PL228855B1 - Zastosowanie pochodnej betuliny do wytwarzania preparatu do stymulowania syntezy kolagenu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej betuliny o nazwie chemicznej Betulin-Dab-NH2 do wytwarzania preparatów do stymulowania syntezy kolagenu w stomatologii, przyspieszających gojenie dziąsła, do regeneracji błon śluzowych jamy ustnej, w kosmetologii i medycynie estetycznej oraz przyspieszania gojenia podrażnień i ran. Pochodna Betulin-Dab-NH2 charakteryzuje się silniejszą stymulacją syntezy kolagenu, a także wykazuje łatwiejszą rozpuszczalność w wodzie w porównaniu z niezmodyfikowaną betuliną i kwasem betulinowym.

Description

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)228855 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 413038 (22) Data zgłoszenia: 06.07.2015 (51) Int.CI.

A61K 31/575 (2006.01) A61P 17/02 (2006.01) A61K 8/63 (2006.01) A61Q 19/08 (2006.01)

Zastosowanie pochodnej betuliny do wytwarzania preparatu do stymulowania syntezy kolagenu

(43) Zgłoszenie ogłoszono: 16.01.2017 BUP 02/17	(73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MEDYCZNY IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	(72) Twórca(y) wynalazku: MAŁGORZATA DRĄG-ZALESIŃSKA, Wrocław, PL
30.05.2018 WUP 05/18	JULITA KULBACKA, Wrocław, PL
	JOLANTA SACZKO, Wrocław, PL MARCIN DRĄG, Wrocław, PL MARCIN PORĘBA, Lubin, PL

m m

oo oo

CM

CM

Ω.

PL 228 855 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej betuliny o nazwie chemicznej betulin-Dab-NH2 do wytwarzania preparatu do stymulowania syntezy kolagenu w stomatologii, przyspieszających gojenie dziąsła, do regeneracji błon śluzowych jamy ustnej, w kosmetologii i medycynie estetycznej oraz przyspieszania gojenia podrażnień i ran.

Kolagen jest białkiem strukturalnym, zewnątrzkomórkowym. Występuje w połączeniu z innymi białkami strukturalnymi (elastyna) i mukopolisacharydami (kwas hialuronowy). Wpływa na funkcjonowanie wszystkich tkanek i narządów. Pobudza komórki do odnowy. Jego niedobór objawia się dysfunkcją narządu ruchu, mięśni i zmianami w skórze (obniżenie jędrności i elastyczności skóry). W syntezę kolagenu zaangażowane są hormony tarczycy, wzrostu i insulina. Kolagen ulega ciągłej degradacji, a jego niedobór jest uzupełniany. Niestety, procesowi starzenia towarzyszy przewaga degeneracji kolagenu nad procesem jego syntezy. Po sześćdziesiątym roku życia synteza kolagenu całkowicie ustaje, wraz z zanikiem aktywności neurohormonalnej. Na zmniejszenie ilości kolagenu, szczególnie o prawidłowej strukturze mają wpływ nie tylko procesy towarzyszące starzeniu się ale szereg czynników zewnętrznych, takich jak ekspozycja na słońce, czyli promieniowanie UV. Konsekwencją działania tych czynników jest nieprawidłowe usieciowane kolagenu i utrata sprężystości skóry. Od wielu lat problem utraty zdolności do syntezy kolagenu jest przedmiotem badań. Istotne miejsce zajmuje w dermatologii estetycznej, reumatologii periodontologii i protetyce stomatologicznej. Prowadzone są liczne badania mające na celu znalezienie nowych substancji zdolnych do stymulacji syntezy kolagenu i jednocześnie charakteryzujących się najlepszymi właściwościami biologicznymi i fizykochemicznymi.

Środowisko naturalne jest bogatym źródłem substancji, które mogą mieć właściwości biologiczne, w tym takie, które stymulują syntezę kolagenu. Jednym z nich jest kwas askorbinowy, będący kofaktorem enzymu, hydroksylazy profilowej, niezbędnego w syntezie kolagenu (Peterkofsky, B. (1972). Regulation of collagen secretion by ascorbic acid in 3T3 and chick embryo fibroblast. Biochem. Biophys. Res. 26: 1557-1562.1972; Murad, S., Grove, D., Lindberg, KA., Reynolds, G., Sivarajah, A., Pinneilt, S.R. (1981). Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proc Natl Acad Sci. 5: 2879-2882). Wykazano także, że syntezę kolagenu stymulują beta alkaloidy pochodzące z orzechów arekolina i arekaidyna. Wykazano ponadto stymulujące działanie forskoliny na produkcję kolagenu w sklonowanych komórek osteoblastycznych (Hakeda, Y., Nakatani, Y., Kurikara, N., Ikeda, E., Maedo, N., Kunegawa, N. (1985). Prostoglandin E2 stimulates collagen and prostaglandin E2 stimulates collagen and non-collagen protein synthesis and prolyl hydroxylase activity in osteoblastic clone MC3T3-E1 cells. Biochem Biophys Res Commun. 126: 340-345.). Niestety, z wyjątkiem kwasu askorbinowego środki te nie mogą być stosowane ze względu na ich potencjalną toksyczność. Kwas askorbinowy natomiast jest niestabilny chemicznie.

