PL223203B1

PL223203B1 - Sposób identyfikacji chemotypów lipopolisacharydowych bakterii Gram-ujemnych z zastosowaniem metody MALDI-TOF MS

Info

Publication number: PL223203B1
Application number: PL400598A
Authority: PL
Inventors: Sabina Koj; Tomasz Niedziela; Czesław Ługowski
Original assignee: Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną; Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2016-10-31
Also published as: WO2014035270A1; PL400598A1; WO2014035270A8

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji chemotypów bakterii Gram - ujemnych wykorzystujący metodę spektroskopii masowej MALDI-TOF MS.

Antygen O jako jeden z antygenów powierzchniowych bakterii Gram-ujemnych jest wykorzystywany do wyróżniania i identyfikacji bakterii [1], Antygen O, składający się z wielu powtarzających się podjednostek, stanowi cukrową część lipopolisacharydu (LPS), który pokrywa około 70% powierzchni komórki bakteryjnej. Ze względu na aktywność biologiczną LPS jest określany mianem endotoksyny. Podczas infekcji LPS jest uwalniany z powierzchni komórki bakteryjnej do krwiobiegu prowadząc do wewnątrzustrojowej reakcji zapalnej.

Antygen O wykazuje dużą zmienność ze względu na obecność różnych typów cukrów, ich aranżacji w podjednostce oraz połączeniach w obrębie oraz pomiędzy podjednostkami sprawiającą, że jest to najbardziej zmienny składnik komórki [2]. Zmienność strukturalna tego antygenu powoduje, że jest on unikatowy dla danego szczepu bakteryjnego. Jednocześnie, będąc wysoce immunogennym składnikiem eksponowanym na powierzchni komórki bakteryjnej antygen O stanowi podstawę do serologicznego typowania bakterii Gram-ujemnych. Na podstawie analiz swoistości przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom O wśród szczepów bakteryjnych w klasyfikacji bakteryjnej wydzielono odpowiadające im serotypy. Przykładowo, wśród 180 typów serologicznych Escherichia coli antygen O stanowi główny antygen różnicujący. W obrębie tego gatunku wyróżniono 170 antygenów O, około 80 antygenów K i około 50 antygenów H. Przeciwciała generowane w odpowiedzi na antygen O są szeroko stosowane w diagnostyce infekcji powodowanych przez bakterie Gram-ujemne. W przypadku bakterii Gram-ujemnych mających LPS pozbawiony antygenu O specyficzność serologiczną determ inuje oligosacharyd rdzenia (OS rdzenia, antygen R). Określany wówczas jako lipooligosacharyd (LOS, R-LPS) składnik ten powszechnie jest znajdowany wśród patogenów błon śluzowych, np. Neisseria meningitidis [3].

Oprócz części cukrowej w skład lipopolisacharydów wchodzi fragment fosfolipidowy (lipid A) zakotwiczający LPS w błonie komórki bakteryjnej. W składzie LPS wyróżnia się zatem trzy części: łańcuch O-swoisty, oligocukier rdzenia oraz lipid A. Pełna struktura izolowanego LPS różnych szczepów bakteryjnych jest określona na podstawie kombinacji metod analiz strukturalnych takich jak magnetyczny rezonans jądrowy i spektrometria mas na preparatach pełnych cząsteczek LPS (HR-MAS NMR, MS), de-acylowanych LPS (NMR, MS i GC) oraz jego fragmentach oligosacharydowych (NMR, MS i GC). W ten sposób dostępne są dane na temat struktury bakteryjnego LPS, a także jego zmienności strukturalnej wśród szczepów bakteryjnych [3-8].

