PL231079B1 - Kompleksy wanadu z hydrazydohydrazonami, preparaty farmaceutyczne oraz zastosowanie kompleksów wanadu z hydrazydohydrazonami - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe kompleksy wanadu, preparaty farmaceutyczne z tymi kompleksami oraz zastosowanie kompleksów oraz ich kompozycji z innymi substancjami w zapobieganiu i leczeniu różnych zaburzeń i chorób z grupy zaburzeń metabolicznych i/lub związanych z aktywnością różnych fosfataz.

Zaburzenia metaboliczne są schorzeniami o różnorakiej etiologii, z których cukrzyca jest najważniejsza z punktu widzenia epidemiologii. Spowodowana może być zaburzeniami syntezy i wydzielania insuliny i/lub obniżeniem wrażliwości tkanek na działanie insuliny. Prowadzi to do zaburzeń metabolizmu węglowodanów, lipidów i białek, a w konsekwencji do wielu poważnych chorób i powikłań (np. otyłości, miażdżycy, retinopatii, nefropatii, stopy cukrzycowej) obniżających jakość życia oraz będących częstą przyczyną zgonów.

Cukrzycę leczy się przez modyfikację stylu życia oraz odpowiednią farmakoterapię. Stosuje się leki wpływające na dwie główne przyczyny cukrzycy: zaburzenia wydzielania i działania insuliny na tkanki (np. pochodne tiazolinodionu, sulfonylomocznika). Dodatkowo stosuje się leki zmniejszające wchłanianie glukozy z przewodu pokarmowego (np. akarboza).

Stosowane środki farmakologiczne obarczone są wieloma niedogodnościami, z których wynika konieczność dalszych poszukiwań leków o mniejszych działaniach niepożądanych, a większej skuteczności. Obejmuje to poszukiwanie leków wykorzystujących niedawno poznane mechanizmy działania przeciwcukrzycowego, np. polegające na hamowaniu aktywności fosfataz tyrozynowych.

Fosfatazy są liczną grupą enzymów, które hydrolizują monoestry kwasu fosforowego do grupy fosforanowej i cząsteczki z wolną grupą hydroksylową. Poprzez usuwanie grupy fosforanowej, fosfatazy białkowe zdolne są do modulowania aktywności licznych białek komórkowych, co stanowi jeden z podstawowych mechanizmów regulacyjnych komórek. W organizmie stanowią grupę kilkuset enzymów wpływających na regulację licznych szlaków przekazywania sygnałów, które warunkują przebieg podstawowych funkcji komórek, jak np. metabolizm, zdolność podziałów, śmierć komórek.

Aktywność fosfataz białkowych ma istotne znaczenie w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu, a w świetle licznych badań regulacja ich aktywności może mieć istotne znaczenie terapeutyczne mi.in. w zaburzeniach metabolizmu glukozy, chorobach nowotworowych, chorobach zapalnych i autoimmunologicznych, chorobach układu nerwowego (w tym neurodegeneracyjnych, zaburzeniach pamięci, różnych zaburzeniach psychicznych), chorobach układu kostnego, chorobach infekcyjnych. Udział fosfataz białkowych w regulacji licznych funkcji i układów organizmu nie ogranicza ich potencjalnego zastosowania w terapii do wymienionych w tym miejscu chorób (Xu Y., Fisher G.J., J. Cell. Commun. Signal., 6 (2012) 125; Braithwaite S.P., Voronkov M., Stock J.B., Mouradian M.M., Neurochem. Int., 61 (2012) 899; Braithwaite S.P., Stock J.B., Lombroso P.J., Nairn A.C., Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 106 (212) 343; Sun H., Wang Y., Physiology (Bethesda), 27 (2012) 43; Pagano M.A., Tibaldi E., Gringeri E., Brunati A.M., IUBMB Life, 64 (2012) 27; Blunt M.D., Ward S.G., Curr. Opin. Pharmacol., 12 (2012) 444.)

Od wielu lat prowadzone są intensywne prace nad biologiczną aktywnością związków wanadu. Badania prowadzone są z wykorzystaniem modeli komórkowych i zwierzęcych. Niektóre związki były również badane klinicznie. Badania te wykazały wyraźny wpływ związków wanadu na różne mechanizmy regulacyjne komórek, w tym mechanizmy związane z działaniem insuliny oraz z inhibitowaniem fosfataz białkowych.

W badaniach na komórkach wykazano, że wanad reguluje syntezę lipidów i glikogenu, hamuje lipolizę i glukoneogenezę oraz zwiększa transport glukozy do komórek. Badania te dowiodły, że związki wanadu mogą wpływać na metabolizm komórek, co może być podstawą do zastosowania tych związków w leczeniu chorób metabolicznych (Adachi Y., Sakurai H, Chem. Pharm. Bull., 52 (2004) 428; Crans D.C., Yang L., Alfano J. A., Chi L.H., Jin W., Mahroof-Tahir M., Robbins K., Toloue M.M., Chan L.K., Plante A.J., Grayson R.Z., Willsky G.R., Coord. Chem. Rev., 237 (2003) 13; Hamrin K., Henriksson J., Life Sci., 76 (2005) 2329; Katoh A., Matsumura Y., Yoshikawa Y., Yasui H, Sakurai H, J. Inorg. Biochem., 103 (2009) 567; Sakurai EL, Watanabe H, Tamura H, Yasui EL, Matsushita R., Takada J., Inorg. Chim. Acta, 283 (1998) 175; Thompson K.H., Orvig C., J. Inorg. Biochem., 100 (2006) 1925; US4882171, US5266565, US5278154, US5338759, US6414029).

