PL231078B1 - Sposób syntezy polifosforanów - Google Patents

Sposób syntezy polifosforanów

Info

Publication number
PL231078B1
PL231078B1 PL400248A PL40024812A PL231078B1 PL 231078 B1 PL231078 B1 PL 231078B1 PL 400248 A PL400248 A PL 400248A PL 40024812 A PL40024812 A PL 40024812A PL 231078 B1 PL231078 B1 PL 231078B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
general formula
formula
group
acid
reaction
Prior art date
Application number
PL400248A
Other languages
English (en)
Other versions
PL400248A1 (pl
Inventor
Marcin Krzysztof Chmielewski
Joanna Romanowska
Original Assignee
Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk filed Critical Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL400248A priority Critical patent/PL231078B1/pl
Priority to PCT/PL2013/000098 priority patent/WO2014025272A1/en
Priority to US14/412,951 priority patent/US9376460B2/en
Priority to EP13750163.1A priority patent/EP2880044B1/en
Publication of PL400248A1 publication Critical patent/PL400248A1/pl
Publication of PL231078B1 publication Critical patent/PL231078B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6581—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6584—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and nitrogen atoms with or without oxygen or sulfur atoms, as ring hetero atoms having one phosphorus atom as ring hetero atom
    • C07F9/65842—Cyclic amide derivatives of acids of phosphorus, in which one nitrogen atom belongs to the ring
    • C07F9/65844—Cyclic amide derivatives of acids of phosphorus, in which one nitrogen atom belongs to the ring the phosphorus atom being part of a five-membered ring which may be condensed with another ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/02—Phosphorylation
    • C07H1/04—Introducing polyphosphoric acid radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/02—Phosphorylation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób syntezy analogów polifosforanowych, związków o znaczeniu biologicznym takich jak nukleozydy, oligonukleotydy mających zastosowanie w chemii organicznej, biologii molekularnej i biotechnologii. Polifosforanowe analogi w szczególności nukleozydo 5’-trójfosforany to związki o dużej aktywności biologicznej, które w organizmach żywych odpowiedzialne są za dostarczanie i magazynowanie energii. Nukleozydo 5’-trójfosforany stanowią także jednostki budulcowe w enzymatycznej syntezie cząsteczek DNA zachodzącej w komórkach organizmów żywych. Ponadto nukleozydo 5'-trójfosforany znajdują szerokie zastosowanie zarówno w badaniach podstawowych jak i w zaawansowanych procesach diagnostycznych jak i terapeutycznych. Ze względu na te właściwości oraz fakt iż są one substratami dla enzymów z grupy polimeraz, stosuje się je w licznych aplikacjach biomolekularnych katalizowanych przez te enzymy. Jednym z najszerszych praktycznych zastosowań nukleozydo 5'-trójfosforanów jest ich wykorzystanie jako substratów w reakcjach typu PCR (ang. polymerose chain reaction) do namnażania matrycy DNA za pomocą enzymu polimerazy.
Ze względu na aplikacyjny potencjał trójfosforanowych analogów nukleozydów istnieje i oligonukleotydów duże zainteresowanie nowymi skutecznymi metodami ich otrzymywania. Obecnie najszerzej stosowane są metody biologicznego pozyskiwania nukleozydo 5'-trójfosforanów, które polegają na degradacji natywnego DNA. Jednocześnie obserwujemy intensywne prace syntetyczne mające na celu opracowywanie nowych metod otrzymywania trifosforanowych analogów na drodze chemicznej syntezy. Metody te pozwalałyby na zwiększenie skali syntezy przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości i czystości końcowego produktu.
Znane są z literatury metody chemicznej syntezy nukleozydo 5'-trójfosforanów oparte na reakcji odpowiednio aktywowanego nukleozydo monofosforanu z pirofosforanem. Najczęściej stosowana chemiczna metoda polega na generowaniu nukleozydo dichlorofosforanu w reakcji z bis(tri-n-butyloaminowym) pirofosforanem, a następnie hydrolizie powstałego cyklicznego produktu przejściowego, którą omówiono między innymi w literaturze Ludwig, J. Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1981, 16, 131-3, Ruth, J. L.; Cheng, Y. C. Mol. Pharmacol. 1981,20, 415-22. Podejście to nie posiada jednak cech uniwersalności, gdyż nie można go zastosować w syntezie trójfosforanów nukleozydów modyfikowanych w obrębie zasad heterocyklicznych, co opisano w Wu, W.; Bergstrom, D. E.; Davisson, V. J. J. Org. Chem. 2003, 68, 3860-5, a także z uwagi na powstające w trakcie reakcji produkty uboczne, co opisano między innymi w literaturze Gillerman, J.; Fischer, B., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2010, 29, 245-256.
