PL231213B1

PL231213B1 - Pochodne kolchicyny, sposób ich wytwarzania i zastosowanie

Info

Publication number: PL231213B1
Application number: PL424865A
Authority: PL
Inventors: Adam Huczyński; Greta Klejborowska; Urszula Majcher; Joanna Wietrzyk; Ewa Maj
Original assignee: Univ Im Adama Mickiewicza W Poznaniu
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2019-02-28
Also published as: PL424865A1

Description

PL 231 213 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są potrójnie modyfikowane w pozycji C-4, C-7 i C-10 pochodne kolchicyny oraz sposób ich wytwarzania.

Chemiczna modyfikacja związków pochodzenia naturalnego, wykazujących aktywność biologiczną, jest obecnie jedną z najbardziej efektywnych metod poszukiwania nowych leków. Kolchicyna pseudoalkaloid izolowany głównie z Colchicum autumnale i Gloriosa superba jest dobrze znanym czynnikiem antymitotycznym oraz przeciwzapalnym. W testach in vivo wykazuje dobre właściwości cytostatyczne. Mechanizm działania cytostatycznego kolchicyny polega na wiązaniu się jej z tubuliną w kolchicynowym miejscu wiążącym tubuliny, czego skutkiem jest zablokowanie mitozy (podziału komórki). Powstawanie trwałego kompleksu kolchicyna - tubulina hamuje polimeryzację mikrotubul, co prowadzi do zablokowania tworzenia wrzeciona kariokinetycznego i zahamowania mitozy. Zastosowanie kliniczne kolchicyny w leczeniu nowotworów jest obecnie ograniczone ze względu na jej stosunkowo wysoką toksyczność i niską biodostępność.

W zgłoszeniu patentowym WO2011021397 ujawniono podwójnie modyfikowane pochodne kolchicyny podstawione atomami halogenu w pozycji C-4 oraz posiadające zmodyfikowaną grupę w pozycji C-7. Aktywność przeciwnowotworowa niektórych ujawnionych związków została sprawdzona wobec ludzkich nowotworowych linii komórkowych A549 (ludzki gruczolak płuc) oraz HT-29 (ludzki nowotwór jelita grubego). Związki modyfikowane w pozycji C-4 i C-7 ogólnie charakteryzowały się dobrą cytotoksycznością. W publikacji nie podano żadnych danych o działaniu badanych substancji na komórki zdrowe, zatem nie można określić współczynników selektywności badanych związków, które pozwalają przewidzieć czy dana substancja będzie w pierwszej kolejności działała na komórki nowotworowe czy na zdrowe komórki organizmu. Badania dotyczące pochodnych podstawionych atomem halogenu w pozycji C-4 prowadził również Yasobu i współpracownicy [Yasobu et al., ACS Medicinal Chemistry Letters, 2(5), 2011,348-352]. Z danych ujawnionych w publikacji wynika, że związki podstawione atomem halogenu w pozycji C-4 charakteryzowały się wyższą cytotoksycznością od niemodyfikowanej kolchicyny w stosunku do linii komórkowej A549 (ludzki gruczolak płuc) oraz porównywalną cytotoksyc znością jak niemodyfikowana kolchicyna w stosunku do linii komórkowych HT-29 (ludzki nowotwór jelita grubego) oraz HCT116 (ludzki rak okrężnicy). Informacje zawarte w tej publikacji ograniczają się do testów in vitro w stosunku do komórek nowotworowych, zatem nieznane jest działanie tych związków na zdrowe komórki ludzkie, czyli nieznane są współczynniki selektywności tych związków.

W zgłoszeniu patentowym CA2808277, co prawda ujawniono m.in. podwójnie modyfikowane pochodne kolchicyny podstawione grupą metylosulfidową w pozycji C-10 oraz różnorodnymi podstawnikami w pozycji C-7, jednak nie ma tam żadnych doniesień (w przeciwieństwie do innych związków ujawnionych w tym zgłoszeniu) dotyczących badań cytotoksyczności dlatego typu pochodnych.

Kerekes i współpracownicy opisali badania nad pochodnymi kolchicyny modyfikowanymi w pozycji C-7 i C-10 [P. Kerekes et al., J Med Chem, 1985, 28, 1204-1208]. Badania cytotoksyczności otrzymanych związków prowadzono in vivo na myszach z mysią nowotworową linią komórkową P388 (mysia białaczka). Dla przebadanych pochodnych określono toksyczność na poziomie związku wyjściowego. Pochodne z grupą karbaminianową w pozycji C-7 oraz grupą metylosulfidową w pozycji C-10 charakteryzowały się dobrym oddziaływaniem z tubuliną, ale słabą aktywnością w stosunku do linii komórkowej P388. Informacje zawarte w tej publikacji dotyczą wyłącznie badań in vivo wobec myszy z wszczepionymi mysimi komórkami nowotworowymi. Organizm myszy istotnie różni się od organizmu człowieka zatem nie można wyników uzyskanych dla komórek mysich bezpośrednio odnosić do komórek ludzkich, zatem nie można wnioskować o cytotoksyczności badanych pochodnych w stosunku do ludzkich nowotworowych linii komórkowych oraz zdrowych komórek organizmu.

Powszechnie wiadomo, że aktywność przeciwnowotworowa określonych farmakoforów jest specyficzna w stosunku do danej linii komórkowej. Dodatkowo żadna z otrzymanych do tej pory pochodnych kolchicyny nie znalazła zastosowania farmaceutycznego, a poszukiwania związku, który będzie charakteryzował się wysoką aktywnością przeciwnowotworową oraz dobrą selektywnością w stosunku do komórek nowotworowych wciąż trwają.

Celem wynalazku było wytworzenie nowych pochodnych kolchicyny modyfikowanych w pozycji C-4, C-7 i C-10 mogących znaleźć zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej w szczególności wobec nowotworów podobnych do ludzkich nowotworowych linii komórkowych A549, MCF-7, LoVo, LoVo/DX.

PL231 213 Β1

Przedmiotem wynalazku są /V-karbaminianowe pochodne /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny o wzorze ogólnym 1

gdzie:

- X oznacza Cl, Br lub I;

- Y oznacza grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 4 atomów węgla;

- R oznacza:

• grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha od 1 do 3 atomami halogenu, które mogą znajdować się zarówno przy tym samym jak i przy różnych atomach węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w pozycji terminalnej grupą hydroksylową, • grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe, • grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą grupę hydroksylową przy terminalnym atomie węgla oraz w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe.

