PL227930B1 - Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi - Google Patents
Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi Download PDFInfo
- Publication number
- PL227930B1 PL227930B1 PL402289A PL40228912A PL227930B1 PL 227930 B1 PL227930 B1 PL 227930B1 PL 402289 A PL402289 A PL 402289A PL 40228912 A PL40228912 A PL 40228912A PL 227930 B1 PL227930 B1 PL 227930B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- hsa
- mir
- pmol
- molecular
- Prior art date
Links
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title claims description 14
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 title description 13
- KIWQWJKWBHZMDT-UHFFFAOYSA-N homocysteine thiolactone Chemical compound NC1CCSC1=O KIWQWJKWBHZMDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 108091066896 Homo sapiens miR-331 stem-loop Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 208000033892 Hyperhomocysteinemia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000003225 hyperhomocysteinemia Effects 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 20
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 20
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 108091050724 let-7b stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 108091030917 let-7b-1 stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 108091082924 let-7b-2 stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OROGUZVNAFJPHA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2,4-dimethyl-2H-thiophen-5-one Chemical compound CC1SC(=O)C(C)=C1O OROGUZVNAFJPHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 3
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 102000011848 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine S-Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010075604 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine S-Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108010003060 Methionine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 102000000362 Methionyl-tRNA synthetases Human genes 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- TZBGSHAFWLGWBO-ABLWVSNPSA-N (2s)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-1h-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]-5-methoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC)C(O)=O)=CC=C1NCC1NC(C(=O)NC(N)=N2)=C2NC1 TZBGSHAFWLGWBO-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 102100034976 Cystathionine beta-synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010073644 Cystathionine beta-synthase Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102100032839 Exportin-5 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108091067995 Homo sapiens miR-192 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067243 Homo sapiens miR-377 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 235000021170 buffet Nutrition 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000012124 rapid diagnostic test Methods 0.000 description 1
- 230000011363 regulation of cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004906 unfolded protein response Effects 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi. Wynalazek umożliwia szybką i nieinwazyjną diagnostykę ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, które pozwoliłoby na ograniczenie negatywnych skutków przed wystąpieniem choroby, a także kosztów związanych z hospitalizacją i późniejszą rehabilitacją.
Mimo ogromnego postępu medycyny choroby układu krążenia są wciąż podstawowym zagrożeniem dla zdrowia i życia człowieka, szczególnie w krajach wysoko rozwiniętych. W Polsce jest to najczęstsza przyczyna hospitalizacji. Hiperhomocysteinemia (stan, w którym stężenie całkowitej homocysteiny we krwi przekracza 15 gM) jest niezależnym, rozpoznanym czynnikiem ryzyka rozwoju chorób układu krążenia takich jak miażdżyca, choroba niedokrwienna serca, czy udar mózgu. Diagnostyka na wczesnym etapie choroby umożliwiłaby wprowadzenie odpowiedniego leczenia i profilaktyki, zanim dojdzie do poważnych powikłań i długotrwałego leczenia szpitalnego.
Homocysteina (Hcy) jest niebiałkowym aminokwasem - pod względem budowy strukturalnej przypominającym białkowy aminokwas metioninę, od której różni się brakiem grupy metylowej. W organizmie człowieka może ona powstawać jedynie z metioniny dostarczanej wraz z pokarmem. Metionina uwolniona z białek podczas procesu trawienia, wykorzystywana jest przez maszynerię komórkową do syntezy nowych białek oraz S-adenozylometioniny (SAM), która pełni role uniwersalnego donora grupy metylowej. W wyniku reakcji metylacji SAM przekształcana jest do S-adenozylohomocysteiny, która następnie hydrolizowana jest do homocysteiny i adenozyny. Hcy jest reutylizowana poprzez remetylację do metioniny bądź jest przekształcana w reakcji transsulfurylacji do cysteiny. Hcy może również ulegać konwersji do cyklicznego tioestru - tiolaktonu homocysteiny (HTL). Szlak ten staje się dominującym, gdy remetylacja i transsulfurylacja zostają zaburzone poprzez wystąpienie defektów genetycznych enzymów zaangażowanych w metabolizm Hcy, takich jak syntaza metioniny (MS), syntaza β cystationiny (CBS) czy reduktaza metylotetrahydrofolianu (MTHFR) lub też na skutek niedoboru kwasu foliowego, witaminy B6 i B12 w diecie.
Homocysteina ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do metioniny, może być błędnie rozpoznana przez syntetazę metionylo-tRNA w reakcji aminoacylacji. Jednak dzięki aktywności korekcyjnej tego enzymu, nigdy nie dochodzi do wbudowania Hcy do cząsteczki białka w procesie translacji. W wyniku reakcji korekcyjnej syntetazy metionylo-tRNA z Hcy powstaje tiolakton homocysteiny [1,2].
