PL229532B1

PL229532B1 - Żelowy preparat soli sodowej heparyny do podawania naskórnego

Info

Publication number: PL229532B1
Application number: PL408371A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof BILMIN; Krzysztof Bilmin; Paweł GRIEB; Paweł Grieb; Piotr SZOPIŃSKI; Piotr Szopiński; Marek LAGNER; Marek Lagner; Magdalena PRZYBYŁO; Magdalena Przybyło
Original assignee: Lipolek Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2018-07-31
Also published as: PL408371A1; WO2015181746A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest żelowy preparat soli sodowej heparyny przeznaczony do stosowania naskórnego jako produkt leczniczy lub kosmetyk.

Heparyna jest dobrze rozpuszczalnym w wodzie liniowym polimerem węglowodanowym pochodzenia naturalnego, charakteryzującym się dużą zawartością grup sulfonowych i wysokim ładunkiem ujemnym w roztworze wodnym. Substancja ta znalazła szerokie zastosowanie w medycynie, przede wszystkim jako składnik czynny leków i parafarmaceutyków o działaniu układowym bądź miejscowym, których zadaniem jest przede wszystkim zapobieganie krzepnięciu krwi i tworzeniu się skrzepów krwi w naczyniach krwionośnych.

W krajach Unii Europejskiej heparyna w postaci substancji przeznaczona do celów farmaceutycznych - tzw. heparyna wieprzowa API (skrót od Active Pharmaceutical Ingredient) jest pozyskiwana ze śluzu jelitowego świń będącego odpadem poubojowym i następnie oczyszczana zgodnie z wymogami farmakopealnymi. Heparyna wieprzowa jest polidyspersyjnym polimerem, której łańcuchy mają ciężar cząsteczkowy zawarty w przedziale 3-30 kD, a średni ciężar cząsteczkowy wynosi 15,5-17,0 kD (Sommers C.D., Ye H., Koliński R.E., Nasr M., Buhse L.F., Al-Hakim A., Keire D.A., Characterization of currently marketed heparin products: analysis of molecular weight and heparinase-l digest patterns, Anal. Bioanal. Chem. 2011 ;401:2445-2454). Heparyna API ma najczęściej postać soli sodowej. Jej aktywność farmakologiczną wyraża się w jednostkach międzynarodowych (IU), przy czym aktywność heparyny wieprzowej API nie może być mniejsza niż 180 lU/mg. Zastosowania medyczne znalazły także heparyny niskocząsteczkowe o średniej masie cząsteczkowej <8,0 kD, otrzymywane poprzez częściową depolimeryzację heparyny przeprowadzaną chemicznie, fizycznie lub enzymatycznie. Przykładową niskocząsteczkową heparyną jest enoksaparyna. W porównaniu z wpływem heparyny, wpływ heparyn niskocząsteczkowych na układ krzepnięcia jest zmodyfikowany, co skutkuje lepszym stosunkiem korzyści do ryzyka, szczególnie po podaniu dożylnym (Bhaskar U., Sterner E., Hickey A.M., Onishi A., Zhang F., Dordick J.S., Linhardt R.J., Engineering of routes to heparin and related polysaccharides, Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:1-16, 2012).

Formulację heparyny i heparyn frakcjonowanych przeznaczone do iniekcji dożylnych lub podskórnych znajdują się w obrocie handlowym w postaci leków sprzedawanych na receptę, gdyż ich działanie przeciwkrzepliwe jest silne i mogą mu niekiedy towarzyszyć poważne i niebezpieczne skutki uboczne, takie jak krwawienia wewnątrzustrojowe. W zależności od wskazania stosowane są różne dawki heparyny bądź jej pochodnych. Dla przykładu, w leczeniu świeżego zawału serca podaje się w ciągu doby nie mniej niż 37000 IU heparyny w ciągłym wlewie dożylnym, podczas gdy w profilaktyce zakrzepicy żył głębokich i zatorowości płucnej po operacjach chirurgicznych podaje się 5000 IU podskórnie dwa lub trzy razy na dobę (Hirsh J, Dalen J, Guyatt G; American College of Chest Physicians. The sixth (2000) ACCP guidelines for antithrombotic therapy for prevention and treatment of thrombosis, American College of Chest Physicians, Chest 2001; 119 (1 Suppl): 1S-2S.). Dostępność tylko na recepty lekarskie i konieczność wstrzykiwania dożylnego lub podskórnego ograniczają zakres stosowania iniekcyjnych formulacji heparyny do stanów chorobowych wymagających interwencji lekarskiej.

