PL226349B1 - Pentapeptydy zawierające 3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo] alaninę, kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe pentapeptydy, kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjna i/lub grzybiczą.

Poszukiwanie przez człowieka nowych skutecznych leków jest nierozerwalnie związane z rozwojem cywilizacyjnym, który jest równocześnie jedną z przyczyn szerzenia się chorób, zwłaszcza zakaźnych. W walce z tymi chorobami od kilku dziesięcioleci stosuje się coraz liczniejsze antybiotyki. Stosowanie naturalnych antybiotyków (np. penicylin, tetracyklin itp.) jest jednak obecnie często z góry skazane na niepowodzenie, ponieważ w toku rozwoju ewolucyjnego mikroorganizmy wykształciły mechanizmy oporności. Ponadto powszechne stosowanie antybiotyków od połowy XX wieku spowodowało pojawienie się presji selekcyjnej, preferującej szczepy oporne, które się z czasem rozprzestrzeniły. Powoduje to rosnące trudności w antybiotykoterapii, w szczególności leczenie tzw. zakażeń szpitalnych. Dlatego też wciąż istnieje zapotrzebowanie na kolejne substancje o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Oprócz syntezy zupełnie nowych związków intensywnie prowadzone są także badania nad poszukiwaniem nowych antybiotyków peptydowych. Jedną z często stosowanych modyfikacji w tego typu peptydach w celu zwiększenia ich aktywności biologicznej jest wbudowanie niekodowanego α-aminokwasu, co powoduje iż otrzymane w ten sposób antybiotyki składają się z części białkowej i niebiałkowej. Przykładem takiego fragmentu niebiałkowego może być benzoksazol i jego pochodne (rys.), co związane jest przede wszystkim z licznymi doniesieniami literaturowymi na temat różnorodnej aktywności biologicznej związków zawierających fragment benzoksazolowy.

6'

R - grupa alkilowa lub arylowa lub funkcyjna Rys. Wzór strukturalny benzoksazolu wraz z numeracją atomów.

Pierścień benzoksazolowy jest obecny w naturalnie występujących związkach biologicznie czynnych, np. kalcimycynie (antybiotyku wytwarzanym przez Streptomyces chartreusensis) czy cezomycynie (antybiotyku zaliczanym do klasy kalcimycyn wyizolowanym z promieniowca Frankia), produkowanych przez Streptomyces sp. 517-02 metabolitach UK-1 (aktywność antynowotworowa) oraz UK-2 i UK-3 (aktywność przeciwgrzybicza) czy też alkaloidach, wyizolowanych z koralowca Pseudopterogorgia elisabethae czy gąbek morskich z gatunku Dysidea, wykazujących aktywność przeciwgruźliczą i/lub przeciwgrzybiczą oraz bakteriobójczą.

W literaturze przedmiotu można również znaleźć wiele przykładów prób zastosowania syntetycznych pochodnych benzoksazoli w medycynie, a ich skuteczność jest zwykle uwarunkowana obecnymi w cząsteczce danego związku podstawnikami. Liczna grupa pochodnych benzoksazoli wykazuje aktywność antybakteryjną w stosunku do bakterii gram-dodatnich (Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis) i/lub gram-ujemnych (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) oraz/lub przeciwgrzybiczą (Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida-6, Candida-51, Aspergillus niger, Aspergillus flavus), niekiedy wyższą niż stosowane leki kontrolne. Związki te mają więc stosunkowo szerokie spektrum działania, a wykazywana aktywność zależy głównie od rodzaju podstawnika w pierścieniu benzoksazolowym oraz jego miejsca podstawienia, przy czym szczególne znaczenie ma podstawienie w pozycji 2 i 5 (rys.). W stosunku do Pseudomonas aeruginosa, gram-ujemnej bakterii często opornej na konwencjonalne antybiotyki, 6-metylo-2-(2-chlorofenylo)benzoksazol (MIC=25 μg/ml), 5-fenyloacetamido-2-fenylobenzoksazol (MIC=25 μg/ml), 2-chlorobenzamido-2-fenylobenzoksazol (MIC=25 μg/ml) i 5-propyloksybenzamido-2-fenylobenzoksazol (MIC=25 μg/ml) są bardziej aktywne niż leki kontrolne - tetracyklina (MIC=50 μg/ml) i streptomycyna (MIC=100 pg/ml).

Podobnie 1-[2-(benzoksazol-2-ylo)etoksy]-2,6-bis(p-chlorofenylo)-3-metylopiperydyn-4-on (MIC= 6,25 μg/ml) jest bardziej aktywny w stosunku do Streptococcus faecalis niż penicylina (MIC=25 μg/ml) i streptomycyna (MIC=12,5 μg/ml). Natomiast jedną z pochodnych bardziej aktywnych w stosunku do

PL 226 349 B1 patogennych grzybów Candida-51, Aspergillus niger i Aspergillus flavus niż amfoterycyna B (MIC=25 μg/ml dla Candida-51 i 50 μg/ml dla A. niger i A. flavus) jest 1-[2-(benzoksazol-2-ylo)etoksy]-2,6-bis(p-metoksyfenylo)-3-metylopiperydyn-4-on (MIC=12,5 μg/ml dla Candida-51 i 25 μg/ml dla A. niger i A. flavus). Ponadto wbudowanie pochodnych benzoksazolu w strukturę antybiotyku glikopeptydowego mannopeptymycyny-β spowodowało wzrost aktywności większości otrzymanych związków w porównaniu ze związkiem niezmodyfikowanym. Wykazały one aktywność w stosunku do licznych szczepów Staphylococcus aureus (w tym opornych na metycylinę), szczepów Enterococcus (w tym opornych na wankomycynę) oraz Streptococcus (w tym opornych na penicylinę).