Podwyższony poziom Hcy we krwi (powyżej 15 gM) jest czynnikiem ryzyka wielu chorób, w tym chorób układu krążenia i neurodegeneracyjnych. W 1997 roku zaproponowano hipotezę, według której konwersja Hcy do HTL inicjuje szlak metaboliczny prowadzący do zmian patologicznych w organizmie [3].
Tiolakton homocysteiny jest cząsteczką wysoce reaktywną i może spontanicznie reagować z białkami, tworząc wiązanie amidowe z ε-aminową grupą reszt lizyny w białku. N-homocysteinylacja białek powoduje upośledzenie ich funkcji poprzez zmiany w drugorzędowej strukturze białek. Funkcja N-Hcy-białka jest tym bardziej zaburzona, im większy procent reszt lizynowych jest zmodyfikowanych przez tiolakton Hcy. Ponadto N-Hcy-białka stają się bardziej podatne na agregację, oraz na uszkodzenia spowodowane utlenianiem [4,5]. Patofizjologiczne konsekwencje N-homocysteinylacji białek obejmują: odpowiedź autoimmunologiczną, toksyczność komórkowa, stres siateczki śródplazmatyc znej, aktywację odpowiedzi na niesfałdowane białka [3,5,6] na podstawie danych pochodzących z eksperymentów z użyciem kultur komórkowych dowiedziono, że modyfikacje potranslacyjne białek komórkowych poprzez N-homocysteinylację, inicjują uszkodzenia komórkowe, co może prowadzić do powstawania stanów patologicznych. N-homocysteinylacja białek jest procesem specyficznym wyłącznie dla homocysteiny, ponieważ HTL może powstać w organizmie ludzkim wyłącznie z Hcy [3,5].
Warstwa komórek śródbłonka naczyń krwionośnych odpowiadają za prawidłowe funkcjonowanie układu krwionośnego. Jedną z cech charakterystycznych dla wczesnych stadiów rozwoju miażdżycy jest uszkodzenie warstwy komórek śródbłonka. Wykrycie zmian w funkcjonowaniu śródbłonka jest możliwe dużo wcześniej, niż zaobserwowanie zmian strukturalnych tej tkanki. Wyniki badań przeprowadzonych in vitro oraz in vivo, wskazują, że HTL jest bardziej toksyczny dla komórek śródbłonka niż Hcy. Powoduje on wiele zmian morfologicznych, wywołuje stan zapalny, a także indukuj e apoptozę [8,9].
PL 227 930 B1
MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, których występowanie potwierdzono u wielu organizmów. Są one zaangażowane w regulację ekspresji informacji genetycznej. Cząsteczki miRNA w komórkach ssaków mają długość około 22 nukleotydów. Prekursory miRNA, zwane primiRNA, transkrybowane są przez polimerazę III RNA w jądrze, są znacznie dłuższe niż dojrzałe cząsteczki. Na końcu 5' mają guanozynę metylowaną w pozycji siódmej (ang. cap) oraz sekwencję poli(A) na końcu 3'. Podlegają one obróbce enzymatycznej przy udziale enzymów Drosha i Pasha, co prowadzi do powstania pre-miRNA. Następnie cząsteczki te przenoszone są przez białko eksportynę 5 do cytoplazmy, gdzie enzym Dicer przycina je do pełnej długości, dojrzałych miRNA. Dojrzała aktywna nić miRNA włączana jest do rybonukleoproteinowego kompleksu RISC, dzięki czemu cząsteczka miRNA może oddziaływać z sekwencją komplementarną w mRNA, powodując jej przecięcie lub zahamowanie translacji. Jedna cząsteczka miRNA może posiadać wiele sekwencji docelowych w mRNA, a także pojedyncza sekwencja mRNA może zawierać wiele miejsc wiązania dla różnych miRNA [10,13].
Z danych literaturowych wiadomo, że miRNA ulegają wysokiej ekspresji w układzie sercowo-naczyniowym. Biorą one udział w regulacji procesów komórkowych takich jak różnicowanie, wzrost czy apoptoza. Przy pomocy eksperymentów z użyciem enzymów kluczowych dla powstawania miRNA (Dicer i Drosha) wykazano, iż cząsteczki te pełnią główne funkcje w regulacji takich procesów jak angiogeneza, proliferacja komórek czy procesy zapalne w obrębie naczyń krwionośnych. Zaburzenia w funkcjonowaniu tych cząsteczek mogą prowadzić do powstania stanów chorobowych [ 11, 12, 13, 14, 15, 16].
