PL227980B1 - Sposób oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadajacego metki fuzyjnej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest metoda oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej charakteryzującego się wysoką czystością oraz aktywnością biologiczną.

W znanych heterologicznych systemach ekspresyjnych wykorzystywanych do nadekspresji oraz pozyskiwania białek rekombinowanych wykorzystywane są wektory posiadające metki fuzyjne np. His, GST lub MBP wykazujące powinowactwo odpowiednio: do jonu metalu (np. niklu), glutationu lub amylozy. Zastosowanie wymienionych metek umożliwia łatwe oraz szybkie uzyskanie pożądanego prep aratu białkowego charakteryzującego się zazwyczaj wysokim stopniem czystości. Podejście takie z powodzeniem jest stosowane dla wielu białek m.in. białka PCNA. Niejednokrotnie specyfika prowadzonych badań wymaga korzystania z białka które nie zawiera metki fuzyjnej. W takim przypadku możliwe są co najmniej dwa rozwiązania: a) odcięcie metki fuzyjnej które nie zawsze jest możliwe lub b) oczyszczanie białka pozbawionego metki fuzyjnej klasycznymi metodami chromatograficznymi.

Opublikowane dotychczas w literaturze naukowej metody oczyszczania białka PCNA bez metki fuzyjnej opisują konieczność zastosowania kilku złóż chromatograficznych celem pozyskania czystego preparatu.

Celem wynalazku jest dostarczenie alternatywnej metody oczyszczania ludzkiego białka PCNA, która zapewniałaby wysoką wydajność oraz czystość i aktywność uzyskiwanego białka.

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej poddanego nadekspresji w komórkach E. coli, charakteryzujący się tym, że prowadzi się nadekspresję białka PCNA w komórkach E. coli transformowanych plazmidem zawierającym sekwencją kodującą to białko, prowadzi się wysalanie białka siarczanem amonu z roztworu uzyskanych białek wewnątrzkomórkowych a następnie rozdziela się wysoloną frakcję białkową metodą chromatografii jonowymiennej, na kolumnie jonowymiennej Q, przy czym izoluje się frakcję zawierającą białko PCNA.

Korzystnie, komórki E. coli zawierają kasetę ekspresyjną przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 1.

Opracowana metoda oczyszczania ludzkiego PCNA jest łatwa w realizacji ponieważ bazując na dużej rozpuszczalności tego białka wykorzystuje technikę wysalania siarczanem amonu, a następnie chromatografię na kolumnie jonowymiennej Q. Cechuje się ona wysoką wydajnością a uzyskiwany preparat białkowy posiada nieoczekiwanie wysoką czystość i aktywność.

Dla lepszego wyjaśnienia istoty zdefiniowanego powyżej wynalazku niniejszy opis wzbogacono o rysunek oraz opis przykładowej realizacji.

Na figurze 1 przedstawiono oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego białka PCNA: 1) standard białkowy; 2) całkowity ekstrakt białkowy z komórek E. coli BL21(DE3) pRIL przed indukcją ekspresji PCNA; 3) całkowity ekstrakt białkowy z komórek E. coli BL21(DE3) pRIL po 4 godzinach indukcji ekspresji PCNA; 4) frakcja białek rozpuszczonych, wyekstrahowanych z komórek E. coli po nadekspresji PCNA; 5) frakcja białek rozpuszczonych przy 60% nasyceniu siarczanu amonu; 6) frakcja białek wysolonych przy 80% nasyceniu siarczanu amonu nałożona na kolumnę Q; 7) 1 ąg frakcji oczyszczonego PCNA. Białka rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono w barwniku Coomassie.