Wśród licznych chorób zakaźnych jedną z najbardziej rozpowszechnionych jest gruźlica wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis. Wiele osób jest nosicielami formy utajonej tej bakterii, która stanowi groźne źródło remisji choroby po zakończeniu terapii, dlatego też istnieje zapotrzebowanie na nowe klasy leków przeciwgruźliczych pozwalających całkowicie wyleczyć pacjentów bez konieczności wielomiesięcznego przyjmowania antybiotyków. Mogą się wśród nich znaleźć pochodne benzoksazoli, biorąc pod uwagę fakt, iż podstawione w pozycji 2 lipofilowe pochodne 5,7-di-tert-butylobenzoksazoli wykazały aktywność w stosunku zarówno do M. tuberculosis, jak i kilku oportunistycznych szczepów nie wywołujących gruźlicy (Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium 80/72 i 152/74), w stosunku do których pierwszy lek przeciwgruźliczy izoniazyd był nieaktywny. W przypadku leków przeciwgruźliczych duże znaczenie ma właśnie lipofilowość związku, co związane jest z bardzo małą przepuszczalnością błony komórkowej oraz bardzo grubą i ściśłą ścianą komórkową tych bakterii. W przypadku wspomnianych wyżej pochodnych benzoksazoli obecność grup tert-butylowych w cząsteczce zwiększa jej lipofilowość, przy czym zaobserwowano większy wpływ na aktywność tych związków ich struktury chemicznej niż lipofilowości.

Najbardziej aktywne w stosunku do badanych szczepów okazały się 5,7-di-tert-butylo-2-(pirydyn-4-ylo)benzoksazol oraz 5,7-di-tert-butylo-2-styrylobenzoksazol. Stwierdzono również, iż związki wykazujące aktywność w stosunku do szczepów niegruźliczych są równocześnie toksyczne w stosunku do ludzkich komórek jelita HTC-8. Aktywność w stosunku do M. tuberculosis CNCTC My 331/88, Mycobacterium kansasii CNCTC My 235/80 i 6509/96 oraz Mycobacterium avium CNCTC My 330/88 wykazują również pochodne 2-benzylosulfanylobenzoksazoli, przy czym aktywność ta rośnie, gdy w pierścieniu fenylowym obecne są podstawniki, zwłaszcza dwie grupy nitrowe lub grupa tioamidowa. Stwierdzono również, iż związki, w których podstawnik znajduje się w pozycji 4 fenylu są bardziej aktywne niż ich analogi z podstawnikiem w pozycji 3.

Pomimo stosunkowo licznych doniesień dotyczących aktywności przeciwdrobnoustrojowej pochodnych benzoksazoli brak jest w literaturze szczegółowych informacji na temat mechanizmu ich działania. Stwierdzono jednak, iż pierwszą fazą metabolizmu benzoksazolu i 2-metylobenzoksazolu w organizmie królika jest prawdopodobnie rozpad pierścienia oksazolowego (wiązanie C-O) pod wpływem łagodnej hydrolizy z utworzeniem odpowiednio o-formamidofenolu i o-acetamidofenolu.

Wynalazek stanowi pięć nowych pentapeptydów zawierających w sekwencji aminokwas niebiałkowy 3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaninę (Fig. 1). Związki te wykazują aktywność przeciwdrobnoustrojową w zakresie stężeń od kilku do kilkudziesięciu mikrogramów na mililitr (Tabela 1). Jeden z nich, H-Box(2Q)-His-lle-His-Met-NH2, jest selektywny i wykazuje aktywność wyłącznie w stosunku do drożdży Pichia pastoris. Natomiast pozostałe 4 pentapeptydy wykazują aktywność przeciwdrobnoustrojową w stosunku do bakterii Gram-dodatnich (Bacillus subtilis 168), w tym patogennych (Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus ATCC 25923) oraz drożdży (Pichia pastoris). Aktywność pentapeptydów jest porównywalna z aktualnie stosowanymi komercyjnie antybiotykami, jednak odmienna budowa chemiczna tych związków (zwłaszcza obecność fragmentu niebiałkowego opartego na szkielecie benzoksazolyloalaniny) powoduje, iż izolowane obecnie szczepy wielolekoopornych bakterii są wrażliwe na te związki. Stwierdzono, iż związki te wykazują znaczną aktywność w stosunku do 6 wielolekoopornych szczepów gronkowca złocistego (S. aureus) - izolatów klinicznych od pacjentów (Fig. 5). Ponadto stwierdzono, iż badane bakterie wielolekooporne nie nabywają oporności na wynalezione pentapeptydy przez ok. 150 pokoleń, z wyjątkiem związku H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH2 w stosunku do jednego szczepu (spadek aktywności o ok. 50%). Wyniki te wskazują na możliwość stosowania tych związków w terapii ciągłej bez zagrożenia szybkim uodpornieniem się niszczonych bakterii na stosowany antybiotyk. Ponadto pentapeptydy (H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH2, H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH2, H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH2) nie wykazują znaczącej cytotoksyczności w stosunku do prawidłowej linii komórek embrionalnych nerki Hek293 oraz nowotworowej linii komórek mysich fibroblastów A9 w zakre4

PL 226 349 B1 sie stężeń, przy których są one aktywne przeciwdrobnoustrojowo, co sugeruje, iż możliwe będzie bezpieczne stosowanie tych związków na organizmach żywych.