Inna znana z literatury metoda syntezy 5'-nukleozydo trójfosforanów opiera się na reakcji aktywowanego nukleozydo monofosforanu w formie niepodstawionego amidofosforanu, co omówiono między innymi w literaturze Tomasz, J.; Simoncsits, A.; Kajtar, M.; Krug, R. M.; Shatkin, A.,J. Nucleic Acids Res. 1978, 5, 2945-57 oraz Simoncsits, A.; Tomasz, J. Nucleic Acids Res. 1975, 2, 1223-33) albo W-morfolido amidofosforanu, co omówiono między innymi w literaturze: Moffatt, J. G.; Khorana, H. G. J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 649-58 oraz Moffatt, J. G. Can. J. Chem. 1964, 42, 599-604 i van Boom, J. H.; Crea, R.; Luyten, W. C.; Vink, A. B. Tetrahedron Lett. 1975, 16, 2779-82 albo W-imidazolo amidofosforanu, co omówiono między innymi w literaturze Hoard, D. E.; Ott, D. G. J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, 1785-8 oraz Shimazu, M.; Shinozuka, K.; Sawai, H. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 235-8, z pirofosforanem. Metoda ta jednak charakteryzuje się jednak wieloetapowością i przez to długim czasem reakcji, trwającym nawet kilka dni.
Znana jest także z literatury metoda opracowana przez Borcha i współpracowników, w której synteza nukleozydo trójfosforanów odbywa się poprzez generowanie wysoce aktywnego produktu przejściowego, pirolidynowego amidofosforanu w formie jonu obojnaczego, który ulega szybkiej reakcji kondensacji z tris(tetra-n-butyloamoniowym) pirofosforanem, co omówiono między innymi w literaturze Wu W.; Freel Meyers C. L.; Borch R. F. Org. Lett. 2004, 6, 2257-2260. Pomimo że autorzy zapewniają o wysokiej wydajności syntezy to jednak metoda ta wymaga kilku pracochłonnych etapów, co znacznie wydłuża cały proces otrzymywania pożądanych nukleozydo trifosforanów. Przydatność tych metod jest ograniczona ze względu na niską wydajność procesu syntezy, użycie agresywnych i drogich reagentów, długi czas reakcji, powstawanie produktów ubocznych, które zanieczyszczają docelowy analog trój fosforanowy.
Celem wynalazku jest nowy sposób syntezy organicznych analogów polifosforanowych, w szczególności polifosforanów organicznych nukleozydów, oligonukleotydów, który charakteryzuje
PL 231 078 Β1 się uproszczeniem metody ich syntezy, obniżeniem kosztów przeprowadzenia syntezy polifosforanowych analogów oraz wyeliminowaniem produktów ubocznych.
Przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
O
OH
O
II
F=»-0
OH
O !l ψ-ο-χ
OH n
(I) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę nukleozydu polegający na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2
ΟΗ-Χ (2) w którym X ma wyżej podane znaczenie, a odpowiednią podstawioną pochodną 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o wzorze ogólnym 3
Ra
R/
(3) w którym • R-ι, R2, R3, R4 są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznaczają H lub CH3, atom halogenu, NO2, NH2, C2H5 • Re oznacza NR9R10 gdzie Rg i R10 są takie same lub różne i oznaczają , n-propyl lub izopropyl, przy czym w przypadku gdy Re oznacza NR9R10 gdzie Rg i R10 mają wyżej podane znaczenie wówczas w celu aktywowania aminy dodatkowo stosuje się słaby kwas w szczególności 1-H-tetrazol lub 5-etylotio-1H-tetrazol.
Następnie produkt tej reakcji o ogólnym wzorze 4,
Re
V M A r?
Rg Rg |4'i w których R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 i X mają wyżej podane znaczenie, podaje się reakcji z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
© © 9 0
Π
0 ψ 0 ©
©
Rit Ru
(5) w których n przyjmuje wartości od 0 do 2, a Rn oznacza grupę o wzorze ogólnym 6 lub grupę o wzorze ogólnym 7
PL 231 078 Β1
M2 ’Ν-R-|2
Μ2 (β>
r12-n-h
Μ2 (?) gdzie podstawniki R12 oznacza CH3 lub grupy CH2-R1, w których Rn są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, a po zakończeniu reakcji produkt podaje się utlenianiu jodem, korzystnie rozpuszczonym w pirydynie, po czym znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1. W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki R11 oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
Reakcje według sposobu przeprowadza się korzystnie w rozpuszczalnikach organicznych najkorzystniej w acetonitrylu lub chlorku metylenu.
W drugim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
O
HQ-F>~O
OH
O π
-Ι·Η
OH (I
-i5-o~x
OH n
(1) w którym n i X mają wyżej podane znaczenie, polegający na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 4,
w których R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 i X mają wyżej podane znaczenie, a solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5 '11 rw®
Rn o
Π o
© ©
Ro
-OH
L J n (5) w których n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7, gdzie podstawniki R11 oznacza CH3 lub grupy CH2-R11 w których Rn są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, a po zakończeniu reakcji produkt podaje się utlenianiu jodem, korzystnie rozpuszczonym w pirydynie, po czym znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
PL 231 078 Β1
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki Rg lub Rio oznaczają grupę o wzorze 7 lub 8.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
Reakcje według sposobu przeprowadza się korzystnie w rozpuszczalnikach organicznych najkorzystniej w acetonitrylu lub chlorku metylenu.