W drugim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych /V-karbaminianów /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny o wzorze ogólnym 1, w którym X, R i Y mają wyżej podane znacznie w reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2,

(2) w którym X i Y mają wyżej podane znacznie w reakcji z alkoholem o wzorze ogólnym 3,

R-OH w którym R ma wyżej podane znacznie w obecności trifosgenu, jako aktywatora oraz aminy alifatycznej.

Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku apolarnym chloroalifatycznym, aromatycznym lub wtetrahydrofuranie, korzystnie w chloroformie, chlorku metylenu, toluenie, benzenie, tetrahydrofuranie. Korzystne jest prowadzenie reakcji w warunkach bezwodnych. Jako aminę alifatyczną stosuje się korzystnie tributyloaminę, tripropyloaminę, triizobutyloaminę, triizopropyloaminę, diizopropyloaminę, /V,/V-diizopropyloetyloaminę, trietyloaminę, najkorzystniej trietyloaminę. Aminy kompleksują powstający w wyniku rozpadu trifosgenu produkt uboczny - chlorowodór. Wiązanie chlorowodoru przez aminę zapobiega

PL231 213 Β1 zachodzeniu niepożądanych reakcji i zapobiega rozpadowi związku o wzorze 2. Z uwagi na właściwości trifosgenu i możliwość zachodzenia reakcji ubocznych, etap aktywacji polegający na dodaniu trifosgenu do mieszaniny związku o wzorze 2 i aminy alifatycznej rozpuszczonych w rozpuszczalniku apolarnym powinien być prowadzony w obniżonej temperaturze <5°C. Aktywacja związku o wzorze 2 w obniżonej temperaturze trwa na ogół od 10 do 30 minut. Po tym czasie zaprzestaje się chłodzenia, mieszaninę reakcyjną doprowadza się do temperatury pokojowej i dodaje się do niej odpowiedni alkohol o wzorze ogólnym 3, a następne miesza w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia reakcji, korzystnie stopień przereagowania kontroluje się za pomocą chromatografii TLC. Następnie w przypadkach, gdy wytrącił się osad chlorowodorku aminy alifatycznej oddziela się go od roztworu.

Jeżeli reakcja była prowadzona w innym rozpuszczalniku niż rozpuszczalnik chloroalifatyczny, rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszcza w rozpuszczalniku chloro alifatycznym, korzystnie w chlorku metylenu lub chloroformie po czym produkt ekstrahuje roztworem HCI(aq) (0,5 M), a następnie wodą. Warstwę organiczną odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się przy użyciu chromatografii kolumnowej, korzystnie przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę rozpuszczalników organicznych, korzystnie heksan:octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Wtrzecim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych /V-karbaminianów /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotio-kolchicyny o wzorze ogólnym 1, w którym X, R i Y mają wyżej podane znacznie w reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2.

(2) w którym X i Y mają wyżej podane znaczenia a odpowiednim chloromrówczanem o wzorze ogólnym 4,

O

gdzie R oznacza:

• grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha od 1 do 3 atomami halogenu, które mogą znajdować się zarówno przy tym samym jak i przy różnych atomach węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe, w obecności aminy alifatycznej.

Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku aprotycznym chloroalifatycznym, acetonitrylu lub tetrahydrofuranie, korzystnie chloroformie, chlorku metylenu, acetonitrylu lub tetrahydrofuranie. Korzystne jest prowadzenie reakcji w warunkach bezwodnych. Jako aminy stosuje się aminy alifatyczne, korzystnie tributyloaminę, tripropyloaminę, triizobutyloaminę, triizopropyloaminę, diizopropyloaminę, /V,/V-diizopropyloetyloaminę, trietyloaminę, najkorzystniej trietyloaminę.

PL231 213 Β1

Związek pośredni o wzorze ogólnym 2 można otrzymać ze związku o wzorze ogólnym 5

(5) w którym X i Y mają wyżej podane znaczenie, w wyniku jego deacetylacji pod wpływem roztworu kwasu nieorganicznego.

Reakcję deacetylacji związku o wzorze 5 prowadzi się w roztworze kwasu nieorganicznego korzystnie roztworze kwasu siarkowego (VI) o stężeniu 2 M - 5 M, kwasu solnego o stężeniu 2 M - 5 M, najkorzystniej kwasu solnego o stężeniu 2 M - 3 M. Reakcję można prowadzić w temperaturze pokojowej lub w podwyższonej temperaturze <100°C. Z uwagi na skrócenie czasu reakcji korzystne jest prowadzenie jej w podwyższonej temperaturze 70-90°C. Stopień przereagowania substratu kontroluje się za pomocą chromatografii TLC.

Związek pośredni o wzorze ogólnym 5 można otrzymać w reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6

(6) w reakcji z alkilotiolanem o wzorze ogólnym 7

NaSY w którym Y ma wyżej podane znaczenie.

Reakcję prowadzi się w mieszaninie wody i alkoholu (1/1, v/v), korzystnie metanolu, etanolu. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej.

Związek pośredni o wzorze ogólnym 5 można również otrzymać w reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 8

Y (8)

PL 231 213 B1 a:

- W-chlorosukcynoimidem (NCS) w celu podstawienia atomu chloru, lub

- W-bromosukcynoimidem (NBS) w celu podstawienia atomu bromu, lub

- W-jodosukcynoimidem (NIS) w celu podstawienia atomu jodu.

Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku protycznym tj. prostym kwasie karboksylowym, korzystnie kwasie mrówkowym lub kwasie octowym lub w rozpuszczalniku polarnym aprotycznym tj. prostym nitrylu, korzystnie acetonitrylu. Rekcję można prowadzić zarówno w temperaturze pokojowej, jak i w podwyższonej temperaturze (<100°C).

W czwartym aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnych kolchicyny według wynalazku do wytwarzania środków stosowanych w terapii przeciwnowotworowej.