Zastosowany w pentapeptydach fragment niebiałkowy (pierścień benzoksazolowy) występuje stosunkowo często w różnego rodzaju związkach o aktywności biologicznej i również w tym przypadku jest źródłem tej aktywności, co zostało potwierdzone wcześniej w testach mikrobiologicznych na estrze metylowym 3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaniny. Połączenie pochodnej benzoksazolowej z łańcuchem peptydowym, zwiększa jej aktywność biologiczną jako substancji hamującej wzrost mikroorganizmów należących zarówno do prokaryota jak i eukaryota. Fakt, iż za wzrost aktywności związku odpowiedzialna jest obecność odpowiedniej sekwencji peptydowej został udowodniony w czasie badań na dipeptydach otrzymanych w wyniku modyfikacji grupy karboksylowej lub aminowej benzoksazolyloalaniny poszczególnymi aminokwasami białkowymi (z wyjątkiem cysteiny). Również dalsze badania, w wyniku których otrzymano z wykorzystaniem metod chemii kombinatorycznej biblioteki pentapeptydów (każda złożona z 6859 związków), dodatkowo to potwierdziły. W wyniki dekonwolucji bibliotek pentapeptydów wyselekcjonowano najbardziej aktywne sekwencje peptydowe, do których należą opisane pentapeptydy. Stężenie efektywne rzędu od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu mikrogramów na mililitr pozwala przypuszczać, iż możliwe jest zastosowanie tych związków jako antybiotyków.

Przedmiotem wynalazku są nowe pentapeptydy o wzorze ogólnym

H-Box(2Q) A1A2A3A4NH2 gdzie poszczególne podstawniki oznaczają:

H-Box(2Q) - oznacza: 3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaninę

A₁A₂A₃A₄ - oznacza His-Leu-His-Ile (1)

A1A2A3A4 - oznacza His-Leu-His-Phe (2)

A1A2A3A4 - oznacza Leu-Arg-Trp-Phe (3)

A1A2A3A4 - oznacza His-Ile-His-Ala (4)

A1A2A3A4 - oznacza His-Ile-His-Met (5)

Kompozycja farmaceutyczna, która zawiera nowy pentapeptyd opisany powyżej oraz co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik.

Kompozycja ta ma zastosowanie przeciwbakteryjne i/lub przeciwgrzybicze.

Zastosowanie nowych pentapeptydów określonych powyżej do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjną i/lub grzybiczą.

Zastosowanie nowych pentapeptydów określonych powyżej do wytwarzania środka leczniczego, który korzystnie wykazuje działanie przeciwbakteryjne na szczepy wielolekooporne w tym gronkowiec złocisty.

Zastosowanie nowych pentapeptydów określonych powyżej do wytworzania środka leczniczego korzystnie stosowanego w terapii ciągłej.

Nowe związki będące przedmiotem niniejszego wynalazku posiadają następujące zalety:

• Stosunkowo wysoka aktywność przeciwdrobnoustrojową (niskie wartości MIC - na poziomie stosowanych antybiotyków), • Aktywność w stosunku do patogennych szczepów bakterii Gram-dodatnich (zwłaszcza

S. aureus), w tym również w stosunku do szczepów wielolekoopornych - możliwość potencjalnego zastosowania związków do zwalczania tzw. zakażeń szpitalnych, • Wolne uodparnianie się patogennych szczepów bakterii S. aureus na związki - możliwość zastosowania w terapii ciągłej, • Brak stwierdzonej cytotoksyczności związków w stosunku do prawidłowej linii komórkowej w zakresie stężeń odpowiadających MIC, • Stosunkowo prosta metoda otrzymywania związków.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia wzory strukturalne pentapeptydów zawierających 3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaninę.

Fig. 2 - przedstawia schemat syntezy N-(tert-butoksykarbonylo)-3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaniny.

Fig. 3 - przedstawia uproszczony schemat syntezy pentapeptydów.

PL 226 349 B1

Fig. 4 - przedstawia żywotność komórek po inkubacji ze związkiem (Z2 = H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH Z10 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH₂, Z11 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH₂ 0 - D = kolejne rozcieńczenia związku).

Fig. 5 - przedstawia przykładowe płytki po inkubacji z wysianymi wielolekoopornymi szczepami gronkowca złocistego (435 (A), 128/0 (B), 1322 (C), 1863 (D)) i naniesionymi roztworami pentapeptydów w 96% etanolu (Z2 = H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH2, Z10 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-lIe-NH2, Z11 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH2, CM = chloramfenikol (komercyjny antybiotyk), EtOH = 96% etanol (rozpuszczalnik)). Kropki oznaczają miejsce naniesienia 1 μΐ roztworu o odpowiednim stężeniu (malejąco od prawej do lewej w liniach poziomych - dla Z2 (6 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,006 mg/ml), Z10 (8 mg/ml; 0,8 mg/ml; 0,08 mg/ml; 0,008 mg/ml) i Z11 (5 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,005 mg/ml)).