W trzecim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
O O
II SI
HCHP-O-P-O
OH
OH
O
H
-ę--G-x
OH n
(I) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę nukleozydu polegający na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2
ΟΗ-Χ (2) w którym X ma wyżej podane znaczenie, a odpowiednią podstawioną pochodną 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o wzorze ogólnym 3
Ra w którym • R-ι, R2, R3, R4 są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznaczają H lub CH3, atom halogenu, NO2, NH2, C2H5 • Re oznacza atom halogenu lub NR9R10 gdzie Rg i R10 są takie same lub różne i oznaczają n-propyl, lub izopropyl, przy czym w przypadku gdy Re oznacza NR9R10 gdzie Rg i R10 mają wyżej podane znaczenie wówczas w celu aktywowania aminy dodatkowo stosuje się słaby kwas w szczególności 1-H-tetrazol lub 5-etylotio-1 H-tetrazol.
Następnie produkt tej reakcji o ogólnym wzorze 4,
Re
R?
RZ Rg (4) w którym R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 i X mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji utleniania za pomocą jodu, korzystnie rozpuszczonego w pirydynie i otrzymuje się tlenek odpowiednio podstawionej pochodnej 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o ogólnym wzorze 8, x ,,ο * A Γ S.
O
R,-)— < Rg (8)
PL 231 078 Β1 który z kolei podaje się reakcji z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
Ru o
o © © Ru
OH (5) w których n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7, gdzie podstawniki R12 oznacza CH3 lub grupy CH2-R11 w których R11 są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, po czym znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jedno wodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki Rn oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
Reakcje według sposobu przeprowadza się korzystnie w rozpuszczalnikach organicznych najkorzystniej w acetonitrylu lub chlorku metylenu.
W czwartym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1, o
HO-ę-O
OH
O li p~o
OH
O
-ę-O~X
OH n
(O w którym n i X mają wyżej podane znaczenie, polegający na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 4,
Ri z>-p:6 »
R? Ri-4--(-R4 (¾ Rs (4) w którym R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 i X mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji utleniania za pomocą jodu, korzystnie rozpuszczonego w pirydynie i otrzymuje się tlenek odpowiednio podstawionej pochodnej 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o ogólnym wzorze 8,
ozO
H 'O -pR4 R·? R:i (8) który z kolei podaje się reakcji z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
Ru
O
O © © Ru
OH (5)
PL 231 078 Β1 w których n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 8, gdzie podstawniki R12 oznacza CH3 lub grupy CH2-R11 w których R11 są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, a po zakończeniu reakcji znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 lub 6 gdzie wszystkie podstawniki Rn oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
Reakcje według sposobu przeprowadza się korzystnie w rozpuszczalnikach organicznych najkorzystniej w acetonitrylu lub chlorku metylenu.
W piątym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób realizowany na podłożach stałych np. szkło o kontrolowanych porach (CPG), które posiadają grupy hydroksylowe. Grupy hydroksylowe na podłożach są wykorzystywane do wzrostu łańcucha kwasu nukleinowego (oligonukleotydu). Podłoże jest umieszczone w kolumnach reakcyjnych pozwalających na przepływ cieczy i gazu przez kolumnę. Sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
O O
II SI
HCHP-O-P-O
OH
OH
O
H
-ę--G-x
OH n
(I) w którym n przyjmuje wartość od 1 do 2 a X oznacza resztę oligonukleotydu lub kwasu nukleinowego polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze 2
.....
ΟΗ-Χ (2) w którym X oznacza resztę oligonukleotydu lub kwasu nukleinowego, a związkiem o wzorze 3 Ra
Rż (3) w którym R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 i Re mają wyżej podane znaczenie w obecności słabego kwasu, w szczególności 1-H-terazolu, 5-etylotio-1H-tetrazolu, 4,5-dicyjanoimidazolu, 5-benzylotio-1H-tetrazolu, kwas octowego następnie po zakończeniu reakcji i usunięciu nadmiarów rozpuszczalników i przemyciu kolumny suchym acetonitrylem na kolumnę podaje się mieszaninę soli amoniowej kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5 w którym Rn mają wyżej podane znaczenia, korzystnie jednowodorowego z jodem w obecności pirydyny, przy czym stosuje się co najmniej 20-50 krotny nadmiar stechiometryczny mieszaniny kwasu i jodu względem dostępnych grup hydroksylowych powstających w wyniku wzrostu łańcucha kwasu nukleinowego na powierzchni fazy stałej. Czas reakcji jest w zakresie od 5 do 25 minut.
Następnie po zakończeniu reakcji izoluje się produkt znanymi metodami.
W sposobie według wynalazku stosuje się mieszaninę soli amoniowej kwasu polifosforanowego, korzystnie jednowodorowego z jodem w proporcji od 1:0,8 do 0,8:1, korzystnie 1:1.