Badania przeprowadzone na zwierzętach z cukrzycą potwierdziły efektywność terapeutyczną związków wanadu przede wszystkim poprzez obniżenie stężenia glukozy we krwi. Dodatkowo wykazano, że efekty te związane są między innymi z hamowaniem aktywności fosfataz tyrozynowych (Crans D.C., Yang L., Alfano J. A., Chi L.H., Jin W., Mahroof-Tahir M., Robbins K., Toloue M.M., Chan L.K.,

PL 231 079 B1

Plante A.J., Grayson R.Z., Willsky G.R., Coord. Chem. Rev., 237 (2003) 13.; Gao L., Niu Y., Liu W., Xie M., Liu X., Chen Z., Li L., Clin. Chim. Acta 388 (2008) 89; Hamrin K., Henriksson J., Life Sci., 76 (2005) 2329; Islam M.N., Kumbhar A.A., Kumbhar A.S., Zeller M., Butcher R.J., Dusane M.B., Joshi B.N., Inorg Chem. 49 (2010) 8237; Nilsson J., Degerman E., Haukka M., Lisensky G.C., Garribba E., Yoshikawa Y., Sakurai H., Enyedy E.A., Kiss T., Esbak H., Rehder D., Nordlander E., J. Chem. Soc., Dalton Trans. (38) (2009) 7902; Sakurai H., Katoh A., Yoshikawa Y., Bull. Chem. Soc. Jpn., 79 (2006) 1645; Thompson K.H., Orvig C., Coord. Chem. Rev., 219-221 (2001) 1033; US4882171, US5266565, US5278154, US6414029).

Efekt przeciwcukrzycowego działania kompleksów wanadu, maltolanu i etylomaltolanu wanadylu, potwierdzony został u ludzi w badaniach klinicznych (Hamrin K., Henriksson J., Life Sci., 76 (2005) 2329.; Sakurai H., Katoh A., Yoshikawa Y., Bull. Chem. Soc. Jpn., 79 (2006) 1645; Scior T., GuevaraGarciaA., BernardP., DoQ., Domeyer D., Laufer S., Mini-Rev.Med. Chem., 5 (2005) 995; Vardatsikos G., Mehdi M.Z., Srivastava A.K., Int. J. Mol. Med., 24 (2009) 303.

W badaniach stosowano związki wanadu na III, IV i V stopniu utlenienia, zarówno proste sole nieorganiczne (np. VOSO4, VOCI2, NaVO3), jak również związki kompleksowe z ligandami organicznymi oraz perokso kompleksy wanadu(V). Stosowano ligandy dwuwiążące typu OO, ON, OS, NS, NN (duża litera oznacza atom, przez który wiązany jest ligand do wanadu np. O oznacza atom tlenu), trójwiążące typu ONO oraz czterowiążące typu ONNO oraz NONN (Sakurai H., Katoh A., Yoshikawa Y., Bull. Chem. Soc. Jpn., 79 (2006) 1645; Thompson K. H., McNeill J. H., Orvig C., Chem. Rev., 99 (1999) 2561.

Na ogół, kompleksy wanadu z ligandami organicznymi są mniej toksyczne oraz wykazują lepsze właściwości regulacji procesów metabolicznych w porównaniu do nieorganicznych związków, takich jak siarczan wanadylu i wanadany.

Przykłady związków wanadu będących skutecznymi inhibitorami fosfataz białkowych opisano w literaturze: Han H., Lu L., Wang Q., Zhu M., Yuan C., Xing S., Fu X., Dalton Trans., 41 (2012) 11116; Mehdi M.Z., Srivastava A.K., Arch. Biochem. Biophys., 440 (2005) 158; Schmid A.C., Byrne R.D., Vilar R., Woscholski R., FEBS Lett., 566 (2004) 35; Tracey A.S., J. Inorg. Biochem., 80 (2000) 11; oraz ujawniono w opisach patentowych: US 5,583,242. US 7,692,012 B2; GB0328157; US6432941; US8242092; US8008035; US5877210; US 5155031; US 6579540. Wykazano, że związki kompleksowe wanadu są silnymi inhibitorami fosfataz, szczególnie białkowych fosfataz tyrozynowych, takich jak PTP1B, TCPTP, PTP-MEG2, SHP-1, SHP-2, LAR. Wykazano także, że związki wanadu mogą być także inhibitorami innych fosfataz, np. ATP-az, glukozo-6-fosfatazy czy fruktozo-2,6-bisfosfatazy.

Zdolność do hamowania aktywności fosfataz wykazano dla tej grupy związków w badaniach z użyciem izolowanych enzymów, w badaniach z użyciem komórek oraz w badaniach na zwierzętach. W badaniach prowadzonych na komórkach oraz zwierzętach wykazano, że związki te mogą wpływać na ogólny poziom fosforylacji białek oraz na różne białka regulacyjne i receptorowe oraz czynniki transkrypcyjne m.in. INS-R, Akt, GSK-3, NF-kappaB, FKHR, FKHRL-1, FOXO, ERK 1/2. Prowadzi to do modulacji różnych funkcji komórek i może być podstawą do terapeutycznego zastosowania kompleksowych związków wanadu m.in. w chorobach nowotworowych, metabolicznych, zapalnych, neurodegeneracyjnych i innych. Korzystne efekty związków kompleksowych wanadu obserwowano w badaniach z użyciem komórek (w tym nowotworowych) oraz w badaniach na zwierzętach, wykazując potencjalną skuteczność terapeutyczną tej grupy inhibitorów fosfataz m.in. w cukrzycy, w nowotworach, w chorobach neurodegeneracyjnych i chorobach układu krążenia.

Szereg kompleksów wanadu z N-1salicylidenohydrazydami oraz hydrazydam i 1-(2-hydroksyfenylo)alkiloloketonów jako trójwiążącymi ligandami ONO donorowymi zostało otrzymanych, a prace przeglądowe na ich temat zostały opublikowane (Plass, W., Coord. Chem. Rev., 255 (2011) 2378; Maurya, M. R., Coord. Chem. Rev., 237 (2003) 163; Seena E. B., Mathew N., Kuriakose M., Kurup M. R. P., Polyhedron, 27 (2008) 1455; Sreeja P. B., Kurup M. R. P., Spectrochim. Acta A, 61 (2005) 331).