W obrocie handlowym znajdują się także formulację heparyny przeznaczone do podawania naskórnego. Mają one postać kremów, maści lub aerozoli i są dostępne bez recepty jako parafarmaceutyki przeznaczone do samoleczenia, stosowane m.in. w przypadku żylaków kończyn dolnych i związanego z tym zagrożenia zakrzepicą żył powierzchniowych, a także obrzęków, bólu i uczucia ciężkości nóg, bądź jako dermokosmetyki (kosmetyki medyczne) poprawiające kondycję skóry. Dla niektórych naskórnych preparatów zawierających heparynę wykazano pewną skuteczność kliniczną, choć nie obserwowano efektów układowych w postaci zmniejszenia krzepliwości krwi krążącej. Z tego względu uważa się, że skuteczność preparatów heparyny do podawania naskórnego w porofilaktyce zakrzepicy żył powierzchniowych jest znacząco niższa, niż skuteczność dożylnych lub podskórnych wstrzyknięć heparyny lub heparyn niskocząsteczkowych (Vecchio C., Frisinghelli A., Topically applied heparins for the treatment of vascular disorders: a comprehensive review, Clin. Drug lnvestig. 2008; 28: 603-614). Wyjątkiem jest preparat w postaci aerozolu zawierający liposomalną heparynę, którego skład zgodny jest z patentem nr EP0704206 udzielonym na rzecz niemieckiej firmy MikaPharma. Badania porównawcze aerozolu zawierającego heparynę wg tego wynalazku i podskórnego podawania heparyny niskocząsteczkowej (enoksaparyny) wykazały, że oba preparaty cechuje porównywalna skuteczność w zapobieganiu zakrzepicy żył płytkich kończyn dolnych (Górski G., Szopiński P., Michalak J., Marianowska A., Borkowski M., Geremek M., Trochimczuk M., Bratanek

PL 229 532 Β1

J., Sarnik S., Semenka J., Wilkowski D., Noszczyk W., Liposomal heparin spray: a new formula in adjunctive treatment of superficial venous thrombosis, Angiology 2005; 56:9-17; Katzenschlager R., Ugurlouglu A., Sipos G., Bihari I., Anyova E.B., Hirschl M., Maruszynski M., Noszczyk W., Rybak Z., Cencora A., Efficacy and tolerability of liposomal heparin spraygel as an add-on treatment in the management of superficial venous thrombosis, Angiology 2007; 58, Suppl 1:27S-35S; Katzenschlager R., Ugurluoglu A., Minar E., Hirschl M., Liposomal heparin-spraygel in comparison with subcutaneous Iow molecular weight heparin in patients with superficial venous thrombosis. A Randomized, controlled, open multicentre study, Journal fur Kardiologie - Austrian Journal of Cardiology 2003; 10:375-378). Jednak aerozolowa postać tej formulacji stanowi jej wadę, gdyż aerozol jest niechętnie stosowany przez pacjentów, kojarząc się raczej z kosmetykiem takim jak dezodorant, niż z lekiem lub kosmetykiem medycznym. Ponadto natryskiwanie preparatu na chorobowo zmienioną skórę może być źródłem przykrego odczucia zimna, co jest skutkiem zastosowania alkoholu etylowego jako substancji pomocniczej.

W literaturze naukowej opisano także liposomowe postacie heparyn niskocząsteczkowych (Song Y.K., Kim C.K., Topical delivery of low-molecular-weight heparin with surface-charged flexible liposomes, Biomaterials 2006; 27:271-280; Song Y.K., Hyun S.Y., Kim H.T., Kim C.K., Oh J.M., Transdermal delivery of Iow molecular weight heparin loaded in flexible liposomes with bioavailability enhancement: comparison with ethosomes, J. Microencapsul. 2011; 28:151 -158). Heparyny niskocząsteczkowe, ze względu na niższy ciężar cząsteczkowy łańcuchów węglowodanowych przenikają przez skórę lepiej niż heparyna niefrakcjonowana (Betz G., Nowbakht P., Imboden R., Imanidis G., Heparin penetration into and permeation through human skin from aąueous and liposomal formulations in vitro, Int. J. Pharm. 2001;228:147-159.).

Aby zwiększyć wydajność przenikania substancji czynnych przez skórę do preparatów dermatologicznych i kosmetycznych dodaje się często substancje zwane wspomagaczami przenikania (ang. permeability enhancers). Najczęściej są to detergenty, substancje amfifilowe, terpeny czy alkohole, które stosuje się w celu destabilizacji lipidowej frakcji zrogowaciałej części naskórka (Kanikkannan, N., Kandimalla, K., Lamba, S. S., and Singh, M. (2000) „Structure-activity relationship of Chemical penetration enhancers in transdermal drug delivery” Curr Med Chem 7, 593-608). Stosowaniu tego typu substancji często towarzyszy podrażnienie lub wysuszenie powierzchni skóry. W przypadku, gdy stosowany jest alkohol etylowy pacjent odczuwa nieprzyjemne schłodzenie skóry wywołane parowaniem alkoholu. Bogate w cysteinę enzymy proteolityczne pochodzenia roślinnego, takie jak papaina i bromelaina, znalazły liczne zastosowania w kosmetologii i dermatologii kosmetycznej. Dla przykładu bromelaina, enzym otrzymywany z ananasa, stosowana jest do oczyszczania ran spowodowanych oparzeniami skóry i do usuwania strupów (Rosenberg L, Krieger Y, Silberstein E, Amon O, Sinelnikov IA, Bogdanov-Berezovsky A, Singer AJ. Selectivity of a bromelain based enzymatic debridement agent: a porcine study. Burns 2012; 38:1035-1040). Papaina stosowana jest naskórnie w celu poprawienia stanu skóry poprzez usunięcie lub przejściową destabilizację białkowej macierzy międzykomórkowej, co pozwala na ogólną poprawę stanu skóry oraz usunięcie niektórych jej niejednorodności czy blizn (S.J. Baik, B.Y. Kong, E.J. Kim, Cosmetic composition for exfoliating skin keratin, US Patent Application 2010/0254969 A1; Manosroi, A., Chankhampan, C., Manosroi, W., Manosroi, J. Transdermal absorption enhancement of papain loaded in elastic niosomes incorporated in gel for scar treatment, Eur J Pharm Sci 2013; 48: 474-483). Ponieważ wspomniane roślinne enzymy proteolityczne często nie są stabilne w kosmetykach i postaciach leku do podawania naskórnego, opracowane zostały różne stabilne pochodne tych enzymów, na przykład koniugat papainy z chitosanem (Kilinc A., Onal S., Telefoncu A., Stabilization of papain by modification with chitosan. Turk. J. Chem. 2002; 26:311-316) i bromelaina zmodyfikowana grupami bezwodnikowymi [Y. Xue, C.Y. Wu, C.J. Branford-White, X. Ning, H.-L. Nie, L-M. Zhu, Chemical modification of stem bromelain with anhydride groups to enhance its stability and catalytic activity, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 63 (2010) 188-193). Enzymy proteolityczne i ich stabilizowane pochodne, chociaż powszechnie stosowane w kosmetologii oraz w dermatologii kosmetycznej, nigdy wcześniej nie były użyte jako składniki preparatów heparyn do podawania naskórnego.