Badania przeprowadzone in vitro wobec ludzkich linii komórek nowotworowych potwierdziły działanie cytotoksyczne, przewyższające aktywność związku wyjściowego - kolchicyny. W badaniach wykorzystano następujące linie komórkowe:

- A549 - ludzki gruczolak płuc,

- MCF-7 - ludzki gruczolak piersi,

- LoVo - ludzki gruczolak jelita grubego wrażliwy na doksorubicynę,

- LoVo/DX - ludzki gruczolak jelita grubego oporny na doksorubicynę.

W badaniach wykorzystano również normalne mysie fibroblasty BALB/3T3, w celu określenia współczynnika selektywności badanych związków, który pozwala przewidzieć czy dana substancja będzie w pierwszej kolejności działała na komórki nowotworowe czy na zdrowe komórki organizmu.

W tabeli 1 podano dane dotyczące stosowanych w badaniach linii komórkowych.

T a b e l a 1

Symbol linii komórkowej	Nazwa linii komórkowej	Źródło pochodzenia linii komórkowej
A549	ludzki gruczolak płuc	ECACC 86012804
MCF-7	ludzki gruczolak piersi	ECACC 86012803
LoVo	ludzki gruczolak jelita grubego wrażliwy na doksorubicynę	ATCC CCL-229
LoVo/DX	ludzki gruczolak jelita grubego oporny na doksorubicynę	Prof. E. Borowski, Politechnika Gdańska
BALB/3T3 clone A31	normalne mysie fibroblasty	ATCC CCL-163

W trakcie badań cytotoksyczności stosowano media hodowlane i odczynniki podane w tabeli 2.

PL231 213 Β1

Tabela 2

Nazwa	Producent
Medium hodowlane dla linii A-549	. OptiMEM+RPMI 1640 (1:1) (PChO, IITD PAN, Wrocław) . 5% FBS HyClonc (GE Hcalthcarc, USA), • 2 mM L-Glutamina (Sigma Aldrich, Niemcy) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Sigma Aldrich, Niemcy i Polfa Tarchomin, Polska)
Medium hodowlane dla linii MCF-7	• Eagle medium (PChO, IITD PAN, Wrocław) • 10% FBS (Sigma-Aldrich, Niemcy) • 2 mM L-Glutamina (Sigma-Aldrich, Niemcy) • 8 pg/mL insulina (Sigma-Aldrich, Niemcy) • 1 % aminokwasy (Sigma-Aldrich, Niemcy) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Sigma Aldrich, Niemcy i Polfa Tarchomin, Polska)
Medium hodowlane dla linii LoVo	. OptiMEM+RPMI 1640 (1:1) (PChO, IITD) . 5% FBS HyClone (GE Healthcare, USA), • 2 mM L-Glutamina (Sigma Aldrich, Niemcy) • 1 mM pirogronian sodu (Sigma Aldrich, Niemcy) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Sigma Aldrich, Niemcy i Polfa Tarchomin, Polska)
Medium hodowlane dla linii LoVoDX	Medium dla linii LoVo/DX jak dla LoVo oraz doksorubicyna (Accord Healthcare Ltd, UK) o stężeniu 10 pg/100 ml medium.
Medium hodowlane dla linii BALB3T3	• Dulbecco medium (Gibco, UK) . 10 % FB S HyClone (GE Healthcare, USA) • 2 mM L-Glutamina (Sigma Aldrich, Niemcy) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Sigma Aldrich, Niemcy i Polfa Tarchomin, Polska)
Medium hodowlane do rozcieńczeń związków	• OptiMEM+RPMI 1640 (1:1) (PChO, IITD PAN, Wrocław) • 5% FBS HyClone (GE Healthcare, USA), • 2mM L-Glutamina (Sigma Aldrich, Niemcy) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Sigma Aldrich, Niemcy i Polfa Tarchomin, Polska)
lOmM TRIS	1. Woda dejomzowana ogólnolaboratoryjna niejalowa 2. TRIZMA BASE (Sigma-Aldrich, Niemcy)
l%kwas octowy	1. Woda dejonizowana ogólnolaboratoryjna niejalowa 2. Kwas octowy 80% CZDA (POCH SA, Gliwice)
0,1 % roztwór sulforodaminy B(SRB)	1. Sulforhodamine B sodium salt (Sigma-Aldrich, Niemcy) 2. 1% kwas octowy
50% kwas trój chlorooctowy (TCA)	1. Woda dejonizowana ogólnolaboratoryjna niejalowa 2. Kwas trichlorooctowy CZDA (POCH SA, Gliwice)
Cisplatyna	Koncentrat do sporządzania roztworu do infuzji, 1 mg/ml (10 mg/10 ml); 1 fioł. 10 ml (Teva Pharmaceuticals Sp. z o.o., Warszawa, Polska)
Doksorubicyna	Koncentrat do sporządzania roztworu do infuzji; 2 mg/ml; 1 fioł. 10 ml (Accord Healthcare Ltd, UK)

Badania cytotoksyczności zostały przeprowadzone zgodnie z poniżej opisaną procedurą.

PL 231 213 B1

Roztwory wyjściowe (stock solutions) testowanych związków o stężeniu 10 mg/ml przygotowywano do każdego eksperymentu ex tempore, rozpuszczając 1 mg preparatu w 100 μΙ DMSO. Rozpuszczalnikiem dla dalszych rozcieńczeń było medium hodowlane. Związki przetestowano w przedziałach stężeń od 100 do 0,001 μg/ml.