Fig. 6 - przedstawia płytki po inkubacji z wysianym wielolekoopornym szczepem gronkowca złocistego 435 i naniesionymi roztworami pentapeptydów w DMSO (Z2 = H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH2, Z10 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH2, Z11 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH2 435(k) szczep kontrolny, 435 12, Z10 lub Z11 - szczepy hodowane w obecności subletalnych ilości pentapeptydu odpowiednio Z2, Z10 i Z11). Kropki oznaczają miejsce naniesienia 1 μί roztworu o odpowiednim stężeniu (malejąco od prawej do lewej w liniach poziomych).

Fig. 7 - przedstawia płytki po inkubacji z wysianymi wielolekoopornymi szczepami gronkowca złocistego 128 i naniesionymi roztworami pentapeptydów w DMSO Z2 = H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-PheNH2, Z10 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH2, Z11 = H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH2 (k) - szczep kontrolny, 128 Z10 i 632 Z10 - szczepy hodowane w obecności subletalnych ilości pentapeptydu Z10). Kropki oznaczają miejsce naniesienia 1 μΐ roztworu o odpowiednim stężeniu (malejąco od prawej do lewej w liniach poziomych).

Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia

P r z y k ł a d

a) Synteza niebiałkowego aminokwasu

Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie niebiałkowego aminokwasu (N-(tert- butoksykarbonylo)-3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaniny) (Fig. 2) w oparciu o opisaną w literaturze procedurę opartą na oksydacyjnej cyklizacji zasady Schiffa przy użyciu czterooctanu ołowiu w dimetylosulfotlenku [Guzow et al, Tetrahedron 58 (2002) 2201]. Jako substrat stosuje się N-(tert-butoksykarbonylo)-3-nitrotyrozynę (1 eq.), którą rozpuszcza się w metanolu i umieszcza na mieszadle magnetycznym, po czym dodaje zawiesinę palladu na węglu aktywnym (10% - może być również 5%) w metanolu. Następnie przez mieszany roztwór przepuszcza się gazowy wodór przez ok. 3 h. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej, a jej postęp kontroluje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC, płytki pokryte żelem krzemionkowym Kieselgel 60 F254, Merck, wywoływanie chromatografów poprzez oświetlanie płytek promieniowaniem o długości fali 254 nm i 366 nm) w układzie rozwijającym chlorek metylenu : metanol : kwas octowy 100:10:1 (v/v/v) (Rf=0,91 (substrat), Rf=0,36 (produkt)). Po zakończeniu reakcji odsącza się katalizator na twardym sączku karbowanym, a przesącz odparowuje na wyparce obrotowej, uzyskując N-(tert-butoksykarbonylo)-3-aminotyrozynę w postaci brązowego oleju, który rozpuszcza się w bezwodnym etanolu i umieszcza na mieszadle magnetycznym. Do mieszanego roztworu dodaje się roztwór aldehydu 2-chinolinowego (1 eq.) w bezwodnym etanolu, w wyniku czego po kilku minutach wytrąca się drobny żółty osad zasady Schiffa. Reakcję prowadzi się przez ok. 24 h w temperaturze pokojowej, kontrolując jej postęp za pomocą TLC (układ rozwijający: octan etylu, Rf=0,80 (aldehyd), Rf=0,08 (zasada Schiffa)). Następnie na wyparce obrotowej odparowuje się rozpuszczalnik, uzyskując żółtobrązowe ciało stałe, które rozpuszcza się w DMSO. Do mieszanego za pomocą mieszadła magnetycznego roztworu zasady Schiffa dodaje się czterooctan ołowiu (1,5 eq.), w wyniku czego roztwór zmienia kolor z żółtego na ciemnoczerwony. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez ok. 1 h, kontrolując jej postęp za pomocą TLC (układ rozwijający: octan etylu, Rf=0,17 (produkt)). Następnie mieszaninę reakcyjną przenosi się do rozdzielacza, dodaje octanu etylu i nasyconego wodnego roztworu chlorku sodu, po czym rozdziela warstwy. Warstwę organiczną przemywa się 3x nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu, a następnie osusza za pomocą bezwodnego siarczanu magnezu. Następnie odsącza się środek suszący na sączku karbowanym o średniej twardości, a przesącz odparowuje na wyparce obrotowej, uzyskując ciemnobrązowy olej, który oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej, używając jako fazy stacjonarnej żelu krzemionkowego (Kieselgel 60, 0,040-0,063 mm, Merck), natomiast jako fazy ruchomej mieszaniny

PL 226 349 B1 octan etylu : kwas octowy 100:1 (v/v). Otrzymany produkt krystalizuje się z mieszaniny octan etylu : eter naftowy, uzyskując z 30% wydajnością N-(tert-butoksykarbonylo)-3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaninę (Boc-Box(2Q)-OH) w postaci kremowego ciała stałego. Czystość związku sprawdza się za pomocą TLC (R_f=0,51 - układ octan etylu : kwas octowy 100:1 (v/v)) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej na fazach odwróconych (RP HPLC), stosując kolumnę analityczną Phenomenex® Jupiter (4,6x250 mm, C-18, 5 μm) oraz detektor z macierzą diodową (Shimadzu, długości fali detekcji równe 223, 254 i 320 nm) przy przepływie fazy ruchomej równym 1 ml/min. Fazę ruchomą stanowi liniowy gradient od 0 do 100% B w czasie 60 minut (A=0,1% wodny roztwór kwasu trifluorooctowego, B=80% acetonitryl w fazie A, tR=42,5 min.). Związek identyfikuje się w oparciu o widmo mas (spektrometr Bruker Biflex III (MALDI TOF), m/z = 434,1 [M+H]⁺, M=433 g/mol).