Jako sól amoniową kwasu polifosforanowego, korzystnie jednowodorowego stosuje się związki o wzorze ogólnym 5 w którym n, Rn R12 mają wyżej podane znaczenie, korzystnie gdy wszystkie R11 oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 8.
Sposób według aspektu piątego ma szczególne zastosowanie w chemicznych syntezach oligonukleotydów na fazie stałej z zastosowaniem automatycznych syntetyzerów kwasów nukleinowych.
Zaletą rozwiązania według wynalazku jest uproszczony sposób syntezy polifosforanów zwłaszcza nukleozydowych, oligonukleotydowych lub cukrowych. Sposób według wynalazku charakteryzuje się skróceniem czasu prowadzenia procesu oraz uproszczeniem procedur niezbędnych do wytworzenia analogu trój fosforanowego.
PL 231 078 B1
Opisany wynalazek można zastosować do otrzymywania analogów trójfosforanowych wielu związków o znaczeniu biologicznym takich jak nukleozydy czy oligonukleotydy, które są przedmiotem rozległych badań i działań rozwojowych ze względu na ich potencjał aplikacyjny między innymi w badaniach prowadzonych w działach chemii organicznej, biologii molekularnej i biotechnologii.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.
P r z y k ł a d 1
2-/zopropyIo-3-(piryd-2-yI)-[1,3,2]oksazafosfolidyna
W kolbie umieszczono 50 mL bezwodnego benzenu w atmosferze argonu, po czym kolbę szczelnie zamknięto. Następnie dodano świeżo destylowanego chlorku fosforu (III) (876 λ 1; 10 mmol). Kolbę schłodzono do temperatury 5°C i dodano bezwodnej W,W-di/zopropyloaminy (7,7 ml; 55 mmol).
Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut a po tym czasie powoli ogrzewano do temperatury 25°C, którą następnie utrzymywano do czasu powstania bis(N,N-di/zopropyloamino)chloro fosforynu. Po uzyskaniu przereagowania na poziomie 98% (około 3 dni) do całości dodano 2-(2-pirydylo)aminoetanolu (1,38 mg; 10 mmol). Następnie po około 2 godzinach dodano 1-H-terazolu (700 mg; 10 mmol) rozpuszczonego w suchym benzenie (5 mL). Po przereagowaniu zawartości kolby dodano 1 μl di/zopropyloaminy. Produkt tej reakcji oczyszczano na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym o rozmiarach cząstek 200 mesh. Jako fazę wymywającą stosowano mieszaninę rozpuszczalników: benzenu i trójetyloaminy, przy udziale objętościowym benzenu w mieszaninie 90%. W wyniku reakcji otrzymano związek 2-/zopropylo-3-(piryd-2-yl)-[1,3,2]oksazafosfolidynę. Wydajność reakcji wynosi 70%. Otrzymany produkt poddano liofilizacji z suchego benzenu. Otrzymany związek scharakteryzowano za pomocą spektrometrii magnetycznego rezonansu jądrowego.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) λ 8.12 (dd, J = 0.6, 4.85 Hz, 1H); 7.55 (dd, J = 1.94, 7,24 Hz, 1H); 6.76 (dd, J = 0.6, 8,4 Hz, 1H); 6.71 (dd, J = 0.6, 4.85 Hz, 1H); 4.22 (m, 2H); 3.78 (m, 1H); 3,43 (m, 2H); 3.36 (m, 1H; 1.29 (m, 6H); 1.06 (m, 6H).
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) λ 156.4, 153.4, 148.3, 137.5, 116.2, 110.2, 109.1, 66.3, 62.1, 25.2, 23.6, 22.5, 22.4.
31P NMR (121 MHz, DMSO) λ 115,3
P r z y k ł a d 2
Synteza do - 5’-[3-(piryd-2-yI)-[1,3,2]oksazafosfolidyno]-3’-O-acetylo tymidyny
W kolbie umieszczono w atmosferze argonu rozpuszczoną w bezwodnym acetonitrylu (10 mL) 3’-O-acetylo-tymidinę (50 mg; 1.1 mmol), po czym kolbę szczelnie zamknięto. Następnie dodano 1-H-tetrazolu (180 mg; 1,8 mmola) oraz otrzymaną według przykładu 1 2-/zopropylo-3-(piryd-2-yl)-[1,3,2]oksazafosfolidynę (260 mg; 1mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez ok. 2 godz. w temperaturze pokojowej, do momentu całkowitego przereagowania reagentów. Po zakończeniu reakcji, odparowano rozpuszczalnik a produkt reakcji oczyszczano na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym o rozmiarach cząstek 200 mesh. Jako fazę wymywającą stosowano mieszaninę rozpuszczalników benzenu i trójetylaminy, przy udziale objętościowym trójetylaminy w mieszaninie 10%. Następnie zebrane frakcje zawierające produkt reakcji 5'-[3-(piryd-2-yl)-[1,3,2]oksazafosfolidyno]-3'-O-acetylo tymidynę zatężono i poddano procesowi liofilizacji z suchego benzenu. W wyniku reakcji otrzymywano związek 5'-[3-(piryd-2-yl)-[1,3,2]oksazafosfolidyno]-3'-O-acetylo tymidynę.
