2DESCRIPCIÓNMétodo y dispositivo para detección de bacterias enterasAntecedentes de la invención5La presente invención se refiere a un dispositivo diagnóstico inmediatopara detectar bacterias enteras en una fuente de agua, un método para detectar bacterias enteras de una fuente de agua con el uso del dispositivo y un método para hacer el dispositivo.10Según el World Health Report (OMS, 2002), 3,4 millones de personas mueren cada año por causas relacionadas con el agua, saneamiento, e higiene, el 99% delas cuales se produce en el mundo en desarrollo. Elcontaminante causante de enfermedad más común encontrado en suministros de agua es la bacteria fecal E. coli, aunque otras bacterias patógenas, tal como Enterobacter, Salmonella, Shigellay Pseudomonas, también se 15encuentran comúnmente. Como resultado de la contaminación por aguas residuales, o debido a la desinfección inadecuada en plantas de tratamiento de aguas residuales, estas bacterias patógenas entran en nuestros suministros de agua y alimentos. Cuando se consumen, estas bacterias pueden producir varias enfermedades que incluyen diarrea, infecciones del aparato urinario, y meningitis.20En particular, la presencia de E. colise ha usado durante muchos años para indicar la calidad microbiana de los suministros de agua. Como resultado, los suministradores del servicio de agua y autoridades del servicio de agua controlan regularmente la presencia de esta bacteria en los suministros de agua. Cuando se trata de forma apropiada, debe haber 25de poca aninguna E. colien el agua. Los niveles aceptables de esta bacteria en el agua potable es 0 unidades formadoras de colonias (ufc) en 100 ml (SANS 241 2011, OMS, 2011), y 1000 ufc en 100 ml de agua residual tratada (Tshwane Water, Sudáfrica).Los métodos de detección convencionales para bacterias patógenas de transmisión hídrica 30incluyen filtración en membrana y fermentación en tubo múltiple (Rompre et al. 2002)y requieren un periodo de enriquecimiento de 24-48 horas. Este tiempo de detección prolongado deja a los usuarios del agua expuestos a suministros de agua potencialmente dañinos, y a los usuarios con frecuencia solo se les notifica sobre la contaminación cuando ya es demasiado tarde. Además, se requieren instalaciones de laboratorio y microbiólogos 35entrenados para realizar estas pruebas, que son caras y con frecuencia están confinadas a
3laboratorios urbanos, lo que requiere el transportede las muestras al laboratorio, que hace que el ensayo de las fuentes de agua en áreas remotas solo se produzca raramente.Los expertos en la materia conocen bien los dispositivos de flujo lateral tradicionales. Hasta la fecha, estos dispositivos se han usado para detectar, entre otros, bacterias patógenas y 5toxinas, virus infecciosos, fármacos y pesticidas. Sin embargo, para aplicar los anticuerpos usados para la detección en la tira de prueba de flujo lateral de una manera fiable, reproducible, se requieren máquinas muy caras, que dispensan volúmenes bajos. Como resultado, muchos grupos de investigación con experiencia en sensoresbiológicos, pero con financiación limitada, no pueden profundizar fácilmente en el desarrollo demedios 10diagnósticosbasadosen flujo lateral de bajo coste. Esto afecta la velocidad a la que se desarrollan medios diagnósticos que salvan vidas. Para facilitar la detección usando sustratos de papel para investigación y desarrollo en áreas con baja financiación, los dispositivos microfluídicos basados en papel pueden ofrecer una solución. Estos no utilizan varios papeles especializados (como membranas y almohadillas de conjugado). Se fabrican 15usando una única pieza de papel (habitualmente papel de cromatografía), y o bien se cortan en un patrón específico o utilizan barreras hidrofóbicas para guiar la muestra hacia las zonas de detección. Estas zonas están precargadas con reactivos de detección que se aplican en el sitio usando una pipeta. Como resultado, estos sensores no necesitan máquinas de dispensar caras para la fabricación, y puesto que una única pieza de papel forma el 20dispositivo en vez