Przedmiotem wynalazku jest żel zawierający sól sodową heparyny z domieszką enzymów proteolitycznych, przeznaczony do stosowania jako produkt leczniczy lub kosmetyk, który charakteryzuje się trwałością wymaganą dla takich preparatów, a jednocześnie zwiększa wydajność przechodzenia heparyny przez skórę.

Żel z heparyną może zawierać substancje pomocnicze w postaci polimerów (np. hydrożeli) i struktury lipidowe, których zadaniem jest spowolnienie parowania wody oraz zwiększenie wydajności

PL 229 532 Β1 przechodzenia substancji czynnej (heparyny) przez skórę. Zawiesina neutralnych agregatów lipidowych w wodzie ma tendencję do agregacji i ewentualnej fuzji, co w znaczący sposób zmienia jej właściwości wpływając w ten sposób na profile uwalniania substancji czynnej. Aby ustabilizować zawiesinę agregatów lipidowych stosowane są dwa rozwiązania; wprowadzenie na powierzchnię agregatu ładunku elektrostatycznego oraz zastosowanie polimerów, sferycznie stabilizujących zawiesinę agregatów lipidowych. Te dwie modyfikacje samodzielnie lub w kombinacji zapobiegają agregacji i ewentualnej fuzji liposomów (Allen, T. M. and E. H. Moase: Therapeutic opportunities for targeted liposomal drug delivery. Adv Drug Deliv Rev, 1996 21: 117-123; Barenholz, Y.: “Liposome application: problems and prospects. Curr Opin Colloid & Interf. Sci, 2001, 6: 66-77; Heurtault, B., P. Saulnier, et ai.: Physico-chemical stability of colloidal lipid particles. Biomaterials, 2003 24: 4283-4300). Związanie silnie naładowanej ujemnie heparyny z powierzchnią agregatów lipidowych pozwala ustabilizować elektrostatycznie powstałe w ten sposób agregaty. Agregaty lipidowe ze związaną heparyną posiadają ujemny wypadkowy ładunek powierzchniowy, jak pokazano w załączonych przykładach (Fig. 1-5). Efekt stabilizacji liposomów przez heparynę był także obserwowany wcześniej przez innych (Han, H. D., A. Lee, et ai.: In vivo distribution and antitumor activity of heparin-stabilized doxorubicinloaded liposomes. International J. Pharmaceutics 2006 313:181-188). Dodatkowo przestrzenne połączenie heparyny z agregatami lipidowymi stabilizuje integralność chemiczną lipidów, poprawiając w ten sposób stabilność chemiczną preparatu będącego przedmiotem wynalazku (Albertini, R., S. Rindi, et ai.: Heparin protection against Fe2+- and Cu2+- mediated oxidation of liposomes. Febs. Letters 1996, 383 (3): 155— 158). Dodanie do formulacji hydrożelu, korzystnie 0,5%, dodatkowo stabilizuje agregaty poprzez ich przestrzenną separację (Mufamadi, M. S., V. Pillay, et ai.: A review on composite liposomal technologies for specialized drug delivery. J. Drug Delivery, 2011). W przeciwieństwie do przedstawionego wynalazku istniejące na rynku najskuteczniejsze preparaty liposomowe zawierające heparynę (np. Lipohep) nie spełniają kryterium stabilności fizykochemicznej, co znacząco obniża ich skuteczność.

