PL224514B1 - Sposób wytwarzania podłoża do szybkiego namnażania komórek i zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania podłoża do szybkiego namnażania komórek, zwłaszcza stosowanych w terapiach komórkowych, a szczególnie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) oraz zastosowanie takiego podłoża.

Terapie komórkowe z udziałem komórek hMSC i innych komórek, wykazujących zdolność różnicowania w wybraną tkankę w warunkach in vitro i in vivo, polegają najczęściej na pobraniu niewielkiej próbki tkanki zawierającej interesujące nas komórki od pacjenta i rozhodowaniu ich w warunkach in vitro aż do uzyskania odpowiedniej liczby. Komórki takie następnie podaje się domiejscowo (tj. w miejsce zranienia, uszkodzenia itp.), zwykle w postaci gęstej zawiesiny w roztworach fizjologicznych lub na odpowiednich rusztowaniach z naturalnych lub syntetycznych materiałów. Bez względu na sposób podawania komórek, odpowiednio duża ich liczebność w chwili podania (minimum kilka milionów komórek) zwiększa szanse powodzenia terapii. Ponadto, jeśli komórki będą podawane w zawiesinie lub na innych niż stosowane do ich rozhodowania rusztowaniach, warunkiem koniecznym, który musi spełniać podłoże stosowane do ich rozhodowywania in vitro jest łatwe odrywanie od niego komórek bez straty ich liczebności czy integralności.

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (ang. human mesenchymal stem cells, hMSC) są multipotentnymi adherentnymi komórkami izolowanymi z różnych tkanek, m.in. ze szpiku kostnego i tkanki tłuszczowej. hMSC są najlepiej poznanym i najszerzej wykorzystywanym klinicznie źródłem komórek do terapii komórkowych mających na celu regenerację tkanek zarówno miękkich, jak i twardych, z wykorzystaniem autologicznych komórek pacjenta.

Szeroki potencjał różnicowania komórek, macierzystych sprawia, że mogą one znaleźć zastosowania w różnorodnych terapiach komórkowych. Mogą się one bowiem różnicować w kierunku komórek pochodzenia mezodermalnego (np. osteocytów, chondrocytów, tłuszczowych, kardiomiocytów, włókien mięśniowych, komórek kanalików nerkowych), ektodermalnego (np. neuronów) lub endodermalnego (np. hepatocytów, komórek trzustki).

Autologiczne komórki szpikowe pacjentów pobierane igłą z talerza kości biodrowej lub głowy kości udowej (po zabiegu wymiany/rekonstrukcji stawu biodrowego), a także komórki macierzyste uzyskiwanie z lipoaspiratów najczęściej namnażane są w sterylnych warunkach in vitro i podawane powtórnie dawcom jako wspomagające terapie komórkowe. Namnażanie komórek w warunkach in vitro jest zwykle standardową procedurą mającą na celu uzyskanie odpowiedniej ich ilości do przeszczepu, a także pozbycie się innych frakcji komórek obecnych w wyjściowym izolacie. Efektywne i szybkie namnożenie dużej liczby autologicznych komórek szpikowych w warunkach in vitro pozwala skrócić czas oczekiwania pacjentów na wspomagającą terapię i przyspieszyć czas ich rekonwalescencji, a także obniżyć koszty terapii. Wiadomo jednak, że przez pierwsze 2-3 tygodnie hodowli komórki hMSC rosną ze stałą szybkością, potem czas potrzebny do podwojenia ich liczebności stopniowo się wydłuża, aż do całkowitego zatrzymania się ich wzrostu [Kassem M. Stem cells: Potential therapy for age-related diseases. Annals of the New York Academy of Sciences 2006;1067 (1): 436-42], czemu towarzyszy stopniowa utrata potencjału różnicowania komórek i postępujące starzenie się hodowli. Tempo wzrostu komórek jest też często zależne od wieku dawcy i zwykle potencjał proliferacyjny komórek na podłożu do hodowli komórkowych spada wraz z rosnącym wiekiem dawcy.

