PL227252B1 - Sposób otrzymywania mieszaniny fruktooligosacharydów - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania mieszaniny fruktooligosacharydów (FOS) o działaniu prozdrowotnym.

Proces syntezy FOS z sacharozy można prowadzić zarówno w sposób okresowy z użyciem rozpuszczalnego lub immobilizowanego enzymu transglikozylacyjnego, jak i ciągły z wykorzystaniem unieruchomionego enzymu, bądź całych komórek.

W publikacji Carbohydrate Research 2009, t. 344, 795-800 ujawniono zastosowanie β-fruktofuranozydazy z Aspergillus japonicus ATCC 20236 związanej z grzybnią, immobilizowanej w piance poliuretanowej, jako katalizatora reakcji otrzymywania FOS z sacharozy w trakcie 48-godzinnej wgłębnej hodowli produkcyjnej. Wydajność FOS wynosiła 66% (w/v). Nośnik poliuretanowy okazał się najlepszym dla wzrostu komórek, choć ilość wytworzonych FOS była niska, w porównaniu z pozostałymi preparatami.

Znana jest także, z czasopisma European Food Research and Technology 2012, t. 235, 13-22, biokonwersja sacharozy do FOS podczas 96-godzinnej hodowli wgłębnej (I-szy cykl przez 36 godzin, kolejnych V cykli po 12 godzin), katalizowana przez komórkową β-fruktofuranozydazę z Penicillium expansum, unieruchomioną w piance poliuretanowej. W tym przypadku wydajność syntezy fruktooligosacharydów z sacharozy wynosiła 53% (w/w).

W czasopiśmie Process Biochemistry 2014, t. 49, 840-844 poinformowano o sposobie syntezy FOS z sacharozy, katalizowanej przez związaną z grzybnią fruktozylotransferazę z Aspergillus flavus NFCCI 2364, unieruchomioną w chitozanie. Wydajność FOS wynosiła ok. 43% (w/w). W tym samym periodyku opisano także sposób syntezy FOS w drodze reakcji transglikozylacji katalizowanej przez ten sam biokatalizator unieruchomiony w alginianie. W tym przypadku uzyskano wydajność FOS około 68% (w/w).

Sposoby otrzymywania fruktooligosacharydów z sacharozy z wydajnością 40-57% (w/w), w których jako katalizator stosuje się grzybniową fruktozylotransferazę z Aureobasidium pullulans ATCC 9348 lub z Aureobasidium pullulans ATCC 20524, unieruchomioną w alginianie wapnia, opisane są również w czasopismach odpowiednio: Biotechnology Letters 2011, t. 33, 1621-1624, Journal of Food Technology 2011, t. 9, 91-94, Letters in Applied Microbiology 2004, t. 38, 176-179.

W czasopiśmie Biotechnology and Bioprocess Engineering 1996, t. 1,18-21 ujawniono sposób syntezy FOS z sacharozy (60% w/v) z udziałem wewnątrzkomórkowej fruktozylotransferazy z Aureobasidium pullulans KFCC 10524, unieruchomionej w żywicach jonowymiennych, jako katalizatora. Uzyskana mieszanina zawierała średnio 55-58% (w/w) FOS.

Sposób otrzymywania mieszaniny FOS (z wydajnością 58-68% w/w) z sacharozy (50% w/w), w którym jako katalizator stosuje się zewnątrzkomórkową fruktozylotransferazę Rhodotorula sp. unieruchomioną na stopie niobu i grafitu, opisano w czasopiśmie Food and Bioproducts Processing 2013, t. 91, 609-616.

Znane są sposoby otrzymywania mieszaniny fruktooligosacharydów na drodze biokonwersji sacharozy z użyciem wolnej fruktozylotransferazy, opisane między innymi w opisach zgłoszeń patentowych: US 2011/0081449 A1, CN102127574 A, WO/2011/051965.

Z opisu patentowego PL 205 572 jest znany sposób enzymatyczny wytwarzania mieszanin fruktooligosacharydów w drodze biokonwersji sacharozy w roztworze wodnym o stężeniu 50-70% przy użyciu mieszaniny fruktozylotransferazy i fruktofuranozydazy, w środowisku mleczanu lub propionianu sodu, w temperaturze 20-70°C przy pH 5,8-7,3.

W opisie patentowym PL 214 427 ujawniono sposób wytwarzania fruktozylotransferazy w formie wolnej lub związanej z grzybnią, w drodze hodowli szczepu grzyba strzępkowego Aspergillus niger ŁOCK 0430 na podłożu zawierającym sacharozę, ekstrakt drożdżowy i sole mineralne.

