PL226828B1 - Sposób detekcji S-glikozylowanych białek ipeptydów - Google Patents
Sposób detekcji S-glikozylowanych białek ipeptydówInfo
- Publication number
- PL226828B1 PL226828B1 PL397240A PL39724011A PL226828B1 PL 226828 B1 PL226828 B1 PL 226828B1 PL 397240 A PL397240 A PL 397240A PL 39724011 A PL39724011 A PL 39724011A PL 226828 B1 PL226828 B1 PL 226828B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- axis
- peptides
- labeling
- sample
- silver
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 141
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 92
- 108091007464 S-glycosylated proteins Proteins 0.000 title claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 34
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 33
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 32
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 30
- -1 oligosaccharide glycan Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 23
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 22
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 20
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 20
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 19
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 11
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 9
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical class [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000007324 demetalation reaction Methods 0.000 claims description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 5
- RUACIFFMSHZUKZ-UHFFFAOYSA-O 3-Acrylamidopropyl trimethylammonium Chemical compound C[N+](C)(C)CCCNC(=O)C=C RUACIFFMSHZUKZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 2-vinylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=CC=N1 KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000002841 Lewis acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000002243 furanoses Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000007517 lewis acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000013335 mesoporous material Substances 0.000 claims description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 claims description 2
- 150000003215 pyranoses Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- ACTRVOBWPAIOHC-UHFFFAOYSA-N succimer Chemical compound OC(=O)C(S)C(S)C(O)=O ACTRVOBWPAIOHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003510 tertiary aliphatic amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 30
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 29
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 27
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 241001416181 Axis axis Species 0.000 description 24
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 22
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 22
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 22
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 22
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 22
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 22
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 17
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 15
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 13
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 13
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 12
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 12
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical group SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101710178035 Chorismate synthase 2 Proteins 0.000 description 4
- 101710152694 Cysteine synthase 2 Proteins 0.000 description 4
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical group NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 4
- 229930182475 S-glycoside Natural products 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 4
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- JUSMHIGDXPKSID-DVKNGEFBSA-N 1-thio-beta-D-glucopyranose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](S)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O JUSMHIGDXPKSID-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 3
- 238000002553 single reaction monitoring Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 150000007944 thiolates Chemical class 0.000 description 3
- OEIXGLMQZVLOQX-UHFFFAOYSA-N trimethyl-[3-(prop-2-enoylamino)propyl]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCNC(=O)C=C OEIXGLMQZVLOQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MNHMVGLVJFKQEN-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP.OC(=O)CCP.OC(=O)CCP MNHMVGLVJFKQEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 2
- 241000276478 Gadus morhua callarias Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 2
- LQZMLBORDGWNPD-UHFFFAOYSA-N N-iodosuccinimide Chemical compound IN1C(=O)CCC1=O LQZMLBORDGWNPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117971 Peptide Y Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 159000000009 barium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001690 micro-dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.OCC(N)(CO)CO CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101710085735 Bacteriocin glycocin F Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 101001041669 Oryctolagus cuniculus Corticostatin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000883829 Oryctolagus cuniculus Corticostatin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 229910001514 alkali metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000188 beta-D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000021235 carbamoylation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001972 liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- AHEWZZJEDQVLOP-UHFFFAOYSA-N monobromobimane Chemical compound BrCC1=C(C)C(=O)N2N1C(C)=C(C)C2=O AHEWZZJEDQVLOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 108010004093 retinal S antigen peptide M Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940054334 silver cation Drugs 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- UKHWJBVVWVYFEY-UHFFFAOYSA-M silver;hydroxide Chemical class [OH-].[Ag+] UKHWJBVVWVYFEY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GGCZERPQGJTIQP-UHFFFAOYSA-N sodium;9,10-dioxoanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)C3=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C3C(=O)C2=C1 GGCZERPQGJTIQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052716 thallium Inorganic materials 0.000 description 1
- BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N thallium Chemical compound [Tl] BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób detekcji S-glikozylowanych białek i peptydów wśród związków o ogólnym wzorze 1, Α1Α2·..[Αη]···Αζ
Wzór 1, w którym A1, A2, An, Az oznaczają reszty aminokwasowe, w tym reszty niosące syntetyczne lub naturalne potranslacyjne modyfikacje PTM, przy czym A1 oznacza aminokwas N-terminalny, Az - aminokwas
C-terminalny, zaś An oznacza dowolny aminokwas wewnętrzny, w tym S-glikozylowaną resztę cysteinową CG o strukturze przedstawionej we wzorze 2
wzór 2, w którym A1, A2, An, i Az mają wyżej podane znaczenie, zaś G oznacza poszukiwany nieznany, naturalny monosacharydowy lub oligosacharydowy glikan łączący się z łańcuchem peptydowym wiązaniem S-glikozydowym, przy czym cukier łączący może mieć strukturę piranozową lub furanozową, reszta CG może występować w łańcuchu jednokrotnie- lub wielokrotnie, a także zajmować pozycje terminalne 1 i z.
Szacuje się, iż około 20% białek proteomów jest N-, O- lub C-glikozylowana (http://www.nature.com/srep/2011/110913/srep00090/full/srep00090.html), natomiast S-glikozylacja jest bardzo słabo poznaną modyfikacją białek i peptydów. W 1971 roku opisano dwa krótkie peptydy S-glikozylowane na N-terminalnej cysteinie pochodzące z moczu ludzkiego (czasopismo FEBS Letter,
1971,16, 81-85) i z membran ludzkich erytrocytów (czasopismo Nature New Biology, 1971, 234, 25-26) z glikanem będącym odpowiednio digalaktozydem oraz trisacharydem zbudowanym z D-glukozy.
W 1975 roku wykryto obecność D-glukozy w cząsteczce parwoalbuminy-beta z dorsza bałtyckiego (Gadus morhua callarias) i postulowano, że może być ona połączona wiązaniem S-glukozydowym z resztą Cys18 w łańcuchu polipeptydu (czasopismo Scandinavian Journal of Immunology, 1975,
4(2):203-8). W 1998 roku przedstawiono częściowe dowody na to, że Cys26 w łańcuchu H1 białka osocza ludzkiego ITI jest heksozylowana dwiema resztami galaktozy bądź glukozy (czasopismo Biochemistry 1998, 37, 408-416).
W literaturze opisane są również nieliczne przykłady mono-ADP-S-rybosylowanych białek, które ze strukturalnego punktu widzenia należy zaliczyć do S-glikozylacji (czasopismo FEBS Journal, 2005, 272, 4565-4575). Dopiero w roku 2011 opublikowano niepodważalne dowody, że dwa drobnoustrojowe antybiotyki peptydowe są S-glikozylowane za pomocą monosacharydów. Sublancyna z Bacillus subtilis jest potranslacyjnie beta-D-glukozylowana na Cys22 (czasopismo Nature Chemical Biology, 2011, 7, 78-80), natomiast bakteriocyna Glycocin F z Lactobacillus plantarum posiada dwie reszty N-acetyloglukozaminy połączone wiązaniem beta-D-glikozydowym z resztą Ser18 przez atom tlenu oraz z resztą C-terminalnej Cys43 przez atom siarki (czasopisma FEBS Letters, 2011, 585, 645-650; Biochemistry, 2011, 50, 2748-2755). Wykazano, że obecność S-glikozylacji znacząco wzmaga bakteriostatyczną aktywność bakteriocyny z Lactobacillus plantarum. Sublancyna z błędnie określoną strukturą od 1998 roku zaliczana była do grupy lantybiotyków (czasopismo Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(36):23134-42) i obwarowywana licznymi patentami jako m.in. skuteczne antidotum na groźną broń biologiczną jaką jest wąglik (czyli spory Bacillus antracis). Sublancyna jest inhibitorem rozwoju zarówno form wegetatywnych jak i przetrwalnych Gram-dodatnich bakterii. Wyniki przeprowadzonej ostatnio bioinformatycznej analizy baz danych (czasopismo Nature Chemical Biology, 2011, 7, 78-80) sugerują że sublancyna jest członkiem większej rodziny S-glikozylowanych peptydów. Możliwość oceny rozpowszechnienia w naturze tej nowej modyfikacji, określenia różnorodności strukturalnej S-glikanów oraz zbadania roli biologicznej i właściwości nowych naturalnych S-glikozylowanych białek oraz peptydów, uzależniona jest od dostępu do użytecznej metody ich przesiewowego wykryPL 226 828 B1 wania. Opracowanie specyficznej metody wykrywania takiej modyfikacji cysteiny jest trudne, ponieważ aminokwas ten jest obecny w większości białek, na przykład w 91% białek ludzkiego proteomu (czasopismo Journal of Proteome Research, 2010, 9, 5461-5472) oraz podlega największej liczbie rozmaitych S-modyfikacji (http://srs.ebi.ac.ulc/srsbin/cgi-bin/wgetz?-newId+(([RESID-SequenceSpec:C]))+- view+ResidSimple+-page+qResult). Modyfikacje te cechuje nadzwyczajna różnorodność strukturalna i związana z nią reaktywność chemiczna.
Teoretycznie pośrednie wykrywanie S-glikozylowanych białek i peptydów byłoby możliwe poprzez specyficzne zastąpienie S-glikanów S-znacznikami Tag o cechach umożliwiających ich łatwą detekcję. Najlepszym sposobem wymiany S-glikanu na odpowiedni S-znacznik byłaby hydroliza wiązania S-glikozydowego w białku lub peptydzie, prowadząca do uwolnienia grup holowych, które następnie można by w rutynowy sposób wyznakować tiospecyficznym odczynnikiem odpowiednio dobranym do dalszych potrzeb proceduralno-analitycznych. Transformacja taka powinna przebiegać w możliwie łagodnych warunkach chroniących białko przed niekontrolowanymi modyfikacjami. Wiadomo, że do hydrolizy niepeptydowych S-glikozydów stosowane są tiofilowe promotory metaliczne, typowo: sole talu, rtęci, srebra, bądź promotory w postaci niemetalicznych prekursorów jonów halogeniowych (np. chloramina T, czy NCS, NBS, NJS tj. odpowiednio N-chloro-, N-bromo-, N-jodoimid kwasu bursztynowego). Zwykle reakcje te prowadzi się w rozpuszczalnikach organicznych wobec ograniczonej zawartości wody w środowisku neutralnym lub kwaśnym (czasopisma Carbohydrate Research, 2004, 339, 885-890; Carbohydrate Research, 2006, 341, 1723-1729). Trzeba dodać, że główne tiofilowe promotory metaliczne takie jak sole rtęci i srebra ulegają hydrolizie prowadzącej do wytrącania się promotorowo nieaktywnych wodorotlenków i tlenków tych metali odpowiednio w pH > 5 i w pH > 7. Jednakże, opisanych warunków reakcji hydrolizy wiązania tioglikozydowego nie można zastosować w przypadku, gdy substratem są S-glikozylowane białka czy peptydy, które w powyższych warunkach wykazują niską rozpuszczalność, ulegają utlenieniu czy halogenacji, bądź wytrącają się w obecności jonów metali ciężkich. Jak dotąd selektywna hydroliza wiązania S-glikozydowego w białkach i peptydach nie jest znana.
W badaniach proteomicznych specyficzne wprowadzanie znacznika w miejsce poszukiwanej naturalnej modyfikacji jest często stosowane (czasopismo Mass Spectrometry Reviews, 2011, 30, 366-395). Zabieg taki zawsze poprzedzony jest odpowiednią procedurą przygotowującą próbę białka do reakcji znakowania. Procedura przygotowawcza zazwyczaj polega na poddaniu próby działaniu reduktora, a następnie na specyficznym blokowaniu wszystkich ujawnionych grup holowych za pomocą odpowiednich odczynników. W przypadku poszukiwania modyfikacji jaką jest S-glikozylacja białek czy peptydów taki rutynowy przygotowawczy zabieg jest również konieczny, a jego celem jest przeprowadzenie wszystkich obecnych w białku tzw. pro-SH-modyfikacji cysteiny (jak np. mostki disiarczkowe, S-nitrozo-, S-hydroksy- czy S-acylopochodne) w permanentnie zablokowane grupy tiolowe. Osiąga się to przez działanie środka redukującego, typowo ditiotreitolu (DTT) w środowisku alkalicznym z następczym alkilowaniem za pomocą użytych z nadmiarem tiospecyficznych odczynników typu maleimidowego, akryloamidowego, winyloarylowego lub halogenoalkilowego.
Procedury znakowania miejsc modyfikacji są dostosowane do struktury chemicznej konkretnej modyfikacji, a wykrycie wprowadzonego znacznika pośrednio wskazuje na obecność poszukiwanej modyfikacji. Detekcji znacznika wprowadzonego do białka lub peptydu dokonuje się najczęściej poprzez zastosowanie technologii opartych o tandemowe analizy spektrometryczne (czasopismo Annual Review of Biomedical Engineering, 2009, 11, 49-79), a podstawowym warunkiem skutecznej detekcji jest uzyskanie dobrej jakości widm tandemowych. Cel ten osiąga się zwykle stosując zabieg wyodrębnienia wyznakowanych peptydów przed analizą MS/MS. Stąd pożądaną cechą znacznika jest wykazywanie powinowactwa mającego zastosowanie w procedurach chromatograficznych. Na przykład znaczniki z ugrupowaniami zasadowymi umożliwiają wyodrębnienie peptydów na silnym kationicie, a znaczniki biotynylujące umożliwiają selektywną separację w standardowych procedurach wykorzystujących powinowactwo biotyna-awidyna. Wprowadzony znacznik powinien także posiadać cechy strukturalne umożliwiające wykrycie znakowanego (poli)peptydu poprzez wybraną metodę analityczną, np. detekcję fluorescencji w żelu elektroforetycznym, czy w tandemowej spektrometrii masowej detekcję np.: jonów reporterowych pochodzących z odszczepienia (czasopismo International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 1997, 160, 317-329) lub fragmentacji znacznika (czasopismo Analytical Chemistry,
PL 226 828 B1
2009, 81, 7876-7884). Widma uzyskane z tandemowych analiz spektrometrycznych są następnie interpretowane przez odpowiednio wybrane narzędzia bioinformatyczne (czasopisma Journal of Computer Science and Technology, 2010, 25(1), 107-123; Journal of Proteome Research, 2010, 9, 2051-2061), które umożliwiają detekcję zmodyfikowanego znacznikiem peptydu, często określenie jego sekwencji i miejsca modyfikacji, a także określenie białka, z którego peptyd się wywodzi. Szczególnie użytecznym podejściem bioinformatycznym dla detekcji w badanej próbie określonych peptydów jest metoda SRM (Selected Reaction Monitoring). Metoda ta polega na konstruowaniu tzw. bibliotek widm referencyjnych dla zdefiniowanych peptydów, których obecność ma być wykryta w badanej próbie (czasopisma BMC Bioinformatics, 2011,12:78 http://www.biomedcentral.eom/1471-2105/12/78; Molecular BioSystems, 2011, 7, 292-303; Journal of Mass Spectrometry, 2011, 46, 298-312;
http://www.mcponline.org/content/earlv/2010/07/27/mcp.M110.002931.full.pdf+html)
Analiza SRM sprowadza się do odszukiwania w bibliotece widm tandemowych uzyskanej dla badanej próby tzw. przejść fragmentacyjnych (ang.: transitions) i jonów fragmentacyjnych (ang.: productions), które są unikalne dla poszukiwanych peptydów i zostały wcześniej wybrane z biblioteki referencyjnej. Wykrycie tych poszukiwanych sygnałów w widmach próby badanej jest równoważne z detekcją w badanej próbie związku o znanej strukturze z biblioteki referencyjnej.
Jak dotąd nie jest znany sposób detekcji S-glikozylowanych białek i peptydów, w związku z czym pojawia się potrzeba opracowania metody detekcji takich struktur dla badań przesiewowych. Ponieważ naturalne białka S-glikozylowane są niedostępne, do opracowania metody wykorzystano preparat białka modelowego uzyskany w drodze chemicznych przekształceń lizozymu białka jaja kurzego. Ciąg transformacji polegał na przeprowadzeniu cząsteczek tego białka w S-alkilowane pochodne, które w opisanych warunkach (czasopisma Biochemical Journal 1991, 280 (Pt 1), 261-265; Analytical Chemistry 2003, 75, 6826-6836; Analytical Chemistry 2003, 75, 3232-3243; Mollecular & Cellular Proteomics 2002, 1, 10, 791-804; European Journal of Mass Spectrometry 2004, 10(3), 401-412) ulegają reakcji beta-eliminacji generując reszty dehydroalaniny, do których z kolei w reakcji addycji Michaela przyłączono 1-tio-beta-D-glukozę w sposób opisany w czasopismach: Analytical Chemistry, 2003, 75, 3232-3243; Chemistry - A European Journal, 2003, 9, 5997-6006; Angewandte Chemie International Edition, 2006, 45, 4007-4011.
Otrzymana mieszanina pochodnych S-glukozylowanego lizozymu jest odpowiednia do badań modelowych ze względu na jej ogromną złożoność oraz fakt, że w kilku znanych dotąd naturalnych S-glikozylowanych peptydach i białkach S-glikan jest mono-, di- lub trisacharydem.
Sposób detekcji S-glikozylowanych białek i peptydów służyłby wykrywaniu nowych S-glikozylowanych białek i peptydów - związków o potencjalnym znaczeniu biotechnologicznym.