Zgłoszenie patentowe CA2783536 (opublikowane 2011-06-16) dotyczy metody oceny ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, w oparciu o oznaczenie poziomu przynajmniej dwóch biomarkerów miRNA i/lub przynajmniej trzech biomarkerów białkowych (wybranych z listy podanej przez autorów zgłoszenia patentowego), w badanych próbkach. Poziom oznaczonych markerów molekularnych koreluje z poziomem ryzyka rozwoju chorób układu krążenia człowieka.
Zgłoszenie patentowe 20080300797 (opublikowane 2008 12 04) odnosi się do oceny ryzyka rozwoju miażdżycy, a także monitorowania rozwoju tej choroby w oparciu o oznaczenie dwóch białkowych markerów molekularnych (wybranych z listy podanej przez autorów zgłoszenia patentowego) w próbkach krwi, których poziom ulega zróżnicowaniu w rozwoju i przebiegu miażdżycy.
Zgłoszenie patentowe US 2008/0305507 (opublikowane 2008 11 12) odnosi się do enzymatycznej metody oznaczania poziomu całkowitej homocysteiny w próbkach biologicznych, takich jak osocze czy surowica krwi, która charakteryzuje się wysoką specyficznością.
Pomimo stosowanych do tej pory rozwiązań istnieje ciągła potrzeba opracowania narzędzi molekularnych umożliwiających szybką i nieinwazyjną diagnostykę ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, które pozwoliłoby na ograniczenie negatywnych skutków przed wystąpieniem choroby, a także obniżającego koszty związane z hospitalizacją i późniejszą rehabilitację.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków chemicznych mających zastosowanie do diagnostyki wczesnych stadiów chorób układu krążenia - cząsteczek miRNA, w których wykorzystuje się poziom ekspresji wytypowanych cząsteczek miRNA (hsa-miR 34a, hsa-miR 30e, hsa-miR 125 bl, hsa-miR let 7b, hsa-miR 331 3p, hsa-miR 331 5p) jako narzędzia diagnostycznego do określania ryzyka rozwoju chorób układu krążenia u ludzi.
Nieoczekiwanie okazało się, ze wytypowane cząsteczki miRNA stanowią potencjalne biomarkery dające możliwość szybkiej i precyzyjnej diagnostyki, a przede wszystkim dają możliwość wykrycia zmian na poziomie molekularnym, przed pojawieniem się zmian chorobowych - strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych. Wynalazek ten stanowi podstawę do opracowania testów diagnostycznych mogących znaleźć zastosowanie w profilaktyce chorób układu krążenia oraz wczesnego zapobiegania dalszemu postępowi choroby.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie in vitro biomarkera molekularnego wybranego z grupy składającej się z hsa-miR 30e o długości 22nt i SEQ ID. Nr 2, hsa-miR 331 5p o długości 22 nt i SEQ ID. Nr 5 lub hsa-miR 331 3p o długości 21 nt i SEQ ID. Nr 6 do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi, przy czym za istotny diagnostycznie uznaje się co najmniej czterokrotny wzrost ekspresji rzeczonych biomarkerów w porównaniu z próbką kontrolną.
Na figurze 1 przedstawiono przykładowe widmo dla pomiaru absorbancji w zakresie UV-VIS próbek miRNA wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5.
W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe realizacje wynalazku.
PL 227 930 Β1
Przykłady
Badania prowadzono na komórkach ludzkiego śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) ze źródeł komercyjnych (Lonza). Badania prowadzono przez 24 h z dodatkiem do medium hodowlanego tiolaktonu homocysteiny w stężeniach 1, 10, 100, 1000 μΜ. Po zakończeniu inkubacji za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu (MirVana, Ambion) przeprowadzono izolację kompletu próbek całkowitego RNA z komórek HUVEC. Całkowite RNA wyizolowano również ze świeżej krwi obwodowej, pobranej na EDTA lub z frakcji leukocytarnej. W tym celu próbkę krwi żwirowano przez 10 min w temperaturze 4°C, 16000 g. Po odwirowaniu zaobserwowano trzy frakcje: osoczową, leukocytarną i erytrocytarną. W celu izolacji całkowitego RNA przeniesiono frakcje osoczową i leukocytarną do czystych probówek a następnie rozpoczęto procedurę izolacji przy pomocy odczynnika TRIzol (lnvitrogen) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Wszystkie próbki całkowitego RNA scharakteryzowano pod względem czystości i jakości na bioanalizatorze Agilent 2100 (Eukaryote Total RNA Nano 6000 kit).