Oznaczenie działania cytotoksycznego badanych związków oraz związków referencyjnych - powszechnie stosowanych chemioterapeutyków tj. doksorubicyny i cisplatyny wykonywano w 96-godzinnych hodowlach in vitro. Dla oznaczenia aktywności antyproliferacyjnej związków wobec wybranych linii komórkowych zastosowano test kolorymetryczny SRB wg P. Skehan et al., Journal of the National Cancer Institute, 1990, 82:1107-1112, mierzący zahamowanie proliferacji docelowych komórek na podstawie pomiaru ilości białka komórkowego. W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenia preparatu nanoszono na płytki 96-dołkowe w trzech powtórzeniach. Doświadczenia powtarzano minimum trzy razy.

a) Komórki (pochodzące z hodowli in vitro) nanoszono do dołków płytki w liczbie 1x10⁴w przypadku linii LoVo, LoVo/DX, MCF-7 oraz BALB3T3 lub 0,5 x 10⁴ dla linii A549 komórek w 100 μl medium hodowlanego danej linii komórkowej, a następnie inkubowano w 37°C, w wilgotnej atmosferze (60-90%) nasyconej 5% CO2.

b) Po 24 godzinach do dołków dodawano rozcieńczenia badanych związków w badanych stężeniach w objętości 100 μl medium hodowlanego do rozcieńczeń, a do dołków przeznaczonych na kontrolę wzrostu komórek nietraktowanych oraz dołków przeznaczonych na kontrolę medium bez komórek dodano 100 μl samego medium hodowlanego, stosowanego w przypadku związków do ich rozcieńczeń.

c) Płytki inkubowano przez kolejne 72 godziny w inkubatorze (37°C, w wilgotnej atmosferze (60-90%) nasyconej 5% CO2).

d) Po zakończeniu inkubacji komórek ze związkami wykonywano test SRB.

e) W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenia preparatu nanoszono w trzech powtórzeniach, po 4 stężenia dla danego związku. Kontrolę wzrostu komórek nietraktowanych prowadzono w 9 dołkach, a w kolejnych 3 dołkach stosowano tylko medium hodowlane bez komórek (kontrola tła). Doświadczenia powtarzano 3-5 razy.

Odczyt SRB:

Po upływie czasu inkubacji testu do każdego dołka dodano po 50 μl zimnego 50% kwasu trójchlorooctowego (TCA) i inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej, po czym płytki 4-krotnie przepłukano wodą, a następnie osuszono na ręcznikach papierowych. Następnie do każdego dołka dodano po 50 μl 0,1% roztworu sulforodaminy B (SRB) w 1% kwasie octowym w celu wybarwienia strąconego w dołku białka komórkowego. Po 30-minutowej inkubacji z SRB w temperaturze pokojowej płytki 4-krotnie płukano 1% kwasem octowym i ponownie osuszano na ręcznikach papierowych. W kolejnym etapie do każdego dołka dodano po 150 μl 10 mM buforu TRIS powodującego rozpuszczenie związanego z białkiem komórek barwnika. Gęstość optyczną poszczególnych próbek odczytywano przy długości fali 540 nm przy użyciu uniwersalnego czytnika płytkowego Synergy H4 firmy BioTek Instruments USA, Winooski VT, USA.

Na podstawie pomiaru absorbancji poszczególnych dołków wyliczano % zahamowania proliferacji dla każdego ze związków w danym stężeniu według wzoru:

% za.chamowan.ia proliferacji = ( ----p-\x 100 ) y A-m' J

- 100 gdzie,

Am - średnia wartość absorbancji medium kontrolnego

Ak - średnia wartość absorbancji kontroli komórek, tj. komórek nietraktowanych

At - średnia wartość absorbancji komórek potraktowanych badanymi związkami w danym stężeniu.

Przy obliczaniu średniej wartości absorbancji dla danego zestawu dołków, tzn. komórki nietraktowane, komórki traktowane danym związkiem o danym stężeniu, kontrola samego medium, odrzucano wartości odstające na podstawie współczynnika zmienności CV 10%. Z danych % zahamowania proliferacji wyznaczano parametr IC50 według metody opisanej w D. Nevozhay et al., Plos One 2014, 9:10. Następnie, z kolejnych 3-5 powtórzeń testu, wyliczano średnią wartość IC50 i odchylenie standardowe.

Dla wszystkich badanych pochodnych wyznaczono wskaźnik IC50, który oznacza stężenie związku potrzebne do zahamowania wzrostu komórek o 50%. Dla porównania analogiczne badania

PL231 213 Β1 przeprowadzono z użyciem znanych środków cytotoksycznych a mianowicie cisplatyny i doksorubicyny. Wyniki badań aktywności cytotoksycznej przedstawione w formie stężenia wyrażonego w μΜ dla wybranych związków przedstawione są w tabeli 3. Wszystkie otrzymane pochodne wykazują bardzo wysoką aktywnością cytotoksyczną, wyższą lub porównywalną do powszechnie stosowanych leków przeciwnowotworowych tj. doksorubicyny i cisplatyny. Dodatkowo większość otrzymanych pochodnych charakteryzuje się korzystnymi współczynnikami selektywności (Sf). S/ > 1,0 wskazuje, że związek wykazuje wyższą skuteczność oddziaływania na komórki nowotworowe niż toksyczność w stosunku do komórek zdrowych.

Tabela 3

Związek	A549	MCF-7	LoVo	LoVo/DX	BALB/3T3
	IC_M [μΜ]	SI	IC₃₀ [μΜ]	SI	ic₃₀ [μΜ]	SI	IC50 ΙμΜ]	SI	RI	ic₃₀ [μΜ]
Kolchicyna	0,125	1,1	0,054	2,6	0,108	1,3	1,69	0,1	15,7	0,139
11	0,081	1.7	0,040	3,5	0,081	1,7	0,847	0,2	10,5	0,141
12	0,009	10,4	0,019	5,0	0,007	13,4	0,056	1,7	8,0	0,094
13	0,020	6,1	0,040	3,0	0,020	6,1	0,081	1,5	4,1	0,121
14	0,059	2,0	0,098	1,2	0,020	5,9	0,079	1,5	4,0	0,118
15	0,074	1,4	0,057		0,074	1,4	1,010	0,1	13,7	0,104
16	0,030	4,6	0,055	2,5	0,018	7,7	0,074	1,9	4,1	0,138
17	0,089	1,9	0,132	1,3	0,054	3,2	0,089	1,9	1,7	0,173
18	0,093	2,1	0,125	1,1	0,281	0,5	4,240	<0,1	15,1	0,135
19	0,099	1,1	0,136	0,8	0,048	2,2	4,510	<0,1	94,0	0,106
20	0,089	1,4	0,114	1,1	0,051	2,4	0,239	0,5	4,7	0,122
21	0,109	1,1	0,125	1,0	0,064	1,9	0,413	0,3	6,5	0,124
22	0,101	1,1	0,108	1,1	0,065	1,7	0,680	0,2	10,5	0,113
Doksorubicyna	0,258	0,6	0,386	0,4	0,092	1,8	4,75	<0,1	51,6	0,166
Cisplatyna	6,367	0,6	10,70	0,4	4,37	0,9	5,70	0,7	1,3	3,90

Wartość IC₅₀ - stężenie związku, które odpowiada 50% hamowaniu wzrostu komórek nowotworowych;

Indeks Rl (Resistance lndex): RI=IC₅₀ LoVo/DX/IC₅₀ LoVo;

Indeks SI (Selectivity lndex) = IC₅₀ dla normalnej linii komórkowej (BALB/3T3)/IC₅₀ dla poszczególnych linii komórek nowotworowych.