detres o cuatro, la fabricación se hace más fácil.Sin embargo, se ha realizado poco trabajo para caracterizar y entender la interacción entre papel de cromatografía, el papel comúnmente usado para la construcción del dispositivo, y los reactivos biológicos o químicos usados para la detección enel dispositivo. Por tanto, se 25sabe poco sobre el efecto que tiene el papel de cromatografía sobre la sensibilidad del dispositivo. Por otra parte, las membranas de nitrocelulosa, el tipo más común de papel usado en pruebas de flujo lateral, se hancaracterizado bien.Por tanto, el solicitante empezó con el desarrollo de una prueba de flujo lateral tradicional 30primero y calibró el rendimientodel mecanismo de detección en esta plataforma mejor establecida, antes de aplicarla a un dispositivo microfluídico basado en papel. De esta manera, cualquier cambio en términos de capacidades sensorasdebido al uso de papel de cromatografía más que membranas especializadas, se podría identificar inmediatamente. Actualmente no existe un verdadero método de bajo coste para la fabricación de pruebas de 35flujo lateral. Sin embargo, el solicitante ha demostrado que más que requerir el uso de
4equipo caro para depositar líneas de reactivo en el sustrato de prueba, como se realiza tradicionalmente, se puede usar simplemente una pipeta para depositar manchas de reactivo.Los investigadores trabajando con recursos limitados pueden, por tanto, usar dispositivos de 5flujo lateral de esta manera para demostrar la prueba de concepto de una manera de bajo coste. Además, los investigadores en el campo de microfluidos basados en papel pueden usar esta técnica para el desarrollo inicial y optimización de mecanismos sensoresantes de transferir la metodología a un dispositivo microfluídico basado en papel.De esta manera, cualquier problema que surja durante el desarrollo del dispositivo microfluídico basado en 10papel se puede atribuir inmediatamente al papel o al nuevo formato de sensor mismo, ya que el mecanismo de detección ya se ha demostrado operacional.La presente invención describe el desarrollo y optimización de una prueba de flujo lateral para la detección de E. colien fuentes de agua y su incorporación de la prueba de flujo 15lateral optimizada y bien caracterizada en un dispositivo microfluídico basado en papel. El mecanismo sensor del sistema de prueba (basado en tecnología de inmunoensayo) se optimizó primero en la prueba de flujo lateral, y solo después se transfirió al dispositivo microfluídico basado en papel debido que era una plataforma de prueba bien establecida y mejor entendida. En contraste con los dispositivos microfluídicos basados en papel, las 20pruebas de flujo lateral se construyen usando tipos de papel especialmente desarrollados para fomentar la función de inmunoensayo, transferencia de analito, etc. Como resultado, estos tipos de papel permitirán la optimización del mecanismo sensor sin ninguna influencia negativa del papel mismo. Los dispositivos microfluídicos basados en papel, por otra parte, hacen uso de tipos de papel menos especializados, de menores costes, tal como papel de 25cromatografía. Estos tipos de papeles son más robustos, son menos sensibles a condiciones medioambientales, y pueden resistir los procesos de impresión y calentamiento usados durante la fabricación de dispositivos microfluídicos basados en papel. Como estos tipos de papeles no están diseñados para fomentar la funcionalidad de inmunoensayo, pueden influir en el mecanismo sensor de una manera negativa. Sin embargo, el 30rendimiento óptimo del mecanismo sensor, determinado usando el formato de prueba de flujo lateral, servirá como una directriz sobre cómo debe rendir el dispositivo microfluídico basado en papel. Si el cambio influye negativamente en los sistemas sensores, la razón podría deberse casi exclusivamente al cambio en el tipo de papel, ya que no hicieron otros cambios al sistema sensor. Como resultado, se puede tomar pasos para superar esto y 35restablecer el rendimiento del sensor al obtenido en la prueba de flujo lateral optimizada.