Znane są nieliczne publikacje, w których uzyskano widma izolowanych LPS przy zastosowaniu 2,4,6-THAP jako matrycy oraz trybu jonizacji ujemnej spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserem wspomaganej matrycą z detektorem czasu przelotu (MALDI-TOF MS). Widma MALDI-TOF MS niezmodyfikowanych LPS uzyskano w przypadku bakterii Gram-ujemnych mających R-LPS np. Erwinia carotovora i Shewanella pacifica [7,9], Przy ustalonych optymalnie warunkach pomiaru tą metodą w widmach izolowanych LPS zaobserwowano grupy sygnałów wynikające z heterogenności cząsteczek LPS. Heterogenność w cząsteczkach LPS jest zwykle ograniczona do reszt cukrowych i fosforanowych. Grupy sygnałów w widmach MALDI-TOF MS stanowią unikatowe profile pochodzące od cząsteczek lipopolischarydów. Ze względu na ograniczony zakres detekcji w widmach MALDI-TOF MS izolowanych LPS nie obserwuje się jonów pochodzących od powtarzających się podjednostek łańcucha O-swoistego. Składniki komórki bakteryjnej takie jak lipopolisacharydy i oligosacharydy są badane jako chemotaksonomiczne biomarkery swoiste dla szczepów bakteryjnych w celu identyfikacji mikroorganizmów.

Ze stanu techniki znane jest biotypowanie bakterii z zastosowaniem MALDI-TOF MS oparte o generowanie profilów białkowych MALDI-TOF MS preparatów mas bakteryjnych lub ich ekstraktów białkowych (US6177266, US7684934, US8155892). Profil białkowy stanowi grupa sygnałów spektralnych pochodzących od białek obserwowanych w widmach MALDI-TOF MS uzyskiwanych dla preparatów mas bakteryjnych i ich ekstraktów w trybie dodatnim MALDI-TOF MS z użyciem HCCA jako matrycy. Analiza MALDI-TOF MS jest przeprowadzana na pełnych komórkach bakteryjnych lub ekstraktach białkowych uzyskanych po lizie lub frakcjach składników komórkowych. Tak uzyskane profile pochodzą głównie od białek uwalnianych z cytozolu komórki bakteryjnej podczas preparacji masy bakteryjnej do analizy MALDI-TOF MS (Ryzhov V., Fenselau C., „Characterization of the Protein Subset Desorbed by MALDI from Whole Bacterial Cells.” Analytical Chemistry, 73 (2001): 746-750).

PL 223 203 B1

Zgodnie z notą aplikacyjną „MALDI-TOF Fingerprinting of bacteria” Bruker Daltonics istnieje procedura identyfikacji bakterii z zastosowaniem referencyjnej bazy danych profilów białkowych MALDI-TOF MS bezpośrednio dla preparatów mas bakteryjnych. MALDI-TOF MS oparta na łagodnej metodzie jonizacji pozwala analizować peptydy i białka desorbowane z pełnych komórek mikroorganizmów. Odpowiednie jony są rozdzielane i wykrywane na podstawie ich mas cząsteczkowych i ładunku. Uzyskane widmo składa się z serii sygnałów w zakresie od 2000 do 20000 m/z. Analiza taka jest zwykle prowadzona na izolowanej kolonii bakteryjnej z próbki klinicznej hodowanej na odpowiednim medium wzrostowym i inkubowanej w odpowiedniej temperaturze. Mała ilość materiału biologicznego jest przenoszona bezpośrednio na płytkę MALDI. Kwas alfa-cyjano-4-hydroksy-cynamonowy (HCCA) jest dodawany do próbki. Następnie, próbka jest analizowana w spektrometrze MALDI-TOF w trybie liniowym, dodatnim. Do identyfikacji stosuje się zakres mas 2000 do 20000 Daltonów. W celu identyf ikacji nieznanych mikroorganizmów program wykonuje operacje korelacji wzorów (ang. pattern matching) i porównywanie generowanej listy sygnałów z biblioteką widm referencyjnych, która zawiera charakterystyczne informacje spektralne. Identyfikacja w opisanej metodzie wykorzystuje tzw. „fingerprinting” stanowiący w przypadku bakterii unikatowy wzór białkowy umożliwiający różnicowanie szczepów.