Sposób detekcji S-glikozylowanych białek i peptydów wśród struktur o ogólnym wzorze 1, w którym A1, A2, An i Az mają wyżej podane znaczenie, według wynalazku polega na tym, że próbę białek lub peptydów z pro-SH modyfikacjami uprzednio zastąpionymi permanentnymi grupami blokującymi, poddaje się kolejno hydrolizie wiązań S-glikozydowych promowanej metalicznym tiofilowym kwasem Lewisa, demetalacji prowadzącej do uwolnienia grup holowych w miejscach S-glikozylacji, które następnie znakuje się wybranym tiospecyficznym odczynnikiem w znany sposób i uzyskane S-znakowane związki wykrywa się metodami tandemowej spektrometrii masowej, a z otrzymanych tandemowych widm tych związków konstruuje się zastępczą bibliotekę spektralną służącą do bezpośredniego wykrywania S-glikozylowanych związków. Hydrolizę wiązań S-glikozydowych prowadzi się w środowisku woda-rozpuszczalnik organiczny lub mieszanina rozpuszczalników organicznych, zawierającym korzystnie nie mniej niż 50% objętościowych rozpuszczalnika lub rozpuszczalników organicznych, w obecności tiofilowego promotora, korzystnie w postaci soli srebra (I) użytej w stężeniu 0,1-0,2 M i w obecności zasady organicznej, jak trzeciorzędowa amina alifatyczna, heterocykliczna amina aromatyczna lub ich mieszanina, korzystnie w temperaturze pokojowej lub podwyższonej korzystnie do 50°C i przy pH >7, korzystnie 8-9,5, ewentualnie w obecności detergentów kompatybilnych z jonami srebra jak dodecylosiarczan sodu czy chaotropów jak mocznik. Jako rozpuszczalniki organiczne reakcji hydrolizy korzystnie stosuje się polarne rozpuszczalniki aprotonowe jak dimetylosulfotlenek (DMSO), dimetyloformamid (DMF), dimetyloacetamid (DMA), N-metylopirolidon (NMP) lub fluorowane rozpuszczalniki protonowe jak trifluoroetanol (TFE), heksafluoroizopropanol (HFIP), zaś jako zasadę organiczną korzystnie stosuje się trietyloaminę, pirydynę, N-metyloimidazol lub ich mieszaniny, przy czym pirydyna ewentualnie pełni również rolę ko-solwenta. Użycie odczynników słabo kompleksujących
PL 226 828 B1 jony srebra w postaci alifatycznych amin trzeciorzędowych lub heterocyklicznych amin aromatycznych zapobiega hydrolizie soli srebra i wytrącaniu się nieaktywnych wodorotlenków i tlenków srebra. Następnie z roztworów po hydrolizie, zawierających peptydowe lub polipeptydowe tiolany srebra, usuwa się nadmiar jonów srebra i jednocześnie dokonuje demetalacji tiolanów poprzez działanie co najmniej stechiometryczną ilością związku silnie kompleksującego jony srebra, jak ditiotreitol (DTT), ditioerytritol (DTE), kwas 2,3-dimerkaptobursztynowy (DMSA) w temperaturze otoczenia, po czym odwirowuje się nierozpuszczalne kompleksy jonów srebra, względnie z roztworów po hydrolizie usuwa się jony srebra co najmniej stechiometryczną ilością jonów chlorkowych związków takich jak chlorki metali alkalicznych, odwirowuje osad chlorku srebra i próbkę poddaje demetalacji za pomocą wspomnianych wyżej odczynników kompleksujących jony srebra, użytych w ilości co najmniej stechiometrycznej w stosunku do teoretycznej molowej zawartości cysteiny w badanej próbce. W kolejnym etapie próbkę stanowiącą peptydy lub polipeptydy z uwolnionymi grupami holowymi, poddaną jeśli stanowią ją polipeptydy wpierw dializie lub ultrafiltracji w celu usunięcia nadmiaru odczynnika kompleksującego srebro oraz aminowych komponentów, rozpuszcza się w wybranym układzie buforowym dostosowanym do następczego procesu znakowania odblokowanych grup holowych za pomocą użytych z nadmiarem tiospecyficznych odczynników, jak maleimidowe odczynniki S-znakujące przy pH 4-9, winylopirydynowe odczynniki S-znakujące przy pH około 7, S-znakujące halogenki i akryloamidowe odczynniki S-znakujące przy pH > 8. Jako odczynniki S-znakujące stosuje się zwłaszcza związki zawierające grupę pirydyloetylową (PE), (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniową (APTA) lub bimanylową (BM). Mieszaninę polipeptydów lub peptydów po S-znakowaniu, oczyszcza się ogólnie znanymi metodami. W przypadku polipeptydów stosuje się dializę prowadzącą do wymiany roztworu na bufor dostosowany do następnego etapu sposobu. W przypadku peptydów stosuje się sorpcję na krzemionkowych materiałach mezoporowatych. Próbkę oczyszczonych peptydów lub polipeptydów poddaje się tandemowej analizie spektrometrycznej, przy czym w przypadku polipeptydów tandemową analizę spektrometryczną poprzedza się standardową trypsynolizą. Ponieważ reakcja hydrolizy wiązania tioglikozydowego nie przebiega do końca, w efekcie zachodzi substechiometryczne znakowanie miejsc S-glikozylacji, co oznacza że w przygotowanej do analizy spektrometrycznej mieszaninie peptydów obecne są, między innymi, tzw. idealne pary spektralne, to jest pary S-znakowanych i S-glikozylowanych peptydów o tej samej sekwencji. Uzyskaną w wyniku tandemowej analizy spektrometrycznej bibliotekę eksperymentalnych widm tandemowych CID, HCD, ETD interpretuje się stosując programy bioinformatyczne wykorzystujące bazy danych sekwencji białek, na przykład analizę MASCOT, prowadzące do zidentyfikowania peptydów oraz wprowadzonego znacznika Tag na cysteinie, lub też identyfikuje się peptydy stosując sekwencjonowanie de novo. Z widm tandemowych peptydów S-znakowanych tworzy się zastępczą bibliotekę spektralną, z której następnie wydziela się subbibliotekę referencyjną. Subbiblioteka referencyjna zawiera wyselekcjonowane lub obliczone odpowiednie przejścia fragmentacyjne, w tym przejścia wynikające z neutralnej utraty znacznika Tag z jonów prekursorowych, i osobno jony fragmentacyjne (ang.: product ions) nie zawierające w sekwencji S-znakowanej cysteiny. Diagnostycznie użyteczne sygnały z subbiblioteki referencyjnej odszukiwane są następnie w bibliotece eksperymentalnych widm tandemowych próby badanej, co prowadzi do detekcji S-glikozylowanych partnerów spektralnych i dalej do określenia wielkości S-glikozylacji, a w niektórych przypadkach także do potwierdzenia obecności S-glikozylacji poprzez analizę fragmentacji łańcucha peptydu z zachowaną modyfikacją na reszcie cysteinowej. Takie podejście, pozwala także wykluczyć fałszywie pozytywne rezultaty znakowania miejsc S-glikozylacji na rzecz innej, określonej lub nieokreślonej modyfikacji reszty cysteinowej w peptydzie. Opcjonalnie zastępczą bibliotekę spektralną konstruuje się w oparciu o widma tandemowe peptydów S-znakowanych, które wcześniej wyodrębnia się z badanej próby znanymi metodami chromatograficznymi właściwymi dla wprowadzonego S-znacznika Tag, jak na przykład chromatografię na silnym kationicie w przypadku znaczników PE czy APTA.
Sposób według wynalazku przedstawiono na poniższym Schemacie A.
PL 226 828 B1
Na etapie hydrolizy następuje odszczepienie S-glikanu oraz utworzenie przejściowych srebrowych tiolanów polipeptydów lub peptydów o ogólnym wzorze 3, w którym An oznacza cysteinowy tiolan srebra, zaś Ag oznacza kation srebra związany kowalencyjnie z atomem siarki lub kationowy nanoklaster srebra. Uwolnione mono- lub oligo-sacharydowe glikany (aldozy) ulegają in situ utlenieniu kationami srebra do odpowiednich kwasów aldonowych, co zabezpiecza je przed degradacją w środowisku alkalicznym i umożliwia ich wyodrębnienie do dalszej analizy strukturalnej. Powstały neutralny atom srebra Ag0 w obecności kationów Ag+ tworzy najmniejszy, kationowy nanoklaster Ag2+ który jest także promotorem reakcji hydrolizy wiązania tioglikozydowego.
W następnym etapie roztwory po hydrolizie, zawierające peptydowe lub polipeptydowe tiolany srebra, o ogólnym wzorze 3, poddaje się jednoczesnemu procesowi usunięcia nadmiaru jonów srebra oraz demetalacji tiolanów, po czym usuwa się nierozpuszczalne kompleksy jonów srebra, względnie
PL 226 828 B1 z roztworów po hydrolizie usuwa się jony srebra w postaci nierozpuszczalnych soli i tiolany poddaje się demetalacji.
W kolejnym etapie uzyskane polipeptydy z uwolnionymi grupami tiolowymi w miejscach S-glikozylacji, o ogólnym wzorze 4, w którym An oznacza resztę cysteinową, poddaje się oczyszczaniu ogólnie znanymi metodami prowadzącemu do wymiany rozpuszczalnika na wybrany układ buforowy dostosowany do następczego procesu S-znakowania grup tiolowych białka. Natomiast roztwory peptydów po demetalacji poddawane są procesowi S-znakowania bez dodatkowego oczyszczenia.
Reakcję S-znakowania wybranym tiospecyficznym odczynnikiem przeprowadza się w standardowy sposób.
W następnym etapie mieszaninę białek lub peptydów po S-znakowaniu, zawierającą produkty o ogólnym wzorze 5, w którym An oznacza S-znakowaną cysteinę, oczyszcza się ogólnie znanymi metodami, typowo przez dializę lub ultrafiltrację w przypadku polipeptydów, bądź sorpcję na fazie stałej w przypadku peptydów.
W końcowym etapie oczyszczone peptydy bezpośrednio poddaje się tandemowej analizie spektrometrycznej, natomiast oczyszczone polipeptydy wcześniej poddaje się standardowej proteolizie. Uzyskaną w wyniku tandemowej analizy spektrometrycznej bibliotekę eksperymentalnych widm tandemowych interpretuje się stosując programy bioinformatyczne wykorzystujące bazy danych sekwencji białek, co prowadzi do zidentyfikowania peptydów oraz wprowadzonego znacznika na cysteinie, lub też dąży się do zidentyfikowania peptydów stosując sekwencjonowanie de novo. Z widm tandemowych peptydów S-znakowanych tworzy się zastępczą bibliotekę spektralną, z której następnie wydziela się subbibliotekę referencyjną służącą do przeszukiwania biblioteki eksperymentalnych widm tandemowych w celu odnalezienia S-glikozylowanych partnerów spektralnych.
Sposób według wynalazku umożliwia wykrycie S-glikozylowanych białek i peptydów, określenie pozycji S-glikozylacji w łańcuchu peptydowym, a także określenie rozmiaru S-glikanu i niektórych jego cech strukturalnych. Sposób według wynalazku jest kompatybilny z uznanymi strategiami badań proteomicznych, opiera się na znanych procedurach przygotowania prób do analizy oraz wykorzystuje różnorodne techniki spektrometrii masowej i sprzężone z nimi narzędzia bioinformatyczne.
Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.
P r z y k ł a d 1
Synteza mieszaniny modelowych białek S-glikozylowanych
Ponieważ naturalne białka S-glikozylowane są niedostępne, sposób według wynalazku został opracowany w oparciu o S-glikozylowane białka modelowe otrzymane na drodze chemicznych modyfikacji zredukowanego lizozymu białka jaja kurzego zawierającego osiem reszt cysteinowych w cząsteczce. Na podstawie analizy MALDI TOF MS stwierdzono, że otrzymany preparat jest mieszaniną pochodnych o średnim składzie opisanym wzorem
Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, w którym Lys oznacza aminokwasową sekwencję lizozymu białka jaja kurzego z ośmioma zmodyfikowanymi pozycjami cysteiny przez przekształcenie ich w dehydroalaninę (Dha), w S-alkilowaną cysteinę za pomocą grupy (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniowej (S-APTA) oraz w S-glikozylowaną cysteinę za pomocą grupy beta-D-glukozylowej (S-Glc).
Preparat otrzymano w następujący sposób.
150 mg preparatu lizozymu białka jaja kurzego rozpuszczono w 10 ml buforu denaturującego (0,1 M Tris-HCl w 8 M moczniku) o pH = 8,5 i po 5 minutach sonifikacji (odpowietrzania) dodano 44 mg chlorowodorku tris(2-karboksyetylofosfiny) (TCEP) tj. do stężenia 15 mM reduktora; pH roztworu osiągnęło wartość 5,2. Szczelnie zamkniętą próbę inkubowano 2,5 h w temperaturze 37°C. Po reakcji redukcji pH roztworu wzrosło do wartości 5,6. Do mieszaniny wprowadzono 3,4 ml 4 M roztworu (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniowego chlorku (APTA), całość ponownie odpowietrzono azotem, po czym krystalicznym Tris podniesiono pH do wartości 8,1. Reakcja alkilowania zachodziła w obecności 6 M mocznika, w temperaturze pokojowej i bez dostępu światła w czasie 2 godzin. Produkt reakcji oznaczony jako Lys[S-APTA]8 wytrącono z mieszaniny pięciokrotnym objętościowym nadmiarem izopropanolu w temperaturze pokojowej. Natychmiast pojawiający się biały osad odwirowano i rozpuszczono w 10 ml buforu denaturującego (0,1 M Tris-HCl w 8 M moczniku, pH = 8,5).
Do 10 ml roztworu Lys[S-APTA]8 w buforze denaturującym dodano 10 ml 1,5% wodnego roztworu Ba(OH)2 (przefiltrowanego przez membranę 0,2 μm) i pH mieszaniny doprowadzono do wartości 12,3. Szczelnie zamkniętą próbę umieszczono w ultra-termostatowanej łaźni wodnej o temp. 50°C na 3 godziny.
PL 226 828 B1
Po reakcji eliminacji pH mieszaniny wynosi ok. 12 - neutralizację środowiska osiągnięto przez wprowadzenie pokruszonego stałego CO2. Osad soli baru natychmiast usunięto przez odwirowanie, a roztwór zawierający produkt oznaczony jako Lys[S-APTA]k[Dha]l poddano kolejnej transformacji.
W tym celu do 20 ml roztworu o pH ok. 7 zawierającego produkt Lys[S-APTA]k[Dha]l wprowadzono 180 mg krystalicznej soli sodowej 1-tio-beta-D-glukozy, która podniosła pH środowiska. Odczyn mieszaniny do reakcji addycji Michaela obniżono do wartości pH 7,5 krystalicznym TCEP. Mieszaninę odpowietrzono azotem (5 minut) i szczelnie zamkniętą próbę inkubowano 5,5 godziny w temperaturze 50°C. W trakcie reakcji addycji tiocukru pH mieszaniny wzrasta do ok.8.
Roztwory zawierające produkt końcowy o średnim składzie Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3 (wg analizy MALDI TOF MS) poddano dializie (MWCO: 3500 Da) stosując wielokrotną wymianę wody dejonizowanej. Klarowny roztwór po dializie zamrożono i zliofilizowano otrzymując 57 mg preparatu.
Mieszaninę modelowych S-glikozylowanych białek scharakteryzowano na drodze tandemowej spektrometrii masowej LC/MS/MS z fragmentacjami CID/HCD oraz ETD poprzedzonej standardową trypsynolizą. Identyfikacji peptydów wraz z ich modyfikacjami dokonano poprzez analizę MASCOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search. Zidentyfikowane peptydy zgrupowano w tablicach 1-6.
W tablicy 1 przedstawiono peptydy zawierające S-glukozylowaną Cys, uzyskane w wyniku trypsynolizy białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3 i wykryte metodą LC/MS/MS z fragmentacją CID, HCD, ETD oraz zidentyfikowane poprzez MASCOT error tolerant search wobec sekwencji lizozymu białka jaja kurzego. Ponieważ naturalne białka S-glikozylowane są jeszcze praktycznie nieznane, najpierw zsyntetyzowano S-glikozylowane białka modelowe o wzorze
Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, w którym Lys oznacza lizynę, Dha dehydroalaninę, Glc glicynę, zaś APTA grupę (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniową, na drodze chemicznej modyfikacji zredukowanego lizozymu białka jaja kurzego zawierającego osiem reszt cysteinowych w cząsteczce.
W tym celu 150 mg preparatu lizozymu białka jaja kurzego rozpuszczono w 10 ml buforu denaturującego (0,1 M chlorowodorku Tris (hydroksymetylo)aminometanu - Tris-HCl, w 8 M moczniku) o pH = 8,5 i po 5 minutach sonifikacji (odpowietrzania) dodano 44 mg chlorowodorku tris(2-karboksyetylofosfiny) (TCEP) tj. do stężenia 15 mM reduktora; pH roztworu osiągnęło wartość 5,2. Szczelnie zamkniętą próbę inkubowano 2,5 godz. w temperaturze 37°C. Po reakcji redukcji pH roztworu wzrosło do wartości 5,6. Do mieszaniny reakcyjnej wprowadzono 3,4 ml 4 M roztworu chlorku (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniowego (APTA), całość ponownie odpowietrzono azotem, po czym krystalicznym Tris podniesiono pH do wartości 8,1. Reakcja alkilowania zachodziła w obecności 6 M mocznika, w temperaturze pokojowej i bez dostępu światła w czasie 2 godz. Produkt reakcji czyli Lys[S-APTA]8 wytrącono z mieszaniny pięciokrotnym objętościowym nadmiarem izopropanolu w temperaturze pokojowej. Natychmiast pojawiający się biały osad odwirowano i rozpuszczono w 10 ml buforu denaturującego (0,1 M Tris-HCl w 8 M moczniku, pH = 8,5).
Do 10 ml roztworu Lys[S-APTA]8 w buforze denaturującym dodano 10 ml 1,5% wodnego roztworu Ba(OH)2 (przefiltrowanego przez membranę 0,2 μm) i pH mieszaniny doprowadzono do wartości 12,3. Szczelnie zamkniętą próbę umieszczono w ultra-termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 50°C na 3 godz. Po reakcji eliminacji pH mieszaniny wynosiło około 12 - neutralizację środowiska osiągnięto przez wprowadzenie pokruszonego stałego CO2. Osad soli baru natychmiast usunięto przez odwirowanie, a roztwór zawierający produkt o składzie Lys[S-APTA]k[Dha]l poddano kolejnej transformacji.