5Existen varias técnicas de fabricación de dispositivos microfluídicos basados en papel. Estas incluyen fotolitografía, trazado con polidimetilsiloxano (PDMS), impresión en cera, corte láser y grabado con plasma e inyección de tinta (Dungchai et al. 2011). La técnica de fotolitografía, mientras que es cara, crea dispositivos de alta resolución. Este método 5requiere el uso de instalaciones de salas limpias que incluyen fuentes de luz UV, fotorresistores caros y plasma de oxígeno. La técnica de fabricación de PDMS hace uso de un trazador de escritorio estándar para depositar gotitas de PDMS en papel en un patrón deseado. Es menos caro que la fotolitografía, pero tiene una resolución menor. Produce dispositivos que son flexibles, un requisito importante ya que estos dispositivos con10frecuencia están expuestos a tensiones mecánicas tal como flexión y plegamiento. La impresión encera usa una impresora de tinta sólida que deposita cera en la superficie del papel. La cera se funde después en la profundidad del papel usando una placa calefactorao un horno. El tiempo total de fabricación es menor de 5 minutos y no requiere el uso de solventes orgánicos o cualquier pretratamiento del papel. Una impresora de cera sólida, 15aunquecara, es capaz de fabricar dispositivos a aproximadamente 0,001$ por dispositivo, que es menos caro que todas las otras técnicas mencionadas. Esta técnica de impresión también se aumenta a escala más fácilmente para la producción en masa comparada con los otros procesos. Se prevé que la producción a gran escala sea similar a las técnicas de imprimir periódicos. La cera también es más ecológica, fácilmente disponible y estable a 20altas temperaturas (60ºC), temperaturas que son comunes en países en desarrollo. La resolución de los dispositivos impresos con cera es típicamente menor que los otros métodos de fabricación, y estoes debido al paso de fusión requerido en el proceso. Otros grupos han desarrollado métodos de serigrafía para eliminar la necesidad para una impresora de tinta sólida cara. Sin embargo, el aumento a escala de tal técnica de 25producción se ha demostrado difícil.Los solicitantes exploraron el uso de la técnica de fabricación de impresión en cera para crear un dispositivo microfluídico basado en papel para la detección de E. colien agua. Se investigaronlos parámetros de fabricación óptimos, tal como como los tiempos de fusión de 30la cera óptimos, las temperaturas de fusión y espesor óptimo de la línea. Hasta la fecha solo se han encontrado unos pocos estudios que describen el tiempo de fusión óptimo y temperaturas de fusión, así como la fuente de calor óptima.Por último, se creó un dispositivo microfluídico basado en papel usando todos los 35parámetros óptimos determinados en los estudios anteriormente mencionados. Este
6dispositivo se combinó después con el mecanismo sensor de inmunoensayo optimizado en los ejemplos 1 y 2, para crear un sensor de E. colide bajo coste.Hossain et al.(2012) desarrollaron un sensor de papel para detectar E. coliy coliformes en agua recreacional. Este dispositivo se fabricó cortando papel de cromatografía Whatman no. 51 en tiras de prueba individuales y cargándolas con reactivos sensores. No se usó la técnica de impresión en cera. Como resultado, el movimiento de fluido hacia las zonas de detección se controló puramente por la forma y dimensiones de la tira de prueba. Para aplicar la prueba al análisis de agua potable (donde se debe detectar tan poco como 1 ufc/100 ml), se usó un paso combinado de separación inmunomagnética (IMS) y cultivo de 8 horas. Como 10se emplea tecnología enzima-sustrato en el sensor, también se requiere la lisis química de la muestra. Debido a estos requisitos de preparación de la muestra especializados, el sensor no se puede emplear en el campo por trabajadores semicualificados, y el coste de la prueba sube, negando el beneficio de usar sustrato de papel de bajo coste. Además, la IMS contribuye significativamente al coste, de modo que es vital identificar otros medios de 15preconcentración para reducir el coste de la prueba.Jokerst et al.(2011) desarrollaron una prueba colorimétrica basada en papel que utiliza tecnología enzima-sustrato para detectar patógenos microbianos en muestras de alimentos. El dispositivo se fabricó imprimiendo y después fundiendo círculos de cera en papel de 20cromatografía Whatmanno. 1. Estos círculos sirven como los pocillos en esta placa similar aELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción) basado en papel, a los que los reactivos y muestra se tienen que añadir manualmente para que se produzca la detección. Como resultado, el dispositivo no permite la administración autónoma de la muestra en las zonas de detección, como el dispositivo que se desarrolla en este artículo. Para detectar E. coli, el 25sensor desarrollado por Jokerst et alse dirige a B-galactosidasa, la enzima común a todas las coliformes y por tanto E. coli. Dirigiéndose a esta enzima, el sensor detectará todas las coliformes en una muestra, y por tanto no se puede considerar un sensor selectivo de E. coli. Puesto que se dirige a una enzima, se requiere además lisis bacteriana antes del análisis. Para detectar bajos números de E. coli(10 ufc), se requiere un periodo de 30enriquecimiento de 12 horas. Como el autor fue incapaz de mostrar la detección deuna única E. coli, el dispositivo no se puede usar para análisis de aguapotable. El sensor se estructura como una placa de ELISA, de modo que la muestra y los reactivos se deben añadir en las zonas de detección manualmente. Como resultado, el sensor solo se puede usar por personal de laboratorio entrenado. Debido a la necesidad de lisis, enriquecimiento, 35