P r z y k ł a d

Do plazmidu bakteryjnego pET29a (Novagen (EMD Millipore)) chronionego patentem o numerze (US Patent 5,693,489) wprowadzono przy użyciu enzymów restrykcyjnych Ndel oraz BamHI otwartą ramkę odczytu kodującą ludzkie białko PCNA zawierającą kodon STOP. Uzyskany plazmid zawierający kasetę ekspresyjną przedstawioną na Sekw. Id. nr 1 i posiadający oporność na kan amycynę wprowadzono do komórek bakterii E. coli szczepu BL21 pRIL. Bakterie hodowano w 4L pożywki LB zawierającej kanamycynę o stężeniu 50 mg/L oraz chlofoamfenikol o stężeniu 25 mg/L w temperaturze 37°C intensywnie wytrząsając do momentu, gdy wartość gęstości optycznej OD600 wyniosła 0,5. Następnie, do hodowli dodano induktora ekspresji IPTG (izopropyl p-D-1-tiogalaktopiranozyd) w stężeniu 1 mM i prowadzono indukcję ekspresji przez 4h w temperaturze 37°C. Wszystkie poniżej opisane czynności wykonywano w temperaturze 4°C. Po zakończeniu indukcji bakterie odwirowano (5000x g, 10 min). Osad bakteryjny zawieszono w 50 ml buforu ekstrakcyjnego (50 mM Tris, pH 7,5) i poddano sonikacji (10 min, 10 s puls, 5 s przerwy) celem uwolnienia białek wewnątrzkomórkowych. Uzyskany ekstrakt odwirowano (30 000x g, 30 min). Do nadsączu dodano siarczanu amonu do 40% stężenia wysycającego i inkubowano na mieszadle magnetycznym

PL 227 980 Β1 przez okres 20 min. Próbkę odwirowano (30 000xg, 30 min). Następnie do nadsączu dodano siarczanu amonu do 60% stężenia wysycającego i inkubowano na mieszadle magnetycznym przez okres 20 min. Próbkę odwirowano (30 000x g, 30 min). W kolejnym kroku do nadsączu dodano siarczanu amonu do stężenia wysycającego 80% i inkubowano jak wyżej opisano. Po odwirowaniu uzyskany osad rozpuszczono w 1 ml buforu ekstrakcyjnego i trzykrotnie przedializowano względem 10 ml buforu 50 mM Tris o pH 7.5. Uzyskany preparat białkowy nałożono na kolumnę Econo-Pack High Q (5 ml, BioRad) zrównoważoną wcześniej buforem ekstrakcyjnym. Po związaniu białka kolumnę przepłukano 50 ml buforu ekstrakcyjnego, a następnie dokonano elucji białka 200 ml liniowego gradientu soli (0-0,8M NaCI) rozpuszczonej w 50 mM Tris o pH 7,5. W wyniku przeprowadzonego rozdziału chromatograficznego uzyskano frakcję ludzkiego rekombinowanego białka PCNA nie zawierającego metki fuzyjnej w ilości 6 mg, charakteryzującego się wysoką czystością (Fig. 1) oraz aktywnością biologiczną badaną w teście oddziaływania z ludzką endonukleazą Fen1.

Sekwencja Id. nr 1

5' AGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC

CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATatgttcgaggcgcgcctggtccag ggctccatcctcaagaaggtgttggaggcactcaaggacctcatcaacgaggcctgctgggatattag ctccagcggtgtaaacctgcagagcatggactcgtcccacgtctctttggtgcagctcaccctgcggt ctgagggcttcgacacctaccgctgcgaccgcaacctggccatgggcgtgaacctcaccagtatgtcc aaaatactaaaatgcgccggcaatgaagatatcattacactaagggccgaagataacgcggatacctt ggcgctagtatttgaagcaccaaaccaggagaaagtttcagactatgaaatgaagttgatggatttag atgttgaacaacttggaattccagaacaggagtacagctgtgtagtaaagatgccttctggtgaattt gcacgtatatgccgagatctcagccatattggagatgctgttgtaatttcctgtgcaaaagacggagt gaaattttctgcaagtggagaacttggaaatggaaacattaaattgtcacagacaagtaatgtcgata aagaggaggaagctgttaccatagagatgaatgaaccagttcaactaacttttgcactgaggtacctg aacttctttacaaaagccactccactctcttcaacggtgacactcagtatgtctgcagatgtacccct tgttgtagagtataaaattgcggatatgggacacttaaaatactacttggctcccaagatcgaggatg aagaaggatcttagGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCA

CCACCACCAGTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGA

GCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG

Claims (2)

1. Sposób oczyszczania rekombinowanego ludzkiego białka PCNA nie posiadającego metki fuzyjnej poddanego nadekspresji w komórkach E. coli, znamienny tym, że prowadzi się ekspresję białka PCNA w komórkach E. coli transformowanych sekwencją kodującą tego białka, prowadzi się wysalanie białka siarczanem amonu z roztworu uzyskanych białek wewnątrzkomórkowych a następnie rozdziela się wysoloną frakcję białkową metodą chromatografii jonowymiennej na kolumnie jonowymiennej Q, przy czym izoluje się frakcję zawierającą białko PCNA.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki E. coli zawierają kasetę ekspresyjną przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 1.