Połączenia te zawierają rdzeń typu [V^IVO]²+, [v^vO]³+ i [v^vO²]+, przy czym nieznane są kompleksy wanadu(III), a kompleksy wanadu(IV) należą do rzadkości. Opisywane połączenia w zdecydowanej większości zawierają ligandy ONO donorowe, w których fragment pochodzący od o-hydro-ksybenzaldehydu lub o-hydroksyfenyloketonu posiada niepodstawiony pierścień aromatyczny.

Kompleksy otrzymywano w wyniku reakcji związków wanadu(IV i V) (głównie VOSO4, VO(acac)2 oraz MVO3 i M3VO4) z odpowiednimi ligandami, w wodzie lub rozpuszczalniku organicznym (np. DMF, EtOH, MeOH), w powietrzu lub obojętnej atmosferze (Ar, N2).

PL 231 079 Β1

W literaturze opisane jest potencjalne zastosowanie tych związków w katalizie i utlenianiu związków organicznych (Monafared H.H., Bikas R., Mayer P., Inorg. Chim. Acta, 363 (2010) 2574; Maurya M. R., Agarwal S., Bader C., Ebel M., Rehder D., Dalton Trans., (3) (2005) 537).

Przedmiotem wynalazku są kompleksy wanadu(lll, IV i V) z hydrazydohydrazonami, które do tej pory nie zostały opisane w literaturze ani ujawnione w zgłoszeniach patentowych, sposób syntezy oraz zastosowania w zapobieganiu i leczeniu zaburzeń i chorób metabolicznych i/lub związanych z aktywnością fosfataz.

Zgodnie z wynalazkiem kompleksy wanadu są zdefiniowane wzorem ogólnym M[VX(ONO)y (L)_n] mS, gdzie:

- X oznacza atom tlenu lub jest nieobecny,

- L oznacza Li lub L2, przy czym:

- Li oznacza anion fluorowca lub obojętną lub zdeprotonowaną cząsteczkę rozpuszczalnika wybranego z grupy zawierającej alkohole C1-C12 i/lub wodę;

- L2 oznacza obojętny lub anionowy ligand NN, NO lub OO-donorowy wybrany z grupy zawierającej: polipirydyny, 1,10-fenantrolinę, pirony, chinoliny lub kwasy pirydynokarboksylowe,

- przy czym gdy X jest nieobecny, to y = 2, a n = 0,

- zaś gdy X jest obecny, to y = 1 i gdy L=Li to n oznacza 1 albo 2, a gdy n oznacza 2 to Li są takie same lub różne, zaś gdy L=L2 to n oznacza 1,

- S oznacza obojętną cząsteczkę rozpuszczalnika wybranego z grupy zawierającej alkohole C1-C4, wodę lub kwas siarkowy;

- m zmienia się w zakresie od 0 do 4,

- M może być nieobecny, a gdy jest obecny to oznacza: jednododatni kation metalu alkalicznego, kation amonowy, kation metyloamoniowy, kation etyloamoniowy.

- ONO, gdzie litery O i N oznaczają atom, przez który wiązany jest ligand do wanadu, oznacza trójwiążący ligand o wzorze ogólnym 1

wzór 1 w formie ketonowej lub enolowej, obojętny lub zdeprotonowany, w którym R1, R3 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoru, chloru, bromu, jodu lub grupę SO3, hydrokso, nitro, metoksy, alkilową C1-C4, R2, R4 oznaczają atom wodoru, przy czym przynajmniej jeden z podstawników R1, R3 jest różny od atomu wodom, R5 oznacza atom wodoru, R6, oznacza grupę wybraną z:

przy czym gdy L=L2, to R6 jest grupą o wzorze B albo C albo E.

Korzystnie Li oznacza alkohol etylowy lub alkohol metylowy.

Korzystnie L2 oznacza 2,2’-bipirydynę, zdeprotonowany 3-hydroksy-2-metylo-4-piron, zdeprotonowaną 8-hydroksychinolinę, zdeprotonowany kwas 2-pikolinowy.

Korzystnie M oznacza Na⁺, K⁺.

Korzystnie kompleksy mają budowę zdeformowanej piramidy lub bipiramidy tetragonalnej.

PL 231 079 Β1

Istotę wynalazku stanowią także preparaty farmaceutyczne do stosowania w medycynie i weterynarii, zawierające wyżej zdefiniowane kompleksy wanadu oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze. Korzystnie preparaty według wynalazku mają formę stałą lub płynną.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie wyżej zdefiniowanych kompleksów wanadu do wytwarzania preparatów do zapobiegania i leczenia cukrzycy, nieprawidłowej tolerancji glukozy oraz otyłości. Korzystnie kompleksy wanadu stosuje się w zapobieganiu i leczeniu zaburzeń metabolizmu glukozy.

Kompleksy według wynalazku posiadają budowę zdeformowanej piramidy lub bipiramidy tetragonalnej (A-i, A₂ są to atomy donorowe Liganda L₂, które niezależnie oznaczają atom azotu lub atom tlenu).

o

o

o

Kolejnym aspektem wynalazku są preparaty farmaceutyczne do stosowania w medycynie i weterynarii, zawierające kompleksy według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze. Preparaty mogą być przeznaczone do podawania doustnego, parenteralnego, transdermalnego i wziewnego. Preparaty według wynalazku, poza kompleksami wanadu, mogą zawierać dodatkowe substancje terapeutyczne o odpowiednim działaniu, jak również witaminy, sole mineralne, wyciągi roślinne i suplementy diety.

Kompleksy wanadu można stosować się do wytwarzania preparatów hamujących aktywność fosfataz białkowych, najkorzystniej fosfataz tyrozynowych. Kompleksy hamujące aktywność fosfataz, w tym fosfataz tyrozynowych, mogą być stosowane w zapobieganiu i leczeniu zaburzeń metabolizmu glukozy, w zapobieganiu i leczeniu chorób nowotworowych, chorobach zapalnych i autoimmunologicznych, chorobach układu nerwowego, w tym neurodegeneracyjnych, zaburzeniach pamięci, zaburzeniach psychicznych, chorobach układu kostnego, chorobach infekcyjnych oraz innych jednostkach chorobowych, w których hamowanie aktywności fosfataz może przynieść korzystny efekt profilaktyczny i/lub terapeutyczny.