Wydajność reakcji wynosi 70%. Otrzymany produkt ma postać białego ciała stałego, którą poddano analizie za pomocą metod spektroskopowych.
1H NMR (400 MHz, CDCla) δ (ppm) 8.9 (d, J = 4.95 Hz, 1H); 7.62-7.58 (m, 2H); 7.34 (s, 1H); 6.80-6.77 (m, 1H); 6.20-6.19 (m, 1H); 5.30-5.28 (m, 1H); 4.57-4.48 (m, 2H); 4.14-4.07 (m ,1H); 4.01-3.97 (m, 1H); 3.59-3.52 (m, 2H); 3.47-3.39 (m, 1H); 2.29-2.26 (m, 1H); 2.20-2.18 (m, 1H); 2.01 (s, 3H); 1.78 (d, J = 1.12 Hz, 3H).
13C NMR (75 MHz, CDaCN) λ (ppm) 170.6; 163.0; 156.2; 150.6; 138.3; 128.2; 115.4; 110.4; 107.6; 84.3; 83.6; 74.8; 69.3; 63.8; 45.8; 43.5; 36.9; 20.2; 11.6 31P NMR (121 MHz, DMSO) λ, (ppm) 131,47; 126,17
P r z y k ł a d 3
5’-trójfosforan-3’-O-acetylo tymidyny
Synteza według przykładu 2, w wyniku której otrzymano związek 5'-[3-(piryd-2-yl)-[1,3,2]oksazafosfolidyno]-3'-O-acetylo tymidynę stanowi element wyjściowy do otrzymania 5'-trójfosforanu-3'-O-acetylo tymidyny.
PL 231 078 Β1
W kolbie umieszczono rozpuszczony w bezwodnym acetonitrylu (2ml) otrzymaną według przykładu 2 5-0-[3-(piryd-2-ylo)-[1,3,2]oksafosfolidyno]-3’-0-acetylo tymidynę (45 mg, 0.1 mM, 1 eq.) o wzorze ogólnym 7, a następnie dodano pirofosforanu tri(tetra-n-butyloamoniowego) (135.35 mg, 0.15 mM, 1.5 eq). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, do momentu wytworzenia cyklicznego produktu przejściowego (31P NMR). Następnie do całości dodano jodu (38 mg, 0.15 mM, 1.5 eq) pirydynie (0.5 mL) zawierającej 10% objętościowych wody (v/v). Po około 3 minutach otrzymano oczekiwany 3’-0-acetylo tymidyn-5’-ylo trifosforan.
Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem a rozpuszczalniki odparowano. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i przemyto dwukrotnie 10 ml chlorkiem metylenu, po czym warstwę wodną odparowano. Produkt reakcji izolowano na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym stosując gradient wody w mieszaninie 2-propanolu i trietyloaminy przy udziale objętościowym trietyloaminy 3%.
Frakcje zawierające czysty produkt odparowano, a następnie poddano procesowi liofilizacji z dioksanu. W wyniku reakcji otrzymywano 5’-trójfosforan-3’-0-acetylo tymidyny.
Wydajność reakcji wynosi 56%. Otrzymany produkt ma postać białego higroskopijnego ciała stałego, który poddano analizie za pomocą metod spektroskopowych.
Przykład 4 ogólna metoda wymiany kationów w kwasach polifosforanowych na wymieniaczach jonowych 2,23 g (5 mmoli) pirofosforanu czterosodowego dziesięciowodnego rozpuszczono w 50 mililitrach wody podwójnie destylowanej o oporności 18 miliomów. Następnie roztwór przepuszczono przez kolumnę wypełnioną złożem DC)WEX-50WX8 H+. Frakcję zbierano w kolbie okrągłodennej zawierającej 2,78 g (15 mmoli) tributyloaminy rozpuszczonej w 20 ml absolutnego etanolu i mieszanej za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 0°C. Kolumnę przemywano wodą podwójnie destylowaną do momentu zmiany pH do wartości 7. Otrzymany roztwór odparowano i kilkukrotnie liofilizowano z wody z dodatkiem dioksanu, do uzyskania białego proszku. Otrzymano 2,5 g pirofosforanu tris(tri-n-butyloaminowego) (wydajność 69%).
Przykład 5 Zastosowanie wynalazku w syntezie trójfosforanów oligonukleotydów DNA i RNA na fazie stałej.