Analiza profilów białkowych z zastosowaniem MALDI-TOF MS bezpośrednio dla preparatów mas bakteryjnych pozwala uzyskać informacje o antygenach nieznanej komórki bakteryjnej. Jednakże obok profilu białkowego MALDI-TOF MS generowanego bezpośrednio dla masy bakteryjnej istnieje potrzeba dostarczenia dodatkowych informacji na temat komórki bakteryjnej i jej unikatowych biomarkerów, które mogą zostać wykorzystane w biotypowaniu mikroorganizmów i projektowaniu narzędzi do terapii antybakteryjnej. Informacje na temat antygenów powierzchniowych komórki bakteryjnej (typu Antygenu O) w preparacie nieznanej kolonii bakteryjnej pozwolą na sprawną i precyzyjną identyfikację szczepu bakteryjnego, antygeny powierzchniowe stanowią bowiem swoiste chemotaksonomiczne biomarkery szczepów bakteryjnych. Dodatkowo, Antygen O kwalifikuje się jako dogodny biomarker dla identyfikacji bakterii ze względu na dużą stabilność termiczną i chemiczną. Analiza antygenów powierzchniowych pełnych komórek bakteryjnych pozwala ponadto na zebranie informacji niezbędnych w projektowaniu docelowej terapii skierowanej przeciwko antygenowi O. Terapia może opierać się o przeciwciała lub surowice skierowane przeciwko antygenowi O preparowanemu w formie koniugatu z białkiem nośnikowym.

Nieoczekiwanie cel ten zrealizowano w przedmiotowym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji chemotypów lipopolisacharydowych bakterii Gram-ujemnych z zastosowaniem metody MALDI-TOF MS, charakteryzujący się tym, że

a) przygotowuje się preparat masy bakteryjnej do analizy profilu pełnych komórek bakteryjnych metodą MALDI-TOF MS,

b) preparat masy bakteryjnej analizuje się w trybie ujemnym MALDI-TOF MS w zakresie sygnałów pochodzących od jonów cząsteczek LPS znajdujących się na powierzchni komórek bakteryjnych, zwłaszcza oligocukrów rdzenia LPS, oligocukrów wchodzących w skład O antygenu, lipidu A lub pełnego LPS.

c) otrzymuje się spektralny profil endotoksynowy pełnych komórek bakteryjnych charakterystyczny dla danego szczepu bakteryjnego,

d) uzyskany spektralny profil endotoksynowy preparatu masy bakteryjnej porównuje się z referencyjną bazą danych zawierająca profile spektralne MALDI-TOF MS szczepów bakteryjnych, przy czym jako matrycę dla preparowanych kolonii bakteryjnych stosuje się kwas 2,4-dihydroksybenzoesowy (DHB).

Korzystnie, materiał do otrzymania preparatu stanowi kolonia bakteryjna z podłoża hodowlanego lub osad po odwirowaniu masy bakteryjnej z hodowli na podłożu płynnym.

Korzystnie, preparat masy bakteryjnej otrzymuje się w wyniku inaktywacji i ekstrakcji bakterii z kwasem mrówkowym.

Korzystnie, preparat masy bakteryjnej otrzymuje się w wyniku traktowania bakterii enzymem proteolitycznym.

Korzystnie, widma MALDI-TOF MS analizowane są w zakresie m/z od 700 do 50000. Korzystnie, widma MALDI-TOF MS analizowane są w zakresie m/z od 700 do 4000. Przedmiotowy wynalazek dotyczy metody identyfikacji szczepów bakterii Gram-ujemnych w oparciu o spektralny profil endotoksynowy pełnych komórek bakteryjnych uzyskany z zastosowaniem MALDI-TOF MS. Profil endotoksynowy dla preparatów mas bakteryjnych uzyskuje się w trybie jonizacji ujemnej spektrometru MALDI4

PL 223 203 B1

-TOF z zastosowaniem DHB jako matrycy. Metoda obejmuje przygotowanie preparatów mas bakteryjnych do analizy MALDI-TOF MS, otrzymanie unikatowych profilów endotoksynowych MALDI-TOF MS dla tych preparatów i identyfikację szczepów bakteryjnych poprzez porównanie uzyskanych widm z referencyjną bazą MALDI-TOF MS profilów endotoksynowych.