Kompleksy stosuje się samodzielnie lub w połączeniu z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami, takimi jak np. woda, alkohol, glikol propylenowy, pochodne celulozy, skrobia.

Sposób otrzymywania kompleksów wanadu zależy od rodzaju liganda, stopnia utlenienia wanadu oraz medium reakcyjnego. Kompleksy otrzymuje się w reakcji dwuetapowej z izolacją lub/i bez izolacji hydrazydohydrazonu, w warunkach beztlenowych lub w atmosferze powietrza.

Pierwszy etap syntezy obejmuje reakcję kondensacji aldehydu lub ketonu o wzorze 2

PL 231 079 Β1

OH

R

Wzór 2 w którym R-ι, R2, R3, R4 i R5 mają wyżej podane znaczenie, z hydrazydem o wzorze 3

Wzór 3 w którym R6 ma wyżej podane znaczenie. Reakcję kondensacji aldehydu lub ketonu z hydrazydem prowadzi się przy stosunku molowym 1:1 lub przy nadmiarze stechiometrycznym jednego z reagentów. Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku, którym jest alkohol C1-C12 lub woda lub roztwór wodno-alkoholowy, powstały przez zmieszanie w dowolnym stosunku alkoholu C1-C12 i wody.

W drugim etapie produkt kondensacji poddaje się reakcji kompleksowania z użyciem wyjściowego kompleksu wanadu: VOSC>4, VO(acac)2, VOCl2 lub też V(acac)3, z dodatkiem lub bez dodatku czynnika deprotonującego, którym jest amoniak, alkiloamina lub aryloamina. Reakcję kompleksowania prowadzi się przy stosunku molowym 1:1:1 wanadu do aldehydu (ketonu) i hydrazydu w przypadku kompleksów wanadu(IV) i wanadu(V) oraz przy stosunku molowym 1:2:2 wanadu do aldehydu (ketonu) i hydrazydu w przypadku kompleksów wanadu(lll). Reakcję kompleksowania również można prowadzić przy nadmiarze lub niedomiarze stechiometrycznym wanadu.

Produkty reakcji wytrącają się samoistnie lub po wprowadzeniu dodatkowego czynnika kompleksującego: obojętnego lub anionowego Uganda L2 (tzw. koliganda) dwuwiążącego NN, NO, czy też OOdonorowego. Koligand L2 wprowadza się przy stosunku molowym koliganda do wanadu 1:1. Koligand można również wprowadzić w nadmiarze lub niedomiarze stechiometrycznym w stosunku do wanadu.

Wszystkie etapy syntezy prowadzi się w zakresie temperatur -130 do 260°C oraz w zakresie ciśnień od 0,01 do 1 MPa, czyli w warunkach temperatury i ciśnienia, w których mieszanina reakcyjna występuje w postaci roztworu lub zawiesiny. Najkorzystniej jest prowadzić te reakcje w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika pod ciśnieniem atmosferycznym.

Modyfikacją opisanej metody jest wydzielanie ze środowiska reakcji Uganda otrzymanego w pierwszym etapie syntezy i następnie użycie go jako substratu w etapie drugim przy zachowanych warunkach reakcji etapu drugiego, opisanego powyżej.

Przez odpowiednie kombinacje wspomnianych parametrów oraz stosowanie koliganda otrzymano z dobrą wydajnością kompleksy będące przedmiotem wynalazku.

Wybrane przykłady otrzymanych kompleksów zebrano w Tabeli 1. Podstawniki R odpowiadają numeracji przedstawionej we wzorze 1, a R6 oznacza grupę wybraną z grup A-E. Dla wszystkich kompleksów R4=R5=H.

PL 231 079 Β1

Tabela 1

Ri	r2	r3	Re (A-E)	r7	Li, L2	mS
Kompleksy typu [VO(ONO)(Li)(Li)]-mS
Cl	H	Cl	c		Li = EtOH Li = EtO
H	H	OCH3	c		Li = EtOH Li = EtO’
Br	OCII3	Br	c		Li = EtOH Li = EtO'
Kompleksy typu [VO(ONO)(Li)]-mS
och3	H	Br	D	-	Li = H2O	-
Br	H	Cl	D	-	Li = H2O	-
H	H	no2	D	-	Li = H2O	-
‘Bu	H	‘Bu	D	-	Li - H2O	-
H	H	OH	D	-	Li = H20	-
OH	H	H	D	-	Lx = H20	-
H	H	och3	D	-	Li = H2O	0,5H2O
H	H	no2	B	-	L = EtO'	-
OH	H	H	c	-	L = EtO'	-
H	H	Cl	B	-	L = EtO'	-
H	H	no2	C	-	L = EtO'	ih2o

Kompleksy typu [VO(ONO)(L2)]-mS
Η	H	Br	A	OH	L2 - phen	2H2O
H	H	Cl	A	OH	L2 = phcn	2H2O
OCH3	H	Br	A	OH	L2 = phen	2H2O
Br	H	Cl	A	OH	L2 = phen	ih2o
Cl	H	Cl	A	OH	L2 = phen	ih2o
H	H	Br	A	och3	L2 = phen	-
H	Et2N	H	A	Cl	L2 - phen	1H2O
H	H	Br	A	‘Bu	L2 = phen	0,5H2O
‘Bu	H	‘Bu	A	H	L2 - bpy	IMeOH
‘Bu	H	‘Bu	A	H	L2 - mai’	lEtOH
Kompleksy typu M|VO(ONO)(L2)]-mS
H	H	SO3	A	OH	L2 = phen	4H2O
H	H	SO3	A	OCH3	L? — phen	4H2O
Kompleksy typu M[VO(ONO)(L)]-mS
H	H	so3	C	-	L=OH	-

PL 231 079 Β1

Kompleksy typu |V(ONO)i]-mS

H	H	Br	A	NO2	-	-
H	H	Br	E	-	-	-
och3	H	Br	C	-	-	-
H	Et2N	H	c	-	-	-
H	H	Br	A	Cl	-	ih2o

Wynalazek obejmuje związki, których działanie polega na uwrażliwianiu narządów docelowych na działanie insuliny, nasilających działanie, naśladujących, bądź zastępujących insulinę. Związki te powodują również wzrost syntezy i/lub wydzielania insuliny przez komórki beta trzustki. Związki według wynalazku wykazują także działanie polegające na hamowaniu aktywności różnych fosfataz. Odpowiednie modulowanie związków według wynalazku może być skuteczną strategią prewencyjną i terapeutyczną.