Do namnażania komórek in vitro służą zwykle standardowe handlowe naczynia hodowlane wykonane z odpowiednio traktowanego plastiku do hodowli komórkowych (ang. tissue culture plastic, TCP). Wiele polimerów, jak polistyren czy polipropylen, ma naturę hydrofobową, i dopiero specjalne zabiegi fizyko-chemiczne modyfikujące powierzchnię pozwalają na wykorzystanie wyżej wymienionych materiałów w testach immunologicznych, biologii molekularnej i hodowlach komórkowych. Znane jest np. utlenianie powierzchni w celu wprowadzenia grup = O lub -OH, a także powierzchnie z grupami karboksylowymi lub aminowymi. Dostępne są także powierzchnie powlekane różnymi substancjami sprzyjającymi hodowlom np. kolagenem lub poli-lizyną.

Z opisu zgłoszenia patentowego EP1860181 znane są powierzchnie wykonane z mieszaniny polimeru i związku amfifilowego, czyli zawierającego w cząsteczce fragmenty hydrofilowe i hydrofobowe, przy czym fragmenty hydrofobowe są związane w powierzchni polimeru, a fragmenty hydrofilowe znajdują się na powierzchni polimeru. Polimer może być zarówno powleczony związkiem amfifilowym, jak i wymieszany z tym związkiem. Fragmenty hydrofilowe stanowią grupy hydroksylowe, karboksylowe, aminowe lub ich mieszaniny. Związkiem amfifilowym może być oksyetylenowana alkiloamina,

PL 224 514 B1 polietylenoimina, oktylodekamina i ich mieszaniny. Jako polimery stosuje się polistyren, polipropylen, tereftalan polietylenu, poliwęglan lub ich mieszaniny.

Z opisu międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO9107485 znane są powierzchnie zawierające dodatnio naładowaną cząsteczkę oraz czynnik wspomagający adhezję komórek hodowli. Te dwa składniki są kowalencyjnie związane z powierzchnią i ewentualnie ze sobą. W każdym przypadku oba składniki tworzą homogeniczną mieszaninę, równomiernie rozprowadzoną na powierzchni nośnika. Nośnikiem może być polisacharyd (np. dekstran, skrobia lub celuloza), polistyren, alkohol poliwinylowy, polimery akrylowe lub metakrylowe i szkło. Czynnikiem wspomagającym adhezję komórek są związki peptydowe lub syntetyczne analogi peptydów, takie jak laminina, fibronektyna, kolagen, witronektyna i tenascyna. Jako dodatnio naładowaną cząsteczkę stosuje się np. trzeciorzędowe aminy i czwartorzędowe grupy amoniowe. Szczególnie polecane są alkiloaminy, np. dimetyloaminopropyloamina, chitozan i podobne kationowe poli(aminokwasy), takie jak poliarginina i polilizyna.

Z publikacji A.Plewa i in.: Photocrosslinkable diazoresin/pectin films - Synthesis and application as cell culture supports, European Polymer Journal 47 (2011), 1503-1513, znany jest sposób otrzymywania podłoża do namnażania komórek metodą „warstwa po warstwie”, w którym na nośnik nanosi się naprzemiennie co najmniej jedną warstwę polianionu w postaci żywicy diazoniowej i co najmniej jedną warstwę polikationu w postaci pektyny. Po naniesieniu warstw nośnik naświetla się promieniowaniem o długości fali 350 nm, w celu usieciowania sąsiadujących ze sobą warstw. Takie podłoże zastosowano do namnażania komórek macierzystych, osiągając w siódmym dniu hodowli 4,5-krotny wzrost liczby komórek w stosunku do dnia 0. Po siedmiu dniach hodowli komórki odrywano od podłoża standardową procedurą z użyciem trypsyny, która prowadzi do uzyskania zawiesiny indywidualnych komórek. Szybkość wzrostu komórek nadal nie była zadowalająca.

Modyfikacje powierzchni znane z publikacji EP1860181 i WO9107485 miały na celu zwiększenie adhezji komórek do podłoża i podtrzymywanie ich wzrostu. Rolą dodatnio naładowanego czynnika w rozwiązaniu znanym z WO9107485 jest wspomaganie adhezji komórek w jej początkowej fazie i stabilizowanie wzrostu komórek. Żadne z tych dwóch znanych rozwiązań nie odnosi się do tempa wzrostu komórek hodowli.