7y adición manual de reactivos, el sensor se vuelve inadecuado para uso en el campo por trabajadores no cualificados.Por tanto, un dispositivo de prueba diagnóstica inmediato, sencillo que se pueda usar en la fuente de agua, negando la necesidad para el transporte de muestras y pruebas de 5laboratorio por personal cualificado sería muy beneficioso.Compendio de la invenciónSegún un primer aspecto de la invención, se proporciona un dispositivo diagnóstico 10inmediatopara la detección de bacterias enteras en una muestra fluida, en particular una muestra de agua.El dispositivo diagnóstico inmediatopuede ser un sensor de flujo lateral o dispositivo microfluídico basado en papel.15El dispositivo diagnóstico inmediatopuede comprender además uno o más anticuerpos policlonales específicos para detectar una especie de bacterias enteras.Las bacterias enteras se pueden seleccionar del grupo Enterobacteriaceae, que comprende 20una cualquiera o más deSalmonellasp., Shigellasp., Klebsiellasp., Escherichia coli(E. coli) sp. o Pseudomonassp.). Preferiblemente, las bacterias enteras sonE. coli sp.Preferiblemente, la especie de bacterias enteras comprende múltiples cepas de bacterias en esta especie.25El uno o más anticuerpos policlonales específicos para las bacterias enteras pueden ser un anticuerpo de captura(Ac). El uno o más anticuerpos policlonales puede ser un anticuerpo de detección. Preferiblemente, el uno o más anticuerpos policlonales son tanto un anticuerpo de captura como uno de detección. Los anticuerpos policlonales de captura y 30detección pueden ser el mismo anticuerpo policlonal o diferentes anticuerpos policlonales específicos para las bacterias enteras.El dispositivo diagnóstico inmediatopuede comprender además unanticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo específico para la bacteria entera.El anticuerpo monoclonal o 35fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de captura. El anticuerpo monoclonal o
8fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de detección. Por ejemplo, donde el anticuerpo policlonal es un anticuerpo de captura, el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de detección. Alternativamente, donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de detección, el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de captura.5Típicamente, el anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de detecciónestá marcado con una molécula indicadora.La molécula indicadora puede ser cualquiera de un indicador cromatográfico, óptico, 10fluorescente, basado en transferencia de electrones, radiomarcado u otro conocido para los expertos en la materia. Preferiblemente la partícula indicadora es una nanopartícula de oro.El dispositivo diagnóstico inmediato puede comprender además un anticuerpo control. El anticuerpo control puede ser un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal o fragmento 15de anticuerpo del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo control puede ser un anticuerpo contra el anticuerpo de detección.Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento F(ab’)2, fragmento Fab o fragmento Fab quimérico (cFab).20Típicamente, el dispositivo de flujo lateral comprende:(i)una almohadilla de muestra, para cargar la muestra de prueba fluida;(ii)unaalmohadilla de conjugado, que comprende un anticuerpo de detección policlonal 25o monoclonal o fragmento de anticuerpo, en donde el anticuerpo de detección o fragmento de anticuerpo se une a un antígeno O y/o K en la superficie de la bacteria entera, en donde el anticuerpo de detección está marcado con una molécula indicadora;(iii)una membrana de prueba, que tiene dos regiones, en donde la primera región 30comprende un anticuerpo de captura policlonal o monoclonal o fragmento de anticuerpo en donde el anticuerpo de captura o fragmento de anticuerpo se une a un antígeno O y/o K en la superficie de la bacteria entera marcada con el anticuerpo de detección y en donde la segunda región comprende un anticuerpo control policlonal o monoclonal o fragmento específico para la detección del 35anticuerpo de detección; y