Z opisu patentowego PL 212 473 znane jest wytwarzanie unieruchomionych preparatów mycelium pleśni Aspergillus niger ŁOCK 0431, w drodze hodowli tego szczepu na podłożu produkcyjnym zawierającym sacharozę, ekstrakt drożdżowy, karboksymetylocelulozę oraz sześciany pianki poliuretanowej o wymiarach od 8x8x8 do 10x10x10 mm.

Sposób otrzymywania mieszaniny fruktooligosacharydów (kestozy, nystozy i fruktozylonystozy), polegający na transglikozylacji sacharozy, katalizowanej unieruchomioną grzybniową fruktozylotransferazą (FT) grzyba z rodzaju Aspergillus i po zakończeniu reakcji na oddzieleniu katalizatora z mieszaniny reakcyjnej, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako źródło sacharozy stosuje się roztwór czystego cukru o pH 6,2 ustalonym przy użyciu 0,05 M roztworu buforu octanowego, który

PL 227 252 B1 poddaje się transglikozylacji w obecności związanej z grzybnią fruktozylotransferazy szczepu grzyba strzępkowego Aspergillus niger ŁOCK 0431 osadzonej w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach od 8x8x8 do 10x10x10 mm i o wielkości porów 2,2-3,4 mm, w ilości 40% suchej masy w całkowitej masie preparatu. Transglikozylację prowadzi się w sposób okresowy w reaktorze periodycznym z mieszaniem, stosując roztwór cukru o stężeniu 30-80% w/v i immobilizowaną fruktozylotransferazę o aktywności 132-196 U/g grzybni w ilości 2-8 U/g sacharozy, w temperaturze 40-50°C w czasie 8-24 godzin. Transglikozylację prowadzi się także w sposób ciągły w reaktorze kolumnowym upakowanym immobilizowaną fruktozylotransferazą o aktywności 156-212 U/g grzybni, użytą w ilości 12-23% objętości komory reaktora, stosując roztwór czystego cukru o stężeniu 50-60% w/v przepływający ₃ przez reaktor z szybkością 0,07-6,67 cm³/minutę, w temperaturze 40°C w czasie 2-42 godzin.

Zarówno skład jakościowy jak i ilościowy uzyskanej mieszaniny zależy od ilości wprowadzonej fruktozylotransferazy oraz czasu reakcji (transglikozylacja okresowa) lub szybkości przepływu roztworu cukru (transglikozylacja ciągła).

Szczep grzyba strzępkowego Aspergillus niger oznaczony symbolem ŁOCK 0431, wyodrębniony ze środowiska naturalnego, znajduje się w Kolekcji Czystych Kultur Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie mieszaniny fruktooligosacharydów z wydajnością 50-60% (mierzoną metodą HPLC i liczoną w stosunku do ilości użytej sacharozy). Mieszanina otrzymana sposobem według wynalazku, charakteryzowana na drodze analizy chromatograficznej, zawiera średnio 25% glukozy, 20% sacharozy i 55% FOS. Znajduje ona zastosowanie, jako składnik licznych produktów spożywczych, jak mleko i jego przetwory, napoje, pieczywo, gumy do żucia, desery, słodycze, ciasta, dresingi, sosy, zupy, żywność dla dzieci i osób starszych oraz w kosmetykach. Ponadto FOS może wchodzić w skład synbiotyków.

Sposób według wynalazku ilustrują bliżej poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

Osadzoną w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach 8x8x8 mm i o wielkości porów

2,8 mm, związaną z grzybnią fruktozylotransferazę (FT) szczepu grzyba Aspergillus niger ŁOCK 0431, o aktywności 189,35 U/g grzybni zastosowano w reakcji syntezy FOS z 40% w/v roztworu cukru o pH

6,2 ustalonym za pomocą 0,05 M buforu octanowego, stosując 5 U FT/g sacharozy. Reakcję prowa-1 dzono w reaktorze periodycznym, przy szybkości mieszania 200 minut^-1, w temperaturze 40°C w czasie 24 godzin, otrzymując z 1 l roztworu około 220 g FOS. Konwersja sacharozy do FOS nastąpiła po 8 godzinach reakcji. Mieszanina reakcyjna po tym czasie zawierała w procentach wagowych, średnio: 24,5% glukozy, 20,0% sacharozy, śladowe ilości fruktozy oraz 55,5% FOS, w tym 39,9% kestozy, 15,5% nystozy i 0,1% fruktozylonystozy. Wydłużenie czasu reakcji prowadziło do zmiany składu ilościowego oligosacharydów na skutek zachodzących reakcji dysproporcjonowania. Po 24 godzinach reakcji skład mieszaniny, w procentach wagowych, był następujący: 28% glukozy, 19% sacharozy, śladowe ilości fruktozy oraz 53% FOS, w tym: 23% kestozy, 26% nystozy i 4% fruktozylonystozy.