b) Otrzymywanie pentapeptydów

Pentapeptydy otrzymuje się na nośniku stałym przy użyciu procedury Fmoc/tBu (Fig.3). Odpowiednią naważkę polimeru (żywica amidowa, np. TentaGel S RAM (Rapp Polymere, Niemcy) z osadzonym pierwszym Fmoc-aminokwasem (Fmoc-Ala, Fmoc-lle, Fmoc-Met lub Fmoc-Phe) umieszcza się w naczyniu reakcyjnym (strzykawka ze spiekiem szklanym, naczynko do manualnej syntezy peptydów lub kolumna w przypadku automatycznego syntezatora peptydów). Do syntezy można również zastosować żywicę amidową bez osadzonego pierwszego aminokwasu, jednak w takim przypadku należy najpierw przyłączyć do niej odpowiednio Fmoc-Ala, Fmoc-lle, Fmoc-Met lub Fmoc-Phe, stosując odpowiednią procedurę oraz oznaczyć uzyskany stopień osadzenia. Następnie przygotowuje się żywicę poprzez 15 minutowe wytrząsanie jej w chlorku metylenu (DCM), w wyniku czego następuje jej spęcznienie, po czym usuwa się rozpuszczalnik (odsączenie żywicy).

Kolejnym etapem jest usunięcie osłony Fmoc-aminokwasu w pozycji X1 a następnie jej zacylowanie kolejną resztą, co przeprowadza się zgodnie z poniższą procedurą:

• Usuwanie osłony Fmoc z pozycji X1

1. wstępne przemywanie żywicy:

chlorek metylenu (DCM) : N,N-dimetyloformamid (DMF) (1:1, v/v) 1 x 2 min.

N,N-dimetylofrmamid (DMF) 2 x 2 min.

2. usuwanie osłony Fmoc:

20%piperydyna w DMF 1 x 3 min.

x 8 min.

3. przemywanie żywicy:

DMF 3 x 2 min.

DMF : izopropanol (iPrOH) (1:1, v/v) 1 x 2 min.

izopropanol (iPrOH) 3 x 2 min.

DCM : iPrOH (1:1, v/v) 1 x 2 min.

DCM 3 x 2 min.

4. test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych:

ziarna żywicy kilka bezwodny acetaldehyd 50 μl nasycony roztwór p-chloranilu w toluenie 100 μl czas reakcji ok. 10 min.

Wynik: zielone ziarna (pozytywny) - obecność wolnych grup aminowych bezbarwne ziarna (negatywny) - brak wolnych grup aminowych

W przypadku pozytywnego wyniku testu przechodzi się do kolejnego kroku (acylowanie), natomiast w przypadku negatywnego wyniku - powtarza się procedurę.

• acylowanie pozycji X1

1. wstępne przemycie

DCM : DMF (1:1, v/v) 1 x 2 min.

2. acylowanie - metoda aktywnych estrów

Fmoc-aminokwas : HOBt : TBTU : DIPEA w stosunku molowym 1:1:1:2 rozpuszcza się w mieszaninie DCM : DMF (1:1, v/v) i po dodaniu do żywicy wytrząsa w temperaturze pokojowej przez

PL 226 349 B1 ok. 1,5 h (HOBt - N-hydroksybenzotriazol, TBTU - tetrafluoroboran O-(1H-benzotriazol-1a-ylo)-Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametylouroniowy, DIPEA - N'N'-diizopropyloetyloamina).

Do reakcji stosuje się 3-krotny nadmiar Fmoc-aminokwasu (odpowiednio Fmoc-His(Trt)-OH lub Fmoc-Trp(Boc)-OH) w stosunku do stopnia osadzenia żywicy.

3. przemywanie żywicy

DMF 3 x 2 min.

DMF : iPrOH (1:1, v/v) 1 x 2 min. iPrOH 3 x 2 min.

DCM : iPrOH (1:1, v/v) 1 x 2 min. DCM 3 x 2 min.

4. test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych pozytywny - powtórzenie procedury z zastosowaniem 2-krotnego nadmiaru Fmoc-aminokwasu oraz zmianą metody sprzęgania (np. metoda symetrycznych bezwodników - Fmoc-aminokwas : : HOBt : N,N'-diizopropylokarbodiimid (DIPCI) 1:1:1 lub metoda aktywnych estrów - Fmoc-aminokwas: : HOBt : HBTU (heksafluoroboran O-(1H-benzotriazol-1a-ylo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy) : DIPEA 1:1:1:2).

negatywny - kolejny krok

5. końcowe przemycie żywicy

DCM : metanol (MeOH) (1:1, v/v) 1x2 min. metanol (MeOH) 3 x 2 min.

6. osuszenie żywicy w eksykatorze próżniowym nad P2O5 i KOH.

Kolejne reszty aminokwasowe w pozycje X3 (Fmoc-lle-OH, Fmoc-Leu-OH lub Fmoc- Arg(Pbf)-OH), X4 (Fmoc-His(Trt)-OH lub Fmoc-Leu-OH) oraz X5 (Boc-Box(2Q)-OH) przyłącza się w sposób analogiczny do opisanego dla acylowania pozycji X1(z tym że w przypadku przyłączania pochodnej benzoksazolyloalaniny stosuje się mniejszą jej ilość (tzn. równomolową w stosunku do stopnia osadzenia żywicy).