Jak wspomniano wyżej, szybkie tempo wzrostu jest ważnym parametrem w hodowli komórek przeznaczonych do terapii komórkowych, często wręcz przesądzającym o skutecznej realizacji założonego celu hodowli.

Innym problemem jest zapewnienie odpowiedniej siły adhezji komórek do podłoża. Przy dużej sile adhezji odrywanie warstwy nahodowanych komórek od podłoża wiąże się z możliwością utraty części komórek przeznaczonych do terapii lub naruszeniem ich integralności, np. żywotności w wyniku przerwania ich błony komórkowej w wyniku zbyt długotrwałego lub zbyt silnego działania czynników przerywających ich adhezję.

Istnieje zatem potrzeba opracowania podłoża, które zapewniałoby wysokie tempo wzrostu komórek i jednocześnie pozwoliłoby na łatwe odrywanie warstw nahodowanych komórek.

W sposobie otrzymywania podłoża do namnażania komórek według wynalazku na nośnik pochodzenia syntetycznego lub naturalnego nanosi się naprzemiennie co najmniej jedną warstwę polikationu, który stanowi żywica diazoniowa o wzorze 1, w którym n jest większe lub równe 5 oraz co najmniej jedną warstwę polianionu, który stanowi polisacharyd, po czym nośnik z naniesionymi warstwami naświetla się promieniowaniem o długości fali od 300 do 500 nm, w czasie nie krótszym niż 5 s. W przypadku, gdy nośnik ma powierzchniowy ładunek ujemny, jako pierwszą nanosi się warstwę polikationu, natomiast w przypadku, gdy nośnik ma powierzchniowy ładunek dodatni jako pierwszą nanosi się warstwę polianionu, przy czym korzystnie jest, gdy ostatnią warstwę stanowi warstwa polianionu. Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako polisacharyd stosuje się glikozaminoglikan wybrany spośród: heparyny, siarczanu chondroityny, siarczanu heparanu, siarczanu keratanu lub karagenanu.

Korzystnie nanosi się od trzech do ośmiu warstw polianionów i polikationów, najkorzystniej po sześć warstw. W przypadku, gdy na nośnik nanosi się więcej niż jedną warstwę polikationu i polianionu naświetlanie przeprowadza się po naniesieniu wszystkich warstw.

Nośnikiem, na który nakłada się warstwy polianionu i polikationu jest materiał w formie ciała stałego lub koloidalnego, o budowie krystalicznej lub amorficznej, o różnym stopniu rozdrobnienia i/lub porowatości - od nanometrycznego do makroskopowego. Materiał nośnika może być porowaty lub włóknisty, o różnym stopniu elastyczności i chemizmie. Nośnik może być materiałem 3D tworzącym wewnętrzne otwarte, wzajemnie połączone przestrzenie umożliwiające przepływ substancji płynnych

PL 224 514 B1 i zasiedlanie ich przez komórki ludzkie i zwierzęce. Korzystnie nośnik jest wybrany z grupy zawierającej: kolageny, rusztowania tytanowe, polimerowe (np. PLGA, polistyren, alkohol poliwinylowy, polimery akrylowe lub metakrylowe), TiO2, ceramiczne (np. hydroksyapatyty, bioaktywne szkła) i wszelkiego rodzaju kompozyty tych materiałów.

Warstwy polianionu i polikationu nanosi się zanurzając nośnik na przemian w wodnych roztworach polikationu i polianionu, płucząc ją wodą destylowaną po każdorazowym wyjęciu z roztworu polimeru. Korzystnie stosuje się wodne roztwory polianionu i polikationu o stężeniu w zakresie 0,1

-100 mg/ml.

Innym aspektem wynalazku jest zastosowanie podłoża otrzymanego sposobem zgodnym z wynalazkiem do namnażania komórek ludzkich i zwierzęcych w warunkach in vitro. Korzystnie podłoże stosuje się do namnażania komórek stosowanych w terapiach komórkowych, a zwłaszcza do namnażania mezenchymalnych komórek macierzystych.