Próbkę do biotypowania bakterii sposobem wg wynalazku stanowi preparat masy bakteryjnej. Preparatem może być kolonia bakteryjna z podłoża hodowlanego lub osad po odwirowaniu masy bakteryjnej z hodowli na podłożu płynnym. W przedmiotowym sposobie wyznaczono dwie procedury preparacji masy bakteryjnej: jedna ze względu na patogenność bakterii obejmuje etapy inaktywacji i ek strakcji, natomiast druga obejmuje preparację masy bakteryjnej z traktowaniem enzymem proteolityc znym. W przypadku bakterii patogennych preparacja mas bakteryjnych polega na inaktywacji bakterii 80% etanolem, a następnie ekstrakcji z użyciem 70% kwasu mrówkowego i równej ilości acetonitrylu. Do analizy profilów endotoksynowych MALDI-TOF MS sposobem wg wynalazku stosuje się masy bakteryjne oddzielone od ekstraktu. Procedura preparacji mas dla profilu endotoksynowego stanowi zmodyfikowaną procedurę według noty aplikacyjnej MT-80 „Microorganism Identification and classification based on MALDI-TOF MS fingerprinting with MALDI-Biotyper” Bruker Daltonics (Fig. 1).

Preparacja mas enterobakteryjnych dla analizy MALDI-TOF MS polega na traktowaniu mas bakteryjnych enzymem proteolitycznym. Enzymatyczna preparacja mas enterobakterii pozwala na usunięcie cząsteczek, które generują jony przeszkadzające” w widmach MALDI-TOF MS oraz na obserwację profilów endotoksynowych (Fig. 5 i 6). Do analizy profilów endotoksynowych MALDI-TOF MS sposobem wg wynalazku stosuje się masy bakteryjne oczyszczone od enzymu i soli przed analizą.

Następnie, sposób wg wynalazku polega na dodaniu do wypreparowanych mas bakteryjnych pochodnych kwasu benzoesowego jako matrycy przed analizą MALDI-TOF MS. Preferencyjnie, pochodną kwasu benzoesowego stanowi kwas 2,4-dihydroksybenzoesowy (DHB).

Niewielka ilość próbki, najkorzystniej 1-2 μl jest użyta do analizy MALDI-TOF MS. Sposób wg wynalazku polega na uzyskiwaniu widm MALDI-TOF MS w trybie jonizacji ujemnej dla zakresu m/z obejmującego jony pochodzące od cząsteczek oligocukrów LPS. Zakres mas obejmuje zwykle m/z od 700 do 4000. Widma MALDI-TOF MS są uśredniane dla zakresu 100-200 strzałów lasera, zbierane i porównywane do referencyjnych widm MALDI-TOF MS pełnych komórek bakteryjnych w celu zidentyfikowania nieznanej próbki bakteryjnej.

Sposób wg wynalazku obejmuje referencyjną bazę MALDI-TOF MS profilów endotoksynowych. Serie sygnałów w widmach referencyjnych MALDI-TOF MS stanowią unikatowe profile uzyskane dla preparatów mas bakteryjnych (Fig. 2 i Fig. 5) i potwierdzone jako pochodzące od cząsteczek lipopolischarydów poprzez porównanie z profilami MALDI-TOF MS izolowanych LPS (Fig. 3 i 7). W widmach MALDI-TOF MS izolowanych LPS obserwuje się jony pochodzące od lipidu A, oligocukru rdzenia (OS rdzenia) i pełnego LPS. Zaobserwowaliśmy także, że profile endotoksynowe analizowanych ba kterii Gram-ujemnych (profile pełnych komórek bakteryjnych) są zgodne z profilami izolowanego LPS w zakresie mas dla OS rdzenia. Uzyskiwany profil endotoksynowy izolowanego LPS i pełnych komórek bakteryjnych składa się z wielu sygnałów spektralnych wynikających z heterogenności cząsteczek oligocukrów rdzenia LPS. Heterogenność cząsteczek OS rdzenia wynika z niestechiometrycznego podstawienia grupami fosforanowymi, fosfoetanolaminą oraz resztami cukrowymi. Sygnały profilu endotoksynowego są zwykle uzyskiwane w zakresie m/z od 700 do 4000. W widmach MALDI-TOF MS analizowanych LPS i preparatów mas bakterii mających LPS typu gładkiego (LPS zawierający O-antygen) zaobserwowano jedynie jony pochodzące od oligosacharydów rdzenia pełnych komórek bakteryjnych. Nie stwierdzono obecności jonów pochodzących od powtarzających się podjednostek łańcucha O-swoistego. W przypadku bakterii mających LPS typu S rozróżnienie szczepów jest możliwe również w oparciu o sygnały pochodzące od OS rdzenia obserwowane w widmach MALDI-TOF MS LPS (Fig. 9).