Po przyłączeniu wszystkich reszt aminokwasowych przeprowadza się odszczepienie pentapeptydu od polimeru. W tym celu stosuje się mieszaninę kwasu trifluorooctowego : fenolu : wody : triizopropylosilanu w stosunku 88:5:5:2 (v/v/v/v); w której wytrząsa się peptydylożywicę przez ok. 1,5 h. Następnie odsącza się polimer, przemywając go dwukrotnie niewielką ilością kwasu trifluorooctowego. Otrzymany przesącz zagęszcza się na wyparce obrotowej, a z otrzymanej pozostałości wytrąca się peptyd za pomocą zimnego eteru dietylowego. Wytrącone peptydy odwirowuje się lub odsącza na lejku Schotta, a następnie rozpuszcza w wodzie (ewentualnie z dodatkiem niewielkiej ilości kwasu octowego) i liofilizuje.

Otrzymane związki oczyszcza się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na fazach odwróconych (pół-preparatywna kolumna Supelco (Supelcosil™ SPLC-ABZ, 10x250 mm, C-18, 5 μm), detekcja UV (λ=330 nm), przepływ = 4 ml/min), a następnie identyfikuje w oparciu o widma mas (Tabela 1).

T a b e l a 1. Warunki oczyszczania pentapeptydów oraz ich czasy retencji i wydajności reakcji, a także otrzymane wartości m/z i obliczone masy molowe związków.

Sekwencja pentapeptydu	Oczyszczanie	Identyfikacja
Faza ruchoma	tR [min]*	wydajność [%]	[M]+ [m/z]	M [g/mol]
H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH2	izokrat 30% B	29,3	43,2	833,3	833,0
H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH2	izokrat 30% B	30,3	39,1	867,3	867,0
H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH2	izokrat 35% B	34,0	34,5	935,8	935,1
H-Box(2Q)-His-lle-His-Ala-NH2	izokrat 20% B	25,7	29,5	791,4	790,9
H-Box(2Q)-His-lle-His-Met-NH2	Izokrat 25% B	27,8	29,2	851,4	851,0

* liniowy gradient 0-100% B w czasie 60 min, λ=320 nm (A=0,1% wodny roztwór kwasu trifluorooctowego, B=80% acetonitryl w fazie A)

c) oznaczanie MIC pentapeptydów hamujących wzrost drobnoustrojów

Minimalne stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów (MIC, Tabela 1) wyznacza się w oparciu o testy w hodowli płynnej w 96-dołkowych jałowych płytkach, stosując metodę podwójnych rozcieńczeń. W każdej z serii „studzienek” umieszcza się wzrastające stężenia badanego związku (po 50 μl

PL 226 349 B1 roztworu związku przygotowanego w jałowej wodzie), do którego dodaje się 50 μl hodowli bakterii (Bacillus subtilis 168 lub Enterococcus faecalis ATCC 29212 lub Staphylococcus aureus ATCC 29213 lub Staphylococcus aureus ATCC 25923) lub drożdży (Pichia pastoris) o gęstości optycznej ok. 0,01 ₅ przy λ=570 nm (około 10⁵ komórek na „studzienkę”). Testy przeprowadza się w jałowej pożywce Mueller-Hinton Broth, która dla drożdży zawiera dodatkowo 4% glukozy. Tak przygotowane próbki inkubuje się przez noc w temperaturze 25°C (drożdże) lub 37°C (bakterie), a następnie mierzy gęstość optyczną hodowli przy λ=570 nm. Dla każdego związku przygotowuje się dwie serie takich samych stężeń (2 powtórzenia), stosując jako kontrolę negatywną „studzienki” wypełnione wyłącznie pożywką z odpowiednimi stężeniami badanych związków (kontrola negatywna) oraz wyłącznie pożywkę z zaszczepioną hodowlą bakterii lub drożdży (kontrola pozytywna).

Jako minimalne stężenie hamujące wzrost (MIC) przyjmuje się najniższe stężenie hamujące wzrost bakterii lub drożdży (Tabela 2).

T a b e l a 2. Wartości minimalnych stężeń pentapeptydów hamujących wzrost (MIC) wybranych szczepów bakterii Gram-dodatnich oraz drożdży Pichia pastoris.

Związek	MIC [pg/ml]
B. subtilis 168	E. faecalis ATCC 29212	S. ureus ATCC 29213	S. ureus ATCC 25923	P. pastoris
H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH2	7,5	41,5	26,8	41,5	6,6
H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH2	9,5	52,5	na	na	8,4
H-Box(2Q)-Leu-Arg-T rp-Phe-NH2	15,8	na	60	na	14
H-Box(2Q)-His-lle-His-Ala-NH2	108	135	na	na	84
H-Box(2Q)-His-lle-His-Met-NH2	na	-	-	-	22