W sposobie według wynalazku grupy diazoniowe żywicy pod wpływem naświetlania tracą ładunek dodatni i wchodzą w reakcję z grupami nukleofilowymi (np. karboksylowymi, siarczanowymi, fosforanowymi) z utworzeniem wiązań kowalencyjnych pomiędzy pierścieniami fenylowymi (lub ogólnie aromatycznymi) żywicy a grupami nukleofilowymi polianionu i wydzieleniem cząsteczkowego azotu. Reakcji tej towarzyszy zanik pasma absorpcyjnego żywicy przy długości fali 380 nm w widmie UV-Vis. W wyniku tej reakcji następuje kowalencyjne związanie (usieciowanie) sąsiadujących ze sobą warstw polimerów, skutkujące zwiększeniem ich trwałości i odporności na rozpuszczalniki oraz zmianą potencjału zeta powierzchni podłoża na bardziej ujemny. Powierzchnia hodowlana jest połączona z podłożem na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych.

Na podłożach polimerowych według wynalazku obserwuje się przynajmniej 30% szybszy wzrost hMSC w porównaniu do standardowo używanych podłoży polistyrenowych. W stosunku zaś do podłoża opisanego w publikacji Plewa i in., przez zastąpienie pektyny polisacharydem zawierającym grupy siarczanowe uzyskano wzrost komórek szybszy o 35-75%. Przy małej wyjściowej ilości komórek i stosunkowo powolnym tempie ich wzrostu podłoża otrzymane sposobem zgodnym z wynalazkiem pozwalają zatem na znaczące skrócenie oczekiwania pacjenta na rozpoczęcie terapii. Jest to istotna cecha korzystnie odróżniająca powierzchnię otrzymaną sposobem według wynalazku od znanych modyfikacji powierzchni oferujących wyłącznie większą powierzchnię wzrostową. Znane powierzchnie mogą doprowadzić do uzyskania pożądanej ilości komórek, ale w dłuższym czasie, co może być kluczowe dla pacjenta - biorcy komórek.

Ponadto, komórki na podłożach otrzymanych sposobem zgodnym z wynalazkiem odrywają się samoistnie całą warstwą już na etapie kilkudniowej hodowli, podczas gdy przy takiej samej gęstości początkowej hodowli na znanych podłożach TCP takie odrywanie obserwuje się zwykle po 2-3 tygodniach. W przypadku podłoża opisanego w publikacji A.Plewa i in., w celu oderwania komórek po 7-dniowej hodowli konieczne jest stosowanie trypsyny, co jest standardową procedurą stosowaną do odrywania komórek z podłoża. Komórki oderwane w ten sposób tworzą zawiesinę indywidualnych komórek, a nie warstwę, jak w przypadku podłoża według wynalazku.

Podłoża mogą być wykorzystane w hodowli prowadzonej w warunkach standardowych (tj. stosując pożywkę wzbogaconą w surowicę) lub niestandardowych (np. bezsurowiczych). Podłoże można stosować do hodowli hMSC z udziałem czynników wzrostowych, w których jako czynnik wzrostu stosuje się na przykład rekombinowane ludzkie białka morfogenetyczne kości lub osocze bogato płytkowe.

Wynalazek został bliżej przedstawiony w przykładach. Podłoża zostały zweryfikowane pod kątem żywotności i tempa podziałów ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych celem określenia biozgodności wynalazku i jego potencjalnych zalet w stosunku do typowych polistyrenowych podłoży hodowlanych (TCP).

P r z y k ł a d 1.

Synteza żywicy diazoniowej.

W kolbie o objętości 50 ml chłodzonej w wodzie z lodem umieszczono 4.707 g siarczanu 4-diazodifenyloaminy, który rozpuszczono w 16 ml stężonego H₂SO₄. Następnie w czterech porcjach dodano 0,430 g paraformaldehydu i przez 4 godziny prowadzono reakcję w temperaturze 0-5°C. Mieszaninę reakcyjną powoli wylano do 30 ml zimnej wody (o temperaturze bliskiej 0°C). Następnie żywi₁ cę diazoniową wytrącono jako kompleks ¹/2ZnCl2. Żółto-zielony produkt przefiltrowano, wysuszono pod próżnią i przechowywano chroniąc przed dostępem światła.

PL 224 514 B1

P r z y k ł a d 2.

Otrzymywanie fotosieciowanych podłoży hodowlanych żywica/polisacharyd na płytkach szklanych.