Kompleksy wanadu według wynalazku wykazują wpływ na metabolizm, co zostało wykazane w badaniach na komórkach głównych narządów związanych z mechanizmami patogenetycznymi cukrzycy typu 2 oraz wykazują wpływ na hamowanie aktywności fosfatazy tyrozynowej PTP1B, co zostało wykazane w badaniach z użyciem ludzkiego, rekombinowanego enzymu.

Przeprowadzono badania wpływu kompleksów wanadu na zużycie glukozy przez miocyty (komórki C2CI2), hepatocyty (komórki HepG2) i adipocyty (komórki 3T3-L1). Efektywność kompleksów porównano z działaniem maltolanu wanadylu (VO(mal)2), którego silne działanie przeciwcukrzycowe jest szeroko opisane w literaturze.

Wykazanie hamującego wpływu badanych związków na aktywność PTP1B pozwala założyć takie samo działanie tych związków wobec innych fosfataz. Wynika to z opisanych w literaturze podobieństw strukturalnych różnych fosfataz oraz mechanizmów działania związków wanadu.

Wynalazek został bliżej przedstawiony w przykładach.

Przykład 1

Kompleks typu [Vm(ONO2] mS

Ri = MeO, R₂, R4, Rs = H, R3 = B_r, Re = podstawnik C, m = 0

Aldehyd 5-bromo-3-metoksysalicylowy (695 mg, 3,00 mmol), hydrazyd kwasu fenylooctowego (451 mg, 3,00 mmol) oraz EtOH (28 ml) ogrzewano do wrzenia w atmosferze Ar pod chłodnicą zwrotną przez około 10 min. uzyskując żółty roztwór z białym osadem. Następnie dodano stałego [V(acac)3] (522 mg, 1,50 mmol) i ogrzewano dalej do wrzenia przez około 25 min. Początkowo mieszanina stała się brązowa, po czym wytrącił się produkt. Osad odsączono, przemyto dwukrotnie EtOH i wysuszono na powietrzu. Wydajność: 487 mg, 41,9%. Analiza elementarna: Obliczono dla C32H27BrN4O6V: C, 49,64; H, 3,51; N, 7,24%. Znaleziono: C, 49,24; H, 3,64; N, 7,09%. IR (KBr, cm¹): v_CN(imina) 1592s. Moment magnetyczny: pef = 2.7 με.

PL 231 079 Β1

Przykład 2

Kompleks typu [VO(ONO) Li] mS

Ri, R2, R4, Rs = H, R3 — NO2, Re = podstawnik B, Li = EtO m =0

HC

CH₃

O—N

O

Aldehyd 5-nitrosalicylowy (500 mg; 3,00 mmol), hydrazyd kwasu salicylowego (457 mg; 3,00 mmol) oraz 40 ml EtOH ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez około 10 min. Następnie dodano VOSO4x H2O (665 mg; 3,00 mmol) a ogrzewanie do wrzenia kontynuowano dalej przez około 90 min. Klarowny roztwór pozostawiono do krystalizacji na około 2 dni. Produkt odsączono i przemyto dwukrotnie niewielką ilością zimnego EtOH. Wydajność: 843 mg, 68,0%. Analiza elementarna: Obliczono dla Ci₆Hi4N₃O7V: C, 46,73; H, 3,43; N, 10,22%. Znaleziono: C, 46,58; H, 3,66; N, 10,08%. IR (KBr, cm¹): vcN(imina) 1608s, 1623s; vvo 968s. Moment magnetyczny: preparat diamagnetyczny.

Dane krystalograficzne: układ trójskośny, grupa przestrzenna P-1, a = 7,4393(4), b = 8,6931(5), c = 13,2880(8) A, a = 88,914(5), β = 80,414(5), γ= 82,214(5)°, V = 839,53(8) A³, T= 293(2) K, Z = 2, Dc = 1,627 Mg ητ³, μ = 0,638 mm¹, 8897 refleksy zmierzone, 2556 niezależne (Rint = 0,0457), 2187 obserwowane [/ > 2σ(Ι)]. Rt = 0,1389; \nR2 = 0,4652 [dla 2187 refleksów obserwowanych].

Przykład 3

Kompleks typu [V^lvO(ONO)L1] mS

R2, R4, Rs = H, R1, R3 = Cl, Re = podstawnik D, Li = H2O m = 0

KI

H₂O

Cl

Aldehyd 3,5-dichlorosalicylowy (573 mg, 3,00 mmol) i hydrazyd kwasu nikotynowego (411 mg, 3,00 mmol) oraz 50 ml EtOH ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez około 15 minut w atmosferze beztlenowej (pod Ar). Zaobserwowano powstanie żółtego roztworu. Następnie dodano VO(acac)2 (795 mg, 3,00 mmol) i układ nadal ogrzewano do wrzenia przez około 60 minut w atmosferze beztleno10

PL 231 079 Β1 wej. W tym czasie wytrącił się pomarańczowy związek, który następnie odsączono, przemyto dwukrotnie EtOH i wysuszono na powietrzu. Wydajność: 938 mg, 80,0%. Analiza elementarna: Obliczono dla CisHgChNsOW: C, 39,72; H, 2,31; N, 10,69%. Znaleziono: C, 40,12; H, 2,18; N, 10,67%. IR (KBr, cnr¹):vcN(imina) 1613s; v_V0 882s. Moment magnetyczny: get=1.3 με.