Cykliczny amidofosforyn według wzoru 6 rozpuszczono w acetonitrylu o stężeniu 0,2 mmola i umieszczono w naczyniu wypełnionym suchym argonem i przyłączonym do automatycznego syntetyzera DNA. Syntezę oligonukleotydów wykonano stosując następujące bloki syntetyczne:
1. usunięcie grupy dimetoksytrytylowej za pomocą 3% kwasu trójchlorooctowego w chlorku metylenu czas 1,5 minuty,
2. przyłączenie jednostki amidofosforyn owej w obecności roztworu 0,05 molowego roztworu tioterazolu w acetonitrylu,
3. zablokowanie nieprzereagowanych grup hydroksylowych przy pomocy bezwodnika octowego w obecności N-metyloimidazolu
4. utlenienie wiązania fosforynowego roztworem 0,5 molowym jodu w pirydynie.
Wykonano syntezy czterech oligonukleotydów dwóch w serii DNA i dwóch w serii RNA według tabelki 1. Po zakończeniu syntezy usunięto ostatnią grupę dimetoksytrytylową, a następnie wprowadzono do kolumny reakcyjnej roztwór amidosfosforyny o wzorze w obecności roztworu tiotereazolu. Czas kondensacji 12 minut. Po przemyciu kolumny reakcyjnej wprowadzono roztwór kwasu pirofosforanowego w obecności 0,5 molowego roztworu jodu w mieszaninie pirydyna/acetonitryl. Czas 30 minut.
Po zakończeniu i przemyciu oligonukleotydy odblokowano z podłoża za pomocą reagentu nukleofilowego dane w tabelce 1 kolumna 2.
Oligonukleotydy serii RNA poddano działaniu roztworu fluorku tetrabutylowego w tetrahydrofuranie przez okres 2 godzin w celu usunięcia grup ochronnych w pozycji 2’ a następnie wytrącono w metanolu i oczyszczano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Analogi trójfosforanowe oligonukleotydów były analizowane za pomocą spektrometrii masowej, a wyniki umieszczono w tabelce 1.
PL 231 078 Β1
Tabela 1.
OligonuMeotyd (typ) Użyty sposób odblokowania oligomeru
ρρρ-τητπττττττ (dna) stęż.roztwór amoniaku temp 25 °C czas 30 min.
ΡΡΡ-ΑΤΑΤΑΤΑΪΑΓΑΤΑ (DNA) stęż.roztwór amoniaku temp 25 °C czas 120 min.
ρρρ-υυυϋυϋυυυυυ (rna> roztwór A MA
PPP-AUCGAUCG (RNA) roztwór AMA
Zastrzeżenia patentowe

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
    O ho-f>~q
    ÓH o
    ii
    -?-oOH
    II
    -ί^-0-Χ
    OH n
    U) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę nukleozydu, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2
    ΟΗ-Χ (2) w którym X ma wyżej podane znaczenie, a odpowiednią podstawioną pochodną 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o wzorze ogólnym 3
    Ri-^—4-R.i
    R;; Rs (3) w którym • R-ι, R2, R3, R4 są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznaczają H lub CH3, atom halogenu, NO2, NH2, C2H5 • Re oznacza grupę NR9R10 gdzie Rg i R10 są takie same lub różne i oznaczają n-propyl, lub izopropyl, w obecności kwasu, a następnie produkt tej reakcji o ogólnym wzorze 4, i'1.1
    PL 231 078 Β1 w których R-ι, R2, R3, R4, R5, R6, R7 i X mają wyżej podane znaczenie, podaje się reakcji z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
    Rit o
    o © © Ri, “OH (5) w którym n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze ogólnym 6 lub wzorze ogólnym 7 {«} '1?
    -N-H
    M2 (?) gdzie podstawniki Ri2 oznaczają CH3 lub grupy CH2-Rn, w których R11 są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, a po zakończeniu reakcji produkt podaje się utlenianiu stosując nadmiar stechiometryczny jodu, po czym znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki Rn oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że jako kwas stosuje się 1-H-tetrazol lub 5-etylotio-1H-tetrazol.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że stosuje się w jod rozpuszczony w pirydynie.
  6. 6. Sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
    O
    HO~F>~0
    OH
    O π
    -rą-o
    OH tt ę o-/ OH (1) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę takiej jak nukleozydu, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 4,
    Re o
    R? R1-A.^rR4 R2 Rg (4)
    PL 231 078 Β1 • R-ι, R2, R3, R4 są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznaczają H lub CH3, atom halogenu, NO2, NH2, C2H5 a X ma wyżej podane znaczenie, z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
    R11 o
    o © ©
    Rn
    -OH (5) w którym n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub o wzorze 7,
    Rl2~N—R-I2 {«} *N~H
    M2 (?) gdzie podstawniki Ri2 oznaczają CH3 lub grupy CH2-Rn w których R11 są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, a po zakończeniu reakcji produkt podaje się utlenianiu stosując nadmiar stechiometryczny jodu, po czym znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki Rn oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
  8. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
  9. 9. Sposób według zastrz. 6 albo 7 albo 8, znamienny tym, że stosuje się w jod rozpuszczony w pirydynie.