P r z y k ł a d 2

Osadzoną w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach 8x8x8 mm i o wielkości porów

2,8 mm, związaną z grzybnią mycelium FT szczepu grzyba strzępkowego Aspergillus niger ŁOCK 0431, o aktywności 189,35 U/g grzybni zastosowano w reakcji syntezy FOS z 60% w/v roztworu sacharozy o pH 6,2 ustalonym za pomocą 0,05 M buforu octanowego, stosując 4 U FT/g sacharozy.

Reakcję prowadzono w reaktorze periodycznym, przy szybkości mieszania 200 minut^-1, w temperaturze 40°C w czasie 24 godzin, otrzymując około 290 g FOS z 1 l roztworu sacharozy. Konwersja sacharozy do FOS nastąpiła po 8 godzinach reakcji. Mieszanina reakcyjna po tym czasie zawierała w procentach wagowych średnio: 25% glukozy, 21% sacharozy, śladowe ilości fruktozy oraz 54% FOS, w tym: 36% kestozy, 17% nystozy i 1% fruktozylonystozy. Wydłużenie czasu reakcji prowadziło do zmiany składu ilościowego oligosacharydów na skutek zachodzących reakcji dysproporcjonowania. Po 24 godzinach reakcji skład mieszaniny, w procentach wagowych, był następujący: 28% glukozy, 13% sacharozy, śladowe ilości fruktozy oraz 59% FOS, w tym: 22% kestozy, 29% nystozy i 8% fruktozylonystozy.

P r z y k ł a d 3

Osadzoną w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach 8x8x8 mm i o wielkości porów

2,8 mm, związaną z grzybnią FT szczepu grzyba strzępkowego Aspergillus niger ŁOCK 0431, o aktywności 189,35 U/g grzybni zastosowano w reakcji syntezy FOS z 80% (w/v) roztworu cukru o pH 6,2 ustalonym za pomocą 0,05 M buforu octanowego, stosując 6 U FT/g sacharozy. Reakcję prowadzono

PL 227 252 B1 w reaktorze periodycznym, przy szybkości mieszania 200 minut^-1, w temperaturze 40°C w czasie 24 godzin, otrzymując około 400 g FOS z 1 l roztworu sacharozy. Konwersja sacharozy do FOS nastąpiła po 8 godzinach reakcji. Mieszanina reakcyjna po tym czasie zawierała w procentach wagowych średnio: 30% glukozy, 11% sacharozy, śladowe ilości fruktozy oraz 59% FOS, w tym: 29% kestozy, 25% nystozy i 5% fruktozylonystozy. Wydłużenie czasu reakcji prowadziło do zmiany składu ilościowego oligosacharydów na skutek zachodzących reakcji dysproporcjonowania. Po 24 godzinach reakcji skład mieszaniny, w procentach wagowych, był następujący: 33% glukozy, 9% sacharozy, śladowe ilości fruktozy oraz 58% FOS, w tym: 14% kestozy, 28% nystozy i 16% fruktozylonystozy.

P r z y k ł a d 4

Preparat grzybni Aspergillus niger ŁOCK 0431 immobilizowanej w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach 10x10x10 mm i o wielkości porów 2,8 mm, o aktywności FT 211,68 U/g, użyty ₃ w ilości 12% całkowitej objętości (150 cm³) komory reaktora kolumnowego o długość 40 cm i średnicy

2,5 cm, zalano roztworem cukru o stężeniu 50% (w/v) i o pH 6,2 ustalonym przy użyciu 0,05 M buforu octanowego, po czym natychmiast uruchomiono przepływ roztworu sacharozy w sposób ciągły ₃ z szybkością 0,32 cm³/minutę. Całkowity czas przebywania substratu w reaktorze wynosił 6,95 godzin. Proces ciągłej transglikozylacji sacharozy prowadzono w temperaturze 40°C przez 7 godzin. W tym przypadku maksymalna konwersja sacharozy była obserwowana od około 3,5 godziny procesu. Produktywność objętościowa FOS wyniosła 50 g/l • godzina. Skład otrzymywanego syropu, w procentach wagowych, był następujący: 24% glukozy, 25% sacharozy oraz 51% FOS, w tym 32% kestozy, 16% nystozy i 3% fruktozylonystozy.