W tym celu do 20 ml roztworu o pH około 7, zawierającego Lys[S-APTA]k[Dha]l wprowadzono 180 mg krystalicznej soli sodowej 1-tio-beta-D-glukozy, która podniosła pH środowiska. Odczyn mieszaniny do reakcji addycji Michaela obniżono do wartości pH 7,5 krystalicznym TCEP. Mieszaninę odpowietrzono azotem (5 min.) i szczelnie zamkniętą próbę inkubowano 5,5 godz. w temperaturze 50°C. W trakcie reakcji addycji tiocukru pH mieszaniny wzrosło do około 8 i skorygowano je do 7,5.
Roztwory zawierające produkt końcowy o średnim składzie Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3 (wg analizy MALDI TOF MS) poddano dializie (MWCO: 3500 Da) stosując wielokrotną wymianę wody dejonizowanej; przejściowo roztwór w woreczku ulegał zmętnieniu. Klarowny roztwór po dializie zamrożono i zliofilizowano otrzymując 57 mg preparatu.
Mieszaninę modelowych S-glikozylowanych białek scharakteryzowano na drodze tandemowej spektrometrii masowej LC/MS/MS z fragmentacjami CID/HCD oraz ETD poprzedzonej stanPL 226 828 B1 dardową trypsynolizą. Identyfikacji peptydów wraz z ich modyfikacjami dokonano poprzez analizę MASCOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search. Zidentyfikowane peptydy przedstawiono w tablicach 1-6.
W tablicy 1 przedstawiono peptydy zawierające S-glukozylowaną Cys, uzyskane w wyniku trypsynolizy białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3 i wykryte metodą LC/MS/MS z fragmentacją CID, HCD, ETD oraz zidentyfikowane poprzez MASCOT error tolerant search wobec sekwencji lizozymu białka jaja kurzego. Wskazano uboczne chemiczne modyfikacje (deam, ox, cbm) powstałe w warunkach transformacji cząsteczki lizozymu. W tablicy tej oznaczają: z - ładunek jonu prekursorowego, m.c. - ominięte miejsca trypsynolizy, S-Glc - S-beta-D-glukozylację, S-APTA - grupę tiolową cysteiny znakowaną APTA, deam - deamidację, ox - utlenienie, cbm karbamylację.
W tablicy 2 przedstawiono peptydy zawierające S-APTA-alkilowaną cysteinę pochodzące z trypsynolizy białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dh a]2[S-Glc]3 wykryte metodą LC/MS/MS z fragmentacją CID, HCD, ETD oraz zidentyfikowane poprzez MASCOT error tolerant search wobec sekwencji lizozymu białka jaja kurzego.
W tablicy tej z, m.c., S-APTA i ox mają wyżej podane znaczenie.
W tablicy 3 przedstawiono peptydy zmodyfikowane, uzyskane po trypsynolizie białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, zawierające Dha w miejscu Cys, wykryte metodą LC/MS/MS z fragmentacją CID/HCD oraz zidentyfikowane poprzez MASCOT error tolerant search wobec sekwencji lizozymu białka jaja kurzego. W tablicy tej z i m.c. mają wyżej podane znaczenie, zaś di-ox oznacza dioksydację.
W tablicy 4 przedstawiono wybrane pary spektralne zidentyfikowane w mieszaninie peptydów uzyskanych po trypsynolizie białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3.
W tablicy 5 przedstawiono peptydy nie zawierające modyfikacji, uzyskane po trypsynolizie białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, wykryte metodą LC/MS/MS z fragmentacją CID/HCD oraz zidentyfikowane poprzez MASCOT error tolerant search wobec sekwencji lizozymu białka jaja kurzego; z i m.c. w tej tablicy mają wyżej podane znaczenie.
W tablicy 6 przedstawiono zmodyfikowane peptydy nie zawierające Cys, uzyskane po trypsynolizie białka modelowego Lys[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, wykryte metodą LC/MS/MS z fragmentacją CID, HCD, ETD oraz zidentyfikowane poprzez MASCOT error tolerant search wobec sekwencji lizozymu białka jaja kurzego; z, m.c., deam, ox, cbm zamieszczone w tej tablicy mają wyżej podane znaczenie
PL 226 828 B1
Tablica 1.
| s Ό | cbm | 00 bd | 00 | |||||||||||||||||||||||
| U Ch | w | r-- | r- | |||||||||||||||||||||||
| O | s | s | ||||||||||||||||||||||||
| U | β | & | o | |||||||||||||||||||||||
| tU | «5β | H- | ||||||||||||||||||||||||
| -a o | « τ» | TT z | m | ύ | Ch 9 | |||||||||||||||||||||
| miejsce ni | s- APTA | |||||||||||||||||||||||||
| U | u | u | u | u | y | u | ||||||||||||||||||||
| Ch >, | 3 | g | ||||||||||||||||||||||||
| f- | (Z3 | L> | s | (U s | ZS | zs | •zs | sD | r~- | OS | Os | m | m | m | oo | r- | 00 | m | 00 | Ch | oo | 00 | 00 | |||
| z | Z | Z | y | u | y | y | 2 | 2 | y | y | y | y | y | y | y | y | y | y | y | y | u | u | y | |||
| H | t- | |||||||||||||||||||||||||
| H | cd | od | ||||||||||||||||||||||||
| cd | y | g | ||||||||||||||||||||||||
| S | y | a | ||||||||||||||||||||||||
| Ό | u | z | 2 | |||||||||||||||||||||||
| o. | 6 | S | ||||||||||||||||||||||||
| O & | cd | 2 | % £ | |||||||||||||||||||||||
| es | od | Od | b | Ud | 2 | t- | od | w | H | |||||||||||||||||
| s* | LAAA.M | od | Od | Od | Od | od | od | Od | l/J | έ | Ud | s | § | |||||||||||||
| α w 1 I» | od Cd S | od Cd S | 35 S | X | laaam: | a | < 3 UJ Γ) | 2 Ź | 33 | Uu Od i y | < < y | 3 u | H Cd y | [Λ y g | GRTPGS | O y £ | δ Z g | <y u a | H cd ΰ | y a I | d y > a | z y | z y _i | U 0- I | ||
| < | < | < | ω | ω | W | <? | < | 2 | 2 | o | o | Q | > | a | P | a | H | |||||||||
| < < | < < | < < | < | £ | U od | z | £ Q u- | 5 | < < | 2 | □ u | 2 | δ | δ | od | H 00 | CZ) 5? | δ | Ł | 5Z> O | g GO | {/} | (Z) | |||
| -1 ω | U ω | U ω | U4 | o U- | O | o Om | w | UJ | 3 | GO > | CZ) > | 5 | £ | s | 2 | O H | s | Q h- | O 0- | o Dm | O &< | |||||
| y | u | y | u | > | > | > | isd | y | y | IZ) | O | y | £ | js | σ | i—1 | 2 | σ | z | H | 9- | t- | ||||
| * | “= | od | od | id | Od | ł* | cd | cd | >' | cd | cd | cd | cd | cd | U | 2 | cd | cd | J | od | cd | cd | od | |||
| Λ | . 3 | |||||||||||||||||||||||||
| W 6* o SU | i U -2 Λ | Ό O | SO O | SD L> | SD O | SD U | SD U | SO U | SD U | SO O | SD O | o m U | O m U | O m U | 3 y | 3 y | 3 y | 3 y | 3 y | ’Τ SD U | TT O U | SD U | H- O U | SD f U | SO r- U | sD r· U |
| U | ||||||||||||||||||||||||||
| a | O | o | O | rs | O | O | O | O | o | |||||||||||||||||
| B | en | CS | VS | zs | Ο» | r* | nt | 00 | r- | rs | wn | oo | σι | SO | 'ΖΊ | vs | r- | Os | rs | rn | rs | Os | Ch | |||
| oo | Ch | O, | oo | r- | zs | rs | ry | o | Oi | o | r^ | ZS | ZS | sD | rł | —Ł | rs | tT | O | nt- | ||||||
| Ca Ch | V? 1 | o 1 | V | » | zs 1 | 1 | •X | Vł i | vT | o | o | rn | 'Ϋ | T | T | ZS | 00 1 | 7 | r- | 1 | 7 | |||||
| Ό | O | Os | §? | ’Τ | H- | 3 | Os | OO | O | oo | oo | SO | r· | r- | m | o | Ch | Γ- | rs | Os | ZS | vs | m | |||
| sp | r- | O | ZS | •Zł | rs | 1·^ | o | Tf | H- | 00 | 00 | rs | OO | O | f | SO | f | r- | O | |||||||
| M N | 3. | 3 | r- | O | O | O | vi | Η- | r. | vn | r- | t-' | Tt | θ'. | o | rS | O> | Os | un | |||||||
| 8 .§ | rJ | *n | rs | ł> | oo | zs | νγ | wn | SO | SO | H- | SO | SO | r· | rs. | r- | Π | H- | Ό | |||||||
| Os | r* | rs | rs | r* | sD | sD | TT | SD | ci | US | us | U< | r- | V, | sr, | vs | oo | rs | PO | SD | <hł | |||||
| fi Λ | Os | 85 | ZS | Os | ZS | zs | oo | Os | o | rs | rł | Os | CJs | Os | Ch | n | Us | Ch | rs | rł | rł | |||||
| —1 | o | —< | M- | !/> | —' | CS | rs | 3 | H- | O | ΜΊ | •ZS | SD | r* | 00 | O | so | 0© | rs | |||||||
| ’—l | ** | »—1 | ’ 1 | n | rs | rs | ||||||||||||||||||||
| £ | Π | o | cn | O | zs | MS | r- | r' | m | co | Ch | νΊ | rs | Γ | r« | OO | SO | o | rs | rs | rs | |||||
| O | ZS | os | Ch | oo | r~ | rn | rs | SD | rs | so | TT | VT | 00 | m | r- | rł | rs | o | so | 3 | ||||||
| 5 | 3 | rs | m | o | Os | o | o | Ή | s- | so | s | V> | r* | C-* | •n | 00 | rs | O | oo | Os | ||||||
| a | vs_ | nr. | sn | O | r- | oo | MS | νγ | un | SO | s0 | SD | r; | CS | H; | r-r | 7t | H· | ||||||||
| V | l< | r< | ri | m | r^ | SD | sO | 5 | sD | rs | 0s | Os | O< | r- | V» | V) | ZS | 00 | ri | od | SÓ | rn | rs | rs | ||
| N | Os | Os | Zl | Us | •zs | Os | O | (S | rs | Os | Os | us | Os | Os | Ch | rs | rs | |||||||||
| ć-> | 2 | Os | Os | —I | o | nr | nr | ZS | π | rł | H- | 'T | O | ZS | •Zi | SD | r- | OO | o | so | oo | m | ||||
| o | 1—1 | 1—1 | ’ ‘ | ’ 1 | r—1 | — | 1 | CS | rs | rs | M | |||||||||||||||
| N | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | Ί- | + | + | + | + | ||
| rs | CS | rs | rs | Ol | rs | r-ł | rs | CS | rs | rs | rs | rs | rs | n | m | m | m | m | rs | rs | m | rs | n | ri | ||
| ω | □ | o | Q | Q | Q | Q | Q | o | o | o | Q | a | a | o | o | a | 0 | |||||||||
| s U) -W | o 3 | o H | u 3 | Q H | Q f- | U 3 | Q H | Q H | U 3 | y £ | e | y | u 3 | Q H | y 3 | y 3 | y 3 | y 3 | y P | y 3 | y 3 | Q E— | y 3 | |||
| fi | O | UJ | u | ω | UJ | O | ω | UJ | U | Q | o | B | UJ | Q | Q | UJ | Q | s | o | a | a | a | Q | UJ | a | |
| U | y | y | y | y | y | y | y | y | U | y | y | y | y | y | y | y | ||||||||||
| Lp | CS | rs | m- | sri | só | rś | od | Ch | O | = | rs | rń | vś | so | od | OŚ | O rs | rs | ri rs | rn Π | h- rs | IZS rs |
PL 226 828 B1 cd. tablicy 1
| 2 | |||||||||||||
| oo | |||||||||||||
| z | |||||||||||||
| 0 | 50 | ||||||||||||
| cs | CS | cs | |||||||||||
| υ | CS | u | υ | ||||||||||
| r- | m | 00 | od | od | |||||||||
| u | u | (J | u | <J | u | ||||||||
| U | υ | oo | |||||||||||
| o | c | CS | |||||||||||
| 53 | o | u | CS | u | CS | CS | |||||||
| o | r- | en | c- | ||||||||||
| o | u | z | z | u | υ | υ | u | υ | u | u | u | υ | u |
| id | id | id | |||||||||||
| id | z | id | |||||||||||
| u | < | < | < | ||||||||||
| U | υ | u | |||||||||||
| id | id | 5 | 'ζ | ||||||||||
| * | id | O) | 01 | O) | 01 | ||||||||
| < | < | < | < | < | < | ||||||||
| u | H | H | H | H | |||||||||
| ę | ς | Q | O | Q | Q | ||||||||
| O) | Ol | O) | O) | ||||||||||
| O | < | < | o; | 03 | Ol H-J | 03 mJ | |||||||
| £ | U | u | J | mJ | -1 | mJ | |||||||
| Cd id | q Oj | o | ·—! | GCR. | GCR. | o | « | ·< | < | < | < | ||
| o | od £ | ź < | < | (ZJ 00 U | 05 05 J | Ol O 04 | Ol | Ol U 04 | 03 U 0- | ||||
| id | < θ' | < θ' | i | o > | i | CC £ | -4 < (Λ | SAL | ź u | z | Z § | § | |
| 1 Pl | < > | > i s | > Q F □ id | RCKGTJ | RCKGTJ | TDVQA | TDVQA | U a« 1 | LCNIPC | Ol O CU | Ol 2 | Ol O P- | 01 O 04 |
| 03 oś | u | u | Z | O | O | z | Z | F | F | F | 1- | ||
| cd | od | cd | cd | id | id | cd | cd | od | cd | cd | |||
| Tt | e | ||||||||||||
| ki | Kl | 05 | <35 | 05 | 05 | 05 | |||||||
| Kl | K | KI | C' | km | |||||||||
| Γ— | ·—< | I—i | —11 | «—< | CS | CS | O | O | w | O | O | o | |
| u | ·—1 | *M | »—* | r—t | ·—< | 00 | 00 | 50 | 00 | 00 | 03 | ||
| U | υ | U | u | o | u | u | |||||||
| \0 | 5D | 50 | 50 | 0 | |||||||||
| r- | f | t | r* | ||||||||||
| o | CS | - | - | CS | CS | - | - | o | O | - | - | - | - |
| Kl | 0 | en | Kl | 50 | CS | o | en | 't | c- | m | |||
| VI | 05 | O | o | m | C' | CS | m | ||||||
| cs | T | en 1 | O | CS | 1 | en | 1 | 9 | 'f | 50 1 | m | ||
| 86 | κι r* | g | O OO | - | Ci 50 | 00 | oo | Kl 50 | § | O Kl | CM 50 | ||
| ki | o, | Ch | Os | Ki | en | en | K> | CS | o | o | |||
| νγ | K | 0^ | 50 | 50 | oo | c- | r- | G> | νζ | •'T | CS | l> | |
| o | en | t | o | oo | t~-^ | m | oo | 3 | 50 | 0 | |||
| r- | 05 | m | OO | en | O | oo | en | en | en | m | |||
| CS | 'd- | [- | CS | oo | 00 | en | m | ||||||
| CS | es | en | en | ||||||||||
| κι | 05 | Γ- | 05, | r~- | Γ- | en | RM | oo | en | 00 | Kl | ||
| en | K | CS | 05 | CS | 3 | O | en | Oi | c> | σ- | |||
| Ki | 05 | 00 | 05 | 3 | en | Ki | CS | □5 | oo | ||||
| »n | ki | 50 | 50 | (Λ | r- | en | 'T | »n | 0 | C* | |||
| o | en | t- | O | 00 | Γ*-’ | o | OO | 3 | oo | 50 | 0 | ||
| Γ— | 05 | C*1 | OO | m | o | CS | CS | m | en | en | m | ||
| CS | ·—1 | n- | n· | t· | oo | oo | oo | en | en | m | |||
| 1—1 | —1 | CM | CS | CS | m | en | m | ||||||
| + | + | + | + | + | + | + | + | + | |||||
| CS | ΠΊ | CS | CS | <n | CS | m | m | 't | en | 'd- | KJ | Kl | |
| Cl | Q | c | n | o | Q | o | |||||||
| F | Ci H | /HC | c F | c H | s | 6 | e | /HC | F | Q | |||
| Q | ω | O | Q | ω | U4 | u | z | S | w | O | s | e | UJ |
| U | υ | (J | u | U | u | u | |||||||
| 50 | s | 00 | 05 | ó | rś | rń | ’ςρ | K) | 50 | s | 05 | o | |
| CS | CM | CS | CS | en | en | en | en | en | en | en | en | en |
| Typ i miejsce modyfikacji w peptydzie | o | o 2 | r- 2 | r- 2 | ||||||
| S-APTA | u | LSI_1 | M- U | N-term C | ' N-term C | o 6 u 1 z | N-term C I | | N-term C | ! N-term C | | |
| Sekwencja peptydu | 2 < w S S id | K.YFRCELAAAMK.R ) | K.VFRCELAAAMK.R | 2 i 5 w tj ek | R.CELAAA.M | ! R.CELAAAM.K | cd id 2 < < < j w o Cd | R.CELAAAMK.R | R.CELAAAMK.R 1 | |
| Pozycja I C w białku | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | MD | |
| i m.c. | - | - | - | O | O | O | O | O | 0 | |
| ppm | ·’’431 | t | 00 Ky | OO rn V | -1,58 | O | S3 θ' Γ7 | Cl σ\ es 1 | -1,88 1 | |