Podłoża hodowlane przygotowano metodą „warstwa po warstwie” (ang. layer-by-layer, LBL). Płytki szklane wysterylizowane w piecu w 180°C zanurzano naprzemiennie w wodnym roztworze żywicy diazoniowej otrzymanej zgodnie z przykładem 1, o stężeniu 2 mg/ml oraz w wodnym roztworze odpowiedniego polisacharydu: heparyny, siarczanu chondroityny i karagenanu, o stężeniu 1 mg/ml. Pomiędzy zanurzaniem ich w roztworach polianionu i polikationu płytki przemywano wodą destylowaną. Roztwory żywicy diazoniowej oraz polisacharydów sterylizowano uprzednio poprzez przesączenie ich przez sterylne filtry strzykawkowe MILLEX GP o średnicy porów 0.22 μm. W uzyskanych podłożach polimerowych złożonych z 6 biwarstw ostatnią warstwę stanowiła warstwa polisacharydu. W celu usieciowania podłoży naświetlano je w fotoreaktorze Rayonet RPR-100 firmy Southern New England wyposażonym w sześć lamp o maksimum emisji przy długości fali 350 nm (RPR-3500, mocy 24 W). Podłoża na bazie żywicy diazoniowej i heparyny lub siarczanu chondroityny naświetlano 7 minut. Film złożony z żywicy diazoniowej/karagenanu naświetlano 15 minut, ponieważ czas 7 minut okazał się niewystarczający do utworzenia trwałego podłoża polimerowego. Przed rozpoczęciem hodowli podłoża eksperymentalne dodatkowo sterylizowano poprzez naświetlenie promieniowaniem UV przez 5 min w komorze laminarnej.

P r z y k ł a d 3.

Otrzymywanie fotosieciowalnych rusztowań hodowlanych żywica/polisacharyd na gąbkach poliuretanowych.

Rusztowania hodowlane przygotowano metodą „warstwa po warstwie” (ang. layer-by-layer, LBL). Gąbki poliuretanowe w formie dysków o średnicy 1 cm i grubości 3 mm zmodyfikowano plazmowo w celu wytworzenia na powierzchni porów, zarówno na powierzchni, jak i wewnątrz gąbek, ujemnie naładowanych grup funkcyjnych, a następnie wysterylizowano etanolem i wysuszono. Gąbki zanurzano naprzemiennie w wodnym roztworze żywicy diazoniowej otrzymanej zgodnie z przykładem 1, o stężeniu 2 mg/ml oraz w wodnym roztworze odpowiedniego polisacharydu: heparyny, siarczanu chondroityny i karagenanu, o stężeniu 1 mg/ml. Pomiędzy zanurzaniem ich w roztworach polianionu i polikationu usuwano z nich roztwór polimeru poprzez odciskanie, przemywano wodą destylowaną i również ją usuwano poprzez odciskanie. Roztwory żywicy diazoniowej oraz polisacharydów sterylizowano uprzednio poprzez przesączenie ich przez sterylne filtry strzykawkowe MILLEX GP o średnicy porów 0,22 μm. W uzyskanych multiwarstwach polimerowych złożonych z 6 biwarstw ostatnią najbardziej zewnętrzną, a przez to mającą bezpośredni kontakt z potencjalnymi komórkami warstwę polimerową wyścielającą pory gąbki stanowiła warstwa polisacharydu. W celu usieciowania multiwarstw polimerowych naświetlano je w fotoreaktorze Rayonet RPR-100 firmy Southern New England wyposażonym w sześć lamp o maksimum emisji przy długości fali 350 nm (RPR-3500, mocy 24 W). Podłoża na bazie żywicy diazoniowej i heparyny lub siarczanu chondroityny naświetlano 15 minut. Film złożony z żywicy diazoniowej/karagenanu naświetlano 30 minut, ponieważ czas 15 minut okazał się niewystarczający do utworzenia trwałego podłoża polimerowego. Przed rozpoczęciem hodowli podłoża eksperymentalne dodatkowo sterylizowano poprzez naświetlenie promieniowaniem UV przez 15 min w reaktorze fotochemicznym Rayonet.

P r z y k ł a d 4.

Hodowle komórek hMSC na podłożach zawierających heparynę, siarczan chondroityny i karagenan.