PL231 213 Β1

Wynalazek ilustrują przykłady

Przykład 1

Otrzymywanie 4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 9

Metoda 1

Do roztworu 4-chlorokolchicyny (500 mg, 1,15 mmol) w mieszaninie metanol / woda (1/1, v/v, 5 ml) dodano metanotiolan sodu (roztwór wodny 21%, 0,77 ml, 2,30 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 72 h. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę destylowaną (150 ml). Całość ekstrahowano czterokrotnie CH2CI2. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad MgSCM, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę octan etylu:metanol przy wzrastającym gradiencie stężeń metanolu od 0 do 50%.

Otrzymano 4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicynę z wydajnością 73%.

Metoda 2

Do roztworu 10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny (500 mg, 1,20 mmol) w acetonitrylu dodano NCS (169 mg, 1,27 mmol) i mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu przez 72 h. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano wodny nasycony roztwór Na2S2C>3 (100 ml). Całość ekstrahowano czterokrotnie CH2CI2. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad MgSCM, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę octan etylu:metanol przy wzrastającym gradiencie stężeń metanolu od 0 do 50%.

Otrzymano 4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicynę z wydajnością 70%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 450, [M+Na]⁺ 472, [2M+H]⁺ 889, [2M+Na]⁺ 921.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 170,1, 159,1, 151,3, 150,2, 149,7, 146,6, 137,3, 134,81,

131,7, 129,9, 128,1, 126,4, 122,1,61,6, 61,5,61,1, 52,2, 34,5, 25,9, 22,8, 15,1.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,98 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 7,44 (s, 1H), 7,29-7,24 (m, 1H), 7,08 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,58 (dt, J = 13,1,6,7 Hz, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,96 (s, 3H), 3,61 (d, J = 6,1 Hz, 3H), 3,24 (dd, J= 13,5, 4,8 Hz, 1H), 2,44 (s, 3H), 2,27 (ddd, J= 18,0, 12,1,6,0 Hz, 1H), 2,20-2,09 (m, 1H), 2,00 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 1,92-1,80 (m, 1H).

Przykład 2

Otrzymywanie /V-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 10

4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicynę (500 mg, 1,11 mmol) rozpuszczono w niewielkiej ilości metanolu (3 ml) i dodano 2 M roztwór kwasu solnego (5 ml), a następnie ogrzewano w temperaturze 90°C przez 96 h. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano wodny nasycony roztwór NaHCOs w celu zobojętnienia. Całość ekstrahowano czterokrotnie CH2CI2. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad MgSCM, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę heksan:octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 50 do 100%.

PL231 213 Β1

Otrzymano /V-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicynę z wydajnością 58%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 408, [M+Na]⁺ 430, [2M+H]⁺ 815, [2M+Na]⁺ 837.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 158,7, 153,1, 150,1, 149,2, 146,2, 137,0, 134,0, 132,6,

129,8, 129,2, 125,5, 121,8, 61,3, 61,1,53,5, 38,3,26,5, 15,1.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,59 (s, 1H), 7,13 (dd, J= 10,1,4,8 Hz, 1H), 7,03 (d, J= 10,2, 5,1 Hz, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,96 (s, 3H), 3,67-3,60 (m, 4H), 3,22-3,16 (m, 1H), 2,44 (s, 3H), 2,29 (ddd, J= 17,8, 12,0, 5,9 Hz, 1H), 2,22-2,12 (m, 1H), 1,69-1,51 (m, 1H).

Przykład 3

Otrzymywanie 2-hydroksyetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 11.

(H)

Do roztworu /V-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny (100 mg, 0,25 mmol) w tetrahydrofuranie (5 ml) ochłodzonego do temperatury 0°C dodano trietyloaminę (1 ml) oraz trifosgen (77 mg, 0,26 mmol) i mieszano początkowo przez 20 minut w temperaturze 0°C, a następnie zaprzestano chłodzenia i przez kolejne 20 minut mieszano doprowadzając do temperatury pokojowej. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano glikol etylenowy (0,5 ml) i dalej mieszano w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia reakcji, kontrolowanej za pomocą chromatografii TLC. Następnie odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i ekstrahowano roztworem HCI(aq) (0,5 M), a następnie wodą. Warstwę organiczną odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę heksan:octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano 2-hydroksyetylo-/V-karbaminian-/V-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 45%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 496, [M+Na]⁺ 518, [M+K]⁺ 534, [2M+Na]⁺ 1013.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,5, 159,2, 155,9, 150,7, 150,2, 149,7, 146,6, 137,0, 134,8,

131,8, 129,8, 128,5, 126,3, 122,2, 66,9, 61,5, 61,4, 61,1,61,1,53,8, 35,0, 25,9, 15,1.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,43 (s, 1H), 7,27-7,23 (m, 1H), 7,09 (d, J= 10,5 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,34 (dt, J = 13,4, 6,8 Hz, 1H), 4,09 (dddd, J = 15,6, 11,7, 8,6, 4,5 Hz, 2H), 3,99 (s, 3H), 3,98 (s, 3H), 3,69 (t, J = 4,2, 2H), 3,60 (s, 3H), 3,26 (dd, J = 13,5, 4,8 Hz, 1H), 2,45 (s, 3H), 2,35-1,80 (m, 4H).

Przykład 4

Otrzymywanie 2,2,2-trifluoroetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 12

Postępowano jak w przykładzie 3 przy czym zamiast glikolu etylenowego do mieszaniny reakcyjnej dodano 2,2,2-trifluoroetanol (0,5 ml). Po zakończeniu reakcji odsączono wytrącony chlorowodorek

PL 231 213 Β1 trietyloaminy, przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i postępowano dalej jak w przykładzie 3.

