z adaptorem DNA (próba 9), którego specyficzność potwierdziła obecność wewnątrz „sekwencji kontrolnej”. Zatem do uzyskania produktu specyficznego konieczne jest przeprowadzenie wszystkich etapów analizy ddLMS PCR.

Brak dodatkowych, niespecyficznych produktów PCR amplifikowanych z mieszaniny ligacyjnej w próbie 9 i 10, świadczy o wysokim stopniu supresji amplifikacji fragmentów zawierających terminalne komplementarne sekwencje (fragmenty obustronnie ligowane z adaptorem). Dowodzi to, iż długość adaptora (oligonukleotydu ligowanego) jest odpowiednia w stosunku do długości startera uniwersalnego, aby utworzyć w reakcji PCR stabilną strukturę „rakiety tenisowej” i zahamować amplifikację fragmentów niespecyficznych.

Sprawdzono także wrażliwość układu λ-ddLMS PCR na kontaminację. Pełnej analizie metodą ddLMS PCR w układzie λ-ddLMS PCR poddano czyste DNA faga lambda, zanieczyszczone bakteryjnym DNA faga lambda oraz bakteryjne DNA. Teoretyczną analizę braku lub obecności specyficznego produktu PCR porównano z wynikami otrzymanymi w drodze prowadzenia doświadczenia (tab 8. fig. 12)

Tabela 8

Wykaz matrycowego DNA analizowanego w metodzie λ-ddLMS PCR

	DNA poddane analizie	Obecność produktu specyficzn ego	Cel
	Czyste DNA faga lambda	+	Amplifikacja „produktu specyficznego
	DNA faga lambda zanieczyszczone bakteryjnym DNA	+	Sprawdzenie specyficzności i wydajności amplifikacji „produktu specyficznego z matrycy DNA faga lambda w obecności obcego DNA (kontaminacja)
	Bakteryjne DNA	-	Sprawdzenie możliwości amplifikacji „produktu specyficznego z wykorzystaniem startera 3R na matrycy bakteryjnego DNA, stanowiącego zanieczyszczenie w próbie 2

Tabela 8. Wykaz matrycowego DNA analizowanego w metodzie λ-ddLMS PCR

Wyniki doświadczenia wykazały specyficzność układu modelowego względem DNA faga lambda.

„Produkt specyficzny” otrzymano dla próby 1 i 2, w których obecne było poddane obróbce DNA faga lambda. W próbie 3 produktu nie otrzymano, gdyż starter 3R nie jest specyficzny względem bakteryjnego DNA. „Produkt specyficzny” otrzymano z tą samą wydajnością, gdy analizie poddane było czyste jak i zanieczyszczone innym materiałem genetycznym DNA faga lambda. Zatem zaprojektowany układ modelowy λ-ddLMS PCR w układzie enzymów Bfa\/Rsa\ z wykorzystaniem startera 3R jest specyficzny tylko dla DNA lambda i nie jest wrażliwy na kontaminację obcym DNA.

Analiza układu modelowego λ-ddLMS PCR wykazała, że mechanizm molekularny metody ddLMS PCR jest zgodny z założeniami teoretycznymi:

- w wyniku analizy otrzymuje się jeden, specyficznej długości produkt PCR, zawierający wewnątrz „sekwencję markerową” (miejsce hybrydyzacji startera specyficznego);

- fragmenty restrykcyjne niezawierające „sekwencji markerowej”, obustronnie ligowane z adaptorem nie ulegają amplifikacji, mimo obecności startera uniwersalnego w mieszaninie reakcyjnej. Podczas reakcji PCR fragmenty te tworzą stabilną strukturę „rakiety tenisowej”, blokując miejsce hybrydyzacji startera STu;

PL 232 016 B1

- amplifikacja „produktu specyficznego” PCR1, zawierającego wewnątrz „sekwencję markerową”, jest możliwa tylko na matrycy trawionego i ligowanego z adaptorem DNA, w obecności startera STu i STs;

- kontaminacja obcym DNA w pierwszym etapie analizy nie wpływa na wydajność i specyficzność amplifikacji „produktu specyficznego”;

- mechanizm selekcji fragmentów DNA ulegających amplifikacji w metodzie ddLMS PCR jest wysoce specyficzny. W wyniku analizy nie powstają produkty niespecyficzne, zatem układy diagnostyczne wykorzystujące metodę ddLMS PCR mogą z powodzeniem być wykorzystywane do specyficznego typowania (identyfikacji) mikroorganizmów.

LITERATURA

1. Kovtunovych G., Lytvynenko T., Negrutska V., Lar O., Brisse S. and Kozyrovska N. Identification of Klebsiella oxytoca using a specific PCR assay targeting the polygalacturonase pehX gene. Res Microbiol. 2003 Oct; 154(8): 587-92.

2. Krawczyk B., Lewandowski K. and Kur J. Comparative studies of the Acinetobacter genus and the species identification method based on the recA sequences. Mol Cell Probes. 2002 Feb; 16(1): 1-11.

3. Schwartz D. and Cantor C. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell. 1984 May; 37(1): 67-75.

4. Duck W., Steward D., Banerjee S., McGowan J. and Tenover F. Optimization of Computer Software Settings Improves Accuracy of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Macrorestriction Fragment Pattern Analysis. J Clin Microbiol. 2003 July; 41(7): 3035-3042.

5. Williams J., Kubelik A., Livak K., Rafalski J. and Tingey S. DNA polymorphisms amplifiedby arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990 Nov 25; 18(22): 6531 -5.

6. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornem M., Frijters A., Pot J., Teleman J., Kuiper M. and Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 1995. Vol. 23, No. 21: 4407-4414.

7. Masny A. and Płucienniczak A. Fingerprinting of Bacterial Genomes by Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites. BioTechniques 2001.31: 930-936.

8. Masny A. and Płucienniczak A. Ligation mediated PCR performed at low denaturation temperaturesPCR melting profiles. Nucleic Acids Res. 2003. 31 :e114.

9. Leibner-Ciszak J. rozprawa doktorska: Optymalizacja, walidacja i zastosowanie techniki PCR MP (ang. PCR Melting Profiles) w badaniach epidemiologicznych oraz opracowanie nowej metody typowania genetycznego LM PCR/Shifter. 2009. Politechnika Gdańska.

10. Diatchenko L., Lau Y., Campbell A., Chenchik A., Moqadam F., Huang B., Lukyanov S., Lukyanov K., Gurskaya N., Sverdlov E. and Siebert P. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Jun 11; 93(12): 6025-30.

11. Siebert P., Chenchik A., Kellogg D., Lukyanov K. and Lukyanov S. An improved PCR method for walking in unclosed genomic DNA. Nucleic Acids res. 1995 Mar 25; 23(6): 1087-8.

12. Chua E., Young L., Wu W., Turtle J. and Dong Q. Cloning of TC-1(C8orf4), a novel gene found to be over expressed in thyroid cancer. Genomics 2000; 69: 342-7.

13. Strauss C., Mussgnug J. and Kruse O. Ligation-mediated suppression-PCR as a powerful tool to analyse nuclear gene sequences in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Photosynth Res. 2001; 70(3): 311 -20.

14. Huang S.H. Inverse polymerase chain reaction. An efficient approach to cloning cDNA ends. MolBiotechnol 1994; 2: 14-22.

15. Jeung J., Cho S. and Shin J. A partial-complementary adapter for an improved and simplified ligationmaediated suppression PCR technique. J. Biochem. Biopys. Method. 2005 Aug 31; 64(2): 110-20.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób genetycznego różnicowania i identyfikacji drobnoustrojów, znamienny tym, że genomowe DNA poddaje się trawieniu, przy użyciu zewnętrznego enzymu restrykcyjnego (ERz), trawiącego DNA w kierunku 5' od „sekwencji markerowej” oraz wewnętrznego enzymu restrykcyjnego (ERw), trawiącego DNA wewnątrz „sekwencji markerowej”, bądź w kierunku 3' od

   PL 232 016 B1 „sekwencji markerowej”, przy czym użyte enzymy restrykcyjne pozostawiają po trawieniu różne od siebie końce, a następnie ligacji z adaptorem komplementarnym do jednego z końców fragmentu restrykcyjnego oraz amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy z wykorzystaniem dwóch różnych starterów, przy czym jeden starter jest komplementarny do wybranej „sekwencji markerowej” (STs), a drugi starter jest komplementarny do sekwencji adaptora (STu), w wyniku czego otrzymuje się fragmenty DNA zawierające wewnątrz „sekwencję markerową” identyfikującą daną grupę drobnoustrojów, przy czym „sekwencję markerową” wybiera się z grupy sekwencji wysoce zakonserwowanych dla badanej grupy drobnoustrojów.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że starter komplementarny do adaptora (STu) ma sekwencję 5' - GCATGGTAGACGAAG - 3'.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że adaptor składa się z oligonukleotydu ligowanego i oligonukleotydu pomocniczego, gdzie oba nukleotydy zawierają sekwencję stałą oraz sekwencję zmienną uzależnioną od zastosowanego enzymu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zewnętrzny enzym restrykcyjny (ERz) jest częściej tnący analizowane DNA oraz nie tnie DNA w obrębie „sekwencji markerowej” i pozostawia „lepkie końce” 5' lub 3' o znanej sekwencji, a wewnętrzny enzym restrykcyjny (ERw) jest rzadziej tnący analizowane DNA oraz tnie DNA w obrębie „sekwencji markerowej” i pozostawia „tępe końce” lub „lepkie końce” o sekwencji różnej od sekwencji „lepkich końców” pozostawionych przez zewnętrzny enzym (ERz),
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że część stała oligonukleotydu ligowanego w adaptorze ma sekwencję 5' - GCATGGTAGACGAAGCCGTGAGTAGCGACCGCAG - 3'.
6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że część stała oligonukleotydu pomocniczego w adaptorze ma sekwencję 5' - CTGCGGTCGCTACTCACG - 3'.
7. 7. Zestaw diagnostyczny do genetycznego różnicowania i identyfikacji bakterii z rodzaju Acinetobacter, znamienny tym, że zawiera dwa enzymy restrykcyjne, zewnętrzny enzym (ERz) MaeII oraz wewnętrzny enzym (ERw) Rsa I, adaptor zawierający na końcu 3' sekwencję komplementarną do „wiszącego końca” fragmentu restrykcyjnego pozostawionego przez zewnętrzny enzym (ERz) oraz dwa startery, gdzie jeden jest komplementarny do sekwencji markerowej genu recA (STs), a drugi starter jest komplementarny do sekwencji adaptora (STu).
8. 8. Zestaw według zastrz. 7, znamienny tym, że starter komplementarny do „sekwencji markerowej” (STs) ma sekwencję 5' - GCATGGTAGACGAAG - 3'.