Betulina jest naturalnym terpenem pozyskiwanym z kory brzozy. Związek ten wykazuje szerokie spektrum właściwości, działa m.in. antyoksydacyjnie, przeciwzapalnie, przeciwwirusowo, przeciwbakteryjnie oraz przeciwnowotworowo, przy czym charakteryzuje się brakiem toksyczności, zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo (Rastogi, S., Pandey, M. M., Kumar Singh Rawat, A. (2015). Medicinal plants of the genus Betula—traditional uses and a phytochemical-pharmacological review, J. Ethnopharmacol., 159:62-83). Znanym działaniem betuliny i kwasu betulinowego jest stymulacja syntezy kolagenu (Tolstikov, G.A., Flekhter, O.B., Shultz, E.E., Baltina, L., Tolstikov, A. (2005). Betuli and its derivates. Chemistry and biological activity. Chemistry for Sustainable Development 13 1-29.; Cho, S.H. Gtlieb, K., Santhanam, U. Eur. Pat. Appl. EP 717, 983(C.A. 125(1996)955889). Jednak ze względu na hydrofobowy charakter tych substancji, wykazują one ograniczoną rozpuszczalność w wodzie, przez co ich zastosowanie jest mocno ograniczone.

W ramach realizacji badań zespół twórców projektował i syntetyzował nowe pochodne betuliny o korzystnych właściwościach biologicznych. Sposób syntezy oraz struktury uzyskanych pochodnych opisano w Drąg-Zalesińska, M., Kulbacka, J., Saczko, J., Wysocka, T., Zabel, M., Surowiak, P., Drąg, M. (2009). Esters of betulin and betulinic acid with amino acids have improved water solubility and arevselectively cytotoxic toward cancer cells. Bioorg. Med. Lett., 19 (16): 4814-4817 oraz Drąg-Zalesińska, M., Wysocka, T., Borska, S., Drąg, M., Poręba, M., Choromańska, A., Kulbacka, J., Saczko, J. (2015). The new esters derivatives of betulin and betulinic acid in epidermoid squamous carcinoma treatment In vitro studies. Biomedicine& Pharmacotherapy 72 91-97.). Nieoczekiwanie okazało się, że pochodna

PL 228 855 B1 betuliny o nazwie chemicznej Betulin-Dab-NTB (ester betuliny z kwasem L-2,4-diaminobutylowym) wykazuje większą zdolność stymulacji syntezy kolagenu oraz jednocześnie wykazuje znacznie większą rozpuszczalność w wodzie niż betulina.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej betuliny o nazwie chemicznej betulin-DabNH2 do wytwarzania preparatu do stymulowania syntezy kolagenu.

Zastosowanie według wynalazku polega na tym, że pochodną Betulin-Dab-NH2 stosuje się do wytwarzania preparatów, które mogą być zastosowane w stomatologii, kosmetologii i medycynie do przyspieszenia gojenia ran i regeneracji błon śluzowych, dzięki stymulacji syntezy kolagenu.

Pochodna Betulin-Dab- NH2 jest estrem nienaturalnego aminokwasu kwasu Z-2,4-diaminobutylowego oraz betuliny. Wiązanie estrowe występuje pomiędzy grupą karboksylową aminokwasu a grupą hydroksylową przy węglu 28 betuliny.

Rozpuszczalność w wodzie betuliny, kwasu betulinowego oraz pochodnej betuliny - Betulin-DabNH2 oznaczono według metody opisanej w Jeong, H.J., Chai, H.B., Park, S.Y., Kim, D.S.. (1999). Preparation of amino acid conjugates of betulinic acid with activity against human melanoma. Bioorg. Med. Lett. 9: 12-1-1204. Test polega na analizie obecności osadu lub żelopodobnej zawiesiny w kolejnych rozcieńczeniach badanej substancji. Wynik analizy pokazał, że pochodna betuliny, Betulin-Dab-NH2 ma doskonałą rozpuszczalność w wodzie (pełna rozpuszczalność już w 5-krotnym rozcieńczeniu) w porównaniu do betuliny (żelopodobna zawiesina obecna w rozcieńczeniu 100-krotnym) i kwasu betulinowego (zanik osadu i zawiesiny w rozcieńczeniu 50-krotnym).