Do hodowli na eksperymentalnych podłożach wykorzystano ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste izolowane ze szpiku kostnego na potrzeby analiz klinicznych i badań podstawowych od pacjentów Oddziału Ortopedii i Traumatologii Narządu Ruchu (Kliniczny) Szpitala L.Rydygiera w Krakowie (zgoda Komisji Bioetycznej nr KBET/17L/2007). Komórki przed wysianiem pasażowano 3-krotnie w celu m.in. pozbycia się komórek pnia hemopoetycznego ze szpiku kostnego (te ostatnie słabo przylegają do podłoża) na korzyść komórek fibroblastycznych, zawierających mezenchymalne ₂ komórki macierzyste. Wysiewano 5000 komórek pasażu trzeciego (ok. 2800 komórek/cm²). Zdjęcia komórek hodowanych na poszczególnych podłożach DR/polisacharyd i na podłożu referencyjnym dla różnych czasów trwania hodowli przedstawia Fig. 1. W Tabeli 1, przedstawiono liczbę żywych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych hodowanych na różnych podłożach dla różnych czasów trwania hodowli. Jako podłoże kontrolne zastosowano plastik do hodowli komórkowych TCP. Hodowlę przeprowadzono w płytkach 24-dołkowych. Liczbę komórek oznaczono za pomocą Alamar Blue. Zauważono, że począwszy od 5 dnia hodowli liczba komórek na podłożach DR/polisacharyd jest znacznie

PL 224 514 B1 większa niż na podłożu referencyjnym (handlowy plastik do hodowli komórek, TCP) i jest najwyższa na podłożu DR/i-karagenan. Różnice te wynoszą co najmniej 30% w przypadku hodowli na podłożu

DR/i-karagenan. W przypadku, gdy zastosowano odpowiednio wysoką początkową gęstość wysia₂ nych komórek (11000 komórek/cm²) na podłożach DR/polisacharyd począwszy od dnia 3 następowało odrywanie się warstw nahodowanych komórek i porastanie podłoży nową warstwą komórek (Fig. 2 Hodowle komórek hMSC na podłożach DR/polisacharyd w 3 dniu hodowli (gęstość wysiewania 11000 ₂ komórek/cm²). Taki efekt nie występował w przypadku podłoży z plastiku do hodowli komórkowych (TCP) w tak wczesnych etapach hodowli.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania podłoża do namnażania komórek, w którym na nośnik pochodzenia syntetycznego lub naturalnego nanosi się naprzemiennie co najmniej jedną warstwę polikationu, który stanowi żywica diazoniowa o wzorze 1, w którym n jest większe lub równe 5 oraz co najmniej jedną warstwę polianionu, który stanowi polisacharyd, po czym nośnik z naniesionymi warstwami naświetla się promieniowaniem o długości fali od 300 do 500 nm, w czasie nie krótszym niż 5 s., przy czym gdy nośnik ma powierzchniowy ładunek ujemny, jako pierwszą nanosi się warstwę polikationu, natomiast w przypadku, gdy nośnik ma powierzchniowy ładunek dodatni jako pierwszą nanosi się warstwę polianionu, znamienny tym, że jako polisacharyd stosuje się glikozaminoglikan wybrany spośród: siarczanu chondroityny, siarczanu heparanu, siarczanu keratanu, lub karagenanu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ostatnią warstwę stanowi warstwa polianionu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że warstwy polianionu i polikationu nanosi się zanurzając nośnik na przemian w wodnych roztworach polikationu i polianionu, i płucząc po każdorazowym wyjęciu z roztworu polimeru.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się wodne roztwory polianionu i polikationu o stężeniu 0,1-100 mg/ml.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nanosi się od trzech do ośmiu warstw polianionów i polikationów, korzystnie po sześć warstw.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako nośnik stosuje się materiał w formie ciała stałego lub koloidalnego, o budowie krystalicznej, amorficznej, porowatej lub włóknistej.
7. 7. Zastosowanie podłoża określonego w zastrz. 1 do namnażania komórek ludzkich i zwierzęcych w warunkach in vitro.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że podłoże stosuje się do namnażania komórek stosowanych w terapiach komórkowych.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 7 albo 8, znamienne tym, że podłoże stosuje się do namnażania mezenchymalnych komórek macierzystych.