P r z y k ł a d 5

Preparat grzybni Aspergillus niger ŁOCK 0431 immobilizowanej w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach 10x10x10 mm i o wielkości porów 2,8 mm, o aktywności FT 156,31 U/g, wypełnia₃ jący 16% całkowitej objętości (1840 cm³) komory reaktora kolumnowego o długości 100 cm i średnicy 5 cm, zalano roztworem sacharozy o stężeniu 50% w/v i o pH 6,2 ustalonym przy użyciu 0,05 M buforu octanowego, po czym natychmiast uruchomiono przepływ roztworu sacharozy w sposób ciągły ₃ z szybkością 4,08 cm³/minutę. Całkowity czas przebywania substratu w reaktorze wynosił 6,33 godzin. Proces ciągłej transglikozylacji sacharozy prowadzono w temperaturze 40°C przez 7 godzin. Zużycie sacharozy wynosiło 80-85%. Produktywność objętościowa FOS osiągnęła wartość 169 g/l · godzina. Poziom FOS (270-280 g/l) ustabilizował się po 1,6 godzinach procesu, po kontakcie z 5231 U FT. Mieszanina wypływająca w tym czasie z reaktora zawierała w procentach wagowych: 54% FOS (w tym 35% kestozy, 16% nystozy i 3% fruktozylonystozy), 24% glukozy i 21% sacharozy. W kolejnych frakcjach zmieniał się skład ilościowy mieszaniny FOS, wynikający z kontaktu przepływającego przez kolumnę roztworu cukru z coraz większą ilością złoża biokatalizatora.

Planowany skład wytwarzanej mieszaniny FOS, w warunkach procesu określonych w tym przykładzie, można więc było regulować ilością użytego biokatalizatora upakowanego w reaktorze; przy jego aktywności 5231 U FT uzyskuje się mieszaninę z przewagą kestozy, natomiast przy aktywności złoża 19617 U FT spada ilość kestozy (25%) i wzrasta ilość nystozy (22%) i fruktozylonystozy (8%), przy ustalonym sumarycznym stężeniu FOS.

W poniższej tabeli przedstawiono zmiany składu FOS w mieszaninie reakcyjnej w zależności od aktywności biokatalizatora wchodzącego w kontakt z przepływającym roztworem sacharozy (500 g/l).

T a b e l a

Czas kontaktu cieczy ze złożem [godzina]	Aktywność FT w złożu [U]	Stężenie oligocukrów [g/l]
Kes	Nys	FNys	FOS
1,6	5231	176	83	12	271
3,0	9809	166	99	22	287
6,0	19617	118	109	41	268

PL 227 252 B1

Claims (3)

1. Sposób otrzymywania mieszaniny fruktooligosacharydów, polegający na transglikozylacji sacharozy, katalizowanej unieruchomioną grzybniową fruktozylotransferazą grzyba z rodzaju Aspergillus i po zakończeniu reakcji na oddzieleniu katalizatora z mieszaniny reakcyjnej, znamienny tym, że jako źródło sacharozy stosuje się roztwór czystego cukru o pH 6,2 ustalonym przy użyciu 0,05 M roztworu buforu octanowego, który poddaje się transglikozylacji w obecności związanej z grzybnią fruktozylotransferazy szczepu grzyba strzępkowego Aspergillus niger ŁOCK 0431, osadzonej w sześcianach pianki poliuretanowej o wymiarach od 8x8x8 do 10x10x10 mm i o wielkości porów 2,2-3,4 mm, w ilości 40% suchej masy w całkowitej masie preparatu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transglikozylacji poddaje się roztwór cukru o stężeniu 30-80% w/v, przy czym transglikozylację prowadzi się w sposób okresowy w reaktorze periodycznym z mieszaniem, stosując immobilizowaną fruktozylotransferazę o aktywności 132-196 U/g grzybni w ilości 2-8 U/ g sacharozy, w temperaturze 40-50°C w czasie 8-24 godziny.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transglikozylacji poddaje się roztwór cukru o stężeniu 50-60% w/v, przy czym transglikozylację prowadzi się w sposób ciągły w reaktorze kolumnowym upakowanym immobilizowaną fruktozylotransferazą o aktywności 156-212 U/g grzybni, wypełniającą 12-23 % objętości komory reaktora, przy szybkości przepływu roztwo₃ ru cukru przez reaktor 0,07-6,67 cm³/minutę, w temperaturze 40°C w czasie 2-42 godziny.