Do dalszych etapów wyselekcjonowano tylko próbki, dla których współczynnik RIN (ang. RNA Integrity Number) wynosił powyżej 8,0. W ten sposób zgromadzono bibliotekę próbek całkowitego RNA z dwóch powtórzeń biologicznych eksperymentu obrazującego wpływ tiolaktonu homocysteiny na zmiany w poziomie ekspresji miRNA. Pulę miRNA obecnych w próbkach całkowitego RNA wyznakowano barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5 przy pomocy zestawu komercyjnego (ULS microRNA lab eling Kit, Kreatech Diagnostics), zgodnie z protokołem:
Tabela 1
Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji
| Składniki reakcji | |
| całkowite RNA | |
| Cv3/Cy5 | 2μΙ |
| 1 Ok Iabeling soiution | 2μΙ |
| nuclease free water | do 20μ1 |
| 85°C, iśmin, SlHIcpm |
Po inkubacji, próbki RNA oczyszczono na kolumnach KREApure columns (Kreatech Diagnostics) zgodnie z protokołem dołączonym przez producenta. Jakość wyznakowanych fluorescencyjnie próbek (stężenie cDNA oraz ilość przyłączonego barwnika fluorescencyjnego), oraz ich czystość sprawdzono przy pomocy spektrofotometru Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Do hybrydyzacji używano tylko próbki, w których do puli miRNA przyłączone zostało przynajmniej 100 pmoli barwnika fluorescencyjnego.
Tabela 2
Wyniki pomiarów absorbancji w zakresie UV-VIS próbek miRNA wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5
| nazwa próbki | slęzenie | jedn | typ próbki | barwniki | stężenie | jedn | barwnik2 | stężenie | jedn |
| kłHTLCy3 | 61,5 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 5,5 | pmol/pl | CyS | -0,1 | pmol/pl |
| k2HTLCy3 | 74,0 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 6,6 | pmol/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| k3HTLCy3 | 92,6 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 7,2 | pmol/pl | Cy5 | 0,1 | pmol/pl |
| k4HTLCy3 | 95,0 | ncł/μΙ | ssDNA | Cy3 | 8,1 | pmol/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| kSHTLCy3 | 46,8 | nq/pl | ssDNA | Cy3 | 6,8 | pmol/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| luMHTLCy3 | 80,5 | ng/pl | ssDNA | cy3 | 5,7 | pmol/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| lOuM HTL Cy3 | 110,9 | nq/pl | ssDNA | Cy3 | 7,4 | pmoJ/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| 100uMHTLCy3 | 75,3 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 3,5 | pmol/pl | CyS | 0,0 | pmol/pl |
| 500uMHTLCy3 | 79,4 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 6,6 | pmol/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| 100GuMHTLCy3 | 77,8 | nq/pl | ssDNA | Cy3 | 5,9 | pmol/pl | Cy5 | 0,0 | pmol/pl |
| KlHTLCyS | 102,5 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 1,1 | pmol/pl | Cy5 | 8,6 | pmol/pl |
| K2HTLCy5 | 69,6 | ης/μΙ | ssDNA | 0/3 | 1,0 | pmol/pl | Cy5 | 6,8 | pmol/pl |
| K3HTLCy5 | 94,4 | nq/pl | ssDNA | Cy3 | 0,8 | pmol/pl | CyS | 8,3 | pmol/pl |
| K4HTLCy5 | 79,2 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 0,9 | pmol/pl | CyS | 6,9 | pmol/pl |
| KSHTLC/5 | 47,4 | nq/p! | ssDNA | Cy3 | 1,2 | pmol/pl | Cy5 | 7,0 | pmol/pl |
| luMHTLCyS | 83,8 | nq/p! | ssDNA | Cy3 | 0,9 | pmol/pl | CyS | 6,8 | pmoi/pl |
| lOuMHTLCyS | 92,1 | ng/μ! | ssDNA | Oy3 | 0,1 | pmol/pl | cys | 6,2 | pmol/pl |
| 100uMHTLCy5 | 83,5 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 1,2 | pmol/pl | CyS | 8,0 | pmol/pl |
| SOOuMHTLCyS | 77,0 | ng/pl | ssDNA | Cy3 | 0,9 | pmol/pl | Cy5 | 6,8 | pmol/pl |
| lOOOuMHTLCyS | 83,0 | ng/jjl. | ssDNA | 93 | 1,0 | pmol/pl | Cy5 | 7,0 | pmol/pl |
PL 227 930 Β1
Następnie zastosowano proces hybrydyzacji do mikromacierzy zawierających sondy specyficzne dla prekursorów ludzkich miRNA (pre-miRNA). Podczas hybrydyzacji stosowano podejście typu „dye swap”, tzn. że w pierwszym powtórzeniu próbkę kontrolną (miRNA pochodzące z komórek nie traktowanych tiolaktonem Hcy) wyznakowano Cy3 a próbkę badaną Cy5, a przy drugim powtórzeniu zamieniono barwniki, tak aby próba kontrolna wyznakowana została Cy5 a badana Cy3. Próby kontrolne połączono z odpowiadającymi im próbami badanymi i zatężono do objętości 20 μΙ. Proces hybrydyzacji przeprowadzono według poniższej tabeli. Po wysuszeniu płytki hybrydyzacyjne skanowano za pomocą skanera do mikromacierzy GenePix 4000AL (Molecular Devices) z rozdzielczością 5 μΜ.