Przykład 4

Kompleks typu [V^vO(ONO)(Li)2] mS

R2, R4, Rs = H, R1, R3 = Cl, Re = podstawnik C, Li = EtOH, i EtO¹, m = 0

Aldehyd 3,5-dichlorosalicylowy (717 mg, 3,75 mmol), hydrazyd kwasu fenylooctowego (564 mg; 3,75 mmol) i 125 ml EtOH ogrzewano do wrzenia przez około 15 min. pod chłodnicą zwrotną w atmosferze Ar uzyskując żółty roztwór. Następnie dodano stałego [VO(acac)2] (994 mg, 3,75 mmol) i kontynuowano ogrzewanie do wrzenia przez około 60 min. Żółtobrązowy roztwór zatężono następnie do około 50 ml i pozostawiono do ochłodzenia. Brązowy osad preparatu odsączono, przemyto dwukrotnie EtOH i wysuszono na powietrzu. Wydajność 1.04 g. Wydajność: 1040 mg, 72,3%. Analiza elementarna: Obliczono dla Ci9H2iCI₂N2O₅V: C, 47,62; H, 4,42; N, 5,85%. Znaleziono: C, 47,27; H, 4,27; N, 5,82%. IR (KBr, cm’¹): vcN(imina) 1609s; v_V0973s, 954m. Moment magnetyczny: preparat diamagnetyczny.

Dane krystalograficzne: układ rombowy, grupa przestrzenna Pna2i, a = 38,045(5), b = 7,608(5), c = 15,221(5) A, V= 4406(3) A³, T= 293(2) K, Z = 4, Dc = 1,445 Mg ητ³, μ= 0,724 mm¹, 4347 refleksów zmierzonych, 7820 niezależnych (Rtnt = 0,0243), 5327 obserwowanych [/> 2σ(/)]. Ri = 0,0366; _WR₂ = 0,072 [dla 5327refleksów obserwowanych].

Przykład 5

Kompleks typu [V^lvO(ONO)(L₂)] mS

R2, R4, Rs = H, R1, R3 = t-Bu, Re = podstawnik C, L2 = phen, m = 0

PL 231 079 Β1

Aldehyd 3,5-ditertbutylosalicylowy (254 mg; 1,50 mmol), hydrazyd kwasu fenylooctowego (227 mg; 1,5 mmol) i 25 ml EtOH ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotna w atmosferze Ar przez około 15 min. Do powstałego klarownego roztworu dodano [VO(acac)2] (398 mg; 1,50 mmol) a mieszaninę ogrzewano następnie do wrzenia przez około 40 min. Do ciemnożółtego roztworu dodano 1,10-fenantrolinę (271 mg; 1,50 mmol) i kontynuowano ogrzewanie do wrzenia przez około 10 min. Rozpuszczalnik odparowano do około 12 ml i oziębiono w lodzie. Utworzone na następny dzień kryształy odsączono, przemyto dwukrotnie EtOH i wysuszono na powietrzu. Wydajność: 346 mg, 37,4%. Analiza elementarna: Obliczono dla C35H3sN4O3V: C, 68,28; H, 6,55; N, 9,10%. Znaleziono: C, 67,34; H, 5,62; N, 9,42%. IR (KBr, cm'¹): vcN(imina) 1625s; vVo953s. Moment magnetyczny: 1.7 με..

Dane krystalograficzne: układ jednoskośny, grupa przestrzenna P2i/c, a = 14,9200(3), b = 16,2740(3), c = 19,9320(3) k, β = 130.2810(10)°, V = 3692,08(12) A³, T = 293(2) K, Z = 4, D_c= 1,100 Mg ητ³, μ = 0,303 mnr¹, 30452 refleksy zmierzone, 8445 niezależnych (Rint = 0,0351), 6015 obserwowanych [/ > 2σ(/)]. Ri = 0,0937; w/?2 = 0,2649 [dla 6015 refleksów obserwowanych].

Przykład 6

Nie według wynalazku.

Kompleks typu M[V^lvO(ONO)(L₂)] mS

M = K⁺, Ri R2, R4, Rs = H, R3 =SO₃, Re = podstawnik A, R7 = MeO, L2 = phen, m = 4, S = H2O

Sól potasowa aldehydu 5-sulfosalicylowego (367 mg; 1,50 mmol), 4-metoksybenzhydrazyd (250 mg; 1,50 mmol) i EtOH (45 ml) ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną w atmosferze Ar przez około 20 min. Następnie do jasnożółtego roztworu dodano [VO(acac)2] (378 mg; 1,50 mmol) i kontynuowano ogrzewanie do wrzenia przez około 20 min. Do brązowego roztworu dodano 1,10-fenantrolinę (271 mg; 1,50 mmol). Czerwony roztwór zatężono do ok. 50% objętości i pozostawiono do ochłodzenia. Powstający pomarańczowy osad odsączono, przemyto dwukrotnie EtOH i wysuszono na powietrzu. Wydajność: 599 mg; 56,6%. Analiza elementarna: Obliczono dla C27H29KN4OnV: C, 45,96; H, 3,86; N, 7,94; S, 4,54%. Znaleziono: C, 45,65; H, 3,70; N, 7,83; S, 4,40%. IR (KBr, cm¹): v_CN(imina) 1608s; wo 961 s. Moment magnetyczny: v_ef = 1,3μβ.

Przykład 7

Badania wpływu kompleksów wanadu na zużycie glukozy przez miocyty, hepatocyty, adipocyty.

Hodowle komórkowe

Miocyty linii komórkowej C2CI2 hodowane były w medium hodowlanym: DMEM, 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Hodowle oraz eksperymenty prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.

Fibroblasty linii komórkowej 3T3-L1 hodowane były w medium hodowlanym: DMEM, 10% surowicy cielęcej oraz 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Hodowle oraz eksperymenty prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.

Hepatocyty linii komórkowej HepG2 hodowane były w medium hodowlanym: EMEM, 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Hodowle oraz eksperymenty prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.