na - związek nieaktywny

d) Badanie cytotoksyczności

Cytotoksyczność związków bada się metodami in vitro, wykorzystując linie komórek prawidłowych (komórki embrionalne nerki Hek 293) oraz nowotworowych (komórki mysich fibroblastów A9). Komórki hoduje się jako „monolayer” na pożywce DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełnionej 1% roztworem antybiotyków (penicylina + streptomycyna), 1% glutaminą, NaHCO3 (3,7 g/l) i 10% cielęcą surowicą płodową (FBS) w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 5% stężeniu CO2. Pożywkę w hodowli wymienia się na świeżą co dwa dni. Konfluentne hodowle pasażuje się, a do testu przygotowuje zawiesinę komórek o gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml, którą wysiewa się w 96-dołkowych płytkach Elisa i inkubuje przez 24 godziny. Następnie przygotowuje się seryjne rozcieńczenia badanych związków w DMSO w celu poprawienia ich rozpuszczalności i dodaje do przygotowanych płytek z komórkami (dodatek DMSO nie wpływał na żywotność komórek, co potwierdzono eksperymentalnie). Komórki z odpowiednimi dawkami badanych substancji inkubuje się przez ok. 44 godziny. Do ilościowego oznaczenia proliferacji i żywotności komórek stosuje się test WST-1, który jest czułą i pewną metodą kolorymetryczną, wykorzystującą zdolność dehydrogenaz mitochondrialnych do przekształcania żółto zabarwionego substratu (WST-1 - sól sodowa disulfonianu 4-[3-(4-jodofenylo)-2-(4-nitrofenylo)-2H-5-tetrazolio]-1,3-fenylu) w pomarańczowy formazan, którego ilość w roztworze wodnym jest wprost proporcjonalna do liczby żywych komórek. W tym celu 10 μl odczynnika WST-1, rozcieńczonego czterokrotnie w buforze fosforanowym (PBS), dodaje się do każdego dołka płytki i inkubuje w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 5% stężeniu CO2. Po 4 godzinach odczytuje się absorbancję przy długości fali 450 nm. Żywotność komórek oblicza się jako procent żywotności komórek eksponowanych w stosunku do kontroli. Stwierdza się, że dla stężeń odpowiadających MIC spadek żywotności komórek w stosunku do kontroli jest nie większy niż 20% (Fig.4).

PL 226 349 B1

e) Badanie aktywności przeciwbakteryjnej w stosunku do szczepów wielolekoopornych

Badania aktywności związków w stosunku do 6 wielolekoopornych szczepów S. aureus, pochodzących z kolekcji pracowni Diagnostyki Molekularnej Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii UG i GUMed, będących izolatami klinicznymi od pacjentów wykonano metodą antybiogramu na podłożu stałym. Na płytkę z pożywką Mueller-Hinton Broth zestaloną agarem z wysianą murawą odpowiedniego szczepu bakterii nanosi się 1 lub 2 μΐ roztworu badanego związku w DMSO lub 96% etanolu, a następnie inkubuje płytki w 37°C przez 24 lub 48 h. Jako kontrolę nanosi się sam rozpuszczalnik, odpowiednio 96% etanol lub DMSO. Kontrolę pozytywną stanowi natomiast roztwór chloramfenikolu w 96% etanolu o stężeniu 5 mg/ml. Wrażliwość szczepu określa się w oparciu o wielkość strefy zahamowania wzrostu (tzw. „halo”) wokół miejsca naniesienia badanej substancji. Wszystkie badane szczepy okazały się wrażliwe na każdy z 3 badanych peptydów (Fig. 5).

f) Badanie szybkości nabywania oporności

Badania szybkości nabywania oporności przez bakterie wielolekooporne (128/0, 435, 632, 659, 1863) na badane związki wykonuje się hodując odpowiednie szczepy bakterii w pożywce MuellerHinton Broth w obecności subletalnych ilości tych związków (H-Box(2Q)-His-Leu-His-lle-NH₂ 10 μg/ml, H-Box(2Q)-His-Leu-His-Phe-NH₂ i H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH₂ - 30 μg/ml). Bakterie hoduje się przez ok. 150 pokoleń, po czym wykonuje się ponownie oznaczenie aktywności każdego związku w stosunku do tych szczepów oraz szczepów kontrolnych metodą antybiogramu. Na płytki z pożywką zestaloną agarem z wysianą murawą odpowiednio szczepu traktowanego związkiem lub kontrolnego nanosi się po 1 μl odpowiednich stężeń roztworów związków w DMSO, a następnie inkubuje przez noc w 37°C, po czym określa wielkość strefy zahamowania wzrostu w miejscu naniesienia związku. W przypadku wszystkich związków stwierdza się brak znaczącego spadku ich aktywności w porównaniu z aktywnością w stosunku do szczepów kontrolnych. Wyjątkiem jest szczep 435, w przypadku którego zaobserwowano, iż aktywność związku H-Box(2Q)-Leu-Arg-Trp-Phe-NH2 spada o ok. 50% w porównaniu do szczepu kontrolnego (Fig. 6 i Fig. 7).

Literatura:

Z. Markiewicz, Z. Kwiatkowski, Bakterie, antybiotyki, lekooporność, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006.

A. Chmiel, S. Grudziński, Biotechnologia i chemia antybiotyków, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998.

G. Virella, Mikrobiologia i choroby zakaźne, Wydawnictwo Medyczne Urban&Partner, Wrocław

2000.

R.P. Hicks, J.B. Bhonsle, D. Venugopal, B.W. Koser, AJ. Magill, J. Med. Chem. 50 (2007) 3026.

R. E. Hancock, R. Lehrer, Trends Biotech. 16 (1998) 82.

T. Stein, Molec. Microbiol. 56 (2005) 845.

S. Vila, I. Canet, J. Guyot, G. Jeminet, Y. Pointud, New J. Chem. 27 (2003) 1246.

M.O. Chaney, P.V. Demarco, D.N. Jones, J.L. Occolowitz, J. Am. Chem. Soc. 96 (1974) 1932.