| M.cz. obliczona | g k> 0, k? O CS | ! 1464,7945 | 1480,7894 | 0 σ\ en sd ’Τ t | 0 σ\ Γ*γ 50 Tf r* | ! 877,4401 | 1005,5351 | ' 1021,5300 | O o en in 2 | |
| M.cz. oczekiwana | 1205,6573 ] | 1464,7924 | r- oo o oo 2 | ? en 0 ’Τ | 746,3984 | Ch en Tj- r- r- oo | 1005,5321 j | 1021,5270 | oo CS on g | |
| N | + en | + en | + m | + CS | + CS | + CS | + CS | + CS | + m | |
| i «5 n Λ te « S | 1 ETD | ETD 1- | e w | Q I Q ΰ | 013 | 1 Ο1Ή 1 | e u | C1D/HCD | ETD , | |
| Lp. | cś | en | κϊ | 50 | c- | 00 | 05 |
PL 226 828 B1 cd. tablicy 2
| c~ | r- | |||||||||||||||||||||||||||||||
| 2 | 2 | |||||||||||||||||||||||||||||||
| U | υ | u | u | u | OJ 0 | |||||||||||||||||||||||||||
| 1 | <3 | § | a | u | s© | CO | 0 | O | 0 | . | ||||||||||||||||||||||
| ż | c- | Γ- | r~~ | O- | Os | Os | Os | Os | Os | co | 01 | co | 00 | co | Os | Os | Os | ΓΟ | ||||||||||||||
| ż | z | z | z | u | u | u | O | u | u | u | u | Q | G> | U | u | u | u | υ | u | υ | u | u | u | <v | U | u | u | u | u | u | (J | |
| z | z | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Cd | z 2 | 2 | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Li. | b | < | < | UD | 2 | |||||||||||||||||||||||||||
| ω | »1- | H | 3 | < 0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| 0 | < | Z | 2 | |||||||||||||||||||||||||||||
| cd | u | υ | z | z | GO | |||||||||||||||||||||||||||
| Γ | UD | UD | o | < | o 2 £ < | |||||||||||||||||||||||||||
| X | X | X | X | 0 | b | b W | < | z < < | z < < | b 3 | Cł. 2 < < | i J UD | js Z 0 J tn | w | w < < | Pd CZ3 n | od UD 3 | δ | 5 UD DO | 2 2 | Lsd łź | iZ | 2 2 < | 2 2 < | 0 | J od U O | Pd u O | |||||
| fid | Cd' | od | □£ | 2 | < | < | ύ | u | U | u | u | >- | > | Q | u | cu | H | Pd | • | U | < | < | Q | u | Lzi | 0 | Pd | Pd | ||||
| bż | 2 | 2 | a | 3 | tu 2 < < u > £ | < | SLGNWYCA | ;> | J> | 0 | O | Pd | H | Pd | z | < | υ | 0 | Q | r j | > | 5 | ||||||||||
| CELAAAM | S W O | CELAAAM | 3 w u | w 0 | 2 3 u | SLGNWYC | z 3 w > O | z s vi > O | z 3 w > O | i 60 > O | 3 V) >· 0 | d a -1 O X | ai > a c 0 X | 3 (Λ > O | z 3 (Λ > O | 0 Ę 2 | W.WCNDGR | R.WWCNDG | ώ σ c l-H 3 c | 0 tZ) O £ | ΕΛ U b iu z | UD i § UD | SDITASYN· | UD i Q UD | UD i ł—1 a UD UD | UD < H 3 UD UD | Bi < > | a H 3 3 z | 1 ź P 0 | js σ > e 0 | ||
| d | od | 2 | Bi | oi | z | z | > | > | cd | 2 | od | od | * | Bi | Dd | od | ad | H | od | od | UD | UD | J | J | cd | 2 | ||||||
| SO | so | SU | SO | <0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Tt | 3 | Tt | Tt | su | Tt Os ά> | Tt | Tt | Tt | TT | TT | wo | wo | CJ | c- |
| m | ΓΟ | ro | co | co | co | co | co | co | co | co | co | co | s© | sU | su | θ' | oo | Us | Us | Os | Os | Os | ||||||||||
| SU | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| r- | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| - | - | ~ | ~ | 0 | 0 | 0 | 0 | O | O | 0 | O | 0 | 0 | - | - | - | - | O | - | - | OJ | - | 0 | O | O | O | O | O | ΓΜ | CJ | - | - |
| CJ | wo | 00 | so | 0 | c- | O | O | Os | OJ | 0 | 0- | wo | 00 | Os | 0- | Tt | 0 | OJ | co | O | C' | θ' | co | r* | 3 | su | wo | |||||
| Tt | 00 | cT | Tt | 04 | OJ | ro | <R | s© | o- | V | 0 | 00 | sC | r- | co | Ό | OJ | & | CO | Ol | Tt | θ' | ·—' | Os | Tt | Os | ||||||
| r- 1 | 1 | 1 | CJ | CO 1 | wo 1 | =? | co 1 | O 1 | 1 | 00 | 0 1 | wo 1 | O | 1 | wo co | D1 | 00 | C? | SO 1 | W-i I | wo 1 | 0 | s? | T | CJ 1 | wo 1 | O 1 | |||||
| ci | CJ | « | 0 | sU | wo | £ | £ | Γ | 0 | O | 00 | 00 | s© | Ό | Ol | OJ | θ' | wo | ISO | ΓΟ | sO | Os | Os | Os | Os | Os | SO | co | Os | Os | ||
| o | SO | Tt | 00 | 00 | 00 | co | co | OJ | SO | 0 | OJ | 00 | SU | SO | CO | 3 | 3 | wo | su | su | O | wi | ||||||||||
| rO | ro | co | co | rO | θ' | Ol | wo | WO | o- | 3 | 3 | Tt | Tt | Tt | Tt | O- | 0- | 00 | s© | SU | 00 | Tt | 0 | U\ | Us | OO | CJ | SU | O | |||
| O | <0 | so | so | O | Tt | wo | <0 | so | wo | θ' | o- | *—1 | ·—' | co | co | wo | S© | O- | co | wo | wo | SU | so | so | sU | SU | sU | Us | ¢0 | |||
| _. | c- | r~ | 0- | so | O | c- | θ' | θ' | Os | Os | c- | o- | co | CO | O- | θ' | wc | θ' | ro | ro | 0 | so | θ' | O- | Wi | 3 | 3 | WO | O | O | ||
| o | so | C' | r- | Tt | s© | SO | 0 | 0 | CO | co | Ch | Tt | Tt | 0 | O | so | co | Tt | o- | o- | Γ- | O | CO | co | ||||||||
| 0 | 00 | O | Ol | OJ | co | co | Tt | Tt | 01 | 04 | 00 | 00 | tt | su | θ' | oc | Ol | Ol | 0 | co | ro | CJ | r~- | wo | ||||||||
| OJ | OJ | OJ | OJ | OJ | OJ | Ol | ||||||||||||||||||||||||||
| s© | co | wo | C' | 0 | 0 | wo | 0 | s© | Os | Tt | ct | \O | WM | co | 00 | Os | wo | θ' | CO | I | CO | Tt | r- | CO | n | sO | wo | |||||
| r- | 00 | os | CO | o | 00 | Ol | 00 | Ό | oo | 01 | co | 0 | O | 0 | r- | ro | SO | CO | wo | 0C | cc | wo | o> | Tt | ||||||||
| (~j | ro | ej | CJ | s | r- | wo | W', | t | ^t | 3 | co | 't | oi | Tt | Ό | 0 | CO | SD | 00 | OJ | W) | V) | 0 | 00 | Os | 00 | CJ | O | 0 | |||
| SD | O | Ό | su | Tt | WO | SO | SO | WO | s© | 0- | 0- | 1 | CO | co | wo | SU | Tt | wo | wo | su | su | sU | su | SU | SU | US | 00 | 00 | ||||
| _ | Γ- | r·'· | 0- | so | 0 | O | 0 | US | o\ | o- | r- | co | CO | 0 | Γ'' | wo | Γ' | ro | CO | 0 | so | Γ | r- | WO | 3 | —1 | wo | O | 0 | |||
| SU | su | C' | r- | Tt | SO | Ό | O | o | co | ΓΟ | Os | Ch | Tt | 3 | 0 | O | SU | co | 3 | o- | o- | sO | O | ro | co | |||||||
| 0 | 00 | Cs | O-l | OJ | CO | co | Tt | Tt | Ol | Ol | 00 | Tt | \5 | O- | OJ | OJ | 0 | CO | CO | CJ | c- | wo | wo | |||||||||
| OJ | Ol | 01 | Ol | Ol | OJ | OJ | ||||||||||||||||||||||||||
| + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | |||
| en | ro | ro | ro | T | OJ | ro | OJ | co | OJ | 01 | Ol | co | CO | Tt | Tt | Tt | Tt | co | CO | Tt | Tt | co | wo | co | CM | co | co | ro | ro | Tt | co | co |
| Q | Q | O | a | Ci | o | 0 | Q | O | a | 0 | ||||||||||||||||||||||
| U | U | U | u | U | u | U | u | u | u | |||||||||||||||||||||||
| 0 | 0 | 0 | Q | o | R | Q | Q | Q | R | c | 1 | a | □ | o | Q | Q | o | c | 5 n | 5 π | Q | o | 5 p | a | c | Q | R | |||||
| H | H | H | H | H | H | P | P | H | 1- | H | 1- | H | Ł— | P | H | H | (- | (_ | H | H | ||||||||||||
| u | ω | U | LU | ω | ω | LU | U | LU | LU | u | LU | u | LU | (J | LU | u | LU | LU | LU | LU | LU | X | u | u | ω | ω | u | LU | LU | LU | LU | LU |
| ó | ci | ro | τΤ | wo | so | cś | 06 | Os | ó | oj | co | Tt | wo | MD | l< | 00 | as | Ó | oj | co | Tt | WO | sO | od | Os | O | CJ | |||||
| r-l | OJ | OJ | Ol | Ol | OJ | Ol | Ol | Ol | Ol | 01 | CO | CO | CO | CO | co | CO | CO | CO | co | ro | Tt | Tt | Tt |
PL 226 828 B1
PL 226 828 B1
Tablica 5.
| Sekwencja peptydu | 1 C.ELAAAMK.R | I H.GLDNYR.G ' | E.LAAAMKR.H | I E.LAAAMKR.H | W.YAWRNR.C | N.FNTQATNR.N | 1 G.TDVQAWIR.G | 1 R.CELAAAMKR.H | K.RHGLDNYR.G | o ai £ 1 o | N.GMNAWYAWR.N | R.HGLDNYRGY.S | Z od i o z w | R,NTDGSTDYGIL.Q | F.ESNFNTQATNR.N | R.NTDGSTDYGILQ.l | K.FESNFNTQATNR.N | R.NTDGSTDYGILQIN.S | H 1 H £ tź | £ Pd C/5 δ σ a o > s o c H Z | R.NTDGSTDYGILQ1NSR.W | <Λ O c H < £ £ i ω tu tz | Q.ATNRNTDGSTDYGILQINSR.W i | N.TQATNRNTDGSTDYGtLQINSR.W i | : K.FESNFNTQATNRNTDGSTDYGIL.Q | K.FESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSR.W |
| m.c. | O | O | - | - | - | O | O | - | - | o | O | - | o | O | O | O | O | O | - | o | 0 | - | « | - | - | - |
| Γ* | oo | r- | © | OS | ΓΜ | © | © | o- | CO | os | SC | VD | D* | c* | TT | © | Os | Os | © | © | ||||||
| PP» | 00 | Dl- | CM | r- | 00 | © | OO | co | C- | Os | © | SC | © | *d- | © | o | 00 | D | cO | 00 | 00 | © | ||||
| 1 | © 1 | *? | T | Ύ | MD | 'P | CM | o 1 | 1 | © ) | © 1 | CO 1 | oo 1 | T | 00 | r- | Os 1 | © 1 | r- | © 1 | 00 | rt | © | |||
| o | 04 | © | © | MD | O | oo | CO | O | O | O | O | O | O | O | o | o | O | o | O | 0 | 0 | O | 0 | O | [00 | |
| DT | CM | CM | O | C~ | (O | o* | o | MD | 00 | M- | CM | o·· | MD | oo | co | MS | © | © | 00 | CM | r- | CD | CM | |||
| n | 00 | © | 5 | 3 | MD | OS | CO | US | Cl | o | r~~ | su | Dr | Os | 00 | OO | CM | 00 | MD | © | © | |||||
| < § | co | ro | θ’ | MD | θ' | © | VI | MD | TT | MS | © | MS | © | su | SU | © | o | OO | c- | O | ·—1 | |||||
| fi N | CM | © | os | Os | o | © | r- | i | Os | Os | ro | —. | O | ΓΜ | f | Os | oo | CM | © | s | CM | |||||
| CO | ro | ·/> | md | o | © | oo | Os | CM | OO | OS | © | MD | oo | oo | CM | O | MD | Os | CM | © | ||||||
| Γ | r- | r- | r* | 0O | Os | Os | Os | O | o | o | O | CM | CM | MD | MD | © | C- | 00 | © | |||||||
| * A O | CM | CM | CM | ro | ||||||||||||||||||||||
| © | co | CM | ’Τ | CM | O | o | o | o | O | O | O | o | o | O | O | Q | O | 0 | O | O | © | © | ||||
| Λ | os | © | 00 | Os | MD | r- | © | 00 | TT | © | Df | MD | CD | CD | © | OS | CD | Os | © | |||||||
| e | Γ' | CO | CO | CO | MD | o | 00 | os | CM | oo | CM | O | SC | SD | CD | C- | C | © | ’Τ | CM | ||||||
| CO | fO | tT | o- | O* | Tt | MD | D- | MD | MD | rf | MD | MD | MD | MD | © | © | © | Γ | OO | t | Φ | Df | ||||
| g Ϊ | ΓΜ | © | Os | Os | O | O | r- | os | O* | Os | co | O | CM | C- | Os | oo | DJ | iri | tC | 3 | CM | |||||
| s| o | CO | ro | © | MD | o | Vi | oo | Os | CM | O* | OO | Os | MD | © | OO | 00 | CM | O | cO | MD | Os | CM | © | |||
| Γ- | r- | C~ | r-~ | O0 | Os | Os | Os | O | O | O | O | —i | — | CM | CM | DC | © | MD | © | c- | 00 | © | ||||
| - | - | CM | CM | CM | CO | |||||||||||||||||||||
| N | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ||||||||||
| CM | ΓΜ | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CM | CD | CO | CO | CO | ||
| U | Q | Q | O | O | O | Q | Ci | c | Q | o | o | Ω | o | O | o | D | O | c | Q | o | o | Q | Q | c | o | o |
| O | U | y | u | u | y | U | U | u | U | u | u | U | u | u | u | U | υ | y | O | u | u | y | U | u | u | u |
| s | 5 | I | 5 | 5 | P | 5 | 5 | 3= | 5 | 5 | 5 | ? | 5 | a | Z | 5 | P | Z | z | Z | Z | z | z | EC | ||
| « | 9 | Q | C | 9 | 9 | Q | q | Q | c | Q | c | c | c | o | c | Q | □ | c | Q | 9 | Q | Q | 0 | 0 | Q | Q |
| b | y | O | Ć> | u | u | U | u | O | o | y | y | u | u | u | y | U | y | y | y | y | y | y | y | y | y | y |
| fi. J | - | CM | co | O- | MD | © | r* | oo | Os | O | 1—< | CM | co | ·** | MD | 2 | Γ~· | OO | Os | 1 20 1 | CM | CM CM | rO CM | I24J | © CM | © CM |
PL 226 828 B1
Tablica 6.
PL 226 828 B1
| N-term H j | | N-term S | | N-term T | | ||||||||
| t Q | r- o | Ot Ξ | ||||||||
| 07 1 | £3 | r-~ O | n δ | |||||||
| Γ* | ||||||||||
| | R.NTDGSTDYGIL.Q < | Z od i z iż | & od tn s S £ e rJ-> g od | σ J g Cl f— co 1 σ i ω E sż | O g 3 o £ iż | O -J ś Cl H l od | s od « s S £ e od | O J 1 w i O ŁG UJ IX· iż | O i § _1 s od | z Pd I z (Λ W | £ od Z 2 g p P CG Z 03 £ z |
| o | o | o | - | - | O | O | - | O | O | - |
| CM | OO oo | Ά Ύ | 00 CM tn 1 | Τζ to 1 | c- 1 | to Cl oo | tn oo K * | Γ-- o to” t | tn oo | CM to tn 1 |
| 1176,4910 | O A CM oc M- | o o oo ’Τ r- C- | O d CM tO OO Ά CM | O O o tn to o | O n to X s | O -g· 00 <> o ot c- | O r- Ot o CM* O to CM | tn ’Τ te o | o 00 tn •n 5 | O a- to Γ- to ’Τ CM |
| O o 00 'C to | O m to oC 5 | o CM O oo r- r- | O O tO 00 lA CM | o tn Ot ’Τ § | 8 n tr ej Ot | o Ot to C-e o ot r- | O Γ' o fM s CM | Ά Ot O tO | o o tn •n ot | O o to r- to 't CM |
| + CM | + CM | + CM | + m | + tn | + CM | + tn | + tn | + C-M | + CM | + m |
| OO CM | O CM | O m | tn | CM m | tn tn | tn | ά tn | to tn | t> tn | oo tn |
fi· rt rt c3 Λί cd « Q Q Q Q Q a
O\ oo σ' σ\ oo rłi o tt o> —i u-> tn c t 5- oo se « o >, oo o 03 σ> σ> o Ł ®ϊ, ιη — -4 pt rn .-.
O —i m (N m -+ >
+ + + + + + ca
Ό O T3 td Ό
JC j£ « Z W 5y*’' . . O >3 a o a s·* u o .2 „ w. -<
□ S O < < 9
Ό T3 -rt
PL 226 828 B1
P r z y k ł a d 2
Otrzymywanie modelowej mieszaniny peptydów zawierających peptydy S-glikozylowane
Naważkę 0,5 mg liofilizowanego preparatu białka modelowego rozpuszczano w 90 μl roztworu wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) w wodzie dejonizowanej, sporządzonego przez rozpuszczenie 0,158 g NH4HCO3 w 20 ml dejonizowanej wody (pH roztworu powinno być > 7). Następnie dodawano 10 μl 2% roztworu detergentu RapiGest SF (Waters), sporządzonego przez rozpuszczenie 1 mg tego detergentu w 50 μl 50 mM NH4HCO3 i całość silnie wymieszano. Roztwór białka połączono z roztworem 10 ng^l trypsyny (Sequencing Grade Modified Trypsin) w buforze firmowym (Promega nr kat. V511A) stosując proporcje wagowe 20:1. Próbę inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, po czym zakwaszano do pH < 2 za pomocą kwasu trifluorooctowego (TFA) i po 30 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C odwirowywano w czasie 10 min przy szybkości 13 000 rpm. Klarowny supernatant przepuszczono przez membranę ultra filtracyjną (MWCO: 10 kDa) i uzyskany przesącz zawierający peptydy zliofilizowano.