Zużycie glukozy

Komórki linii komórkowej C2CI2 w ilości 20 tysięcy nanoszone były w medium hodowlanym do dołków mikropłytek 96-dołkowych. Po 3 dniach rozpoczynano proces różnicowania komórek przez dodatek medium różnicującego (DMEM, 2% surowicy końskiej oraz 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml

PL 231 079 B1 streptomycyny). Po 24 godzinach medium wymieniano na medium różnicujące. W ósmym dniu od naniesienia komórek prowadzono eksperymenty wpływu związków wanadu na zużycie glukozy.

Po odrzuceniu medium różnicującego, komórki były preinkubowane 2 godziny w medium eksperymentalnym (DMEM z 16 mmol/dm³ glukozy, 1% albuminy wołowej oraz 100 U/ml penicyliny i 100 gg/ml streptomycyny). Następnie medium to zastępowane było nową porcją medium eksperymentalnego, do którego dodawane były stężone roztwory badanych związków w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) z 1% BSA. Eksperymenty prowadzono bez lub z dodatkiem ludzkiej, rekombinowanej insuliny w stężeniu końcowym 34,5 nmol/dm³. Po wymieszaniu zawartości prowadzono inkubację przez 24 godziny. Po tym czasie zawartość mikropłytek mieszano i pobierano medium do badania stężenia glukozy.

Komórki linii 3T3-L1 w ilości 10 tysięcy nanoszone były w medium hodowlanym do dołków mikropłytek 96-dołkowych opłaszczonych polilizyną. Po osiągnięciu konfluencji rozpoczynano proces różnicowania komórek do adipocytów przez wymianę medium na medium hodowlane z dodatkiem 1 gmol/dm³ deksametazonu i 0,5 mmol/dm³-isobutyl-1-methyloksantyny. Po 48 godzinach inkubacji medium wymieniano na medium hodowlane z dodatkiem 10 gg/ml ludzkiej, rekombinowanej insuliny. Po godzinie do dołków mikropłytki dodawano stężone roztwory badanych związków w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS). Po wymieszaniu zawartości prowadzono inkubację przez 24 godziny.

Po tym czasie zawartość mikropłytek mieszano i pobierano medium do badania stężenia glukozy.

Komórki linii HepG2 w ilości 20 tysięcy nanoszone były w medium hodowlanym do dołków mikropłytek 96-dołkowych. Po 24 godzinach inkubacji do dołków mikropłytki dodawano stężone roztwory badanych związków w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS). Eksperymenty prowadzono z ludzką, rekombinowaną insuliną w stężeniu końcowym 34,5 nmol/dm³. Po wymieszaniu zawartości prowadzono inkubację przez 24 godziny. Po tym czasie zawartość mikropłytek mieszano i pobierano medium do badania stężenia glukozy.

Oznaczanie stężenia glukozy

Stężenie glukozy w medium po inkubacji komórek z badanymi związkami oznaczano metodą oksydazową z detekcją fluorymetryczną w płytkach 384-dołkowych. Do badanej próbki dodawano równą objętość odczynnika 0,4 U/ml peroksydazy, 4 U/ml oksydazy glukozy oraz 200 mikromol/dm³ 10-acetyl3,7-dihydroksyfenoksazyny w 50 mmol/dm³ buforze potasowo-fosforanowym pH 7,4. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37°C prowadzono pomiar intensywności fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 530 nm i emisji 580 nm. Stężenie glukozy obliczano z krzywej wzorcowej. Zużycie glukozy przez komórki obliczano jako różnicę stężenia glukozy w medium eksperymentalnym a medium po i nkubacji związków z komórkami.

Komórki mięśniowe są głównym narządem odpowiadającym za zużywanie glukozy w organizmie i regulującym stężenie glukozy we krwi, a także są istotnym narządem efektorowym w działaniu różnych leków przeciwcukrzycowych. Wpływ związków będących przedmiotem wynalazku na zużycie glukozy zbadano z wykorzystaniem komórek mięśniowych (C2C12) oraz dodatkowo adipocytów (3T3-L1) i hepatocytów (HepG2) i porównano z wpływem rosiglitazonu, stosowanego w terapii cukrzycy typu 2 oraz wpływem maltolanu wanadylu, VO(mal)2, o udokumentowanym silnym działaniu (Tabele 2, 3 i 4). Zużycie glukozy wyrażono w odniesieniu do kontroli nie zawierającej związków wanadu.

T a b e l a 2

Wpływ kompleksów wanadu (50 mikromol/dm³) oraz rosiglitazonu (50 mikromol/dm³) na zużycie glukozy przez komórki C2C12 w obecności (34,5 nanomol/dm³) i nieobecności ludzkiej, rekombinowanej insuliny.

PL 231 079 Β1

Kompleks	Warlościowość wanadu	Podstawniki we wzorze 1, R6 grupy A-E	Zużycie glukozy (%)
Bez insuliny	Z insuliną
LV(ONO)2J	III Ri=R2=R4=R5= h R3= Br Ró=B	317	267
[VO(ONO)(phen)]«2H2O	IV Ri=R3= Cl R2—R4—R5— H Ri= A r7=oh	216	232
[VO(ONOXOC2H5)]	V Ri=OH Kr;—Kę.—F<-|— t\-,— H r6=c	198	156
[VO(mal)2]	TV	104	92
Rosiglitazon		107	123

Tabela 3

Wpływ kompleksów wanadu (50 mikromol/dm³) oraz rosiglitazonu (50 mikromol/dm³) na zużycie glukozy przez komórki 3T3-L1

Kompleks	Wartościowość wanadu	Podstawniki we wzorze 1, R6 grupy Λ E	Zużycie glukozy (%)
[V(ONO)2]	III	Ri=R2=R4=R7= h R3=Br Ró=A R7— t-Bu	124
|VO(ONO)(phen)J»2H2O	IV	R [ =R2=R4=l/-= H R;=Br R6=A r7= OH	136
[VO(ONO)(OC2H5)]	V		110
[V0(mal)2]	IV		116
Rosiglitazon			112