W przedmiotowym wynalazku identyfikacja bakterii Gram-ujemnych obejmuje etap porównania profilów endotoksynowych widm MALDI-TOF MS preparatów mas bakteryjnych z bazą danych zawierającą charakterystyczne widma MALDI-TOF MS szczepów bakteryjnych, która pozwala na rozróżnienie szczepów różniących się typem rdzenia LPS. Uzyskane profile endotoksynowe wg wynalazku obejmują sygnały pochodzące od oligocukrów rdzenia LPS. Oligocukier rdzenia stanowi jeden ze składników LPS określający swoistość bakterii Gram-ujemnych. Przykładowo, wśród Enterobacteriaceae struktura oligocukrów rdzenia typu R1 dominuje wśród szczepów powodujących infekcje jelitowe, natomiast OS typu R3 dominuje wśród izolatów produkujących verotoksynę (np. E. coli O157:H7) [3].

PL 223 203 B1

Analiza profilów endotoksynowych MALDI-TOF MS pozwala na rozróżnienie Enterobacteriaceae mających LPS różniące się strukturą OS rdzenia.

Jak opisano powyżej, sposób wg wynalazku polega na generowaniu unikatowych spektralnych profilów masowych pełnych komórek bakteryjnych z zastosowaniem trybu jonizacji ujemnej MALDI-TOF MS. Metoda ta pozwala na obserwację unikatowych składników oligosacharydowych w obrębie antygenów bakteryjnych i uzyskanie informacji o ich profilu. Przedmiotowy wynalazek pozwala na badanie specyficznych biomarkerów o strukturze oligosacharydowej, które różnicują bakterie różnych gatunków i szczepów umożliwiając skuteczną identyfikację chemotypów lipopolisacharydowych mikroorganizmów. Przedmiotowe rozwiązanie może służyć do analizy próbek klinicznych, diagnozy i nfekcji powodowanych przez bakterie Gram-ujemne oraz mieć zastosowanie jako narzędzie w terapii nakierowanej na antygen O z pomocą swoistych przeciwciał.

Wynalazek uwidoczniono na poniższych figurach.

Fig. 1. Procedura preparacji masy bakterii Gram-ujemnych do analizy profilu endotoksynowego MALDI-TOF MS (zmodyfikowana procedura preparacji próbki do analizy MALDI-TOF MS według noty aplikacyjnej MT80, Bruker Daltonics), umożliwiająca bezpośrednią obserwację LPS/LOS.

Fig. 2. Profil endotoksynowy komórek Bordetella pertussis. Widmo MALDI-TOF MS B. pertussis z zastosowaniem DHB (w ACN/ 0,1% TFA w stosunku 30/70) jako matrycy. Widmo wykonane z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Fig. 3. Widmo MALDI-TOF MS LOS Bordetella pertussis 186 rejestrowane w trybie ujemnym z zastosowaniem DHB (A) tryb liniowy, (B) reflektron; gdzie: Hep - heptoza, PPEtN - reszta pirofosfoetanolaminy, P - grupa fosforanowa, Ac - grupa acetylowa, H₂O - cząsteczka wody, C₁₄OH - reszta kwasu tłuszczowego. Widmo wykonane z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Fig. 4. Interpretacja jonów odpowiadających cząsteczkom obserwowanym na widmach MALDI-MS LOS lub OS B. pertussis 186.