Tabela 3
Protokół hybrydyzacji, wraz z czasem trwania i składem buforów w poszczególnych etapach hybrydyzacji sond wyznakowanych fluorescencyjnie z płytkami mikromacierzowymi
| ETAPI | płukanie; 5x SSC, 0,1% SDS, l,5min, 42°C | |
| ETAP 11 | prehybrydyzacja 5x SSC, 0,1% SDS, lh, 42°C | |
| ETAP III | płukanie | 5 min., 42°C, woda milliQ |
| 1,5 min., 5x SSC, 0.1% SDS | ||
| ETAP IV | nałożenie próbki, miRNA OneArray hybridization buffer II | |
| ETAP V | hybrydyzacja 18h, 42°C | |
| ETAPVI | płukanie | 4 min., 42°C, 5x SSC, 0,1 % SDS |
| 6 min., 23°C, 2x SSC, 0,1 % SDS | ||
| 2 min., 23°C, 0,2x SSC | ||
| ETAPVII | suszenie 2min, 30'C |
Przeprowadzono analizę mikromacierzy z wykorzystaniem oprogramowania GenePix Pro6.0. Dla każdej sondy umieszczonej na mikromacierzy (w tym dla sond kontrolnych) zliczono sygnały pochodzące od próby kontrolnej i badanej, a także wykluczono z dalszej analizy sygnały słabe oraz artefakty. Następnie przeprowadzono analizę statystyczną posługując się dostępnym komercyjnie oprogramowaniem R (http://www.r-project.org).
Na podstawie przeprowadzonych analiz wytypowano markery molekularne, które stanowią miRNA wykazujące przynajmniej czterokrotną różnicę w ekspresji pod wpływem tiolaktonu homocysteiny, w porównaniu do próbek kontrolnych (nie traktowanych tioloaktonem homocysteiny).
Tabela 4
Wykaz miRNA wykazujących odmienną ekspresję pod wpływem tiolaktonu homocysteina. Wartości krotności zmiany przedstawione w tabeli odnoszą się do najwyższego stężenia HTL (1000 μΜ)
| miRNA | Numer w bazie danych miRBase | Krotność (FC) | zmiany |
| hsa-miR-200c | Acc:MI0000342 | 6,59 | |
| hsa-miR-192 | Acc:M10000234 | 5,47 | |
| hsa-miR-30e | Acc:MI0000749 | 15,9 | |
| hsa-miR-let 7b | Acc:MI0000650 | 20,11 | |
| hsa-miR-200b | Acc:M10000650 | 6,38 | |
| hsa-miR-377 | Acc:MI0000785 | 6,41 | |
| hsa-miR-34a | Acc:M10000268 | 18,83 | |
| hsa-miR-331 | Acc:MI0000812 | 6,24 | |
| hsa-miR-125 bl | Acc:MI0000446 | -7,36 |
Spośród tej grupy miRNA wybrano te cząsteczki, których poziom ekspresji był najbardziej zmieniony w porównaniu do kontroli. Były to:
hsa-miR 34a o długości 22nt i SEQ. ID nr 1; hsa-miR 30e o długości 22nt i SEQ. ID nr 2; hsa-miR 125 bl o długości 22nt i SEQ. ID nr 3; hsa-miR let 7b o długości 22nt i SEQ. ID nr 4; hsa-miR 331 5p o długości 22nt i SEQ. ID nr 5 oraz hsa-miR 331 3p o długości 21 nt i SEQ. ID nr 6.
PL 227 930 Β1
Następnie dla wybranych cząsteczek miRNA zaprojektowano primery typu spinki do włosów (ang. stem loop), pozwalające na przepisanie miRNA na cDNA. Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono według protokołu [17]:
Tabela 5
Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem primerówtypu stem loop.
| składniki reakcji | ilość użyta do reakcji |
| całkowite RNA | lOOpg |
| stem loop primer | 250pM |
| 70*Ct 5 min | |
| 0“C, 2 min | |
| 5x Reaction Buffet· | lx |
| dNTP mix | 2,5 μΜ |
| M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/gl) | 0,5U |
| RiboLock RNase Inhibitor (20U/p!) | 0,04U |
| nuclease free water | do 15μΙ |
| I6“C 30 min | |
| 42°C 60 min | |
| 85°Ο 5min |
Sekwencje primerów użyte do reakcji odwrotnej transkrypcji:
SEQ. ID nr 7 stem loop 125b1
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTCACAA 3'
SEQ. ID nr 8 stem loop 331 5p
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACGGATCC3’
SEQ. ID nr 9 stem loop 331 3p
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTTCTAG 3'
SEQ. ID nr 10 stem loop 30e
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCTTCCA 3'
SEQ. ID nr 11 stem loop Iet7b
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAACCAC 3'
SEQ. ID nr 12 stem loop 34a
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACACAACC 3'
W celu określenia różnic w poziomie ekspresji miRNA przeprowadzono reakcję PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-Time PCR).