H.K. Sarma, B.K. Sharma, S.C. Tiwari, Current Science 85 (2003) 1401.

M. Ueki, K. Ueno, S. Miyadoh, K. Abe, K. Shibata, M. Taniguchi, S. Oi, J. Antibiot. 46 (1993) 1089. K. Shibata, M. Kashiwada, M. Ueki, M. Taniguchi, J. Antibiot. 46 (1993) 1095.

M. Ueki, A. Kusumoto, M. Hanafi, K. Shibata, T. Tanaka, M. Taniguchi, J. Antibiot. 50 (1997) 551.

A. D. Rodriguez, C. Ramirez, I.I. Rodriguez, E. Gonzάlez, Org. Lett. 1 (1999) 527.

I.I. Rodriguez, A.D. Rodriguez, Y. Wang, S.G. Franzblau, Tetrahedron Lett. 47 (2006) 3229.

M. Stewart, P.M. Fell, J.W. Blunt, M.H.G. Munro, Aust. J. Chem. 50 (1997) 341.

O. Temiz, i Oren, E. §ener, i. Yalęin, N. Uęartijrk, Il Farmaco 53 (1998) 337.

i. Oren, O. Temiz, i. Yalęm, E. §ener, N. Altanlar, Eur. J. Pharm. Sci. 1 (1998) 153. i. Yalęin, i. Oren, O. Temiz, E.A. §ener, Acta Biochim. Pol. 47 (2000) 481.

E.A. §ener, O.T. Arpaci, i. Yalęin, N. Altanlar, II Farmaco 55 (2000) 397.

O.T. Arpaci, E.A. §ener, L Yalęin, N. Altanlar, II Farmaco 57 (2002) 771.

O. Temiz-Arpaci, i. Ozdemir, i. Yalęin, i. Yildiz, E. Aki-§ener, N. Altanlar, Archiv der Pharmazie

338 (2005)105.

S.M. Rida, F.A. Ashour, S.A.M. El-Hawash, M.M. ElSemary, M.H. Badr, M.A. Shalaby, Eur. J. Med. Chem. 40 (2005) 949.

B. Tekiner-Gulbas, O. Temiz-Arpaci, I. Yildiz, N. Altanlar, Eur. J. Med. Chem. 42 (2007) 1293.

PL 226 349 B1

O. Temiz, i Yildiz, S. Ozkan, F. Kaynak, E. Aki-Sener, L Yalęin, Eur. J. Med. Chem. 43 (2008)

1423.

J.-i. Kuroyanagi, K. Kanai, Y. Sugimoto, T. Horiuchi, I. Achiwa, H. Takeshita, K. Kawakami, Bioorg. Med. Chem. 18 (2010) 7593.

J.-i. Kuroyanagi, K. Kanai, T. Horiuchi, H. Takeshita, S. Kobayashi, I. Achiwa, K. Yoshida,

K. Nakamura, K. Kawakami, Chem. Pharm. Bull. 59 (2011) 341.

T.C. Daboit, Ch.D.O. Stopiglia, M. Carissimi, V.A. Corbellini, V. Stefani, M.L. Scroferneker, Mycoses 52 (2009) 507.

C. Ramalingan, S. Balasubramanian, S. Kabilan, M. Vasudevan, Eur. J. Med. Chem. 39 (2004)

527.

P. -E. Sum, D. How, N. Torres, H. Newman, P.J. Petersen, T.S. Mansour, Bioorg. Med. Chem. Lett. 13 (2003) 2607.

J. Vinsova, V. Horak, V. Buchta, J. Kaustova, Molecules 10 (2005) 760.

J. Vinsova, K. Cermakova, A. Tomeckova, M. Ceckova, J. Jampilek, P. Cermak, J. Kunes,

M. Dolezal, F. Staud, Bioorg. Med. Chem. 14 (2006) 5850.

O. Pytela, V. Klimeśovά, Chem. Pharm. Bull. 59 (2011) 179.

J. Koci, V. Klimeśovά, K. Waisser, J. Kaustovά, H.-M. Dahse, U. Mollmann, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 3275.

H.G. Bray, R.C. Clowes, W.V. Thorpe, Biochem. J. 51 (1952) 70.

Claims (6)

1. Nowe pentapeptydy o wzorze ogólnym

H-Box(2Q) A1A2A3A4NH2 gdzie poszczególne podstawniki oznaczają:

H-Box(2Q) - oznacza: 3-[2-(2-chinolilo)benzoksazol-5-ylo]alaninę A1 A2 A3 A4 oznacza: His-Leu-His-Ile (1)

A1A2A3A4- oznacza His-Leu-His-Phe (2)

A1A2A3A4 - oznacza Leu-Arg-Trp-Phe (3)

A1A2A3A4- oznacza His-Ile-His-Ala (4)

A1A2A3A4 - oznacza His-Ile-His-Met (5)

2. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera nowy pentapeptyd określony w zastrzeżeniu 1 oraz co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma zastosowanie przeciwbakteryjne i/lub przeciwgrzybicze.

4. Zastosowanie nowych pentapeptydów określonych w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjną i/lub grzybiczą.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że wytworzony środek leczniczy korzystnie wykazuje działanie przeciwbakteryjne na szczepy wielolekoopome w tym gronko wiec złocisty.

6. Zastosowanie według zastrz. 4-5, znamienne tym, że wytworzony środek leczniczy korzystnie stosowany jest w terapii ciągłej.