Otrzymano 2,2,2-trifluoroetylo-/\/-karbaminian-/\/-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 51%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 534, [M+Na]⁺ 556, [M+K]⁺ 572, [2M+Na]⁺ 1089.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 159,5, 153,6, 150,3, 149,7, 146,7, 136,5, 134,8, 131,7,

129,8, 128,6, 126,1, 124,2, 122,3, 121,4, 61,5, 61,3, 61,1, 61,1, 60,7, 54,1, 35,1, 25,9, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,44 (s, 1H), 7,27-7,23 (m, 1H), 7,09 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 6,55 (s, 1H), 4,53-4,32 (m, 2H), 4,07 (dq, J = 12,0, 8,1 Hz, 1H), 3,99 (s, 3H), 3,98 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,29 (dd, J= 13,7, 5,0 Hz, 1H), 2,45 (s, 3H), 2,39-1,73 (m, 3H).

Przykład 5

Otrzymywanie izopropylo-/V-karbaminianu-/\/-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 13

(13)

Postępowano jak w przykładzie 4 przy czym zamiast 2,2,2-trifluoroetanolu do mieszaniny reakcyjnej dodano izopropanol (0,5 ml).

Otrzymano izopropylo-/V-karbaminian-/\/-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicynę z wydajnością 30%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 494, [M+Na]⁺ 516, [2M+H]⁺ 987.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 159,2, 155,0, 150,2, 149,9, 149,8, 146,7, 136,5, 134,5, 131,7, 129,9, 128,5, 125,8, 122,1, 68,7, 61,5, 61,1, 53,4, 35,5, 30,9, 25,9, 22,1, 22,1, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,30 (s, 1H), 7,21 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 7,03 (d, J= 10,5, 1H), 5,20 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,77 (td, J = 12,3, 6,1 Hz, 1H), 4,33 (dt, J = 13,4, 6,8 Hz, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,97 (s, 3H), 3,61 (s, 3H), 3,29-3,21 (m, 1H), 2,44 (d, J = 2,8 Hz, 3H), 2,30-1,65 (m, 3H), 1,18 (dd, J = 8,6, 6,3 Hz, 6H).

Przykład 6

Otrzymywanie cyny o wzorze 14 butyl o-/\/-karbaminianu-/\/-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchi-

(14)

Postępowano jak w przykładzie 4 przy czym zamiast 2,2,2-trifluoroetanolu do mieszaniny reakcyjnej dodano butanol (0,5 ml).

Otrzymano butylo-/V-karbaminian-/\/-deacetylo-4-chloro-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 38%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 508, [M+Na]⁺ 530, [2M+H]⁺ 1115, [2M+Na]⁺ 1037.

PL231 213 Β1 ¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,3, 159,2, 155,6, 150,1, 150,0, 149,7, 146,7, 136,5, 134,49, 131,7, 129,9, 128,6, 125,8, 122,1,65,1,61,5, 61,4, 61,1,53,5, 35,4, 30,9, 30,8, 25,9, 19,0, 15,1, 13,6.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,33 (s, 1H), 7,22 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 5,46 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,34 (dt, J = 13,2, 6,7 Hz, 1H), 3,99 (s, 3H), 3,97 (s, 3H), 3,62 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 3,31-3,22 (m, 1H), 2,44 (d, J = 2,7 Hz, 3H), 2,32-2,12 (m, 3H), 1,82-1,69 (m, 2H), 1,59-1,48 (m, 2H), 1,31 (tt, J = 15,0, 7,7 Hz, 2H), 0,89 (t, J = 7,4 Hz, 3H).

Przykład 7

Otrzymywanie 2-hydroksyetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 15

Do roztworu /V-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny (100 mg, 0,22 mmol) w tetrahydrofuranie (5 ml) ochłodzonego do temperatury 0°C dodano trietyloaminę (1 ml) oraz trifosgen (69 mg, 0,23 mmol) i mieszano początkowo przez 20 minut w temperaturze 0°C, a następnie zaprzestano chłodzenia i przez kolejne 20 minut mieszano doprowadzając do temperatury pokojowej. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano glikol etylenowy (0,5 ml) i dalej mieszano w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia reakcji, kontrolowanej za pomocą chromatografii TLC. Następnie odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i ekstrahowano roztworem HCI(aq) (0,5 M), a następnie wodą. Warstwę organiczną odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę heksan:octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano 2-hydroksyetylo-/V-karbaminian-/V-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 50%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 540, [M+Na]⁺ 563, [2M+H]⁺ 1101.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,3, 159,2, 156,0, 151,2, 150,6, 150,3, 146,5, 137,0, 134,7,

133,5, 130,0, 128,5, 126,2, 113,5,66,9,61,4,61,4,61,1,61,0,53,7,34,9,29,0, 15,1.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,43 (s, 1H), 7,23 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 7,07 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,35-4,27 (m, 1H), 4,10-4,01 (m, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 3,68-3,63 (m, 2H), 3,59 (s, 3H), 3,29-3,22 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,34-2,15 (m, 3H), 1,83 (dd, J= 10,4, 6,1 Hz, 1H).

Przykład 8

Otrzymywanie 2,2,2-trifluoroetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 16

(16)

PL231 213 Β1

Postępowano jak w przykładzie 7 przy czym zamiast glikolu etylenowego do mieszaniny reakcyjnej dodano 2,2,2-trifluoroetanol (0,5 ml). Po zakończeniu prowadzenia reakcji odsączono wytrącony chlorowodorek trietyloaminy, przesącz odparowano i postępowano dalej jak w przykładzie 7.

Otrzymano 2,2,2-trifluoroetylo-/\/-karbaminian-/\/-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 30%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 578, [M+Na]⁺ 600, [2M+H]⁺ 1155, [2M+Na]⁺ 1177.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,3, 159,6, 153,5, 151,3, 150,4, 149,4, 146,7, 136,5, 134,8,

133,3, 129,9, 128,4, 126,0, 124,2, 121,4, 113,6, 61,5, 61,2, 61,1, 61,0, 60,8, 54,0, 35,1, 28,9, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,37 (s, 1H), 7,22 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,48 (dq, J = 12,6, 8,5 Hz, 1H), 4,37-4,29 (m, 1H), 4,17-4,07 (m, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,29 (dd, J = 13,2, 4,3 Hz, 1H), 2,44 (s, 3H), 2,36-2,23 (m, 2H), 1,82 (dt, J= 11,0, 4,7 Hz, 1H).