P r z y k ł a d 3
Hydrolityczna deglikozylacja białka modelowego mg krystalicznego azotanu srebra (AgNO3) rozpuszczono w 500 μl DMSO, odpowietrzono strumieniem azotu i dodano 0,8 μl trietyloaminy, w wyniku czego uzyskano pH roztworu 9,1. Do 320 μl tego roztworu wprowadzono 80 μl wodnego roztworu białka modelowego o stężeniu 4 mg/ml. Próbę zabezpieczono folią aluminiową przed dostępem światła i inkubowano w ultratermostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 50°C przez 2 godz. Następnie do klarownej mieszaniny po reakcji, o barwie szarożółtej dodano 9,9 mg stałego DDT i odwirowano wytrącający się natychmiast ciemny osad w czasie 5 min. przy szybkości 12 000 rpm. Klarowny bezbarwny supernatant o pH 2,1 poddano mikrodializie wobec wody dejonizowanej stosując Spectra/Por® MWCO: 3500, Biotech Regenerated Cellulose Membranes - Spectrum Laboratories Inc. Po dializie otrzymano roztwór białka o pH 5,1, który podzielono na dwie porcje po 125 μl i każdą z nich poddano znakowaniu.
P r z y k ł a d 4
Znakowanie odblokowanych grup tiolowych białka za pomocą bromku bimanylu (mBBr)
Do 125 μl badanej próby o pH 5,1, uzyskanej w przykładzie 3, wprowadzono 12,5 μl 1M buforu Tris-HCl o pH 8,4 oraz 5 μl 100 mM roztworu mBBr w acetonitrylu i mieszaninę inkubowano 40 min bez dostępu światła w temperaturze pokojowej. Nadmiar odczynnika fluorescencyjnego usunięto przez mikrodializę (MWCO: 3500 Da) wobec 10% wodnego roztworu acetonitrylu, a następnie wobec wody dejonizowanej. Otrzymany produkt zliofilizowano i poddano standardowej trypsynolizie jak w przykładzie 2 z następczą standardową analizą LC/MS/MS z fragmentacją CID/HCD. Identyfikacji peptydów wraz z ich modyfikacjami dokonano poprzez analizę MACSOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search.
W tablicy 7 przedstawiono peptydy ze zmodyfikowaną Cys pochodzące z trypsynolizy białka modelowego Liz[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, w którym miejsca S-glikozylacji znakowano mBBr. W tablicy tej z, m.c. i S-Glc mają znaczenie jak w tablicach 1-6, S-APTA oznacza grupę tiolową cysteiny znakowaną APTA, zaś S-BM oznacza grupę tiolową cysteiny znakowaną fluorescencyjnym mbir.
PL 226 828 B1
Tablica 7.
| Typ i miejsce modyfikacji | S M 1 (Z) | N-term C | N-term C | N-term C | un U | C7 | O | 05 U | C9 | ||||||||||||||||||
| s- APTA | N-term C | N-term C | C5 | C7 | Γ' O | 05 O | 05 O | Os o | o U | 05 O | |||||||||||||||||
| S-Glc | N-term C | C5 | C5 | C7 | C7 | 05 U | o, U | 06 | |||||||||||||||||||
| Sekwencja peptydu | R.CELAAAMK.R | R.CELAAAMK.R | R.CELAAAMK.R | RCELAAAMKR.H | R.CELAAAMKR.H | R.CELAAAMKR.H | K.YFGRCELAAAMK.R | j K.YFGRCELAAAMK.R | ad JJ u aS O X. > id | cd id ω a o 0- > | Y.SLGNWYCAAK.F | U, i co > | U, o I CZ3 > | Y.SLGNWYCAAK.F | Iy.slgnwvcaak.f | Y.SLGNWYCAAK.F | R.GYSLGNWYCA.A | < υ i o od | id ι § □ w > o cd | u. § -i (ZJ > O cd | u. i O Cd | u. u 1 O cd | R.GYSLGNWYCAAK.F | : R.GYSLGNWYCAAK.F | R.GYSLGNWYCAAK.F | U. O 2 O i % § _] o X pd | |
| pozycja C w białku | 50 | Ό | 50 | 50 | Ό | 50 | 50 | Ό | 50 | 50 | O cn | o n | O m | O m | o m | O m | 30 | 30 | o en | o Γ*Ί | o cn | o en | O en | O m | o cn | o m | |
| m.c. | o | O | O | - | O | o | O | O | o | O | O | O | O | O | o | O | o | o | O | - | |||||||
| ppm | O | 05 •X | 4,77 | -33,21 | 0,28 | 2,87 | 4,03 | 4,04 | 4,99 | | 2,74 | | 4,09 | | 05 00 | 50 CS | νζ CS | -1,07 | | 20,2 | | 3,11 | | 7,44 | | 3,69 | | 00 en en | 2,95 | | CS o 9 | 3,13 | | 05 50 | ΙΓ1 *O | 1 ifc | |
| M.cz. obi. | 997,4460 | 1025,4674 | 50 C1 O | 1161,5310 | CS 50 <*> 50 5© | <Λ 00 Ό •n 00 | 1456,7054 | 1456,7054 | 1464,7945 | 1484,7268 | 1209,5700 | 1209,5700 | o o •Cl 50 r- CS | 1217,6590 | 1237,5914 | 1237,5914 | 1238,6118 | | oo 50. oo m CS | 1309,6489 | | 1429,6548 | | OO Ί •n 50 O CS 2 | 1437,7438 | | 1437,7438 | | 1457,6762 | | 1457,6762 | | to O *O oo CS CS | |
| rf Ji si | 997,4565 | 1025,4733 | 1025,4723 | CS 05 50 | 50 m 50. 50 | 1181,5719 | 1456,7113 | 1456,7113 | O0 o oo^ Ί 50 Ί | 1484,7309 | 1209,5749 | 1209,5799 | 1217,6623 | | O <s 50 50 r- <s | 1237,5900 1 | 1237,6164 | | 50 in 50 m CS | 1238,6210 | | 1309,6537 | | 1429,6499 | | o 05 50. oC CS | 1437,7439 | | 1437,7483 | | 1457,6667 | | 1457,6829 | | £2 05 o •n 00 CS CS | |
| N | 2+ | 2+ | 2+ | + cn | + ΓΠ | + CS | 2+ | 1 2+ 1 | + en | 2+ | 1 2+ 1 | 1 2+ 1 | + | + | 2+ 1 | 2t 1 | 2+ 1 | 2+ | 2+ | | + CS | 2+ j | + m | + CS | + CS | 2+ | | + ΓΊ | |
| frag. | HCD | CID | HCD | CID | HCD | HCD | CID 1 | HCD ] | HCD J | CID j | CID | | HCD | | CID | | HCD | HCD | | CID | | HCD | | CID | | CID | | CID | | HCD | | HCD | | CID | | HCD | | CID 1 | HCD 1 | |
| Lp. | - | CS | tr, | Ό | oo | 05 | 10 | - | CS | 50 | O | OO | 05 | O CS | CS | Γ 22 Ί | m CS | I 24 1 | 1 25 1 | 50 CS |
PL 226 828 B1
PL 226 828 B1
MS/MS Fiagtnentatran of SLGNWVCAAK
Found in 47, lizozym
Matchto Quny 2422: 123761638Efrom(619-815470,2+)intensity(55296J3.5000) TMk 3982: Scan 13471 («=3863.52) [0:\ORBITA',1007-lipiec'4)0715jasio_lciiraw] Data file 007! 5jasio_ 1 cid.mgf
Click mouse within plot area to zoom in by factor of two about that point Or. LPMAogli ,1 150 to 1100 Da ( Fuli rance ]
Monoisotopic mass of neutral peptide Mr(calc): 1237,59X4
Variable modifications:
C7 : Bromobimane (C)
Ions Score: 42 Expect: 0.00013
Matches (Bold Red): 24/96 fragment ions using 32 most intense peaks
| a | a« | a* | a- | b | b* | y | y* | ył++ | ||||||
| 1 | 60.0444 | 30.5258 | 88.0393 | 44.5233 | s | 10 | ||||||||
| 2 | 173.1285 | 87.0679 | 201.1234 | 101.0653 | L | 1151.5666 | 576.2870 | 1134.5401 | 567.7737 | 9 | ||||
| 3 | 230.1499 | 115.5786 | 258.1448 | 129.5761 | G | 1038.4826 | 519.7449 | 1021.4560 | 511.2316 | 8 | ||||
| 4 | 344.1928 | 172.6001 | 327.1663 | 164.0868 | 372.1878 | 186.5975 | 355.1612 | 178.0842 | N | 981.4611 | 491.2342 | 964.4346 | 482.7209 | 7 |
| 5 | 530.2722 | 265.6397 | 513.2456 | 257.1264 | 558.2671 | 279.6372 | 541.2405 | 271.1239 | W | 867.4182 | 434.2127 | 850.3916 | 425.6994 | 6 |
| 6 | 629.3406 | 315.1739 | 612.3140 | 306.6606 | 657.3355 | 329.1714 | 640.3089 | 320.6581 | V | 681.3389 | 341.1731 | 664.3123 | 332.6598 | 5 |
| 7 | 922.4240 | 461.7156 | 905.3974 | 453.2024 | 950.4189 | 475.7131 | 933.3923 | 467.1998 | c | 582.2704 | 291 6389 | 565.2439 | 283.1256 | 4 |
| 8 | 993.4611 | 497.2342 | 976.4345 | 488.7209 | 1021.4560 | 511.2316 | 1004.4295 | 502.7184 | A | 289.1870 | 145.0972 | 272.1605 | 136.5839 | 3 |
| 9 | 1064.4982 | 532.7527 | 1047.4717 | 524.2395 | 1092.4931 | 546.7502 | 10754666 | 5382369 | A | 218 1499 | 109.5786 | 201.1234 | 101.0653 | 2 |
| 10 | K | 147 1128 | 74.0600 | 130.0863 | 65.5468 | 1 |
PL 226 828 B1
P r z y k ł a d 5
Znakowanie odblokowanych grup tiolowvch białka za pomocą chlorku (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniowego (APTA)
Do 125 μl badanej próby o pH 5,1, otrzymanej w przykładzie 3, wprowadzono 12,5 μl 1 M buforu Tris-HCl o pH 8,4 oraz 4 μl 4 M wodnego roztworu APTA i mieszaninę inkubowano 40 min bez dostępu światła w temperaturze pokojowej. Nadmiar odczynnika alkilującego usunięto przez mikrodializę (MWCO: 3500 Da) wobec wody dejonizowanej. Otrzymany produkt zliofilizowano i poddano standardowej trypsynolizie jak w przykładzie 2 z następczą standardową analizą LC/MS/MS z fragmentacją CID/HCD.
Identyfikacji peptydów wraz z ich modyfikacjami dokonano poprzez analizę MASCOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search.
W tablicy 8 przedstawiono peptydy ze zmodyfikowaną Cys pochodzące z trypsynolizy białka modelowego Liz[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, w którym miejsca S-glikozylacji znakowano APTA. W tablicy tej z, m.c., ox, S-Glc i S-APTA mają wyżej podane znaczenie.
Poniżej w tablicy 8 przedstawiono także rezultat analizy MASCOT dla widma fragmentacyjnego CID identyfikującego peptyd z cysteiną znakowaną grupą APTA o sekwencji CAPTAELAAAMK oraz rezultat analizy MASCOT dla widma fragmentacyjnego HCD identyfikującego peptyd z cysteiną znakowaną grupą APTA o sekwencji CAPTAELAAAMKR.
PL 226 828 B1
Tablica 8.
| Typ i miejsce modyfikacji w peptydzie | M 0 | r- 2 | c- £ | MII 1 | ||||||||||||||||||||
| S-APTA | N-term C 1 | N-term C 1 | | N-term C j | | N-term C | | N-term C | N-term C | N-term C | N-term C 1 | r- U | C7 | Os U | Os u | o U | C9 | ||||||||||
| S-GIc | | N-term C | | VI U | V U | V u | C7 | r-- U | C9 1 | OS U | Clć | |||||||||||||||
| Sekwencja | R.CELAAAM.K | R.CELAAAM.K | R.CELAAAMK.R | | R.CELAAAMK.R | I R.CELAAAMK.R | R.CELAAAMKR.H | R.CELAAAMKR.H | R.CELAAAMKR.H | |k.vfgrcelaaamk.r | et! tM 2 W 2 o £ Ł4 | K.YFGRCELAAAMK.R | < d O t/j O od | Y.SLGNWYCAAK.F | Y.SLGNWYCAAK.F | Y.SLGNWYCAAK.F | Y.SLGNWYCAAK.F | R.GYSLGNWYCA.A | R.GYSLGNWYCA.A J | R.GYSLGNWYCAAK.F J | R.GYSLGNWYCAAK.F j | R.GYSLGNWYCAAK.F | Ph < u z o -1 ΙΛ o od | U. s o i CZ) > § > § u o X ed | |
| Pozycja C w białku | SD | SD | SD | SD | MD | SD | SD | so | \o | SD | o m | O <-<Ί | O en | O en | 30 | | 30 | 1 30 1 | O m | O <n | O m | O m | o fn | ||
| U B | O | o | O | O | o | - | - | - | - | - | - | o | O | O | o | O | O | O | O | o | o | o | - | |
| B fi. fi. | r- <n Ci | 3>03 | 133 | r-> rn rn | 3’76 | b49 | 2’24 | 1 5,241 | 2,78 | co CN | 3,06 i | 2’441 | 3’20 | O rn | tt <n^ fn | 3,07 J | SD ci | 4,261 | 3,53 | | oo C> TT | 0,58 1 | SD C^ ci | ||
| M.cz. obliczona | [ 877,4401 | | 877,4401 | | 997,44601 | I 1005,53511 | 1021,5300 | 1161,63621 | 1161,6362 | | 1177,63111 | d V o C\ so v | [ 1456,70541 | 1472,7003 | | 1167,5747 | | 1209,57001 | 1209,57001 | 1217,6590 | | 1217,6590 | | 1238,6118 | 1238,6118 | | 1429,6548 | | 00 n- V O o' CM | 1437,7438 | | 1437,7438 | | 2285,0535 | |
| fi d Ss O | 877,4422 | 877,4428 | 997,4483 | •Cl 00 m n v? O O | [ 1021,5338 | 1161,6379 | 1161,6388 | 1177,6373 | 1456,7094 | O Os o sfi V TT | oę O Γ1 r-~ | 1167,5775 | | 1209,5738 | 1209,5737 | 1217,6631| | 1217,6628 | | 1238,6151 | 1238,6170 | | 00 o. v S© o? CM | s so Ό oś CM | 1437,7454 | | r~- ’Τ TT r-* cn tt | oo Os *A O 00 ΓΜ CM | |
| N | + CM | 2+ | CM | + | 3+ | + fn | + m | + m | + CM | no | + CM | + CM | + CM | + CM | 3+ | 1 3+ i | + CM | 4- CM | 4- CM | 4- CM | + CM | + en | + CM | |
| Fragmen- tacja | HCD | Ci O | 1 HCD | | CID 1 | CID | HCD | CID | 1 HCD | | CID i | HCD | | C[D 1 | HCD | | CID i | HCD | | CID 1 | HCD | | HCD | Γ CID 1 | HCD | | 1-CID 1 | Γ C1D 1 | HCD | HCD | |
| Lp. | - | CM | ΓΠ | TT | Ή | ν© | ®o | OŚ | O | CM | rn | H- | •ci | Γ-'- | 0© | OŚ | CM | CM CM | 23. |
PL 226 828 B1
| u | c- | ||||||||||
| Ό | O | 05 | 05 | o | u | ||||||
| u | u | u | O | o | υ | 5 | a | Cl | |||
| z | o | u | |||||||||
| o | |||||||||||
| Cl | g | ||||||||||
| υ | o | ||||||||||
| ź | |||||||||||
| Z | |||||||||||
| od £ | 34 | ||||||||||
| ŁŁ, | b | < | 34 | ||||||||
| 54 < | 34 | o (- 7 | υ | < U | |||||||
| < ο | < o | E Z | fcd sż | fcd sż | CZ) | V) | |||||
| c | CZ) | < | < | ||||||||
| ω | Z | 3 | 3 | H | H | ||||||
| § G | LGN | u- | Cd V) O H | 34 | 34 34 | u | u | o =4 | R.G | SSDI | SSDI |
| LZJ > | CZ) > | p | < u | CZ> i | co i | £ | § | -J J | G G | ||
| ο | O | c> | od | u | < | < | < | < | |||
| od | Cd | O | θ' | O | CZ) | c/) | |||||
| > | •z | Π | ĆZ) | u | G | > | > | U | u | ||
| § | 5 | LG1 | 2 u | tz> < | i | CZ) CZ) _3 | CZ) CZ) _) | Q H | e | 0-. Z | Oj Z |
| wJ o | o | CZ) > | st | Q | G | G c | O 34 | 34 | o G | G | |
| 33 | 33 | o | CZ) | O) | CZ) | CZ) | U | U | Z | Z | |
| ¢4 | ¢4 | c4 | b4 | czi | G | d | <J | ed | oi | 2 | <4 |
| o | O | ||||||||||
| O | O | O | Tt | nr | nr | nr | oo | » Tt | |||
| Cl | ci | ci | 05 | 05 | θ' | 05 | 1—1 | 50 | tf®' | ||
| Γ | c- | ||||||||||
| - | - | - | - | o | O | O | o | - | - | o | o |
| C- | o | 00 | OO | Os | Cl | Cl | r- | o | Cl | Cl | c- |
| o | Cl | o | 5Π | nT | ·—* | f | CS | oo | nT | nT | 50 |
| o | CS | CS 1 | cT | o | O | V) | cT | c? | |||
| 50 | 50 | CS | c· | 05 | 05 | CS | CS | rs | § | ||
| Cl | CS | 50 | oo | 3 | 50 | nr | nr | CS | Cl | ||
| Tj- | Ί | r-> | r- | 05 | Cl | Cl | 05 | oo | 50 | nr | |
| -1 | ci | 50 | 50 | 50 | 05 | 05 | 50 | c* | CS | VI | |
| c? | ci | C' | v? | C- | oo | OO | Γ- | VI | nr | 50 | |
| 05 | 05 | nr | 05 | c- | 50 | nT | Ί | Cl | c- | nr | |
| Cl | Cl | 00 | Vj | CS | ci | C- | C~ | nr | Cl | 00 | |
| ci | CS | cs | CS | CS | |||||||
| Cl | 05 | Cl | ? | •n | <n | 3 | nT | oo | 05 | ||
| c- | r* | o | vi | oo | ci | nT | 50 | oo | Γ* | ||
| nt | ί | C' | oo | 50 | 05 | Cl | nr | 05 | OO | 50 | |
| ,-1 | Cl | 50 | 50 | 50 | 05 | 05 | 50 | Γ | Cl | VI | |
| c | Cl | C' | vf | r- | 3 | oo | oo | Γ-* | V, | nT | Ό |
| Cs | 05 | nT | 05 | r- | Tt | nT | Cl | 3 | r- | 3 | |
| Cl | CS | oo | Z5 | CS | Cl | r- | C | nT | Cl | ||
| CS | CS | CS | CS | CS | |||||||
| + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | ||
| nj· | nr | Cl | CS | CS | CS | Cl | CS | CS | Cl | Cl | VI |
| Q | G | G | G | G | G | o | Q | Q | G | Q | |
| t—1 | U | U | U | U | U | U | (J | U | U | υ | |
| o | 33 | X | I | a | X | X | (J | X | X | X | X |
| -3T | vi | 50 | s | 00 | 05 | O | cs | Cl | nr | νΐ | |
| cs | CS | CS | CS | CS | CS | Cl | o | Cl | Cl | Cl | Cl |
PL 226 828 B1
Ιν&ΆΕ Fragmentationof CELAAAMK
Found in 47, Lizozym \fetehtoQuery451:1005.538452 &ura(336.1S6760.3+)intensity<256S91260.0000)
Titłe: 850: Sum of 3 seans inrange 5030 (rt=27.0023) to 5053 (rt=27.0976) {Y212.87.29.S8 Orlwb\QFRrrAM007-UpiecXW715jaao_3cid.raw]
Data file \\212.8729.88'.Ori>ita'.CRBrrA\1007-lipiecO0715aao_3cid.raw
Click mouse within płot area to zoom in by factor of two about tłiat point
Or, [ PloUirom 50 to Θ50 Da ί......Fulliartge 1
ftor.oitotcypic i&ass of r.eutral pq)tide Mr(cnlc) : 1005.5351
Fiaced eodif iontions: Carbaiaidomethyl (C)
Vanał>le aodificntior.s :
Ci : QAT (C) lont Score: 44 Empect.: 0.5e~05 ttitełies (BoId Red) : 14/56 fragment iona using 23 rroat intenae peala
| # | b | r* | b° | Seq. | y | y* | y*++ | y° | # | |||
| 1 | 331.1798 | 166.0936 | C | 8 | ||||||||
| 2 | 460.2224 | 230.6149 | 4422119 | 221.6096 | E | 733.3913 | 367.1993 | 7163647 | 358.6S60 | 715.3807 | 358.1940 | 7 |
| 3 | 573.3065 | 287.1569 | 555.2959 | 278.1516 | L | 604.3487 | 302.6780 | 5873221 | 294.1647 | 6 | ||
| 4 | 644.3436 | 322.6754 | 626.3330 | 313.6702 | A | 491.2646 | 2461360 | 4742381 | 237.6227 | 5 | ||
| 5 | 715.3807 | 35S.194O | 697.3702 | 349.1887 | A | 420.2275 | 210.6174 | 4032010 | 202.1041 | 4 | ||
| 6 | 786.4178 | 393.7126 | 768.4073 | 384.7073 | A | 349.1904 | 175.O9SS | 332.1639 | 166.5856 | 3 | ||
| 7 | 917.4583 | 4592328 | S99.447S | 450.2275 | M | 278.1533 | 139.5803 | 2611267 | 131.0670 | 2 | ||
| 8 | K | 147 1128 | 74.0600 | 130.0863 | 65.5468 | 1 |
PL 226 828 B1
Znakowanie miejsc S-glukozylacji w białku modelowym za pomocą APTA mogło być także zauważone jako zanik peptydów S-glukozylowanych, lub w przypadku niepełnej hydrolizy wiązania tioglikozydowego, jako zmiana stosunku intensywności jonów prekursorowych par spektralnych PEPTYDX[S-APTA]/PEPTYDY[S-Glc] obserwowanych w mieszaninie po alkilowaniu, w odniesieniu do tego parametru dla tych samych par spektralnych pochodzących z mieszaniny modelowych peptydów.