Wydajność przenikania substancji czynnych przez skórę zależy do dwóch czynników; stanu stratum comeurn oraz stężenia substancji czynnej w roztworze wodnym na powierzchni skóry. Zastosowanie heparyny samodzielnie skutkuje brakiem jej przenikania do skóry właściwej, ponieważ nie jest ona w stanie samodzielnie przeniknąć bariery stratum comeurn. Dodatkowo w wyniku parowania wody szybko wytrąca się na powierzchni skóry co skutkuje niską trwałością funkcjonalną preparatu na powierzchni skóry. Z tego powodu preparaty tego typu mają znikomą skuteczność. Innym rozwiązaniem jest połączenie heparyny z hydrofobową bazą co ogranicza wytrącanie się heparyny na powierzchni skóry, jednakże w tym przypadku mały kąt zwilżania powoduje, że powierzchnia kontaktu preparatu ze skórą jest ograniczona co zmniejsza lub wręcz uniemożliwia transport heparyny. Połączenie roztworu heparyny z hydrożelem spowalnia parowanie wody oraz zapewnia dobry kontakt ze skórą, jednakże zarówno w tym jak i poprzednich rozwiązaniach bariera stratum comeurn zostaje nienaruszona. Takie rozwiązanie także cechuje się znikomą skutecznością wynikającą z niewielkiego strumienia heparyny przenikającego do skóry właściwej. Połączenie heparyny z agregatami lipidowymi formowanymi z lipidów naturalnych (jak to ma miejsce w LipoHepie) korzystnie wpływa na przepuszczalność stratum corneum jednakże szybkie parowanie ogranicza ilość heparyny wnikającej do skóry właściwej (Cevc, G., G. Blume, et ai.: The skin: A pathway for systemie treatment with patches and lipid-based agent carriers. Advanced Drug Delivery Reviews, 1996,18(3): 349-378). Ponadto dostępny preparat liposomowy o nazwie handlowej LipoHep zawiera w swoim składzie znaczne ilości alkoholu etylowego (4-6%) co może skutkować podrażnieniem skóry.

Rozwiązanie zastosowane w przedstawionym wynalazku charakteryzuje się tym, że sól sodowa heparyny może być zaabsorbowana na powierzchni stabilnych liposomów lub znajdować się w matrycy hydrożelu co powoduje, że znacząco spowolniony jest proces parowania wody (Fig. 6). Dodatkowo substancje pomocnicze, tj. lipidy w postaci liposomów, hydrożel (tj. substancja polimerowa, w szczególności z grupy: polisacharydów naturalnych, pochodnych węglowodanów, białek i polimerów syntetycznych), bądź oba razem, w każdym przypadku wraz z enzymem proteolitycznym działają synergistycznie na stratum corneum przejściowo zwiększając jego przepuszczalność dla substancji hydrofilowych w tym dla heparyny. Fakt ten zilustrowany jest na Fig. 8 gdzie przenikanie przez skórę substancji hydrofilowych zilustrowane jest na przykładzie karboksyfluoresceiny. (OECD- #428). Liposomy modyfikują frakcję lipidową skóry natomiast enzymy proteolityczne destabilizują białkową frakcję naskórka.

Wszystko to powoduje, że wnikanie heparyny do skóry właściwej jest zwiększone. (Fig. 7 i Fig. 9).

Będący przedmiotem wynalazku preparat (Przykład 4) zapewnia znacznie zwiększony strumień heparyny przez skórę, mierzony na modelu in vitro. Fig. 7 i Fig. 9 pokazują kumulatywne ilości heparyny

PL 229 532 Β1 w przedziale trans, mierzony na modelu Franza dla preparatu będącego przedmiotem wynalazku i najskuteczniejszego do tej pory na rynku Liotonu (OECD- #428).

Istotą rozwiązania według wynalazku jest preparat soli sodowej heparyny do zastosowań naskórnych, o lepkości nie mniejszej niż 7000 cP, charakteryzujący się tym, że w jego skład wchodzą: sól sodowa heparyny hydrożel bądź liposomy, lub oba razem; enzym proteolityczny roślinnego pochodzenia a ponadto, rozpuszczalniki organiczne, bufor oraz opcjonalnie: chitosan, konserwanty, przeciwutleniacze oraz substancje żelujące.

Korzystnie, ogólne stężenie heparyny w formulacji wynosi od 0,01 do 10% wagowych, korzystnie 2,4% wagowych.

Korzystnie, budulcem liposomów jest fosfatydylocholina, korzystnie 1,2-palmitylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina.

Korzystnie, ogólne stężenie 1,2-palmitylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny wynosi od 0% do 30% wagowych, korzystnie 10% wagowych.

Korzystnie, budulcem liposomów jest fosfatydylocholina zmieszana z czwartorzędowym związkiem amonowym z grupy tenzydów, korzystnie chlorkiem benzalkoniowym.

Korzystnie, ogólne stężenie substancji kationowej wynosi od 0-80 mol% względem fosfatydylocholiny, korzystnie 40 mol%.

Korzystnie, w jej skład wchodzą liposomy jednowarstwowe.

Korzystnie, w skład preparatu soli sodowej heparyny wchodzą liposomy wielowarstwowe.

Korzystnie, w skład preparatu soli sodowej heparyny wchodzi mieszanina jednowarstwowych i wielowarstwowych liposomów.

Korzystnie, heparyna znajduje się w formie niezwiązanej z liposomami.

Korzystnie, heparyna znajduje się w formie związanej z liposomami.

Korzystnie, w skład preparatu soli sodowej heparyny wchodzi enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina, lub stabilizowana pochodna tego enzymu.

Korzystnie, ogólne stężenie enzymu proteolitycznego lub jego stabilizowanej pochodnej wynosi od 0,01 do 10% wagowych.

Korzystnie, enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina, lub jego stabilizowana pochodna znajduje się na zewnątrz liposomów.

Korzystnie, enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina lub jego stabilizowana pochodna znajduje się wewnątrz liposomów.

Korzystnie, enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina lub jego stabilizowana pochodna znajduje się wewnątrz i na zewnątrz liposomów.

Korzystnie, ogólne stężenie chitosanu wynosi od 0 do 10% wagowych.

Korzystnie, organicznymi rozpuszczalnikami są związki z grupy alkoholi dwu hydroksylowych.