Sekwencje starterów użyte do reakcji Real-time PCR:
SEQ. ID nr 13 uniwersalny revers primer 5’ GTGCAGGGTCCGAGGT 3'
SEQ. ID nr 14 125bforward 5' GTTTCCCTGAGACCCTAAC 3’
SEQ. ID nr 15 331 5p forward
5' GTTCTAGGTATGGTCCCAG 3'
SEQ. ID nr 16 331 3p forward
5’ TTGTGCCCCTGGGCCTAT 3’
SEQ. ID nr 17 30e forward
5' GTTTGGTGTAAACATCCTTGAC 3'
SEQ. ID nr 18 Iet7b forward
5' GGGTGAGGTAGTAGGTTGT 3'
SEQ. ID nr 19 34a forward
5' GTGTGGCAGTGTCTTAGCT 3'
PL 227 930 Β1
Tabela 6
Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji real time PCR
| składniki reakcji | iloić użyta do reakcji |
| 2x qPCR Mater Mix | 10 μΐ |
| 25uMROX | 0,2 μΙ |
| forward primer 1,5 μΜ | 4μΙ |
| universal reverse primer 0,7 μΜ | 1,87μ1 |
| cDNA | 0,67 μΐ |
| nuclease free water | άο20μ! |
Tabela 7
Warunki amplifikacji cDNA w reakcji real time PCR' Tm - temperatura topnienia primerów
| temperatura | czas | ilość cykli |
| 95°C | 10 min | 1 |
| 95°C | 0:15 min | 45 |
| Tm | 1 min | |
| 72°C | 0:30 min | |
| 95°C | 1 min | 1 |
| 55’C | 0:30 min | 1 |
| 95°C | 0:30 min | 1 |
Wszystkie reakcje przeprowadzono w dwóch powtórzeniach technicznych i trzech biologicznych
Różnice w relatywnej ekspresji badanych cząsteczek miRNA pod wpływem tiolaktonu homocysteiny określono na podstawie wartości Ct przy użyciu metody - AACt [18],
Reasumując, zaobserwowane i potwierdzone zmiany w poziomie ekspresji genów miRNA, w odpowiedzi na warunki stresowe, stanowiły podstawę do wytypowania cząsteczek biomarkerów dla wczesnych stadiów chorób układu krążenia.
Zastosowanie tego rodzaju techniki pozwoli na wprowadzenie szybkiego i łatwego do przeprowadzenia badania do laboratoriów diagnostycznych i szpitalnych. Będzie to szczególnie istotne dla osób będących w grupie ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, u których ewentualne zmiany w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych są jeszcze na bardzo wczesnym etapie.
Mimo zwiększających się co roku nakładów na ochronę zdrowia i wdrażanych programów profilaktycznych, nie ma nieinwazyjnych narzędzi diagnostycznych, które umożliwiłyby szybką diagnozę. Opracowany na podstawie wytypowanych biomarkerów test diagnostyczny pozwoliłby znacznie obniżyć koszty badania, jak i zapobiegać przewyższającemu koszty diagnostyki leczeniu szpitalnemu. Z wykorzystaniem proponowanego testu możliwe będzie skrócenie czasu oczekiwania na wydanie wyniku i zwiększenie ilości jednorazowo analizowanych prób.
Opracowane rozwiązanie stanowi podstawę do opracowania szybkich testów diagnostycznych w zakresie wczesnych stanów chorobowych w zakresie chorób układu krążenia.
Zastosowanie tej technologii umożliwia wykrywanie wczesnych zmian w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych na poziomie molekularnym w stosunkowo krótkim czasie.
Wykorzystanie biomarkerów i wczesna identyfikacja niekorzystnych zmian w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych, ma znaczenie dla:
• wprowadzenia szybkiego i łatwego do przeprowadzenia badania w laboratoriach diagnostycznych;
• charakterystyki molekularnej dla badań podstawowych.