W poniższej tablicy 9 przedstawiono względny wzrost stosunku intensywności (a/b) po znakowaniu za pomocą APTA. W oznacza względny wzrost stosunku intensywności (a/b).
Tablica 9
| Sekwencja peptydu | Para spek- tralna | Typ modyfik. na C | Mieszanina wyjściowa | Mieszanina po znakowaniu APTA | W | ||
| Intensywność sygnału MS | Stos. lnt. (a/b) | Intensywność sygnału MS | Stos. Int. (a/b) | ||||
| SLGNWVCAAK. | la | S-APTA | 19640630 | 2,1 | 2339219728 | 10,8 | 5,1 |
| lb | S-Glc | 9496546 | 216604440 | ||||
| GYSLGNWYCAAK | 2a | S-APTA | 2899576525 | 2,5 | 42144433841 | 14,2 | 5,7 |
| 2b | S-GIc | 1152790789 | 2972357086 |
PL 226 828 B1
Relatywna zmiana stosunku intensywności wyniosła dla każdej z nich odpowiednio 5,1 i 5,7 co można uznać jako zadowalającą efektywność znakowania.
Reakcja znakowania (S-Glc >S-APTA) nie zachodzi wyczerpująco, gdyż pozostawia pewną część reszt S-glikozylowych nienaruszonych. Jest to widoczne w postaci detekcji licznych S-glikopeptydów z glikozylacją w pozycjach C6 i C30, a także rzadziej wykrywanych z glikozylacją w pozycjach C64 i C115. W dłuższych peptydach z cysteiną C76, C80 i C94 zidentyfikowano tylko funkcjonalizację S-APTA, co jest pośrednim dowodem znakowania również tych pozycji.
P r z y k ł a d 6
Hydrolityczna deglikozylacja białka modelowego
Do mieszaniny zawierającej 1280 μl 0,2M roztworu AgNO3 w DMSO, 17 μl pirydyny i 1,5 μl trietyloaminy wkroplono 320 μl roztworu białka modelowego w 2 M moczniku zawierającym 0,04% dodecylosiarczan sodu (SDS), o stężeniu 3 mg/ml. Uzyskaną mieszaninę o pH 8,7 inkubowano bez dostępu światła w temperaturze 50°C przez 2 godziny i 20 min (po inkubacji pH 8,1). Następnie do klarownej mieszaniny po reakcji, o barwie szarożółtej, wprowadzono 100 μl wodnego roztworu zawierającego 67 mg DTT uzyskując końcowe stężenie DTT w mieszaninie 0,3 M (tj. 1,7-krotny nadmiar molowy w stosunku do AgNO3). Wytrącający się natychmiast ciemny osad odwirowano, a klarowny, bezbarwny supernatant o pH 3 poddano dializie wobec wody dejonizowanej (MWCO: 3500 kDa). Otrzymano 3 ml dializatu o pH 6,1.
P r z y k ł a d 7
Znakowanie odblokowanych grup tiolowych białka za pomocą 4-winylopirydyny
Do 3 ml dializatu o pH 6,1 otrzymanego w przykładzie 6, wprowadzono 1 μl pirydyny (uzyskując pH 6,9) i 1,3 g mocznika. Objętość roztworu wzrosła do 4 ml, a pH do 7,9. Następnie dodano 0,4 ml metanolu i 12 μl 4-winylopirydyny. Próbę (o pH 6,8) inkubowano w temperaturze pokojowej bez dostępu światła 1 godzinę i 45 min, a następnie poddano dializie wobec wody dejonizowanej zakwaszonej TFA do pH 4,7. Dializat zliofilizowano i poddano standardowej trypsynolizie jak w przykładzie 2 z następczą standardową analizą LC/MS/MS z fragmentacją CID/HCD. Identyfikacji peptydów wraz z ich modyfikacjami dokonano poprzez analizę MACSOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search.
W tablicy 10 przedstawiono peptydy ze zmodyfikowaną Cys pochodzące z trypsynolizy białka modelowego Liz[S-APTA]3[Dha]2[S-Glc]3, w którym miejsca S-glikozylacji znakowano 4-winylopirydyną. W tablicy z, m.c, S-Glc, ox i S-APTA mają wyżej podane znaczenie, zaś S-PE oznacza grupę tiolową cysteiny znakowaną 4-winylopirydyną (grupa S-4-pirydyloetylowa), Cys>Dha oznacza cysteinę przekształconą w dehydroalaninę, Cys>Ser oznacza cysteinę przekształconą w serynę w wyniku addycji cząsteczki wody do Dha.
Poniżej w tablicy 10 przedstawiono także rezultat analizy MASCOT dla widma fragmentacyjnePE go CID identyfikującego peptyd o sekwencji CPEELAAAMK z cysteiną znakowaną grupą pirydyloetylową (PE) oraz rezultat analizy MASCOT dla widma fragmentacyjnego HCD identyfikującego peptyd
PE o sekwencji WWCPENDGR z cysteiną znakowaną grupą PE.
PL 226 828 B1
Tablica 10.
PL 226 828 B1 cd.tablicy 10
| cn | cn | ||||||||||||||||||||||||
| U | (J | ||||||||||||||||||||||||
| Os | Os | cn | O\ | os | |||||||||||||||||||||
| u | u | u | u | u | |||||||||||||||||||||
| os | Os | cn | cn | ||||||||||||||||||||||
| u | u | u | J | u | |||||||||||||||||||||
| Os | os | SO | |||||||||||||||||||||||
| <_) | <J | u | ΰ | ||||||||||||||||||||||
| u | υ | ||||||||||||||||||||||||
| Os | Os | Os | E | g | — | ||||||||||||||||||||
| o | u | o | u | Ó | Ύ | U | ύ | ||||||||||||||||||
| Z | i | ||||||||||||||||||||||||
| z | z | ||||||||||||||||||||||||
| od | od | f— | |||||||||||||||||||||||
| Z | Z | ||||||||||||||||||||||||
| u- | i— < | < | o | ||||||||||||||||||||||
| z | CZ | Q H | Π | ||||||||||||||||||||||
| cd | jz; | Z | |||||||||||||||||||||||
| 1 | d | Z | Eu Z | ||||||||||||||||||||||
| li. | u. | ω u. | ω tu | u. | u. | u. | u. | & | & | z | z, | z | i* co | o es ź < 2 Q H | U | ||||||||||
| NWYCAAK | Z | § | NWYCAAK | U | U Z | z V3 E | O -J > s > | U z | NWYCAAK | H ed | H cd | H ed 2 | ed ΙΛ 2 i | i 3 | DGRTPGSR | s 2 O > e | o eś < | VQAWIR.G | 'AWIRGCR... | od i < | cd 8 Sś Se < | ||||
| O | O | u | ó | □ | O | Ό | o | z | o | O | 2 | 2 | z | 2 | 05 | μ | o | p | CZ | o* | O | ||||
| co >- O | -J ΙΛ > O | 03 O | u > O | -I w o | O | u > O | J o | d | o _) o I | u o | U M >™ O | | | υ | J | U | cd | d | i4 O ad Z | 8 U | > Q H o | o F o | O Ι- Ο | |||
| cd | cd | cd | cd | cd | cd | cd | cd | z | cd | cd | cd | cd | cd | od | cd | cd | cd | od | cd | cd | Łd | z | z | ||
| o | o | o | © | o | o | o | o | o | o | o | o | nt | nt | nt | nt | H- | 3 | »o | V | V | r- CN | C CM | r- <N | ||
| cn | cn | m | cn | cn | cn | en | en | en | m | en | cn | so | SO | so | so | so | so | ||||||||
| O | O | - | - | o | o | O | O | - | - | - | - | O | o | O | CN | ||||||||||
| Os | Os | Os | V | Φ | o | nt | V | oo | r~- | oo | CN | o | Os | θ'. | Ν’ | 00 | SO | o | © | © | © | ||||
| CN | m | 00 | o | — | Os | SO | so | sO | »— | cn | o | v> | S. | cn | o. | VI | cn | cn | Os | V | |||||
| o | Φ | o | 7 | 1 | 1 | O | OO | rn 1 | 9 | CM | cn | m | <4 | V? | T1 | 1 | T | vn | CM | 1 | m 1 | cn | |||
| OO | oo | s | § | 00 | OC | OO | oo | Γ- | SO | S | O | r- | SO | Γ- | Γ- | Os | CN | CN | OO | 00 | Os | ||||
| Os | Os | nt | nt | cn | m | nt | CN | O | oo | cn | O0 | cn | OO | O | ΓΜ | CM | 0s | cr. | OO | ||||||
| V | V | oo | oo | V | V | nt | nt | oo | nt | V | V | Os cn | <N | CN | nt | 00 | r- | n- | Os | n- | Os | © | |||
| s© | so | so | SO | Ό- | SC | r-γ | OS | CM, | (N | nt | nt | SO | SO, | sq | «Ί | SO | 00 | SO | r*F | t~- | oo | ||||
| CN | CM | d | cJ | OS | Os | Γ' | r~- | m | cn | cn | d | r~ | fi | 00 | CN | r- | o | r- | ΓΜ | CM | ó | ||||
| Γ-- | oo | oo | CN | CM | cn | cn | V | Os | 3 | 3 | 3 | Os | rn | Os | m | cn | V | cn | CM | cn | |||||
| cn | m | cn | cn | TT | M- | Tf | 'T | o | ΓΜ | Os | O | nt | V | V, | 00 | n- | SO | N | V | V | |||||
| CM | CM | CM | CM | CM | |||||||||||||||||||||
| o | en | oo | r-i | cn | CN | oo | V | o | CM | CN | SO | nt | r- | 00 | so | oo | CN | r- | Os | sO | |||||
| oo | o | Ή- | Ό | cn | cn | CN | nt | 0O | 3 | cn | o | o | sO | Ό | τΓ | r~- | s; | sO | cn | ||||||
| V | SU | oo | oo | VI | v> | nr | nt | so | m | nr | Ol | CN | CN | 3 | 0 | r~ | CM | OO | m | o | |||||
| o | SO | so | SO | so | so | r- | Γ~- | CTs | CN | ΓΜ | n- | nt | so | so | CN | SO | oo | Γ- | r- | 00 | |||||
| CN | CM | O | o | os | o. | r- | r- | 1—4 | rn | m | m | o | ri | Γ | oo | V | ΓΜ | r* | o | Γ- | CM | CM | o | ||
| Γ-* | r> | oo | oo | ΓΜ | CM | cn | cn | V | Os | 3 | nt | nt | Os | m | os | m | VI | m | CM | ΓΝ | cn | ||||
| cn | m | cn | cn | n· | 'ł | Ή· | o | CM | so | O | O | o | nt | V | V | oo | n- | so | n- | V | V | V | |||
| CN | CM | CN | <N | (N | - | - | |||||||||||||||||||
| + | + | + | + | + | 4- | + | 4- | 4- | + | + | + | 4 | 4- | + | + | 4- | 4- | 4- | + | + | + | + | + | ||
| CN | CN | CN | CN | CN | CN | cn | cn | cn | nt | cn | cn | CN | CM | CN | cn | cn | cn | cn | cn | cn | cn | cn | CN | cn | |
| Q | o | Q | Q | Q | Q | o | o | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | 3 | o | o | o | n | o | Q | O | o | |
| U | U | (J | u | U | U | U | U | U | O | U | U | I—1 | o | U | o | ||||||||||
| X | U | X | U | X | U | X | O | X | X | X | O | X | X | X | X | E | X | u | X | E | U | X | CJ | X | |
| V | so | r- | OC | σ- | © | CM | m | nt | K) | SO | r- | 00 | Os | O | CN | cn | 'Tt | V | SO | r- | 00 | ||||
| CM | CN | (N | CN | CN | CN | en | cn | m | cn | rn | m | cn | cn | cn | m | n- | Ν' | n- | n- | n- | n- | n- |
PL 226 828 B1
NEMi Fragmentańon of&LAAAMK
Found in 47, liaozym
Nfetch to Query 356:94045212S from(471.2333402+) intensit^i 544242.0000)
Tilie: 216: Sum of S seans in rangę 3979 (rt=1300.25) to 4012 (rt=1310.65) [O RE. 1012giudzi en' 012171746buch_d_cid.raw]
Data fite V212.S7.29.243 dane RAWOATAOT mg i 1012)012171746buch_d_admgf
Clicie mouse within plot area to zoom in by factor of twoabout that point
Or, 1 Ptotfrorn*] 10C to eso Da [ Fuli rangę {
Monoisotapic mass of neutrnl peptide Mr (cale) : 940.4510
Vatiable πκκίιίlcatiori :
Cl : Pyridylethyl (C>
Ions Scorc: 31 Eatpect: 0.00071
Katch.es (E-old Hed) : 12/56 fragment ionn using 22 mort intenae peaka
| # | b | b** | b® | b®^ | Seq. | y | y* | v*~ | y® | y®~ | # | |
| 1 | 209.0743 | 105.0408 | C | a | ||||||||
| 2 | 338J169 | 169.5621 | 320.1063 | 160.5568 | E | 7333913 | 367.1993 | 716.3647 | 358.6860 | 715.3807 | 358.1940 | 7 |
| 3 | 4512010 | 226.1041 | 433.1904 | 217.09 SS | L | 6043487 | 302.6780 | 587.3221 | 294.1647 | 6 | ||
| 4 | 5221381 | 261.6227 | 504.2275 | 2526174 | A | 4912646 | 246.1360 | 474.2381 | 237.6227 | 5 | ||
| S | 5932752 | 297.1412 | 5752616 | 2SS.1360 | A | 4202275 | 210.6174 | 4032010 | 202.1041 | 4 | ||
| 6 | 6643123 | 332.6598 | 646.3017 | 323.6545 | A | 349.1904 | 175.0988 | 332 1639 | 166.5856 | 3 | ||
| 7 | 7953528 | 39S.1S00 | 777.3422 | 339.1748 | M | 278J533 | 139.5803 | 261.1267 | 1310670 | |||
| 3 | K | 147J128 | 74.0600 | 130.0863 | 65.5468 | 1 |
PL 226 828 B1
MS MS Era girę raa Eon of WWCTOłGR
Found in 47, tizoiym
Mitch to Quey 5«; 1040.423308 ftwn<511 218960» bKMStę< 1423 83 72.0000)
TMe: 635: Sumer3 seans inran^ 3500{it=16132T)to3520(it=I62224) [O:\RE· 1012-gnxbien'4)lI171'745ł«Kh 6 hcdS.raw] Data me\\212472».3«34lam''itAt0DATA'OTmsf40124>1217n4SlMett_dJic<ffi.iii/ aide mouse within plot arna to zoom in by fa: tor of two ibout dat point
Or. [ FMłra 1 100 c 950 Da . FairansE
B Τ’
I | L. ,.,ίΐΐ.Ι..,.. .III I | ii.łIj,^ i 1 .(im. i i ,—Ł r 1111 ι. i n j 11.....J.-.I. ,·.ι„—.,... , . ... I. I j .. I I li , .1..1^ .1, ... .1 mso zen asa 400 gw βίο ιοβ »»
Monalaotoplc Łiso ar neutial paptidia Ma(cale): 1040.4297
V«c labie nodlfluŁlongi
C3 : Pjrl-dyletJlyl (C) lana Saara: 31 Erpacr: 0.0 00 48
Kaccbaa (Bold Rad) i 3/54 fragwant iona uamg 5 maac luLajiaa paaka
| 4 | b | b** | b* | bł++ | *** | s*a- | T | 7* | 7* | 7*^ | 7* | y·** | s | |
| J | 187.0866 | 94.0469 | W | 7 | ||||||||||
| 2 | 373.1659 | 187.0866 | W | 8553566 | 428.1820 | 8383301 | 419.6687 | 8373461 | 419.1767 | 6 | ||||
| 3 | 5812329 | 291.1201 | c | ¢692 773 | 335.1423 | 6522508 | 326.6290 | 6512668 | 326.1370 | 5 | ||||
| 4 | 6952759 | 348.1416 | 6782493 | 339.6283 | N | 4612103 | 131.1068 | 444.1837 | 222.5955 | 443.1997 | 2221035 | 4 | ||
| 5 | 8103028 | 405.65» | 7932763 | 397.1418 | 7922922 | 396.6498 | D | 347.1674 | 174.0873 | 330.1408 | 165.5740 | 329.1568 | 165.0620 | 3 |
| 6 | 867 3243 | 434.1658 | 8502977 | 425.6525 | 8493137 | 425.1605 | G | 232.1404 | 116.5738 | 215.1139 | 108.0606 | 2 | ||
| 7 | R | 175.1190 | 88.0631 | 158.0924 | 79.5498 | 1 |
P r z y k ł a d 8
Hydrolityczna deglikozylacja białka modelowego z następczą demetalacją mg AgNO3 rozpuszczono w 300 μl wody dejonizowanej i wymieszano z 700 μl trifluoroetanolu. Do bezbarwnego roztworu o pH 3 wprowadzono przy silnym wstrząsaniu 2 x 50 μl pirydyny (pH 7,1), a następnie 3 μl trietyloaminy (pH 8,6) uzyskując 0,2 M alkaliczny roztwór AgNO3. Do 320 μl tego roztworu wkroplono 80 μl wodnego roztworu białka modelowego zawierającego 0,5 mg liofilizowanego preparatu białka modelowego. Próbę inkubowano w temperaturze 40°C bez dostępu światła przez 2,5 godz. Następnie do roztworu wprowadzono 13 mg DTT co spowodowało wytrącenie ciemnego osadu, który usunięto przez odwirowanie. Klarowny, bezbarwny supernatant (pH 5) zakwaszono TFA do pH 4,2 i poddano dializie (MWCO: 3500 kDa) wobec wody dejonizowanej o pH 4,2.