Fig. 5. Widmo MALDI-TOF MS uzyskane bezpośrednio dla preparatu masy enterobakterii (preparat bakterii Salmonella bez trawienia enzymatycznego). Widmo wykonane z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Fig. 6. Widmo MALDI-TOF MS uzyskane dla preparatu masy bakteryjnej Salmonella po trawieniu enzymem proteolitycznym. Widmo wykonane z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Fig. 7. Widmo MALDI-TOF MS LPS Salmonella po trawieniu enzymem proteolitycznym. Widmo wykonane z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Fig. 8. Widma MALDI-TOF MS pełnych komórek E. coli. Porównanie profilów endotoksynowych E. coli różniących się typem OS rdzenia: R1 i R3. Widmo wykonane z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Fig. 9. Widma MALDI-TOF MS LPS E. coli mających LPS typu S w zakresie m/z od 1600 do 2100 przedstawiające sygnały pochodzące od OS rdzenia oraz lipidu A. Wykonano widma MALDITOF MS LPS E. coli serotypów: O5, O6, O39, O64 i O111. Widma wykonano z użyciem instrumentu Autoflex III, Bruker Daltonics.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładach wykonania nie ograniczających jego ochrony.

P r z y k ł a d 1. Profil endotoksynowy MALDI-TOF MS Bordetella pertussis

Kolonie Bordetella pertussis zebrano z podłoża hodowlanego i inaktywowano 80% etanolem, a następnie ekstrahowano kwasem mrówkowym z zachowaniem masy bakteryjnej do analizy MALDITOF MS wg Fig. 1. Ekstrakcja polegała na użyciu 70% kwasu mrówkowego i równej ilości acetonitrylu z etapami strącania przez wirowanie (zmodyfikowana procedura preparacji próbki do analizy MALDITOF MS według noty aplikacyjnej MT80, Bruker Daltonics). Masę B. pertussis zmieszano z DHB i wykonano widmo MALDI-TOF MS pełnych komórek bakteryjnych (Fig. 2). Widmo to uzyskano w trybie ujemnych spektrometru MALDI-TOF Autoflex III, Bruker Daltonics. Pochodzenie profilów od cząsteczek LPS potwierdzono poprzez porównanie z widmami MALDI-TOF MS izolowanych LPS (Fig. 3).

Uzyskano profil endotoksynowy MALDI-TOF MS B. pertussis zgodny z profilem MALDI-TOF MS izolowanego LPS. Sygnały w zakresie m/z od 2200 do 2600 odpowiadają jonom pochodzącym od cząsteczek oligocukru rdzenia LPS (Fig. 4). Dla OS rdzenia obserwowane są jony odpowiadające anhydrododekasacharydowi (m/z 2291,63) oraz jego formie pirofosforylowanej i podstawionej cząsteczką pirofosforyloetanolaminy (m/z 2452,57 i 2497,13). Najbardziej intensywny jon (m/z 2231,43) wskazuje na utratę neutralnej cząsteczki CO2 (-44 Da) z anhydrododekasacharydu. Obserwuje się także kilka glikoform pozbawionych terminalnej heptozy zidentyfikowanych wśród jonów o m/z 2231 i 2039, 2274 i 2028, 2452 i 2260. W widmie izolowanego LOS sygnały w niższym zakresie mas odpo6

PL 223 203 B1 wiadają lipidowi A (m/z 1558,95), natomiast w wyższym zakresie mas obserwuje się jony pochodzące od pełnego lipooligosacharydu (m/z 4056,65). Obserwacja jonów pochodzących od cząsteczki lipidu A w preparacie mas bakteryjnych może wynikać z obecności LOS oddysocjowanego od komórki bakteryjnej.

Porównanie profilów endotoksynowych komórek B. pertussis z profilem cząsteczek LOS B. pertussis pozwala zidentyfikować kolonię bakteryjną jako B. pertussis. Uzyskany profil endotoksynowy pełnych komórek bakteryjnych stanowi referencyjne widmo w bazie danych i służy jako profil odniesienia dla analizy nieznanych kolonii bakteryjnych.

P r z y k ł a d 2. Profile endotoksynowe MALDI-TOF MS enterobakterii

W przypadku zbadanych enterobakterii obserwuje się obecność jonów „przeszkadzających” w widmach MALDI-TOF MS pełnych komórek bakteryjnych w zakresie m/z pochodzącym od cząsteczki LPS (Fig. 5). Przygotowanie preparatów bakteryjnych dla analizy MALDI-TOF MS polega na traktowaniu izolowanych preparatów enterobakteryjnych enzymem proteolitycznym, takim jak Proteinaza K. Enzymatyczna preparacja mas enterobakterii pozwala na usunięcie cząsteczek, które generują jony „przeszkadzające” oraz na obserwację profilów endotoksynowych (Fig. 6).