  10. 10. Sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
    O
    HQ~F>~O
    O il
    OH
    II ? Q'.X
    OH n
    (1) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę nukleozydu, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 2
    ΟΗ-Χ (2) w którym X ma wyżej podane znaczenie, a odpowiednią podstawioną pochodną 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o wzorze ogólnym 3
    PL 231 078 Β1
    Rr
    .....
    (3) w którym • R-ι, R2, R3, Rż są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznaczają H lub CH3, atom halogenu, NO2, NH2, C2H5, • Rg oznacza grupę NR9R10 gdzie Rg i R10 są takie same lub różne i oznaczają n-propyl lub izopropyl w obecności słabego kwasu, a następnie produkt tej reakcji o ogólnym wzorze 4, w którym R1, R2, R3, R4, R5, R5, R7 i X mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji utleniania za pomocą jodu, i otrzymuje się tlenek odpowiednio podstawionej pochodnej 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o ogólnym wzorze 8
    Rf r6 />
    Rs x p,.o 'Q < r3 (8) który z kolei podaje się reakcji z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
    © © 9 0 Π 0 ψ 0 © © Rit Ru
    (5) w którym n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7,
    R^—N“R-j2 &12 (6) '1?
    “N~H
    M2 (7)
    PL 231 078 Β1 gdzie podstawniki R12 oznaczają CH3 lub grupy CH2-R11 w których Rn są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, po czym znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki R11 oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
  12. 12. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
  13. 13. Sposób według zastrz. 10 albo 11 albo 12, znamienny tym, że jako słaby kwas stosuje się 1-H-tetrazol lub 5-etylotio-1H-tetrazol.
  14. 14. Sposób według zastrz. 10 albo 11 albo 12 albo 13, znamienny tym, że stosuje się w jod rozpuszczony w pirydynie.
  15. 15. Sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
    O O
    II SI
    HO-P-O-P-O
    OH
    OH
    O
    H ę-oOH n
    (I) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę nukleozydu, znamienny tym, że, polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 4, w którym • R1, R2, R3, R4 są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznacza H lub Chwatom halogenu NO2, NH2, C2H5 a X ma wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji utleniania za pomocą jodu, i otrzymuje się tlenek odpowiednio podstawionej pochodnej 2-pirydylo-[1,3,2]oksazafosfolidyny o ogólnym wzorze 8
    R6
    Ar '0 —AR4 r2 r3 (8) który z kolei podaje się reakcji z solą amoniową kwasu polifosforanowego o ogólnym wzorze 5
    Ml © 9
    O“p rw®
    Rn
    O
    Π o
    © ©
    R11
    OH w którym n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7,
    PL 231 078 Β1 *12 ’N—R-|2
    M2 («>
    r12-n-h
    M2 (?) gdzie podstawniki R12 oznaczają CH3 lub grupy Chk-Rn w których Rn są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, a po zakończeniu reakcji znanymi sposobami izoluje się związek o wzorze ogólnym 1.
  16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jednowodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki R11 oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
  17. 17. Sposób według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwukrotny nadmiar soli amoniowej kwasu polifosforanowego.
  18. 18. Sposób według zastrz. 15 albo 16 albo 17, znamienny tym, że stosuje się w jod rozpuszczony w pirydynie.
  19. 19. Sposób syntezy polifosforanów organicznych o ogólnym wzorze 1,
    O
    HG-F>~0
    OH
    O il
    OH
    II łj»-O~X
    OH (I) w którym n przyjmuje wartość od 0 do 2 zaś X oznacza resztę oligonukleotydu lub kwasu nukleinowego, realizowany na podłożach stałych, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o ogólnym wzorze 2
    Χ-ΟΗ (2) w którym X ma wyżej podane znaczenie, a związkiem o ogólnym wzorze 3 Ra
    R2 R2 (3) 'Rs ,>h-%
    .....
    w którym • R1, R2, R3, R4 są takie same lub różne i oznaczają H lub nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, nienasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, fenyl, • R5 oznacza CH, • R6 i R7 oznaczają H lub CH3, atom halogenu, NO2, NH2, C2H5 • Re oznacza NR9R10 gdzie Rg i R10 są takie same lub różne i oznaczają n-propyl lub izopropyl, w obecności słabego kwasu, a następnie po zakończeniu reakcji usuwa się nadmiar rozpuszczalników i przemywa kolumny suchym acetonitrylem po czym na kolumnę podaje się mieszaninę soli amoniowej kwasu polifosforanowego, o ogólnym wzorze 5 ® θ »
    O
    Θ
    Ru'
    OH (5)
    PL 231 078 Β1 w którym n przyjmuje wartości od 0 do 2 a Rn oznacza grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7,
    R-,2 Ń R-j2 («>
    -N-H *12 (?) gdzie podstawniki R12 oznacza CH3 lub grupy CH2-R11 w których R11 są takie same lub różne i oznaczają nasycony alkil o długości łańcucha od 1 do 8 węgli, z jodem w obecności pirydyny, przy czym stosuje się co najmniej 20 krotny nadmiar stechiometryczny mieszaniny kwasu i jodu względem dostępnych grup hydroksylowych powstających w wyniku wzrostu kwasu nukleinowego na powierzchni fazy stałej a następnie po zakończeniu reakcji izoluje się produkt znanymi metodami.