Jednocześnie przy zastosowaniu proponowanego wynalazku lekarz/pracownik laboratorium diagnostycznego może realizować następujące cele:
• zastosować biomarkery do wykrywania wczesnych zaburzeń w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych;
• skrócić czas potrzebny na wykonanie badania oraz zwiększyć liczbę tego typu badań wykonywanych w ciągu doby;
• obniżyć koszty wykonania badania a także leczenia poprzez uniknięcie kosztownego pobytu pacjenta w szpitalu;
PL 227 930 B1 • zwiększyć dostęp do badań profilaktycznych;
• zwiększyć wykrywalność osób, które narażone są na rozwój choroby.
Literatura
1. Jakubowski H., Fersht A. R.: Alternative pathways for editing non-cognate aminoacids by aminoacyl-tRNA synthetases; Nucleic Acid Research, 1981, vol9, no.13, 3105-3117
2. Perła-Kajan J., Twardowski T., Jakubowski H.: Mechanisms of homocysteine toxicity in humans; Amino Acids 2007; 32(4): 561-72
3. Jakubowski H.: Metabolism of homocysteine thiolactone in human cell cultures; Journal of Biological Chemistry, 1997, vol. 272, no 3, pp. 1935-1942
4. Jakubowski H.: Protein homocysteinylation: possible mechanism underlying pathological consequences of elevated homocysteine levels: FASEB Journal, 1999 Dec, vol. 13: 2277-2283
5. Jakubowski H.: Pathological consequences of homocysteine excess; Journal of Nutrition
136: 1741S-1749S, 2006
6. Perła J., Undas A., Twardowski T., Jakubowski H.: Purification of antibodies against
N-homocysteinylated proteins by affinity chromatography on Nro-homocysteinylaminohexyl-agarose; J. Chromatogr. B., Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004 5; 807(2): 257-261
7. Jakubowski H., Zhang L., Bardeguez A., Aviv A.: Homocysteine thiolactone and protein homocysteinylation in human endothelial cells: implications for atherosclerosis; Circulation Research 2000; 87(1): 45-51
8. Kerkeni M., Tnani M., Chuniaud L., Miled A., Maaroufi K., Trivin F. Comparative study on in vitro effect of homocysteine thiolactone and homocysteine on HUVEC cells: evidence for a stronger proapoptotoic and proinflammative homocysteine thiolactone; Molecular and Cellular Biochemistry 2006; 219(1 -2): 119-126
9. Suarez Y., Fernandez-Hernando C., Pober J., Sesssa W.: Dicer dependent microRNAs regulate gene expression and functions in human endothelial cells; Circ Res 2007; 100: 1165-1173.
10. Scalbert E., Bril A.: Implication of microRNA in the cardiovascular system; Current Opinion in
Pharmacology, 2008, 8: 181 -188
11. Ji R., Cheng Y., Yue J., Yang J.: MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal as essential role of microRNA in vascular neointimal lesion formation; Circ Re. 2007; 100: 1579-1588.
12. Zhang C.: MicroRNAs: role in cardiovascular biology and disease; Clinical Science 2008,
114: 699-706.
13. Suarez Y., Fernandez-Hernando C., Pober J., Sesssa W.: Dicer dependent microRNAs regulate gene expresion and functions in human endothelial cells; Circ Res 2007; 100: 1165-1173.
14. Kuehbacher A., UrbichC., Zeiher A., Dimmler S.: Role of dicer and drosha for endothelial microRNA expression and angiogenesis; Circ Res. 2007; 101: 59-68.
15. Polseno L., Tuccoli A., Mariani L., Ewangelista M., Citti L., Woods K., Mercatanti A.: Micro
RNAs modulate the angiogenic properties of HUVECs; Blond, 2006 Nov1, vol 108 no9.
16. Jung M, Mollenkopf H J, Grimm C, Wagner I, Albrecht M, Waller T, Pilarsky C, Johannsen
M, Stephan C, Lehrach H, Nietfeld W, Rudel T, Jung K, Kristiansen G.: MicroRNA profiling of clear cell renal cell cancer identifies a robust signature to define renal malignancy; J Cell Mol Med 2009, Sep; 13(9B): 3918-28.