Tabela 4

Wpływ kompleksów wanadu (50 mikromol/dm³) na zużycie glukozy przez komórki HepG2

Kompleks	Wartościowość wanadu	Podstawniki we wzorze 1, Rń grupy A-E	Zużycie glukozy (%)
[V(ONO)2]	III	Ri=R2=R4=R5= h R3=Br R<,-E	119
[VO(ONO)(phen)J-H2O	IV	R2 =R-4=R5= H Ri= Br R?1=C1 R.f,=A r7= OH	158
[VO(ONO)(OC2H5)(C2H5OH)]	V	R'2—R-4=R-5= H Ri- Cl	116
		R3=C1 Ró=A r7=oh
[V0(mal)2]	IV		98

PL 231 079 B1

P r z y k ł a d 8

Badania inhibicji fosfatazy tyrozynowej 1B (PTP1B)

Do roztworu badanego związku w dołku mikropłytki 96-dołkowej o zmniejszonej powierzchni dodawano równe objętości 0,6 mmol/dm³ fosforanu 6,8-difluoro-4-metyloumbeliferylu oraz 1,5 U/ml ludzkiej, rekombinowanej fosfatazy PTP1B w buforze reakcyjnym pH 7,0: 25 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego, 50 mM chlorku sodu, 1 mM ditiotreitolu i 0,05% Tween-20. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37°C prowadzono pomiar intensywności fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 355 nm i emisji 560 nm (Welte S., Baringhaus K.H., Schmider W., Muller G., Petry S., Tennagels N., Anal. Biochem., 338 (2005) 32). Wyniki wyrażono, jako procent aktywności względem próbki kontrolnej niezawierającej inhibitora.

W przeprowadzonych badaniach wykazano silny, hamujący wpływ związków kompleksowych wanadu na aktywność tej fosfatazy (Tabela 5).

PL 231 079 Β1

Tabela 5

Wpływ kompleksów wanadu (1 mikromol/dm³) na aktywność ludzkiej, rekombinowanej fosfatazy PTP1B.

Kompleks	Wartościowość wanadu	Podstawniki we wzorze 1, Rń grupy AE	Aktywność PTP1B (%)
[V(ONO)2]	III	R1 =R2—R4— Rs= H r3= oh r6=c	18
[VO(ONO)(H2O)J	IV	Ri=OH R2—R3—R4— Rg— H Re=D	5
[VO(ONO)(OC2H5)]	V	Ri OH R2—R3—R4—R5— H Ró=C	29
[V0(mal)2]	IV		23

Aktywność enzymatyczną PTP1B podano w odniesieniu do kontroli nie zawierającej związków wanadu, której aktywność przyjęto za 100%. Kompleks [VO(mal)2], maltolan wanadylu jest to kompleksem referencyjnym opisany w literaturze.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompleksy wanadu o wzorze ogólnym M[VX(ONO)_y(L)_n] mS, gdzie:

   -X oznacza atom tlenu lub jest nieobecny,

   - L oznacza Li lub L₂, przy czym:

   - Li oznacza anion fluorowca lub obojętną lub zdeprotonowaną cząsteczkę rozpuszczalnika wybranego z grupy zawierającej alkohole C1-C12 i/lub wodę;

   - L₂ oznacza obojętny lub anionowy Ugand NN, NO lub OO-donorowy wybrany z grupy zawierającej: polipirydyny, 1,10-fenantrolinę, pirony, chinoliny lub kwasy pirydynokarboksylowe,

   - przy czym gdy X jest nieobecny, to y = 2, a n = 0,

   - zaś gdy X jest obecny, to y = 1 i gdy L=Li to n oznacza 1 albo 2, a gdy n oznacza 2 to Li są takie same lub różne, zaś gdy L=L₂ to n oznacza 1,

   S oznacza obojętną cząsteczkę rozpuszczalnika wybranego z grupy zawierającej alkohole CiC4, wodę lub kwas siarkowy;

   - m zmienia się w zakresie od 0 do 4,

   - M może być nieobecny, a gdy jest obecny to oznacza: jednododatni kation metalu alkalicznego, kation amonowy, kation metyloamoniowy, kation etyloamoniowy.

   - ONO, gdzie litery O i N oznaczają atom, przez który wiązany jest Ugand do wanadu, oznacza trójwiążący Ugand o wzorze ogólnym 1 w formie ketonowej lub enolowej, obojętny lub zdeprotonowany, w którym R1, R3 niezależnie oznaczają atom wodoru, fluoru, chloru, bromu, jodu lub grupę SO3, hydrokso, nitro, metoksy,

   PL 231 079 Β1 alkilową C1-C4, R₂, R4 oznaczają atom wodom, przy czym przynajmniej jeden z podstawników R1, R3 jest różny od atomu wodoru, R5 oznacza atom wodom, R, oznacza grupę wybraną z:

   przy czym gdy L=L₂, to R6) jest grupą o wzorze B albo C albo E.
2. 2. Kompleksy według zastrz. 1, znamienne tym, że Li oznacza alkohol etylowy lub alkohol metylowy.
3. 3. Kompleksy według zastrz. 1, znamienne tym, że L₂ oznacza 2,2’-bipirydynę, zdeprotonowany

   3-hydroksy-2-metylo-4-piron, zdeprotonowaną 8-hydroksychinolinę, zdeprotonowany kwas 2pikolinowy.
4. 4. Kompleksy według zastrz. 1, znamienne tym, że M oznacza Na+, K+.
5. 5. Kompleksy według zastrz. 1, znamienne tym, że mają budowę zdeformowanej piramidy lub bipiramidy tetragonalnej.
6. 6. Preparaty farmaceutyczne do stosowania w medycynie i weterynarii, zawierające kompleksy wanadu określone w zastrzeżeniu 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze.
7. 7. Preparaty według zastrz. 6, znamienne tym, że mają formę stałą lub płynną.
8. 8. Zastosowanie kompleksów wanadu określonych w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania preparatów do zapobiegania i leczenia cukrzycy, nieprawidłowej tolerancji glukozy oraz otyłości.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że kompleksy wanadu stosuje się w zapobieganiu i leczeniu zaburzeń metabolizmu glukozy.