9(iv)una mecha absorbente,en donde las cuatro secciones solapantes están en conexión fluida entre sí;en donde si la almohadilla de conjugado comprende un anticuerpo policlonal, la membrana de prueba puede comprenderun anticuerpo policlonal diferente o igual, y en donde si la almohadilla de conjugado comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento, la membrana 5de prueba comprende un anticuerpo policlonal y si la membrana de prueba comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento, la almohadilla de conjugado comprende un anticuerpo policlonal.Por ejemplo, la almohadilla de conjugado puede ser una membrana de fibra de vidrio, o 10cualquier otra almohadilla de conjugado adecuada que conozcan los expertos en la materia. Por ejemplo, la membrana de prueba puede ser una membrana de nitrocelulosa conocida para los expertos en la materia.Preferiblemente, la membrana de prueba comprende además el anticuerpo control.15Típicamente, el dispositivo microfluídico basado en papel comprende:(i)un sustrato de papel; y(ii)un conducto microfluídico definido por una barrera hidrofóbica en el sustrato de 20papel,en donde el conducto microfluídico comprende una zona de entrada de la muestra, una zona de conjugado, una zona de prueba y una mecha;en donde la zona de conjugado, comprende un anticuerpo de detección policlonal o monoclonal o fragmento de anticuerpo y en donde el anticuerpo de detección o fragmento 25de anticuerpo se une a un antígeno O y/o K en la superficie de la bacteria entera, en donde el anticuerpo de detección está marcado con una molécula indicadora; yen donde la zona de prueba comprende una primera región comprende un anticuerpo de captura policlonal o monoclonal o fragmento de anticuerpo, y en donde el anticuerpo de captura o fragmento de anticuerpo se une a un antígeno O y/o K en la superficie del 30anticuerpo de detección-bacteria entera marcada y una segunda región que comprende un anticuerpo control policlonal o monoclonal o fragmento específico para la detección del anticuerpode detección. El uno o más anticuerpos policlonales pueden ser un anticuerpo de captura o un anticuerpo de detección. Por ejemplo, el anticuerpo de captura policlonal puede ser el mismo o un anticuerpo policlonal diferente al anticuerpo de detección policlonal.35
10El conducto microfluídico se puede definir por un margen de cera fundida que forma una barrera de cera hidrofóbica que penetra la sección transversal del sustrato de papel.El sustrato de papel puede ser un papel de cromatografía. Por ejemplo, el sustrato de papel puede ser papel de cromatografía Whatman no. 1.5La zona de prueba del dispositivo puede comprender además un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo contra la bacteria entera. El anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de captura. El anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de detección. Por ejemplo, donde el anticuerpo 10policlonal es un anticuerpo de captura, el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de detección. Alternativamente, donde el anticuerpo policlonal es un anticuerpo de detección, el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de captura.15Preferiblemente, el área de prueba del dispositivo comprende el anticuerpo control.En particular, el conducto microfluídico puede definir una pluralidad de zonas en el área de prueba. Por ejemplo, el área de prueba puede comprender una zona de entrada de la muestra, una zona de detección y una zona de mecha en comunicación fluida en el área de 20prueba. Preferiblemente, la zona de detección comprende una zona de prueba y una zona control. Más preferiblemente, la zona de entrada de la muestra está en comunicación fluida con una zona de conjugado que está además en comunicación fluida con la zona de detección.25En particular, el conducto microfluídico se puede definir por un margen de cera impreso que tiene una anchura de entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 1000 µm. Preferiblemente, el margen de cera impreso tiene una anchura de aproximadamente 500 µm.30El dispositivo microfluídico basado en papel o dispositivo de flujo lateral puede comprender además una escala de calibración para la cuantificación de resultados colorimétricos impresaen el sustrato de papel.
11La presencia de una señal positiva en el dispositivo de flujo lateral o dispositivo microfluídico de una muestra fluida que se ha precultivado en un caldo nutriente durante entre 5 y 6 horas es indicativade que la muestra fluida contiene 9000 ufc o menos de la bacteria entera.Similarmente, la presencia de una señal positiva de una muestra fluida que se ha 5precultivado en un caldo nutriente durante 15 horas es indicativa de que la muestra fluida contiene entre 1 y 9 ufc de la bacteria entera.Según una forma de realización adicional de la invención, se proporciona un método de detectar bacterias enteras en una muestra fluida con el uso del dispositivo diagnóstico 10inmediato de la invención.El dispositivo diagnóstico inmediato puede ser un sensor de flujo lateral oun dispositivo microfluídico basado en papel.15El método puede comprender un paso de poner en contacto uno o más anticuerpos policlonales específicos para una especie de bacterias enteras que se va a detectar con las bacterias enteras.Las bacterias enteras se pueden seleccionar del grupo Enterobacteriaceae, que comprende 20una cualquiera o más deSalmonellasp., Shigellasp., Klebsiellasp., Escherichia coli(E. coli) sp. o Pseudomonassp. Preferiblemente, las bacterias enteras sonE. coli sp.Preferiblemente, la especie de bacterias enteras comprende múltiples cepas de bacterias en esta especie.25En particular, el método comprende los pasos de:(i)cargar una muestra fluida que comprende las bacterias enteras en el dispositivo;(ii)poner en contacto las bacterias enteras en la muestra con un anticuerpo de 30detección policlonal o monoclonal o fragmento de anticuerpo para producir la detección de bacterias enteras marcadas con anticuerpode deteccióny anticuerpo de detección restante;(iii)poner en contacto las bacterias enteras marcadas con anticuerpode detecciónen la muestra con un anticuerpo de captura policlonal o monoclonal o fragmento de 35anticuerpo en una zona o membrana de prueba del dispositivo; y