17. M. Tevfik Dorak (ed.), 2006 Real-time PCR.
PL 227 930 Β1
Lista sekwencji
SEQ. ID nr 1 (hsa-miR 34a)
5'cuagguauggucccagggaucc'3
SEQ. ID nr 2 (hsa-miR 30e)
5'uguaaacauccuugacuggaag'3
SEQ. ID nr 3 (hsa-miR 125 bl)
5'ucccugagacccuaacuuguga'3
SEQ. ID nr 4 (hsa-miR let 7b)
5'ugagguaguagguugugugguu'3
SEQ. ID nr 5 (hsa-miR 331 5p)
5'cuagguauggucccagggaucc'3
SEQ. ID nr 6 (hsa-miR 331 3p) 'aagauccuauccggguccccg'3
SEQ. ID nr 7 stem loop 125bl
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTCACAA 3'
SEQ. ID nr 8 stem loop 331 5p
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACGGATCC3’
SEQ. ID nr 9 stem loop 331 3p
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTTCTAG 3'
PL 227 930 Β1
SEQ. ID nr 10 stem loop 30e
5' GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCTTCCA 3'
SEQ. ID nr 11 stem loop let7b
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAACCAC 3'
SEQ. ID nr 12 stem loop 34a
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACACAACC 3'
SEQ. ID nr 13 uniwresalny revers primer
5’ GTGCAGGGTCCGAGGT 3'
SEQ. ID nr 14
125b forward
5' GTTTCCCTGAGACCCTAAC 3'
SEQ. ID nr 15
331 5p forward
5' GTTCTAGGTATGGTCCCAG 3'
SEQ. ID nr 16
331 3p forward
5’ TTGTGCCCCTGGGCCTAT 3’
SEQ. ID nr 17
30e forward
5' GTTTGGTGTAAACATCCTTGAC 3'
SEQ. ID nr 18 let7b forward
5' GGGTGAGGTAGTAGGTTGT 3’
SEQ. ID nr 19
34a forward
5' GTGTGGCAGTGTCTTAGCT 3’
PL 227 930 Β1
Claims (1)
1. Zastosowanie in vitro biomarkera molekularnego wybranego z grupy składającej się z: hsa-miR 30e o długości 22nt i SEQ ID. Nr 2 hsa-miR 331 5p o długości 22nt i SEQ ID. Nr 5 lub hsa-miR 331 3p o długości 21 nt i SEQ ID. Nr 6 do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi, przy czym za istotny diagnostycznie uznaje się co najmniej czterokrotny wzrost ekspresji rzeczonych biomarkerów w porównaniu z próbką kontrolną.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL402289A PL227930B1 (pl) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL402289A PL227930B1 (pl) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL402289A1 PL402289A1 (pl) | 2014-07-07 |
| PL227930B1 true PL227930B1 (pl) | 2018-01-31 |
Family
ID=51063099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL402289A PL227930B1 (pl) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL227930B1 (pl) |
-
2012
- 2012-12-28 PL PL402289A patent/PL227930B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL402289A1 (pl) | 2014-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111356774B (zh) | 用于检测衰老细胞的新型生物标记物 | |
| Vatandoost et al. | Dysregulated miR-103 and miR-143 expression in peripheral blood mononuclear cells from induced prediabetes and type 2 diabetes rats | |
| US20170067106A1 (en) | Methods and compositions for diagnosis of alzheimer's disease | |
| US20120034612A1 (en) | Methods and Kits for miRNA Isolation and Quantitation | |
| CN107267604B (zh) | 一种基于短链核酸探针和双链特异性核酸内切酶的高特异性microRNA荧光检测方法 | |
| CN103642914B (zh) | 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用 | |
| EP4560026A2 (en) | Use of micro-ribonucleic acid (mirna) to diagnose transplant rejection and tolerance of immunosuppression therapy | |
| CN105177132A (zh) | 一种定量检测miRNA的RT-PCR方法 | |
| CN102443638B (zh) | 一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用 | |
| Jodati et al. | Different expression of Micro RNA-126, 133a and 145 in aorta and saphenous vein samples of patients undergoing coronary artery bypass graft surgery | |
| CN111733227A (zh) | 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用 | |
| Hu et al. | High homocysteine promotes telomere dysfunction and chromosomal instability in human neuroblastoma SH-SY5Y cells | |
| PL227930B1 (pl) | Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi | |
| EP2540829B1 (en) | Marker for detection of myogenic diseases, and method for detection of the diseases using same | |
| CN110951870A (zh) | miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用 | |
| Jin et al. | Comparative studies of two methods for miRNA isolation from milk whey | |
| PL227931B1 (pl) | Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią | |
| CN108699588A (zh) | 诊断伴随过度细胞死亡的疾病的方法以及用于其实施的试剂盒 | |
| Sultan et al. | Impact of gestational and type 2 diabetes on fetal endothelial cell miRNA expression | |
| CN106929601A (zh) | 一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒 | |
| CN114196747A (zh) | 一种与代谢相关脂肪性肝病发生发展关联的生物标志物 | |
| CN119799878B (zh) | 一种用于诊断帕金森症严重程度的分子标志物及其应用 | |
| CN106520915B (zh) | 一种用于冠心病血清/血浆miRNA检测的内参 | |
| CN103740845B (zh) | 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-513b检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN110699450A (zh) | miRNA生物标志物在肝脏疾病诊断和预后判断中的应用 |