Korzystnie, ogólne stężenie alkoholu dwu hydroksyl owego wynosi od 0 do 30% wagowych, korzystnie 10%.

Korzystnie, organicznymi rozpuszczalnikami są związki z grupy alkoholi krótkołańcuchowych, korzystnie długości łańcuchów c2-c4.

Korzystnie, organicznymi rozpuszczalnikami są związki z grupy halogenków alkilu.

Korzystnie, ogólne stężenie rozpuszczalnika organicznego wynosi nie więcej niż 0,5% wagowych formulacji.

Korzystnie, substancją buforującą jest kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)piperazyn-1-ylo)etanosulfonowy soli sodowej heparyny według zastrz. 24, znamienny tym, że pH buforu (kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)piperazyn-1-ylo)etanosulfonowy) mieści się w przedziale między 6,0 a 8,0.

Korzystnie, przeciwutleniaczem jest disodu edetynian.

Korzystnie, konserwantem jest metylu parahydroksybenzoesan.

Korzystnie, substancją żelującą jest kopolimer akryloamidometylopropanosiarczan amonu i winylopirolidonu.

Korzystnie, ogólne stężenie kopolimeru akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu wynosi od 0 do 5% wagowych.

Zastosowanie nanostruktur lipidowych w naskórnej kompozycji żelu zwiększa biodostępność heparyny, a ponadto zastosowane nanostruktury tworzą cienką warstewkę lipidową, modyfikującą lipidową frakcję naskórka oraz zabezpieczającą maść przed zbyt szybkim wysychaniem, wydłużając tym samym czas wchłaniania heparyny oraz zwiększając jego efektywność. Dodatkowo obecność enzymu proteolitycznego destabilizuje białkowe składniki naskórka wspomagając proces wchłaniania heparyny.

PL 229 532 Β1

Nanostruktury wytworzone według poniższych przykładów poddano standardowemu pomiarowi rozmiarów metodą dynamicznego rozpraszania światła wykazując ich jednorodność a znak i wielkość ich ładunku powierzchniowego określana jest za pomocą pomiaru zeta-potencjału.

Pomiar wielkości i zeta-potencjału nanostruktur wykonano w fazie wodnej przed dodaniem substancji żelującej.

W wyniku przeprowadzenia przedstawionej powyżej procedury uzyskano nanostrukturę. Heparyna obdarzona ładunkiem ujemnym skondensowana jest na powierzchni chitosanu. Ze względu na anizotropowy charakter rozkładu ładunku na powierzchni polimeru (heparyny) po związaniu z chitosanem, agregat wykazuje w dalszym ciągu ładunek ujemny (Fig. 4). W celu zneutralizowania i ustabilizownia agregatu w kolejnym kroku dodawany jest lipid z rozpuszczalnika organicznego o wypadkowym ładunku dodatnim, stabilizujących nano-agregat. Agregat przeprowadza się do fazy wodnej w obecności neutralnych cząstek amfifilowych, gwarantujących jednorodny rozkład kompleksu. Zewnętrzna warstwa uformowana jest z neutralnego lipidu co powoduje, że nanostruktura łatwo rozpuszcza się w wodzie i wykazuje jednorodny rozkład rozmiarów (Fig. 3, Fig. 5).

Wynalazek jest zilustrowany przez następujące przykłady i odpowiedni rysunek, na którym:

Fig. 1 zawiera panel lewy przedstawiający dystrybucję rozmiarów chitosanu w buforze o pH 6.5 oraz panel prawy przedstawiający dopasowanie funkcji korelacyjnej do danych eksperymentalnych dla roztworu chitosanu w buforze o pH 6.5.

Fig. 2 zawiera panel lewy przedstawiający dystrybucję rozmiarów heparyny skondensowanej na powierzchni chitosanu w buforze o pH 6.5. oraz panel prawy przedstawiający dopasowanie funkcji korelacyjnej do danych eksperymentalnych dla roztworu heparyny z chitosanem w buforze o pH 6.5.

Fig. 3 zawiera panel lewy przedstawiający dystrybucję rozmiarów heparyny skondensowanej na powierzchni chitosanu w otoczkach z dwuwarstwy lipidowej w buforze o pH 6.5, z dodatkiem jonów wapnia oraz panel prawy przedstawiający dopasowanie funkcji korelacyjnej do danych eksperymentalnych dla roztworu heparyny z chitosanem w otoczkach z dwuwarstwy lipidowej buforze z dodatkiem jonów wapnia o pH 6.5.

Fig. 4 zawiera panel lewy przedstawiający rozkład potencjału zeta agregatów heparyny z chitosanem w roztworze wodnym (widoczna wyraźnie ujemna (-40 Mv) średnia wartość potencjału zeta) oraz panel prawy przedstawiający odpowiadający rozkładowi na panelu lewym wykres fazowy.

Fig. 5 zawiera panel lewy przedstawiający rozkład potencjału zeta agregatów heparyny z chitosanem w roztworze wodnym (widoczna wyraźnie zwiększona wartość potencjału zeta przesunięta w kierunku wartości dodatnich (-6,8 mV) średnia wartość potencjału zeta) oraz panel prawy przedstawiający odpowiadający rozkładowi na panelu lewym wykres fazowy.

Fig. 6 przedstawia krzywe parowania uzyskane dla formulacji heparyny preparat liposomowy, o składzie podanym w przykładzie 1 (-A-) w porównaniu do preparatu komercyjnego LipoHep (- ♦ -).