Wrażliwość komórek prawidłowych na preparat betuliny, kwasu betulinowego oraz pochodnej betuliny - Betulin-Dab-NH2 oceniono testem MTT. Test MTT jest metodą kolorymetryczną przeznaczoną do określania aktywności metabolicznej żywych komórek. Jej działanie oparte jest na soli tetrazoliowej (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliowy) redukowanej przez dehydrogenazę mitochondrialną do kolorowych kryształów formazanów. Test wykazał w szerokim zakresie stężeń zbliżony wpływ betuliny i jej pochodnej na żywotność komórek oraz potwierdził, że pochodna nie jest toksyczna i może być bezpiecznie stosowana.

Pochodnej Betulin-Dab-NH2 można nadać rozmaite postacie, takie jak maści, kremy, żele, pasty, roztwory, mazidła, zawiesiny i emulsje z zastosowaniem znanych sposobów formułowania, łącznie z dodatkami.

Poniżej podano skład i sposób przygotowania przykładowego preparatu.

Maść do stosowania zewnętrznego przygotowuje się na bazie lekobazy (Firma Amara).

Skład lekobazy Amara: wazelina biała (nr CAS 123-94-4), monostearynian glicerolu (nr CAS 94-4), alkohol cetostearylowy (nr CAS 36653-82-4), triglicerydy nasyconych kwasów tłuszczowych (nr CAS 56-73398-61-5), polisorbat 40 (nr CAS 9005-66-7), glikol propylenowy (nr CAS 57-55-6), glcerol (nr CAS 56-81-5), woda, krzemionka koloidalna bezwodna (amorficzna), kwas sorbinowy (nr CAS 110-44-1).

Skład maści:

Substancja czynna (Betulin-Dab- NH2) 0,005

Woda destylowana 10,0

Lekobaza do 20,0

Do uzyskania maści wykorzystuje się urządzenie UNGUATOR (model e/s, Firma EPRUS-B & Łukasz Ejsmont), w skład którego wchodzi urządzenie miksujące, trzpień stalowy do mieszadełek jednorazowych, zestaw mieszadeł stałych oraz zestaw akcesoriów Optimum Plus. Do tuby urządzenia dodaje się 0,005 g substancji czynnej (Betulin-Dab-NH2) następnie nalewa się 10 g wody destylowanej i uzupełnia całość do 20 g lekobazą. Tubę zamknąć nakrętką zaopatrzoną w odpowiednie mieszadło. Całość umieszcza się w UNGUATORZE i miesza przez 2 min/5obr (opcja do wykonania maści według instrukcji obsługi urządzenia). W wyniku tego procesu otrzymuje się maść o jednorodnej strukturze zawierającą w swoim składzie 0,025% substancji czynnej (Betulin-Dab- NH2) do stosowania zewnętrznego.

Niniejszy wynalazek zostanie opisany w następujących przykładach.

P r z y k ł a d 1

Badania potwierdzające zdolność pochodnej Betulin-Dab- NH2 do stymulacji syntezy kolagenu zostały wykonane na hodowli fobroblastów, przy użyciu metody Sircol™ Collagen Assay (Biocolor). Metoda Sircol™ Collagen Assay (Biocolor) jest kolorymertycznym testem służącym określaniu zawartości ssaczego kolagenu typu od I do V w materiale biologicznym, wykorzystującym właściwości barwnika Sirius Red, który wiąże się z helikalną strukturą [Gly-X-Y]n charakterystyczną dla wszystkich tych

PL 228 855 Β1 typów kolagenu. Do badań przygotowano fibroblasty izolowane z dziąsła zdrowego pacjenta, które rozsiewano na butelki hodowlane o powierzchni 25 cm² po 3x10⁵ komórek/ butelkę w 4 ml DMEM z 5% surowicą. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C zbierano medium znad komórek i zalewano komórki 4 ml DMEM bez surowicy z dodatkiem odpowiedniego preparatu (betulin-Dab-NFL, kwas betulinowy, betulina - 6 μΜ). Po 3 dobach inkubacji w temperaturze 37°C i przy 5.5% CO2 medium znad komórek zbierano i poddawano analizie zawartości kolagenu przy użyciu zestawu Sircol™ Soluble Collagen Assay (Biocolor). Do analizy pobierano po 100 μΙ każdej próbki medium znad komórek, a także po 100 μΙ medium kontrolnego, z odpowiednim stężeniem preparatu, ale nie mającego styczności z komórkami. Równolegle przygotowywano roztwory kolagenu (Reference Standard, Biocolor), tak aby przygotować krzywą standardową w zakresie 50-200 μg/ml kolagenu. Do probówek zawierających medium znad komórek, medium kontrolne oraz roztwory standardowego kolagenu dodawano po 500 μΙ Sircol Dye Reagent (Biocolor), a następnie wytrząsano probówki przez 30 minut. Po upływie tego czasu próbki żwirowano przez 30 min. przy 13000 RCF w 4°C. Następnie zlewano supernatant a osady zawieszano w 500 μΙ Wash Reagent (Biocolor) i wirowano ponownie przy takich samych parametrach. Po ponownym usunięciu supernatantu osad zawieszano w 250 μΙ Alkali Reagent (Biocolor), wytrząsano przez 5 min. i nakładano na płytkę 96 dołkową. Mierzono absorbancję przy 550 nm. Z danych dotyczących standardowego roztworu kolagenu wykreślano krzywą standardową, z otrzymanego wzoru wyliczano zawartość kolagenu w każdej próbce, następnie odejmowano wynik kontroli od analogicznego wyniku dla medium znad komórek. Wyniki przestawiono w Tabeli 1.