Przykład 9

Otrzymywanie izopropylo-/\/-karbaminianu-/\/-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 17

(17)

Postępowano jak w przykładzie 8 przy czym zamiast 2,2,2-trifluoroetanolu do mieszaniny reakcyjnej dodano izopropanol (0,5 ml).

Otrzymano izopropylo-/V-karbaminian-/\/-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 32%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 560, [2M+H]⁺ 1097.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 159,2, 155,0, 151,1, 150,4, 149,9, 146,6, 136,6, 134,5,

133,4, 130,1, 128,5, 125,8, 113,5, 68,7, 61,5, 61,4, 61,0, 53,3, 35,4, 29,0, 22,1,22,1, 15,1.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,29 (s, 1H), 7,19 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 4,77 (dp, J = 12,5, 6,2 Hz, 1H), 4,35-4,26 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 3,60 (s, 3H), 3,29-3,23 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,25 (dd, J = 7,3, 3,9 Hz, 2H), 1,64 (dd, J = 11,5, 5,6 Hz, 1H), 1,17 (dd, J = 8,9, 6,3 Hz, 6H).

Przykład 10

Otrzymywanie 2-(2-hydroksoetoksy)etylo-/\/-karbaminianu-/\/-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 18

Postępowano jak w przykładzie 7 przy czym zamiast glikolu etylenowego do mieszaniny reakcyjnej dodano glikol dietylenowy (0,5 ml).

Otrzymano 2-(2-hydroksoetoksy)etylo-/V-karbaminian-/\/-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 38%.

PL231 213 Β1

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 584, [M+Na]⁺ 606, [2M+Na]⁺ 1189.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 159,3, 155,4, 151,2, 150,4, 150,2, 146,6, 136,8, 134,7,

133,4, 130,0, 128,3, 126,1, 113,5, 72,4, 69,1,64,2, 61,5, 61,4, 61,0, 53,7, 34,9, 28,9, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,36 (s, 1H), 7,22 (d, J= 10,3 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,35-4,20 (m, 2H), 4,13-4,06 (m, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,96 (s, 3H), 3,79-3,70 (m, 2H), 3,64 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 3,60 (s, 3H), 3,57 (dd, J = 5,3, 4,4 Hz, 2H), 3,27 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 2,44 (s, 3H), 2,27 (dd, J = 6,6, 3,5 Hz, 2H), 1,80-1,71 (m, 2H).

Przykład 11

Otrzymywanie 2-hydroksyetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 19

Do roztworu /V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny (100 mg, 0,20 mmol) w tetrahydrofuranie (5 ml) ochłodzonego do temperatury 0°C dodano trietyloaminę (1 ml) oraz trifosgen (62 mg, 0,21 mmol) i mieszano początkowo przez 20 minut w temperaturze 0°C, a następnie zaprzestano chłodzenia i przez kolejne 20 minut mieszano doprowadzając do temperatury pokojowej. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano glikol etylenowy (0,5 ml) i dalej mieszano w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia reakcji kontrolowanej za pomocą chromatografii TLC. Następnie odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu i ekstrahowano roztworem HCI(aq) (0,5 M), a następnie wodą. Warstwę organiczną odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną S1O2 oraz mieszaninę heksan:octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano 2-hydroksyetylo-/V-karbaminian-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 36%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 588, [M+Na]⁺ 610, [2M+H]⁺ 1175, [2M+Na]⁺ 1197.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 159,2, 155,9, 153,5, 151,4, 150,4, 145,5, 137,3, 136,8,

134,6, 129,5, 128,5, 126,2, 92,2, 66,9, 61,4, 61,3, 61,2, 60,8, 53,7, 34,9, 34,5, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,36 (s, 1H), 7,16 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,32 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 4,27-4,19 (m, 1H), 4,00 (dd, J = 7,7, 3,8 Hz, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 3,63-3,58 (m, 2H), 3,53 (s, 3H), 3,12 (dd, J= 13,7, 4,8 Hz, 1H), 2,42-2,32 (m, 4H), 2,28-2,18 (m, 1H), 2,11 (s, 1H), 1,77-1,66 (m, 1H).

Przykład 12

Otrzymywanie 2,2,2-trifluoroetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylo-

(20)

PL231 213 Β1

Postępowano jak w przykładzie 11 przy czym zamiast glikolu etylenowego do mieszaniny reakcyjnej dodano 2,2,2-trifluoroetanol (0,5 ml). Po zakończeniu prowadzenia reakcji odsączono wytrącony chlorowodorek trietyloaminy, przesącz odparowano i postępowano dalej jak w przykładzie 11.

Otrzymano 2,2,2-trifluoroctylo-/V-karbaminian-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 27%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 626, [M+Na]⁺ 648.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,3, 159,5, 153,6, 153,6, 151,4, 149,4, 145,6, 136,9, 136,6,

134,6, 129,5, 128,4, 126,0, 124,2, 121,4, 92,2, 61,4, 61,2, 61,2, 60,8, 53,9, 35,0, 34,4, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,36 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,06 (d, J= 10,4 Hz, 1H), 6,27-6,06 (m, 1H), 4,49 (ddd, J= 16,9, 12,6, 8,5 Hz, 1H), 4,31 (dt, J= 11,8, 6,8 Hz, 1H), 4,194,09 (m, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,96 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,21 (dd, J= 13,8, 4,8 Hz, 1H), 2,51-2,27 (m, 5H), 1,85-1,62 (m, 1H).

Przykład 13

Otrzymywanie izopropylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny o wzorze 21

Postępowano jak w przykładzie 12 przy czym zamiast 2,2,2-trifluoroetanolu do mieszaniny reakcyjnej dodano izopropanol (0,5 ml).