12(iv)detectar si se produce una señal positiva o no en la zona o membrana de prueba del dispositivo,en donde si el anticuerpo de detección es un anticuerpo monoclonal o fragmento, el anticuerpo de captura es un anticuerpo policlonal y si el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal o fragmento, el anticuerpo de detección es un anticuerpo policlonal.5Preferiblemente, los anticuerpos de detección y captura son ambos anticuerpos policlonales. Los anticuerpos de detección y captura policlonales pueden ser el mismo o diferentes anticuerpos policlonales.10El método puedecomprender además un paso de poner en contacto el anticuerpo de detección restante del paso (ii) con un anticuerpo control en una zona o membrana de prueba del dispositivo, en cuyo caso una señal positiva en la zona de prueba y control del dispositivo indica que la muestra fluida es positiva para las bacterias enteras y una señal negativa en la zona de prueba y señal positiva en la zona control del dispositivo indica que la 15muestra fluida es negativa para las bacterias enteras.La señal positiva puede seruna señal cromatográfica, óptica, fluorescente, basada en transferencia de electrones, radiomarcada u otra.20El método puede comprender además un paso de comparar una intensidad de la señal positiva con una escala de calibración para cuantificar de esta manera la cantidad de bacterias presentes en la muestra fluida. Por ejemplo, donde el dispositivo es un dispositivo microfluídico basado en papel la escala de calibración puede estar impresa en el sustrato de papel.25El método puede comprender además un paso de precultivo de las bacterias. Por ejemplo, las bacterias se pueden incubar durante un periodo desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 18 horas. El método puede comprender además un paso de cuantificar el número de bacterias enteras en la muestra fluida precultivando la muestra fluida en un caldo 30nutriente y ensayando la presencia o ausencia de las bacterias enteras en el caldo nutriente durante el periodo de incubación.La presencia de una señal positiva en el dispositivo de flujo lateral o dispositivo microfluídico cuando se usa el método de la invención de una muestra fluida que se ha precultivado en un 35
13caldo nutriente durante entre 5 y 6 horas es indicativade que la muestra fluida contiene 9000 ufc o menos de las bacterias enteras.Similarmente, la presencia de una señal positiva en el dispositivo de flujo lateral o dispositivo microfluídico cuando se usa el método de la invención de una muestra fluida que se ha 5precultivado en un caldo nutriente durante 15 horas es indicativade que la muestra fluida contiene entre 1 y 9 ufc de las bacterias enteras.El método puede comprender además un paso de agitar con vórtex la muestra de bacterias antes de ensayar.10Preferiblemente, cuando se usa un paso de precultivo, el método es capaz de detectar solobacterias vivas. Por ejemplo, cuando no se usa un paso de precultivo y el nivel de bacterias en la muestra es igual a o mayor que el límite de detección de la prueba, la prueba es capaz de detectar bacterias muertas, vivas y viables, pero no cultivables.15Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de hacer un dispositivo diagnóstico inmediato de la invención para la detección de bacterias enteras en una muestra fluida.20En una forma de realización, el dispositivo diagnóstico inmediato es un sensor de flujo lateral.En particular, el método de hacer el dispositivo comprende los siguientes pasos:25(i)proporcionar una almohadilla de muestra, almohadilla de conjugado, membrana de prueba y una mecha absorbente en conexión fluídica entre sí;(ii)depositar un anticuerpo de detección policlonal o monoclonal o fragmento de anticuerpo específico para las bacterias enteras sobre la almohadilla de conjugado;30(iii)depositar un anticuerpo de captura policlonal o monoclonal o fragmento de anticuerpo específico para el organismo completo en la membrana de prueba,en donde si el anticuerpo de detección es un anticuerpo monoclonal o fragmento, el anticuerpo de captura es un anticuerpo policlonal y si el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal o fragmento, el anticuerpo de detección es un anticuerpo policlonal.35