P r z y k ł a d 9
Znakowanie odblokowanych grup tiolowych białka za pomocą 4-winylopirydyny
Do 0,9 ml roztworu białka po dializie (pH 4,2), otrzymanego jak w przykładzie 8, wprowadzono
475 mg mocznika i po jego rozpuszczeniu (v = 1,25 ml, pH 5,4) dodano 100 μl metanolu, w którym rozpuszczono 3,6 μl 4-winylopirydyny. W mieszaninie widoczne było lekkie zmętnienie, które nie zniknęło po dodaniu 36 μl metanolu i 50 μl acetonitrylu. pH mieszaniny podniesiono z wartości 6 do 6,9 za pomocą 20 μl pirydyny. Reakcję alkilowania grup tiolowych białka prowadzono bez dostępu światła w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, po czym za pomocą TFA zakwaszono próbę do pH 4,6 i poddano dializie (MWCO: 3500 kDa) wobec wody dejonizowanej o pH 4. Roztwór białka po dializie zliofilizowano i poddano standardowej trypsynolizie jak w przykładzie 2 z następczą standardową analizą LC/MS/MS z fragmentacją CID/HCD. Identyfikacji peptydów wraz z ich modyfikacjami dokonano
PL 226 828 B1 poprzez analizę MASCOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search.
W wyniku analizy spektrometrycznej wykryto znacznik PE w trzech pozycjach cysteiny: C6 (w peptydzie o sekwencji: CPEELAAAMK), C30 (w peptydzie o sekwencji GYSLGNWVCPEAAK) i C115 (w peptydzie o sekwencji: CPEKGTDVQAWIR).
P r z y k ł a d 10 mg liofilizatu mieszaniny modelowych peptydów, uzyskanego wg standardowej procedury jak w przykładzie 2, poddano procedurze hydrolitycznej deglikozylacji i demetalacji w warunkach jak w przykładzie 3. Po odwirowaniu wytrąconych kompleksów srebra z DTT, pH roztworu podniesiono do wartości 6,5 za pomocą trietyloaminy, a następnie wprowadzono 12 μl 4-winylopirydyny. Reakcję alkilowania grup tiolowych prowadzono bez dostępu światła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie roztwór rozcieńczono wodą do uzyskania ok. 5% stężenia DMSO i zakwaszono TFA do wartości pH 3. Do 7 ml roztworu wprowadzono 2 mg mezoporowatego materiału krzemionkowego MCM-41 i zawiesinę umieszczono na 2 godziny na wstrząsarce rotacyjnej (600 rpm) w temperaturze pokojowej. Następnie fazę stałą oddzielono przez odwirowanie (5 min, 12 000 rpm), a zaadsorbowane peptydy wyodrębniono poprzez ekstrakcję stosując następujące odczynniki:
4% TFA: 40 μl TFA + 960 μl wody dejonizowanej mieszanina ekstrakcyjna 1: 500 μl acetonitrylu + 250 μl wody + 250 μl 4% TFA mieszanina ekstrakcyjna 2: 500 μl trifluoroetanolu + 250 μl acetonitrylu + 250 pl 4% TFA
Przeprowadzono trzykrotną ekstrakcję (2 x mieszaniną 1 + 1 x mieszaniną 2) przez silne wytrząsanie próby (vortex, 1000 rpm) w czasie 5 min. w temperaturze pokojowej. Połączone porcje ekstraktu wysuszono w koncentratorze próżniowym, następnie poddano analizie spektrometrycznej LC ESI MS/MS z następczą analizą bioinformatyczną za pomocą przeszukiwarki MASCOT wobec sekwencji lizozymu i z wykorzystaniem trybu pracy error tolerant search.
W wyniku analizy spektrometrycznej wykryto znacznik PE w trzech pozycjach cysteiny: C6 (w peptydzie o sekwencji: CPEELAAAMK), C30 (w peptydzie o sekwencji GYSLGNWVCPEAAK) i C64 (w peptydzie o sekwencji: WWCPENDGR)
P r z y k ł a d 11
Bezpośrednia detekcja S-glikozylowanych peptydów z wykorzystaniem zastępczej spektralnej biblioteki peptydów S-znakowanych
Spośród wszystkich widm tandemowych CID, HCD uzyskanych w sposób opisany w przykładach 5, 7 i 10 wyodrębniono widma tandemowe peptydów S-znakowanych i utworzono w ten sposób tzw. zastępczą bibliotekę spektralną. Z zastępczej biblioteki spektralnej dla przykładowego peptydu X: GYSLGNWVCAPTAAAK o masie cząsteczkowej 1437,7438 Da oraz dla peptydu W: GYSLGNWVCPEAAK o masie cząsteczkowej 1372,6598 Da wyselekcjonowano zbiór diagnostycznie użytecznych przejść fragmentacyjnych (ang.: transitions) i jonów przejściowych (ang.: product ions) T1-T5 i w ten sposób utworzono subbiblioteki przejść fragmentacyjnych przedstawione w tablicach A i B.
W tablicy A przedstawiono przejścia fragmentacyjne peptydu X wybrane na podstawie widma 1_CID i widma 2_HCD. W tablicy tej znaczkiem *) oznaczono wartości obserwowane w zakresie +/0,6 Da od teoretycznej wartości uzyskanej w analizie
MASCOT i podanej w tabelach pod widmami. Dokładna obserwowana wartość m/z dla tego jonu może być odczytana z pliku RAW odpowiedniego widma tandemowego.
W tablicy B przedstawiono przejścia fragmentacyjne peptydu W wybrane na podstawie widma 3_CID i widma 4_HCD. Symbol ** w tej tablicy ma wyżej podane znaczenie.
PL 226 828 B1
Tablica A,
| JonT | przejścia fragmentacyjne [MHn]n+^ (y,b)z+ | m/z jonu przejściowego T [Da] | |
| 1 | [MH2 - APTAJ++ | Obliczone: | 634,3040 |
| 2 | [MH-APTA]+ | Obserwowane*: | 1267,6001 l0 |
| 3 | [MH2]++ -> b3+ | Obserwowane*: | 308,1241 |
| 4 | [MH2]++ b8+ | Obliczone: | 877,4873 |
| 5 | [MH2]++ ->y3+ | Obserwowane*: | 289,1870 |
Tablica B
| Jon T | przejścia fragmentacyjne [MHn]n+-> (y,b)z+ | m/z jonu przejściowego T [Da] | |
| 1 | [MH2-PE]++ | Obliczone: | 634,8086 |
| 2 | [MH-PEJ+ | Obserwowane*: | 1268,6098 |
| 3 | [MH2 ]++ -> b3+ | Obserwowane*: | 308,1241 |
| 4 | [MH2 ]++ -> b8+ | Obserwowane*: | 877,4873 |
| 5 | [MH2]++ y3+ | Obserwowane*: | 289,1870 |
PL 226 828 B1 ——-*—--5—-ϊ”
478.2296
239.6185
860.3937
859.4097
111 0497
308.1141
4212082
211.1077
1292.6456
646.8264
1275.6191
638 3132
1274.6350
637.8212
218.1499
109 5786
58 0287
5180
1381 7297
691.3685
1364.7031
403.197«
202 1024
1131 6343
566.3208
1114.6078
557.8075
4602191
230.6132
509.7788
1001 5237
501 2655
296.6399
287.6346
481 2680
944.5022
472.7348
778.3519
389.6796
761.3253
381 166)
760.3413
3SO.6743
847.4859
424.2466
6304593
415.7333
877.4203
4302085
644 3800
322.6936
562.3381
281.6727
545.3116
273.1594
289.1870
145.0972
272 1605
1365839
201 1234
101.0653
147 1128
74.0600
WIDMO 1 CID jon prekursorowy [MH2J++ 719,8801 Da jon przejściowy T2: [MH-APTAJ+ 1267,6001 Da
HoDolacŁopla *ua of neotral pepttde Mr(oala) : H37.S43S Varlabie Modliloatloft*:
C9 : QAT CC) ' lena Seere: 32 Xxpeet: 0.001
Matclwe (Sold Red]: 30/100 fragment lone -uaing C3 wm lntenae peske
I-* Ϋ3
GYS i LG NWWV Capta|AAK ba *—bg *—'
121X6663
609.SJ68
12016398
601.3235
12006558
600 8315
1150.5714
575.7893
1133.5448
567.2761
1132.5608
566.7840
12216085
611.3079
1204.5819
602.7946
1203.5979
602.3026
130 0863
655468
WIDMO 2_HCD jon prekursorowy [MH2J++ 719,8816 Da jon przejściowy T2: [MH-APTA]+ 1267,6001 Da
GYSiLGNWWVCaptaiAAK
MH
ΑΡΤΑ]
MH2 - N(Me)3]++
[MH - APTAJ+
Sś
Μοηοϊaotopic mas· of nantral peptide Itr (ca la) i 1437.7439 Varlabie eodlfleatlona:
C9 : (JAT (C] łona Soore: 17 £jqpect; 0.013
Katches (Sold Red]; 19/100 fragment lana ualng 4< most intenae peaka
| T | g | b«. | b- | b... | b | Sk,. | — y | r~ | }-· | Ϊ* | ł*~ | 0 | ||
| 1 | 58.0287 | 29.51SO | C | 12 | ||||||||||
| 2 | 221.0921 | 111.0497 | ¥ | 13817297 | 691 3685 | 1364.7031 | 682.8552 | 13637191 | 682.3632 | 11 | ||||
| 3 | 30B.1241 | 154.5657 | 290.1135 | 145,5604 | s | 12186663 | 609.8368 | 1201.6398 | 601 3235 | 1200.6558 | 600.8315 | 10 | ||
| 4 | 421.2082 | 211 1077 | 403.1976 | 202 1024 | L | 11316343 | 566.3208 | 1114.6078 | 557.8075 | 9 | ||||
| 5 | 478.2296 | 2396185 | 4602191 | 230.6132 | c | 1018,5502 | 509.7788 | 1001.5237 | 501.2655 | 8 | ||||
| 6 | 592-2726 | 296.6399 | 575.2460 | 288 1266 | 574.2620 | 287.6346 | N | 961.5288 | 4812680 | 944 5022 | 472 7548 | 7 | ||
| 7 | 778.3519 | 389.6796 | 761.3253 | 381.1663 | 760.3413 | 380.6741 | W | 847 4859 | 424.2466 | 830.4593 | 415.7333 | 6 | ||
| 8 | 877,4203 | 439 2138 | 860 3937 | 430.7005 | 859 4097 | 430.2085 | V | 661.4065 | 331 2069 | 644.3800 | 322.6936 | 5 | ||
| 9 | 1150.5714 | 575-7893 | 1133,5448 | 567 2761 | 1132 5608 | 566,7840 | c | 562.3381 | 281.6727 | 545.3116 | 273.1594 | 4 | ||
| 10 | 1221.6085 | 611.3079 | 12045819 | 602.7946 | 12035979 | 602.3026 | A | 289.1870 | 145.0972 | 272.1605 | 116.5839 | 3 | ||
| 1) | 1292 6456 | 646 8264 | 1275 6191 | 638.3132 | 1274,6350 | 637.8212 | Λ | 218.1499 | 109.5786 | 201.1254 | 101 0653 | 2 | ||
| 12 | K | 147.1128 | 74 0600 | 130.0863 | 65.5468 | 1 |
PL 226 828 B1
WIDMO 3_CID jon prekursorowy [MH2J++ 687,3374 Da jon przejściowy T2: [MH-PE]+ 1268,6098 Da
Hoiiol »otopic u·· of rwa trel peptłd· Hr(caJo) ; 1372,¢59(
Varlabie aodiftaatlona;
C9 ; Pyrldylethyl <C>
lwu S-OOt-β: 65 £xp«ct: 3.5«-07
KaLchea (lk>14 fced); 23/200 fraę*ent lor.a uainfl 3? noac imana* paaka
| b | b** | V | b*4* | b»~ | S«j. | > | }* V*” | yfrH | # | |||
| i | 58 0287 | 295180 | g | 12 | ||||||||
| z | 221.0921 | 111 0497 | V | 13166456 658.8264 | 1299 6191 050.3132 | 1298 6350 649 8212 | ||||||
| 3 | 208.1241 | 154 5657 | 296.1135 145 5604 | $ | 1153.5823 577.294# | 1136 5557 568,7815 1135.5717 568,2895 | 10 | |||||
| 4 | 421.2082 | 211 1077 | 403.1976 202.1024 | L | 1066.5502 533,778# | 1049,5237:525 2655 | 9 | |||||
| 5 | 478 2296 | 2396185 | 460 2191 | 230.6132 | G | 953.4662 477,2367 | 936.4396 468 7235 | 8 | ||||
| « | 592.2726 | 2966399 | 575.2460 | 288 1266 | 574 2620 | 287.6346 | N | 896.4447 448 7260 | 8794IS2 440 2127 | |||
| 7 | 778 )519 | 3896796 761.3253 | 381 1663 | 760 3413 | 3806743 | w | 782.4018 3917045 | 765 3752 383 1913 | « | |||
| S | 877.410.» | 4392138 | 860.3937 | 430.7005 | 8594097 430 2085 | V | 596-3225 296 6649 | 579 2959 290.1516 | 5 | |||
| 9 | 1085.4873 | 54) 247) 1068,4605 | $34 7340 | 1067 4767 534,2420 | c | 497.2541 249.1307 | 480.2275 2406174 | 4 | ||||
| id | 1156.5244 | 578 7659 1139.4979 | 570 2526 | 1138 5 i 39 <69.7606 | Λ | 289,1870 145.0972 | 172.1605 136 5839 | 3 | ||||
| 11 | 1227.5615 | 614.2844 1210.5350|605 7711 | 1209 5510 605,2791 | Λ | 218.1499 109.5786 | 201 1234 101 0653 | r | 2 | ||||
| 12 | —........ | _______ | K | 147 1128 74.0600 | 1)0 0863: 65 3468 | 1 |
WIDMO 4 HCD jon prekursorowy [MH2J++ 687,3363 Da jon reporterowy PE+
106,0651 Da
Dla obydwu peptydów X i W, o tej samej sekwencji i różnej modyfikacji na cysteinie, wybrane przejścia fragmentacyjne [MHn]n+ > (y, b)2+ są (w granicach błędu pomiaru) jednakowe co do wartości m/z, ponieważ nie obejmują miejsca S-znakowania. Następnie w eksperymentalnej bibliotece widm tandemowych CID, HCD uzyskanych dla peptydów mieszaniny modelowej, które przedstawiono w tablicach 1-6 dołączonych do przykładu 1, poszukiwano jonów przejściowych T1 - T5. Sygnały te odnaleziono dla peptydu Y o masie 1429,6548 Da i zestawiono w Tablicy C.