Tabela 1

Zawartość kolagenu w medium komórkowym w oznaczeniu metodą Sircol™ Collagen Assay.

Rodzaj próby	Ilość kolagenu wyprodukowanego w medium znad komórek fgg/ml]
Komórki hodowane w obecności preparatu	64,4
pochodnej betulin-Dab-NFb
Komórki hodowane w obecności kwasu	i 8,2
betulinowego
Komórki hodowane w obecności betuliny	10,2
Komórki kontrolne	9,4

Badanie wykazało prawie 7-krotnie większą ilość wyprodukowanego kolagenu przez komórki hodowane w obecności pochodnej Betulin-Dab-NFL w stosunku do komórek kontrolnych.

Przykład 2

Ekspresję kolagenu I i III oceniono metodą immunocytochemiczną. W tym celu ludzkie prawidłowe fibroblasty rozsadzano na szkiełka podstawowe, 8-dołkowe. Po 24 godzinach po uzyskaniu przez komórki adherentności dodawano badane preparaty pochodnej betulin-Dab-NFL, kwasu betulinowego i betuliny w stężeniu 6 μΜ. Po 24 godzinnej inkubacji, preparaty komórkowe płukano w PBS i następnie utrwalano 4% formaliną. Ponownie szkiełka przepłukiwano w buforze PBS i umieszczano je w 1% H2O2 na 30 minut. Następnie przepłukiwano 3x5 minut w PBS z Tritonem (1% trytonu w PBS). Kolejno szkiełka osuszano i nakładano przeciwciało skierowane przeciwko kolagenowi I i III (SantaCruz). Po 24 godzinnej inkubacji w 4°C płukano 3x5 minut w PBS-ie z Tritonem. Następnie nakładano ll-rzędowe przeciwciało z zastawu DAKO LSAB na 20 minut. Reakcję barwną wywoływano tetrachlorodoworkiem 3,3-diaminobenzydyny (DAB) - czynnikiem barwiącym komórki, w których zaszła reakcja z użytym przeciwciałem (inkubacja w ciemności przez 5-7 minut). W celu wybarwienia jąder komórkowych zastosowano hematoksylinę przez 30s-1 min. Kolejno preparaty płukano w wodzie przez 30 minut, suszono i poddawano szeregowi alkoholowemu i odwadniano w ksylenie. Na koniec preparaty zamykano żywicą syntetyczną DPX z użyciem szkiełek nakrywkowych. Barwną reakcję immunocytochemiczną oceniano przy użyciu mikroskopu prostego Olympus ΒΧ51, aby scharakteryzować stan komórek, na które działały określone czynniki. Szacowano procentowy udział komórek, u których zaszła reakcja barwna. Wyniki oceny reakcji immunocytochemicznej zaprezentowano w Tabeli 2.

PL 228 855 Β1

Tabela 2

Ocena intensywności reakcji immunocytochemicznej z zastosowaniem przeciwciał przeciwko kolagenowi I i III w ludzkich fibroblastach. Intensywność reakcji immunocytochemicznej: - bez zabarwienia, + - ze słabym zabarwieniem, ++ - ze średnim zabarwieniem, +++ - z silnym zabarwieniem.

Rodzaj próby	Kolagen typu I	Kolagen typu III
Komórki hodowane w	100%	100%
obecności betulin-Dab-NIL·	++	++/+++
Komórki hodowane w	100%	100%
obecności kwasu betulinowego	+	+
Komórki hodowane w	100%	100%
obecności betuliny	+	+
Komórki kontrolne	100% -/+	100% -/+

Szczególnie intensywne zabarwienie komórek traktowanych betulin-Dab-Nhk potwierdza działanie silnie stymulujące syntezę kolagenu tej pochodnej.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie pochodnej betuliny o nazwie chemicznej Betulin-Dab-Nhk do wytwarzania preparatu przeznaczonego do stymulacji syntezy kolagenu.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że pochodna betuliny o nazwie chemicznej Betulin-Dab-NH2 stosowana jest do wytwarzania maści, kremów, żeli, past, roztworów, mazideł, zawiesin i emulsji.