14Preferiblemente, los anticuerpos de detección y captura son ambos anticuerpos policlonales. Los anticuerpos de detección y captura policlonales pueden ser el mismo o diferentes anticuerpos policlonales.El dispositivo puede comprender además depositar un anticuerpo control en la membrana 5de prueba del dispositivo. Por ejemplo, el anticuerpo control puede ser específico para el anticuerpo de detección. El anticuerpo control puede ser un anticuerpopoliclonal o monoclonal o un fragmento de anticuerpo.El mediode depositar puedeser una pipeta o con el uso de una máquina de franjeado de10reactivo automatizada.En otra forma de realización, el dispositivo diagnóstico inmediato es un dispositivo microfluídico basado en papel.15En particular, el método de hacer el dispositivo comprende los siguientes pasos:(i)proporcionar un sustrato de papel;(ii)definir un conducto microfluídico en el sustrato de papel para dirigir la muestra a través de un área de pruebadel dispositivo; y20(iii)depositar uno o más anticuerpos policlonales específicos para las bacterias enteras en el área de prueba del dispositivo.El paso de definir un conducto microfluídico se puede realizar por una técnica de fabricación de un dispositivo microfluídico tal como fotolitografía, trazado de polidimetilsiloxano (PDMS), 25impresión en cera, inmersión en cera, serigrafía de cera, corte láser, grabado en plasma o inyección de tinta o similares.Preferiblemente, el paso de definir un conducto microfluídico se realiza por impresión en cera, seguido por fusión de la cera para formar una barrera de cera hidrofóbica que penetra 30la sección transversal del sustrato de papel.El sustrato de papel puede ser papel de cromatografía. Por ejemplo, el sustrato depapel puede ser papel de cromatografía Whatman no. 1.35
15El uno o más anticuerpos policlonales pueden ser un anticuerpo de captura. El uno o más anticuerpos policlonales puede ser un anticuerpo de detección. Preferiblemente, el uno o más anticuerpos policlonales comprende tanto un anticuerpo de captura como uno de detección. El anticuerpo policlonal de captura y detección puede ser el mismo anticuerpo policlonal o diferentes anticuerpos policlonales específicos para las bacterias enteras.5El método puede comprender además un paso de depositar un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo específico para las bacterias enteras en el área de prueba del dispositivo. El anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de captura. El anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de 10detección. Por ejemplo, donde el anticuerpo policlonal es un anticuerpo de captura, el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de detección. Alternativamente,donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de detección, el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de captura.15Típicamente, el anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de detección está marcadocon una molécula indicadora.La molécula indicadora puede ser cualquiera de un indicador cromatográfico, óptico, fluorescente, basado en transferencia de electrones, radiomarcado u otro conocido para los 20expertos en la materia. Preferiblemente la partícula indicadora es una nanopartícula de oro.El método puede comprender además un paso de depositar un anticuerpo controlen el áreade prueba del dispositivo. El anticuerpo control puede ser un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo 25control puede ser un anticuerpo contra el anticuerpo de detección.Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento F(ab’)2, fragmento Fab o fragmento Fab quimérico (cFab).30Típicamente, al menos los anticuerpos de captura y control se depositan en el área de prueba del dispositivo como manchas o los anticuerpos de captura y control se imprimen en el dispositivo. El medio de depositar puede ser una pipeta.El conducto microfluídico puede definir una pluralidad de zonas en el área de prueba. Por 35ejemplo, el área de prueba puede comprender una zona de entrada de la muestra, una zona
16de detección y una zona de mecha en comunicación fluida en el área de prueba. Preferiblemente, la zona de detección comprende una zona de prueba y una zona control. Más preferiblemente, la zona de entrada de la muestra está en comunicación fluida con una zona de conjugado que está además en comunicación fluida con la zona de detección.5El conducto microfluídico cuando se fabrica por impresión en cera se puede definir por un margen de cera impreso que tiene una anchura de entre aproximadamente 300 µm y aproximadamente 1000 µm. Preferiblemente, el margen de cera impreso tiene una anchura de aproximadamente 500 µm.10La impresión en cera del conducto microfluídico se puede realizar por cualquier impresora de cera sólida conocida para los expertos en la materia. La fuente de calor para fundir la cera en una barrera de cera hidrofóbica puede ser un horno o una placa calefactora, u otra fuente de calor adecuada conocida para los expertos en la materia. Preferiblemente, la fuente de calor es una placa calefactora.15La temperatura de fusión para calentar el margen de cera impresa en la barrera de cera hidrofóbica es entre aproximadamente 100ºC hasta aproximadamente 250ºC. Preferiblemente, la temperatura de fusión es desde aproximadamente 100ºC hasta aproximadamente 200ºC. Incluso más preferiblemente, la temperatura de fusión es 20aproximadamente 200ºC. El tiempo de fusión deseado depende de la anchura del margen de cera impresa y la temperatura de fusión, pero típicamente es aproximadamente entre 1 y2 minutos.El método puede comprender además un paso de imprimir una escala de calibración para la 25cuantificación de resultados colorimétricos en el sustrato de papel.Breve descripción de las figurasAhora se describirán formas de realización no limitantes de la invención a modo de ejemplo 30solo y con referencia a las siguientes figuras:Figura 1: muestra un gráfico de absorbancia que indica la concentración mínima de anticuerpo que estabiliza el conjugado de oro cuando se ensayaron concentraciones de anticuerpo de 0,01 mg/ml a 0,128 mg/ml.35