Fig. 7 przedstawia kumulatywne ilości heparyny w przedziale trans mierzone na modelu Franza dla preparatu będącego przedmiotem wynalazku (Przykład 4) oraz rynkowego odpowiednika (LipoHep)

Fig. 8 przedstawia kumulatywne ilości hydrofitowego znacznika fluorescencyjnego carboksy-fluoresceiny w przedziale trans mierzone na modelu Franza dla preparatu będącego przedmiotem wynalazku (P2 - formulacja z przykładu 4) oraz rynkowego odpowiednika (Lioton). Uzyskany wynik pokazuje zwiększone przechodzenie przez model skóry (dla formulacji z przykładu 4; P2) substancji hydrofitowych w obecności enzymu proteolitycznego (5% wagowy papainy).

Fig. 9 przedstawia kumulatywne ilości heparyny w przedziale trans mierzone na modelu Franza dla preparatu będącego przedmiotem wynalazku (Przykład 4) oraz rynkowego odpowiednika (Lioton). Uzyskany wynik pokazuje zwiększone przechodzenie przez model skóry heparyny w obecności enzymu proteolitycznego (5% wagowych papainy). Na wykresie pokazano także, że zwiększenie ilości heparyny (P3 -2400 jednostek heparyn) także zwiększa jej ilość w przedziale trans.

Przykład 1

Heparynę (Shenzhen Hepalink) rozpuszczono w temperaturze pokojowej w oczyszczonej wodzie, następnie dodano kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego otrzymując bufor o pH = 6.5. Lipid kationowy (DOTAP) (Avanti Lipids, USA) rozpuszczono w chloroformie i dodano do roztworu wodnego heparyny i chitosanu. W wyniku tego powstały dwie niemieszające się fazy. Do próbki dodano metanol tak aby powstała jedna, jednorodna faza. Całość mieszano w temperaturze ok. 25°C aż do powstania jednorodnego roztworu. Oczyszczoną fosfatydylocholinę rozpuszczoną w chloroformie dodano do roztworu zawierającego heparynę, chitosan i lipid kationowy całość uzupeł

PL 229 532 Β1 niono buforem HEPES do objętości końcowej (5 ml). Całość odwirowano w celu przyspieszenia rozdziału faz. Faza dolna zawierała głównie chloroform z nadmiarem oczyszczonej fosfatydylocholiny oraz metanolem. Górną fazę zawierającą nanostruktury oraz bufor oddzielono, dbając aby nie była zanieczyszczona fazą dolną, w celu określenia rozkładu wielkości nanostruktur. Resztki metanolu pozostające w fazie buforowej odfiltrowano z zastosowaniem systemu MiliPore. Na koniec do fazy wodnej dodano enzym proteolityczny.

Tabela 1

Skład gotowej formulacji wg przykładu 1

SUBSTANCJE CZYNNE:	% wagowy
Heparyna	1,5
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
Oczy szczona Fostałydy 1 ochol i na	10,00
Chlorek trłnmyłoammwy (DOIAP)	10,00
Chitosan	5,00
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetyl o)-1 -piperazynylo ]etanosulfonowy (1 ΙΕΡΕ S)	OJ 5
Papaina	1
Woda oczyszczona	723 5
SUMA	100,00

Tabela 2

Skład gotowej formulacji wg przykładu 1

SUBSTANCJE CZYNNE:	% wagowy
Heparyna	1,5
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
Oczyszczona Fosfatydyl ochol i na	30,00
Chlorek N-[l-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N- trimetyloamonowy (DOTAP)	10,00
Chitosan Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1 -piperazynylo jetanosul fonowy (HEPES)	5,00 0,15
Papaina	5
Woda oczyszczona	48,35
SUMA	100,00

PL 229 532 Β1

Przykład 2

Heparynę wraz z chitosanem rozpuszczono w temperaturze pokojowej w oczyszczonej wodzie z dodatkiem kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynyl]etanosulfonowego oraz chlorku wapnia otrzymując bufor o pH=6.0. Chlorek benzalkoniowy rozpuszczono w chloroformie i dodano do roztworu wodnego heparyny. W wyniku tego powstały dwie niemieszające się fazy. Do próbki dodano metanol tak aby powstała jedna, jednorodna faza.

Całość mieszano w temperaturze ok. 25°C aż do powstania jednorodnego roztworu. Oczyszczoną fosfatydylocholinę rozpuszczoną w chloroformie dodano do roztworu zawierającego heparynę, chitosan i chlorek benzalkoniowy, całość uzupełniono wodą oczyszczoną do objętości końcowej. Całość odwirowano w celu przyspieszenia rozdziału faz. Faza dolna zawierała głównie chloroform z nadmiarem oczyszczonej fosfatydylocholiny. Górną fazę zawierającą głównie wodę oddzielono, dbając, aby nie była zanieczyszczona fazą dolną, w celu określenia wielkości nanostruktur. Resztki metanolu pozostające w fazie buforowej odfiltrowano z zastosowaniem systemu MiliPore. Frakcję wodną poddano procesowi żelowania z udziałem substancji żelujących.