Otrzymano izopropylo-/V-karbaminian-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 33%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 586, [M+Na]⁺ 608.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,4, 159,2, 155,0, 153,4, 151,4, 149,9, 145,6, 136,9, 136,7, 134,3, 129,6, 128,4, 125,8, 92,1,68,7, 61,4, 61,3,60,8, 53,3, 35,3, 34,5, 22,1,22,1, 15,2.

¹H NMR (403 MHz, CDCIs) δ 7,29 (s, 1H), 7,18 (d, J= 10,3 Hz, 1H), 7,04-7,00 (m, 1H), 5,15 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 4,77 (dt, J= 12,5, 6,2 Hz, 1H), 4,34-4,23 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,60 (s, 3H), 3,20-3,13 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,40-1,56 (m, 3H), 1,18 (dd, J = 9,1,6,3 Hz, 6H).

Przykład 14

Otrzymywanie 2-etoksyetylo-/V-karbaminianu-/V-deacetylo-4-jodo-10-demetoksy-10-metylotikolchicyny o wzorze 22

Postępowano jak w przykładzie, 11 przy czym zamiast glikolu etylenowego do mieszaniny reakcyjnej dodano 2-etoksyetanol (0,5 ml).

Otrzymano 2-etoksyetylo-/V-karbaminian-/V-deacetylo-4-bromo-10-demetoksy-10-metylotiokolchicyny z wydajnością 29%.

ESI-MS (m/z): [M+H]⁺ 616, [M+Na]⁺ 638.

¹³C NMR (101 MHz, CDCIs) δ 182,3, 159,3, 155,2, 153,5, 151,4, 149,6, 145,6, 136,8, 136,7,

134,4, 129,6, 128,5, 125,7, 92,1,68,5, 66,6, 64,5, 61,4, 60,8, 53,4, 35,2, 34,4, 30,9, 15,2, 15,0.

PL231 213 Β1 ¹Η NMR (403 ΜΗζ, CDCIs) δ 7,30 (s, 1Η), 7,18 (d, J= 10,3 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 5,39-5,33 (m, 1H), 4,32-4,24 (m, 1H), 4,14 (tdd, J = 11,7, 8,1, 3,6 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 3,60 (d, J = 2,8 Hz, 6H), 3,59-3,48 (m, 4H), 3,18 (dd, J= 13,8, 4,7 Hz, 2H), 2,47-2,42 (m, 3H), 2,33-2,19 (m, 2H), 1,37-1,11 (m, 3H).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. /V-karbaminianowe pochodne /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny o wzorze ogólnym 1 gdzie:

- X oznacza Cl, Br lub I;

- R oznacza:

• grupę alkilową prostą lub rozgałęziającą zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha od 1 do 3 atomami halogenu, które mogą znajdować się zarówno przy tym samym jak i przy różnych atomach węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w pozycji terminalnej grupą hydroksylową, • grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe, • grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą grupę hydroksylową przy terminalnym atomie węgla oraz w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe.

(2) w którym X i Y mają wyżej podane znaczenia a odpowiednim chloromrówczanem o wzorze ogólnym 4, gdzie R oznacza:

2. Sposób otrzymywania nowych /V-karbaminianów /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny o wzorze ogólnym 1, w którym X, R i Y mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2, w którym X i Y mają wyżej podane znacznie z alkoholem o wzorze ogólnym 3,

R-OH (3) (2)

PL231 213 Β1 w którym R ma wyżej podane znacznie w obecności trifosgenu, jako aktywatora oraz aminy alifatycznej.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w rozpuszczalniku apolarnym chloroalifatycznym, aromatycznym lub w tetrahydrofuranie.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w chloroformie, chlorku metylenu, toluenie, benzenie, tetrahydrofuranie.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w obecności tributyloaminy lub tripropyloaminy lub triizobutyloaminy lub triizopropyloaminy lub diizopropyloaminy lub Λ/,Λ/-diizopropyloetyloaminy lub trietyloaminy, najkorzystniej w obecności trietyloaminy.

6. Sposób otrzymywania /V-karbaminianów /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy —10-alkilotio-kolchicyny o wzorze ogólnym 1, w którym X, R i Y mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w rozpuszczalniku aprotycznym chloroalifatycznym, acetonitrylu lub tetrahydrofuranie.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w chloroformie, chlorku metylenu, acetonitrylu lub tetrahydrofuranie.

9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w obecności tributyloaminy lub tripropyloaminy lub triizobutyloaminy lub triizopropyloaminy lub diizopropyloaminy lub Λ/,Λ/-diizopropyloetyloaminy lub trietyloaminy, najkorzystniej w obecności trietyloaminy.

10. Zastosowanie /V-karbaminianowych pochodnych /V-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny o wzorze ogólnym 1

PL231 213 Β1 gdzie:

- X oznacza Cl, Br lub I;

- R oznacza:

• grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha od 1 do 3 atomami halogenu, które mogą znajdować się zarówno przy tym samym jak i przy różnych atomach węgla, • grupę alkilową prostą zawierającą od 1 do 5 atomów węgla podstawioną w pozycji terminalnej grupą hydroksylową, • grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe, •grupę alkilową prostą zawierającą od 2 do 10 atomów węgla zawierającą grupę hydroksylową przy terminalnym atomie węgla oraz w dowolnej pozycji łańcucha wiązania eterowe, do przygotowania preparatów leczniczych stosowanych w terapii przeciwnowotworowej.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że /V-karbaminianowe pochodne N-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny są użyte do sporządzania leków przydatnych w chemioterapii ludzkiego gruczolaka płuc.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że /V-karbaminianowe pochodne N-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny są użyte do sporządzania leków przydatnych w chemioterapii ludzkiego gruczolaka piersi.

13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że /V-karbaminianowe pochodne N-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny są użyte do sporządzania leków przydatnych w chemioterapii ludzkiego gruczolaka jelita grubego.

14. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że /V-karbaminianowe pochodne N-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny są użyte do sporządzania leków przydatnych w chemioterapii ludzkiego gruczolaka jelita grubego wrażliwego na doksorubicynę.

15. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że /V-karbaminianowe pochodne N-deacetylo-4-(bromo/chloro/jodo)-10-demetoksy-10-alkilotiokolchicyny są użyte do sporządzania leków przydatnych w chemioterapii ludzkiego gruczolaka jelita grubego opornego na doksorubicynę.