Kolonie enterobakteryjne zebrano z podłoża hodowlanego za pomocą ezy i zawieszono w PBS, a następnie poddano trawieniu Proteinazą K przez 2 doby w 4°C z mieszaniem (20 μg enzymu na około 10 mg masy bakteryjnej). Po upływie około 48h zawiesinę odwirowano (35000xg, 20'), supernatant odrzucono, a osad przemywano wodą destylowaną. Masę enterobakterii zliofilizowano i użyto do analizy w trybie ujemnym MALDI-TOF MS po zmieszaniu z DHB jako matrycą. Na widmach komórek enterobakterii obserwowano sygnały zgodne z sygnałami widm MALDI-TOF MS izolowanych LPS (Fig. 7). Uzyskany profil endotoksynowy pełnych komórek bakteryjnych stanowi referencyjne widmo w bazie danych i służy jako profil odniesienia dla analizy nieznanych kolonii bakteryjnych.

P r z y k ł a d 3. Identyfikacja szczepów E. coli różniących się typem rdzenia R1 i R3

Kolonie enterobakteryjne zebrano z podłoża hodowlanego za pomocą ezy i zawieszono w PBS, a następnie poddano trawieniu Proteinazą K przez 2 doby w 4°C z mieszaniem (20 μg enzymu na około 10 mg masy bakteryjnej). Po upływie około 48h zawiesinę odwirowano (35000xg, 20'), supernatant odrzucono, a osad przemywano wodą destylowaną. Preparat masy enterobakterii zliofilizowano i użyto do analizy w trybie ujemnym MALDI-TOF MS. Na widmach komórek enterobakterii obserwowano sygnały zgodne z sygnałami widm MALDI-TOF MS izolowanych LPS. Porównanie widm MALDITOF MS w zakresie m/z odpowiadającemu jonom pochodzącym od LPS pozwala rozróżnić typy OS rdzenia np. R1 i R3 (Fig. 8). Obserwuje się także istotne różnice w profilu wynikające z heterogenności OS rdzenia pod względem reszt cukrowych i grup acetylowych. Porównanie tych widm pozwoliło zidentyfikować szczep bakteryjny. Uzyskany profil endotoksynowy pełnych komórek bakteryjnych stanowi referencyjne widmo w bazie danych i służy jako profil odniesienia dla analizy nieznanych k olonii bakteryjnych.

P r z y k ł a d 4. Referencyjna baza danych profilów endotoksynowych bakterii Gram-ujemnych mających LPS typu S

Lipopolisacharydy E. coli izolowano metodą wodno-fenolową według Westphala. Widma MALDI-TOF MS izolowanych LPS wykonano w trybie jonizacji ujemnej MALDI-TOF MS po zmieszaniu z DHB jako matrycą. W widmach MALDI-TOF MS analizowanych LPS zaobserwowano jony pochodzące od oligosacharydów rdzenia oraz lipidu A (Fig. 9). Profile pochodzące od OS rdzenia są o dmienne dla każdego z analizowanych szczepów bakteryjnych (E. coli O5, O6, O39, O64 i O111) ze względu na heterogenność tych cząsteczek. Analizowane profile endotoksynowe są unikatowe i p ozwalają rozróżnić bakterie różniące się w obrębie OS rdzenia. Uzyskane widma MALDI-TOF MS izolowanych LPS umieszczono w referencyjnej bazie danych profilów endotoksynowych bakterii Gram ujemnych. Identyfikacja bakterii mających LPS typu S polega na porównaniu widm MALDI-TOF MS preparatów mas bakteryjnych z widmami w bazie danych w oparciu o sygnały pochodzące od OS rdzenia. Dla szczepów E. coli mających wspólny typ rdzenia - R1 (E. coli O5, O6, O39, O64) zaobserwowano w widmach MALDI-TOF MS odmienne profile endotoksynowe. Różnice w profilach endotoksynowych analizowanych szczepów, pomimo posiadania wspólnego typu rdzenia mogą wynikać z naturalnej heterogenności cząsteczek LPS. Różnice obserwuje się także w porównaniu z widmem E. coli O111 mającej typ rdzenia R3.