Tabela 3

Skład gotowej formulacji wg przykładu 2

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	1,0
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
Oczyszczona Fosfatydyiocholina	10,00
Chlorek benzalkoniowy	8,00
Chitosan	5.00
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo Jetanosultonowy (HEPES)	0,15
Bromelaina	2
kopol i mer akryl oamid om etyl opropanosiarczanu amonu i winyl opi roi idonu	i 5
Woda oczyszczona	68.85
SUMA	100,00

Tabela 4

Skład gotowej formulacji wg przykładu 2

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	5,0
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
Oczyszczona Fosfatydylocholi n a	10.00
Chlorek benzalkoniowy	8,00
Chitosan	10
Kwas 2-[4-(2-h.ydroksyety1o)- 1 -piperazynylo Jetanosulfonowy (HEPES)	0,15
Papaina	5
Woda oczyszczona	61,85
SUMA	100,00

PL 229 532 Β1

Przykład 3

Heparynę i chitosan rozpuszczono w temperaturze pokojowej w oczyszczonej wodzie. Następnie dodano kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego otrzymując bufor o pH=8.0. Sól bromową dimetyldioktadecylamonu oraz 1,2-palmitylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholinę rozpuszczono w chloroformie. Po odparowaniu rozpuszczalnika do utworzonego suchego filmu lipidowego dodano roztwór buforowy heparyny i chitosanu. Całość mieszano w temperaturze ok. 25°C aż do powstania jednorodnej zawiesiny. Otrzymaną zawiesinę przeekstrudowano w temperaturze 60°C pod ciśnieniem 150 psi. W wyniku ekstruzji otrzymano żel o lepkości 9000 cP.

Tabela 5

Skład gotowej formulacji wg przykładu 3

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	L5 ;
SUBS TANCJE POMOCNICZE:
1,2-palini ty l o-sn-gl ice ro-3 -fosfaty dylochol i ii a	10,00
lecytyna	5
Sól broniową dimetyldioktadecylamonu	3,00
Chitosan	5,00
Kwas 2-[4-(2-bydroksyet.ylo)-1 -piperazynylo ] etanosulfonowy (HEPE S)	0,15
papaina	1
Di sodu edetynian	0,1
Metyl u parahydroksy b enzoesan	0,1
kopoli mer akryloamidometyl opropanosiarczanu amonu i winyl opirolidonu	5
Woda oczyszczona	69 J 5
SUMA	100,00

Tabela 6

Skład gotowej formulacji wg przykładu 3

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	5
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
1,2-palmi tylo-sn-^icero-3-fosfatydylochdina	30,00
Sól bromową dimetyldioktadecylamonu	3,00
Chitosan	5,00
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1 -piperazynylo Jetanosulfcmowy (HEPES)	0,15
papaina	5
Woda oczyszczona	51,85 100,00.....
SUMA

PL 229 532 Β1

Tabela 7

Skład gotowej formulacji wg przykładu 3

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	0,01
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
1 „2-palmity lo-sn -gli cero-3 -fosfatydy 1 ocboli n a	1,00
lecytyna Sól bromową dimetyldioktadecylamonu	15 3,00
Cbitosan	0,10
Kwas 2-{4-(2-bydroksyetylo)-l-piperaz.ytiylo Jetanosulfonowy (HEPES)	0,15
papaina	5
kopolimer akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu	5
Woda oczyszczona	70,74
SUMA	100,00

Przykład 4

Próbka P2 z papainą. Fosfolipon 90 G dodano do glikolu propylenowego. Całość mieszano w temperaturze 50°C do całkowitego rozpuszczenia się lipidu. Heparynę dodano do oczyszczonej wody i rozpuszczono w temperaturze pokojowej. Tak przygotowane roztwory zmieszano ze sobą i pozostawiono do całkowitego uwodnienia frakcji lipidowej mieszając całość w temperaturze 30°C do otrzymania jednorodnej zawiesiny. Otrzymaną zawiesinę przeekstrudowano w temperaturze 40°C pod ciśnieniem 150 psi. W wyniku ekstruzji otrzymano żel o lepkości 10 200 cP. Następnie do tak otrzymanej zawiesiny liposomów dodano papainę oraz/lub znacznik fluorescencyjny carboxyfluoresceinę, jako wzorzec wewnętrzny. Do gotowego żelu liposomowego dodano kopolimer akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu.

Tabela 8

Skład gotowej formulacji wg przykładu 4

SUBSTANCJE CZYNNE:	g'100g
Heparyna	0.52
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
oczyszczona fosfatydylochol ina	18
glikol propylenowy	18
Papaina'	5
kopolimer akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu	1
Woda oczyszczona	57,48
SUMA	100,00

PL 229 532 Β1

Tabela 9

Skład gotowej formulacji wg przykładu 4

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	1,5
SUBSTANCJE POMOCNICZE.
oczyszczona fosfatydylocholina	30
glikol propylenowy	20
papaina	5
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1 -piperazynylo ]etanosul fbnowy (HEPES)	0,15
kopolimer akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu	1
Woda oczyszczona	42,35
SUMA	100

Tabela 10

Skład gotowej formulacji wg przykładu 4

SUBSTANCJE CZYNNE:
Heparyna	1,5
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
oczyszczona fosfatydylocholina	30
glikol propylenowy	30
papaina	5
Kwas 2- [4 -(2-hydrok sy etyl o)-1 -pi pe razy ny 1 o jetanosul fbnowy (HEPE S)	0,15
kopoli m er akry 1 oami dom etyl opropanosi arczan u amonu i winylopirolidonu	1
Woda oczyszczona	32,35
SUMA	100

Przykład 5

Próbka P3 z papainą. Heparynę dodano do oczyszczonej wody i rozpuszczono w temperaturze pokojowej. Do tak przygotowanego roztworu dodano 1 g kopolimeru akryloilodimetylotaurynianu amonu i poliwinylopirolidonu i mieszano w temperaturze 25°C do całkowitego usieciowania żelu. Do tak sporządzonego żelu dodano 3 g papainy i mieszano do rozdyspergowania enzymu w strukturze żelu.