  20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się sól amoniową kwasu polifosforanowego jedno wodorowego o ogólnym wzorze 5 gdzie wszystkie podstawniki Rn oznaczają grupę o wzorze 6 lub grupę o wzorze 7.
  21. 21. Sposób według zastrz. 19 albo 20, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę soli amoniowej kwasu polifosforanowego jednowodorowego z jodem w stosunki od 1:0,8 do 0,8:1.
  22. 22. Sposób według zastrz. 19 albo 20 albo 21, znamienny tym, że stosuje się co najmniej 50 nadmiar stechiometryczny mieszaniny kwasu i jodu.
  23. 23. Sposób według zastrz. 19 albo 20 albo 21 albo 22, znamienny tym, że jako słaby kwas stosuje się 1-H-terazol, 5-Etylotio-1H-Tetrazole, 4,5-dicyjanoimidazol, 5-Benzylotio-1 H-Tetrazole, kwas octowy.
PL400248A 2012-08-05 2012-08-05 Sposób syntezy polifosforanów PL231078B1 (pl)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL400248A PL231078B1 (pl) 2012-08-05 2012-08-05 Sposób syntezy polifosforanów
PCT/PL2013/000098 WO2014025272A1 (en) 2012-08-05 2013-07-29 New method of polyphosphate synthesis
US14/412,951 US9376460B2 (en) 2012-08-05 2013-07-29 Method of polyphosphate synthesis
EP13750163.1A EP2880044B1 (en) 2012-08-05 2013-07-29 New method of polyphosphate synthesis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL400248A PL231078B1 (pl) 2012-08-05 2012-08-05 Sposób syntezy polifosforanów

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL400248A1 PL400248A1 (pl) 2014-02-17
PL231078B1 true PL231078B1 (pl) 2019-01-31

Family

ID=48986196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL400248A PL231078B1 (pl) 2012-08-05 2012-08-05 Sposób syntezy polifosforanów

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9376460B2 (pl)
EP (1) EP2880044B1 (pl)
PL (1) PL231078B1 (pl)
WO (1) WO2014025272A1 (pl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3455232B1 (en) * 2016-05-12 2020-05-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Enhanced coupling of stereodefined oxazaphospholidine phosphoramidite monomers to nucleoside or oligonucleotide
CN109680342B (zh) * 2018-12-18 2021-09-28 上海药明康德新药开发有限公司 DNA编码化合物库中On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法
CN113354545B (zh) * 2020-03-06 2023-06-23 深圳华大生命科学研究院 一种焦磷酸盐及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20150203524A1 (en) 2015-07-23
EP2880044A1 (en) 2015-06-10
EP2880044B1 (en) 2019-11-27
PL400248A1 (pl) 2014-02-17
WO2014025272A1 (en) 2014-02-13
US9376460B2 (en) 2016-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2705913B2 (ja) インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法
US7795423B2 (en) Polynucleotide labeling reagent
US5545730A (en) Multifunctional nucleic acid monomer
US5367066A (en) Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
WO2002020537A2 (en) Linker phosphoramidites for oligonucleotide synthesis
CN109311925A (zh) 立体限定的氧杂氮杂磷杂环戊烷亚磷酰胺单体与核苷或寡核苷酸的增强的偶联
US20220002334A1 (en) Phosphorous protecting groups and methods of preparation and use thereof
US20100093990A1 (en) Nucleotide with an Alpha-Phosphate Mimetic
US5252760A (en) Method of using colored phosphorylating reagents
PL231078B1 (pl) Sposób syntezy polifosforanów
JP5194256B2 (ja) ２’水酸基修飾リボヌクレオシド誘導体
Powles et al. Reactive intermediates in the H-phosphonate synthesis of oligonucleotides
CN102532199B (zh) 核苷类化合物之新型苄基胺基磷酸酯前药的结构与合成
US5332845A (en) Phosphorylating reagents
EP1308452B1 (en) Oligonucleotide labeling reactants based on acyclonucleosides and conjugates derived thereof
US10927140B2 (en) Compositions and methods for reverse automated nucleic acid synthesis
JP4805143B2 (ja) ２‘水酸基を修飾された新規人工ｒｎａ
US20150361124A1 (en) Method for the solid-phase based synthesis of phosphate-bridged nucleoside conjugates
Lavéna et al. Synthetic studies on the preparation of nucleoside 5'-H-phosphonate monoesters under the Mitsunobu reaction conditions.
JP2007077043A (ja) ピロリン酸アナログ及びピロリン酸アナログ合成方法
PL170146B1 (pl) Sposób wykrywania obecnosci danej sekwencji oligonukleotydowej PL
PL171314B1 (pl) Sposób wytwarzania pochodnych kwasu ditiofosforowego
JP2005162631A (ja) 新規ヌクレオチドアナログ