PL 226 828 B1
Tablica C przedstawia przejścia fragmentacyjne peptydu Y: GYSLGNWVCPTMAAK wybrane na podstawie widma 5_CID i widma 6_HCD, a symbol w tej tablicy ma wyżej podane znaczenie
Tablica C
| Jon T | przejścia fragmentacyjne [MHn]n+-> (y,b)z+ | m/z jonu przejściowego T [Da] |
| 1 | [MH2-PTM]++ | “Obserwowane: 634,8075 |
| 2 | [MH-PTM]+ | * Obserwowane: 1268,6077 15 |
| 3 | [MH2 ]++ b3+ | “Obserwowane: 308,1241 |
| 4 | [MH2 ]++ -» b8+ | “Obserwowane: 877,4873 |
| 5 | [MH2]-H- y3+ | “Obserwowane: 289,1870 |
PL 226 828 B1
[MH2-PTM}++ §
Μοαο 1·οtopie mm of neatral peptlde Mr(oalo) : 1429.(Ml varial>l» eodlftoation»:
¢9 : S-O-SU (CJ lwu Scere: 60 Eagpeot: l.fe-Oi
Matebea (Bold Red) : 25/100 frageane lor.» uajjifl 36 seo»r metru» paaks
| # b | b~ 1* 8-« b° b> S«,. y jr~ >* y-« ,♦ | |||
| ! » | 5* 0287 | 29-5180! | 1 | j G [ | U; | |
| fj | 221.0921)] 11.0*97 j | [ V 1373,6*06:687.3239 135β.«14θ!φ78βΙΟτ[ΐ355 6300 | 678 3186 11) | ||
| 3 | 308.1241,154.5657' 29Ο.113ί]Ϊ45.56Ο4 S 1210.5773 *05.7913 2193 $507[597.2790 |i 192.5667 | 596.7870 10 | ||
| 14 | 421.2082 | 211.1077 ) 403.1976 202 1024 L 1123.5452 562.2762!1106.51S7|553.76M | 9 | |
| (i | *78.2296 239.61*5 *60.2191 [2306132 G 1010.4612:505.73*2 993.4346)497.22091 | 8 | ||
| 6 | 592 2726 296-6399 575.24« 2*8 1266 i 57* 2620)2*7.63*6; N 953.4397 477.2235 936.41311*68 7102 | η | ||
| i 7 | 778.3519 389-6796 761J2S3 381.1663 760 3413(3*0.67*3 W *393968)420 2020 822.3702 *11 6887 | 6 | ||
| • | 877.4203 4392138 860J937 430.7005 859.4097 *30.2085 V 653,3175 327.1624 636 2909 318 6491 | 5 | ||
| 9|l 142 4923 | 571.7448 1125.4557 563.2315 1124.4717:562.7395 C 554.2490 277.6282 537.2225 269.1149 | 4 | ||
| 1»| 1213.519* | 607,2633 1196 4929 59S 7501 1195 5088 $98 2581 A ) 2891870 145.0972 · 272.1605 136.5839) | i | ||
| 11 1284 .5565 | 642 7819 1267 5300 634.2686 1266.5459 633.7766 A 218.1499 109.5786 201.1234'101.0653 | 2 | ||
| K 147.1128 74.0600 130.0863 ) 65.5468 | 1 |
Monetaotoplo w»»» of neatral peptide Hr(oalo); 1429.6546
Va.r labie eodlfiaatlona:
C9 : S-D-Giu (C) łona Soora; 15 Łicpoot. 0.13
Matcho· (Bold Red)j 13/100 frageent łona u»lng 51 no»t inten»» peeka
| tt | b | y* | / i# | ||||
| i 1 | 58.0287 | 29.5180! | G [ | 12, | |||
| 2 | 221.0921 | 111 0*97 | V 1373.6*06 687.3239 1356.6140 | 67S.S107 1355 6300 678.3186 11 | |||
| 308.1241 | 154.5657 | 290.1135 Ί 45.5604 | S 1210.5773 605 7923 1193 5507 | 597.2790 1192 5667 596 7870' 10 | |||
| 4 | 421.2082 | 211.1077] | 405.1976'202.1024 | L 1123.5452 562.2762)1106.5187 | 553.7630 | (9 | |
| 5 | 478.2296 | 239.6185: | *60 21911230,6132 | G Ί010.4612 505.7342! 993.4346 | 497.2209 | [ij | |
| ) 6 | 592.2726 | 296.6399 575.2460 | 288.1266 | 574,2620)287.63*6 | Pi 953 4397 4772.235! 936,4131 468 7102 | ?i | |
| 7 | 778.3519 | 389.67«) 761.3253 | 381.1663 | 760.3413:380.6743 | W 839.3968 *20.2020 822.3702)411.6887 | β | |
| 8 | 877.4203 | 439.2138 : 860.3937 | 430.7005 | 859.4097 430.2085 | V 653.3175 327.162* 636.2909 3186*91 | i i | |
| 9 | 1142.4823 | 571 74*8:1125 4557:563 2315 | 1124 4717 562 7395 | C 5542490 277.6282 | 53T.222S|269.1149 | η | ||
| 10 | 1213.5194 | 607.2633 i 1196.4929 598 7501 | 1195.5088 598.2581 | A 289.1870 145.0972 ) 272.1605)136.5839 | ! 3 | ||
| P | 1284.5565 | 6*2.7819 1267.5300 634.2686 | 1266.5459.633.7766 | A 218.1499 109.5786) 201.1234:101.0653 | 1. | ||
| !u| | K 1472128 74 0600! 130.0863 | 65 5*68 | i 1 li |
PL 226 828 B1
W widmach tandemowych CID/HCD poszukiwanego peptydu Y obserwuje się jony przejściowe T - T5, które pochodzą z jonu prekursorowego M(PTM). Natomiast jony przejściowe T1 - T5 peptydów X oraz W wywodzą się z jonów prekursorowych cząsteczki M(Tag) odpowiednio M(Tag) = M(APTA) oraz M(Tag) = M(PE). Oznacza to, że odszukany peptyd Y ma taką samą sekwencję jak peptydy X i W z biblioteki zastępczej, ale inną modyfikację PTM na cysteinie. Wielkość PTM można wyliczyć z następujących zależności:
M(PTM) - PTM = M(Tag) - Tag
PTM = M(PTM) - M(Tag) + Tag
W rozpatrywanym przykładzie obliczeń dokonano w oparciu o dane z widma 3_CID oraz z widma 5_CID.
PTM = M(PTM) - M(PE) + PE = 1429,6548 - 1372,6598 + 105,0578 = 162,0528 Da. Uzyskana wartość PTM = 162,0507 Da wskazuje na obecność S-glikozylacji peptydu heksozą. W bazie danych Unimod monoizotopowa masa dla modyfikacji heksozą wynosi: 162,0528 Da. Na glikozylację wskazuje także intensywność jonu neutralnej utraty heksozy Tl w widmie 5 CID. Nieprzerwany ciąg jonów fragmentacyjnych y2 - y10 umiejscawia glukozylację na cysteinie, a wyklucza jej obecność na serynie. Identyfikacja rodzaju heksozy wymaga odrębnych rutynowych analiz.
Przedstawioną powyżej procedurę stosuje się dla innych S-znakowanych peptydów z biblioteki zastępczej. Pozwala ona na odszukanie S-glikozylowanego partnera spektralnego w widmach tandemowych próby badanej, określenie wielkość S-glikozylacji, a w niektórych przypadkach także potwierdzenie obecności S-glikozylacji poprzez analizę fragmentacji łańcucha peptydu z zachowaną modyfikacją na reszcie cysternowej. Takie podejście, pozwala także wykluczyć fałszywie pozytywne rezultaty znakowania miejsc S-glikozylacji na rzecz innej, określonej lub nieokreślonej modyfikacji reszty cysteinowej w peptydzie.
Claims (5)
1. Sposób detekcji S-glikozylowanych białek i peptydów wśród związków o ogólnym wzorze 1,
A1A2...[An]---Az
Wzór 1, w którym A1, A2, An, Az oznaczają reszty aminokwasowe, w tym reszty niosące syntetyczne lub naturalne potranslacyjne modyfikacje PTM, przy czym A1 oznacza aminokwas N-terminalny, Az - aminokwas C-terminalny, zaś An oznacza dowolny aminokwas wewnętrzny, w tym S-glikozylowaną resztę cysternową CG o strukturze przedstawionej we wzorze 2 w którym A1, A2, An, i Az mają wyżej podane znaczenie, zaś G oznacza poszukiwany nieznany, naturalny monosacharydowy lub oligosacharydowy glikan łączący się z łańcuchem peptydowym wiązaniem S-glikozydowym, przy czym cukier łączący może mieć strukturę piranozową lub furanozową, reszta CG może występować w łańcuchu jednokrotnie- lub wielokrotnie, a także zajmować pozycje terminalne 1 i z, znamienny tym, że próbę białek lub peptydów, z pro-SH modyfikacjami uprzednio zastąpionymi permanentnymi grupami blokującymi, poddaje się hydrolizie w środowisku woda- rozpuszczalnik organiczny lub mieszanina rozpuszczalników organicznych, zawierającym korzystnie nie mniej niż 50% objętościowych rozpuszczalnika lub rozpuszczalników organicznych, promowanej metalicznym tiofilowym kwasem Lewisa, korzystnie solą srebra (I), użytą w stężeniu 0,1-0,2 M, w obecności zasady organicznej, jak trzeciorzędowa amina alifatyczna, heterocykliczna amina aromatyczna lub ich mieszaniny, w temperaturze pokojowej lub podwyższonej korzystnie do 50°C i przy pH >7, korzystnie pH
PL 226 828 B1
8-9,5 ewentualnie w obecności detergentów kompatybilnych z jonami srebra jak dodecylosiarczan sodu lub chaotropów jak mocznik, roztwory po hydrolizie, zawierające peptydowe lub polipeptydowe tiolany srebra, poddaje się jednoczesnemu procesowi usunięcia nadmiaru jonów srebra oraz demetalacji w wyniku działania co najmniej stechiometryczną ilością związku silnie kompleksującego jony srebra, jak ditiotreitol, ditioerytritol, kwas 2,3-dimerkaptobursztynowy w temperaturze otoczenia, po czym usuwa się nierozpuszczalne kompleksy jonów srebra przez odwirowanie, względnie z roztworów po hydrolizie usuwa się jony srebra co najmniej stechiometryczną ilością jonów chlorkowych związków takich jak chlorki metali alkalicznych, odwirowuje osad chlorku srebra i próbkę poddaje demetalacji za pomocą wspomnianych wyżej odczynników kompleksujących jony srebra, użytych w ilości co najmniej stechiometrycznej w stosunku do teoretycznej molowej zawartości cysteiny w próbce, którą to próbkę, stanowiącą peptydy lub polipeptydy, poddaną dodatkowo oczyszczaniu jeśli stanowią ją polipeptydy, rozpuszcza w wybranym układzie buforowym dostosowanym do następczego procesu znakowania odblokowanych grup tiolowych za pomocą użytych z nadmiarem tiospecyficznych odczynników, jak maleimidowe odczynniki S-znakujące przy pH 4-9, winylopirydynowe odczynniki S-znakujące przy pH około 7, S-znakujące halogenki i akryloamidowe odczynniki S-znakujące przy pH >8, po czym próbkę peptydów lub polipeptydów ponownie oczyszcza się, jeśli stanowią ją S-znakowane polipeptydy poddaje dodatkowo trypsynolizie i następnie próbkę poddaje się tandemowej analizie spektrometrycznej, w wyniku której uzyskuje się bibliotekę eksperymentalnych widm i następnie na drodze bioinformatycznej identyfikuje S-znakowane peptydy, dla których z kolei konstruuje się zastępczą bibliotekę widm tandemowych i wywodzącą się z niej subbibliotekę referencyjną za pomocą której przeszukuje się bibliotekę widm eksperymentalnych i odnajduje S-glikozylowane peptydy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę stanowiącą polipeptydy poddaje się przed procesem znakowania dodatkowo oczyszczeniu w drodze dializy lub ultrafiltracji.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie hydrolizy jako zasadę organiczną korzystnie stosuje się trietyloaminę, pirydynę, N-metyloimidazol lub ich mieszaniny, zaś jako rozpuszczalniki organiczne reakcji hydrolizy stosuje się polarne rozpuszczalniki aprotonowe, jak dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid, dimetyloacetamid, N-metylopirolidon lub fluorowane rozpuszczalniki protonowe jak trifluoroetanol, heksafluoroizopropanol.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w procesie S-znakowania jako odczynniki S-znakujące stosuje się zwłaszcza związki wprowadzające grupę pirydyloetylową, (3-akryloamidopropylo)trimetyloamoniowąlub bimanylową.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymaną po S-znakowaniu mieszaninę polipeptydów oczyszcza się w drodze dializy prowadzącej do wymiany roztworu na bufor dostosowany do następnego etapu sposobu, zaś otrzymaną po S-znakowaniu mieszaninę peptydów oczyszcza się przez sorpcję na krzemionkowych materiałach mezoporowatych.
Departament Wydawnictw UPRP
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL397240A PL226828B1 (pl) | 2011-12-05 | 2011-12-05 | Sposób detekcji S-glikozylowanych białek ipeptydów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL397240A PL226828B1 (pl) | 2011-12-05 | 2011-12-05 | Sposób detekcji S-glikozylowanych białek ipeptydów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL397240A1 PL397240A1 (pl) | 2013-06-10 |
| PL226828B1 true PL226828B1 (pl) | 2017-09-29 |
Family
ID=48539559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL397240A PL226828B1 (pl) | 2011-12-05 | 2011-12-05 | Sposób detekcji S-glikozylowanych białek ipeptydów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL226828B1 (pl) |
-
2011
- 2011-12-05 PL PL397240A patent/PL226828B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL397240A1 (pl) | 2013-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6135710B2 (ja) | 分析用試料の調製方法および分析方法 | |
| Cordwell et al. | Technologies for plasma membrane proteomics | |
| AU2003249692A1 (en) | Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins | |
| JP6281349B2 (ja) | 質量分析用ペプチド混合物試料の調製方法 | |
| Ohkawa et al. | A glycosylated byssal precursor protein from the green mussel Perna viridis with modified dopa side-chains | |
| Moyer et al. | Leveraging orthogonal mass spectrometry based strategies for comprehensive sequencing and characterization of ribosomal antimicrobial peptide natural products | |
| Buchowiecka | Protein cysteine S-glycosylation: oxidative hydrolysis of protein S-glycosidic bonds in aqueous alkaline environments | |
| WO2016159291A1 (ja) | 分析用試料の調製方法および分析方法 | |
| EP3402894A1 (en) | Protein preparation by reduction of oxidized methionines | |
| PL226828B1 (pl) | Sposób detekcji S-glikozylowanych białek ipeptydów | |
| Spodzieja et al. | Interaction of serum amyloid A with human cystatin C—assessment of amino acid residues crucial for hCC–SAA formation (part II) | |
| Kan et al. | An improved method for the detection and enrichment of low-abundant membrane and lipid raft-residing proteins | |
| JP2020056727A (ja) | 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット | |
| Nahálka et al. | Targeting lectin activity into inclusion bodies for the characterisation of glycoproteins | |
| JP6742235B2 (ja) | 質量分析を用いたタンパク質の検出方法 | |
| WO2005075993A1 (en) | Selective labeling agent for phosphoproteome analysis and phosphorylated site analysis | |
| Rosenfeld et al. | Characterization of haptoglobin in the blood plasma of harbor seals (Phoca vitulina) | |
| CN110857936A (zh) | 分析用试样的制备方法、分析方法和分析用试样的制备用试剂盒 | |
| Kupčík et al. | Selective isolation of hydrophobin SC3 by solid‐phase extraction with polytetrafluoroethylene microparticles and subsequent mass spectrometric analysis | |
| CN105445358A (zh) | 基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的分析方法 | |
| Nagao et al. | Chemical synthesis of La1 isolated from the venom of the scorpion Liocheles australasiae and determination of its disulfide bonding pattern | |
| Nika et al. | N-terminal protein characterization by mass spectrometry after cyanogen bromide cleavage using combined microscale liquid-and solid-phase derivatization | |
| Kalkhof et al. | Determination of disulfide bond patterns in laminin β1 chain N‐terminal domains by nano‐high‐performance liquid chromatography/matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight/time‐of‐flight mass spectrometry | |
| Dong et al. | Toward Homogeneous Erythropoietin: Application of Metal‐Free Dethiylation in the Chemical Synthesis of the Ala79‐Arg166 Glycopeptide Domain | |
| KR100693111B1 (ko) | 인산화 단백질의 질량 분석 및 인산화 위치 분석용 표지물질 |