PL 229 532 Β1

Tabela 11

Skład gotowej formulacji wg przykładu 5

SUBSTANCJE CZYNNE:	g/Ί OOg
Heparyna	0.52
SUBSTANCJE POMOCNICZE:
oczyszczona fosfatydylocholina i	0
glikol propylenowy	0
Papaina i	3
kopolimer akryloilodimetylotaurynianu amonu i poli winylopiro! idonu	1
Woda oczyszczona i	95.48
SUMA	100

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1 do 6, znamienny tym, że w jej skład wchodzi mieszanina jednowarstwowych i wielowarstwowych liposomów.

1 do 6, znamienny tym, że

1. Preparat soli sodowej heparyny do zastosowań naskórnych, znamienny tym, że jego lepkość wynosi nie mniej niż 7000 cP, a w jej skład wchodzą: sól sodowa heparyny, liposomy zbudowane z fosfatydylocholiny i/lub hydrożel, enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, oraz opcjonalnie; chitosan, rozpuszczalniki organiczne, bufor, konserwanty, przeciwutleniacze oraz substancje żelujące.

2. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1, znamienny tym, że ogólne stężenie heparyny w formulacji wynosi od 0,01 do 10% wagowych, korzystnie 2,4% wagowych.

3. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że budulcem liposomów jest fosfatydylocholina, korzystnie 1,2-palmitylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina.

4. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że ogólne stężenie 1,2-palmitylo-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny wynosi od 0% do 30% wagowych, korzystnie 10% wagowych.

5. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1, znamienny tym, że budulcem liposomów jest fosfatydylocholina zmieszana z czwartorzędowym związkiem amonowym z grupy tenzydów, korzystnie chlorkiem benzalkoniowym.

6. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że ogólne stężenie substancji kationowej wynosi od 0-80 mol% względem fosfatydylocholiny, korzystnie 40 mol%.

7.

8.

9.

Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od w jej skład wchodzą liposomy jednowarstwowe.

Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od w jej skład wchodzą liposomy wielowarstwowe.

Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od

10. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że heparyna znajduje się w formie niezwiązanej z liposomami.

11. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że heparyna znajduje się w formie związanej z liposomami.

12. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że heparyna znajduje się w formie związanej i niezwiązanej z liposomami.

PL 229 532 Β1

13. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 12, znamienny tym, że w jej skład wchodzi enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina, lub stabilizowana pochodna tych enzymów.

14. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że ogólne stężenie enzymu proteolitycznego lub jego stabilizowanej pochodnej wynosi od 0,01 do 10% wagowych.

15. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 14, znamienny tym, że enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina, lub jego stabilizowana pochodna znajduje się na zewnątrz liposomów.

16. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 14, znamienny tym, że enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina, lub jego stabilizowana pochodna znajduje się wewnątrz liposomów.

17. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 14, znamienny tym, że enzym proteolityczny pochodzenia roślinnego, korzystnie papaina lub bromelaina, lub jego stabilizowana pochodna znajduje się wewnątrz i na zewnątrz liposomów.

18. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. od 1 do 17, znamienny tym, iż ogólne stężenie chitosanu wynosi od 0 do 10% wagowych.

19. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1, znamienny tym, że organicznymi rozpuszczalnikami są związki z grupy alkoholi dwuhydroksylowych.

20. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1 i 19, znamienny tym, że ogólne stężenie alkoholu dwu hydroksylowego wynosi od 0 do 30% wagowych, korzystnie 10%.

21. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1 znamienny tym, że organicznymi rozpuszczalnikami są związki z grupy alkoholi krótkołańcuchowych, korzystnie długości łańcuchów c2-c4.

22. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1 znamienny tym, że organicznymi rozpuszczalnikami są związki z grupy halogenków alkilu.

23. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 1 lub 19, lub 20, lub 21, lub 22, znamienny tym, że ogólne stężenie rozpuszczalnika organicznego wynosi nie więcej niż 0,5% wagowych formulacji.

24. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 22, znamienny tym, że substancją buforującą jest kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)piperazyn-1-ylo)etanosulfonowy.

25. Preparat soli sodowej heparyny według zastrz. 24, znamienny tym, że pH buforu (kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)piperazyn-1-ylo)etanosulfonowy) mieści się w przedziale między 6,0 a 8,0.

26. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 25, znamienny tym, że przeciwutleniaczem jest disodu edetynian.

27. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. od 1 do 26, znamienny tym, że konserwantem jest metylu parahydroksybenzoesan.

28. Preparat soli sodowej heparyny według dowolnego z zastrz. do 1 do 27, znamienny tym, że substancją żelującą jest kopolimer akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu.

29. Preparat soli sodowej heparyny, według zastrz. 28, znamienny tym, że ogólne stężenie kopolimeru akryloamidometylopropanosiarczanu amonu i winylopirolidonu wynosi od 0 do 5% wagowych.