Bordetella pertussis 186 otrzymano z kolekcji Zakładu Profilaktyki Zakażeń i Zakażeń Szpitalnych Narodowego Instytutu Leków, Warszawa. Pozostałe szczepy: Salmonella typhimurium Ra,

PL 223 203 B1

Escherichia coli (R1, R3, 06, 05, 064, 039) otrzymano z Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM), Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław.

Literatura:

1. Łukasiewicz J., Ługowski C., „Biologiczna aktywność lipopolisacharydu” Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 57 (2003): 33-53.

2. Wang L., Wang Q., Reeves P. R „The variation of O antigens in Gram-negative bacteria” in Subcellular Biochemistry 53, chapter 6 (2010), 123-152.

3. Raetz C. R, Whitfiel C. „Lipopolisaccharide endotoxin” Annu Rev Biochem., 71 (2002): 635-700.

4. Banoub J. H., El Aneed A., Cohen A. M., Joly N., „Structural lnvestigation of Bacterial Lipopolysaccharides by Mass Spectrometry and Tandem Mass Spectrometry.” Mass Spectrometry Reviews, 29 (2010): 606-650.

5. van Baar B L., „Characterisation of Bacteria by Matrix-assisted Laser Desorption/ionisation and Electrospray Mass Spectrometry.” FEMS Microbiology Reviews, 24 (2000): 193-219.

6. Caroff M., Karibian D., „Structure of Bacterial Lipopolysaccharides.” Carbohydrate Research, 338 (2003): 2431-2447.

7. Harvey J. D. „Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohyd rates” Mass Spectrometry Reviews, 18 (1999): 349-451.

8. Jachymek W., Niedziela T, Petersson C., Ługowski C., Czaja J., Kenne L., „Structures of the O-specific polysaccharides from Yokenella regensburgei (Koserella trabulsii) strains PCM 2476, 2477, 2478, and 2494: high-resolution magic-angle spinning NMR investigation of the O-specific polysaccharides in native lipopolysaccharides and directly on the surface of living bacteria” Biochemistry, 38 (1999): 11788-11795.

9. Sturial L., Garozzo D., Silipo A., Lanzetta R., Parrilli M., Molinaro A., „New conditions for matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry of native bacterial R-type lipopolysaccharides” Rapid Communications in Mass Spectrometry, 19 (2005): 1829-1834.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób identyfikacji chemotypów lipopolisacharydowych bakterii Gram-ujemnych z zastosowaniem metody MALDI-TOF MS, znamienny tym, że

a) przygotowuje się preparat masy bakteryjnej do analizy profilu pełnych komórek bakteryjnych metodą MALDI-TOF MS,

b) preparat masy bakteryjnej analizuje się w trybie ujemnym MALDI-TOF MS w zakresie sygnałów pochodzących od jonów cząsteczek LPS znajdujących się na powierzchni komórek bakteryjnych, zwłaszcza oligocukrów rdzenia LPS, oligocukrów wchodzących w skład O antygenu, lipidu A lub pełnego LPS.

c) otrzymuje się spektralny profil endotoksynowy pełnych komórek bakteryjnych charakterystyczny dla danego szczepu bakteryjnego.

d) uzyskany spektralny profil endotoksynowy preparatu masy bakteryjnej porównuje się z referencyjną bazą danych zawierająca profile spektralne MALDI-TOF MS szczepów bakteryjnych, przy czym jako matrycę dla preparowanych kolonii bakteryjnych stosuje się kwas 2,4-dihydroksybenzoesowy (DHB).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał do otrzymania preparatu stanowi kolonia bakteryjna z podłoża hodowlanego lub osad po odwirowaniu masy bakteryjnej z hodowli na podłożu płynnym.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że preparat masy bakteryjnej otrzymuje się w wyniku inaktywacji i ekstrakcji bakterii z kwasem mrówkowym.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że preparat masy bakteryjnej otrzymuje się w wyniku traktowania bakterii enzymem proteolitycznym.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że widma MALDI-TOF MS analizowane są w zakresie m/z od 700 do 50000.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że widma MALDI-TOF MS analizowane są w zakresie m/z od 700 do 4000.