17Figura 2: muestra el gráfico RGB que se usó para determinar la cantidad de color rojo y púrpura en cada uno de los viales usados para este estudio.Figura 3: muestra un gráfico de la concentración óptima de anticuerpo en mancha control basado en la medida del valor de la escala de grisescon Image J y coste en rands.5Figura 4: muestra un gráfico dela concentración óptima de anticuerpo en mancha de prueba basado en la medida del valor de la escala de grisescon Image J y coste en rands.Figura 5: muestra un gráfico del volumen de conjugado óptimo basado en la medida del 10valor de la escala grisescon Image J y coste en rands.Figura 6: muestra un gráfico de la tendencia a partir de estudios de elución que indica disminución en el recuento de E. colicon distancia creciente de la almohadilla de muestra.15Figura 7: muestra una ilustración gráfica de un dispositivo microfluídico basado en papel para la detección de E. coli.Figura 8: muestra un gráfico que indica la anchura de línea impresa óptima basado en medida del valor en la escala de grisescon Image J.20Figura 9: muestra un gráfico de la comparación de la eficacia entre un horno y una placa calefactoraen cada anchura de línea basado en medida del valor en la escala de grisescon Image J.25Figura 10: muestra un gráfico de la temperatura de fusión óptima para cada anchura de línea basado en medidadel valor enla escala de grisescon Image J.Figura 11: muestra un gráfico del tiempo de fusión óptimo para cada anchura de línea basado en medida del valor en la escalade grises con Image J.30Figura 12: muestra un gráfico que representa el efecto de la temperatura de fusión en la resolución de líneas basado en medida del valor enlaescaladegrisescon Image J, yFigura 13: muestra un gráfico que representa el efecto del tiempo de fusión en la resolución 35de líneas basado en medida del valor en la escala de grisescon Image J.
18Figura 14: muestra el método usado para análisis de muestras de aguas residuales; a) evaluación de E. colien 100 ml de efluente, b) evaluación de E. colien 1 ml de balsa de sedimento, c) técnica de agregaciónusada para crear suspensiones que contienen varios recuentos de bacterias para uso en pruebas de tiempo.Una vez cargadas, todas las placas 5de Petri son incubadas en un horno a 37ºC.Figura 15: muestra el resultado del análisis de 24 horas del efluente y balsa de sedimentación.10Figura 16: muestra el tiempo requerido para la detección en prueba de flujo lateral basado en recuento de bacterias en muestra (a) el mejor caso, b) el peor caso. PB = tampón fosfato; SP = balsa de sedimento, E = efluente.Figura 17: muestra una comparación entre la prueba de Colilert* y la prueba de flujo lateral 15de la presente invención (ColiSpot). *Colilert se realizó en placas de Petri y se evaluó el cambio de color. No se usaron bandejas Colilert.Descripción detallada de la invención20La presente invención se describirá ahora más completamente de aquí en adelante con referencia a las figuras acompañantes, en las que se muestran algunas, pero no todas las formas de realización de la invención.La invención como se describe no se debe limitar a las formas de realización específicas 25divulgadas y se pretende que modificaciones y otras formas de realización estén incluidas en el ámbito de la invención. Aunque en el presente documento se emplean términos específicos, se usan en un sentido genérico y descriptivo solo y no para fines de limitación.Como se usa a lo largo de esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, las 30formas singulares “un”, “una”, “él” y “la” incluyen la forma plural, a menos que el contexto claramenteindique otra cosa.La terminología y fraseología usadas en el presente documento es para el fin de descripción y no se debe considerar como limitante. El uso de los términos “comprender”, “contener”, 35“tener” e “incluir” y variaciones de los mismos usados en el presente documento, se
19pretende que abarquen los elementos enumerados después de ellos y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.La presente invención proporciona un dispositivo diagnóstico inmediato para detectar bacterias enteras en una fuente de agua, un método dedetectar bacterias enteras de una 5fuente de agua con el uso del dispositivo y un método dehacer el dispositivo.Mientras que los sensores de flujo y basados en papel se han desarrollado para la detección de bacterias tal como E.coli, la mayoría de los sensores solo pueden detectar o bien i) una única cepa de la bacteria, ii) las toxinas producidas por la bacteria o iii) ADN de bacteria 10(Alocilja et al. 2004; Zhao et al. 2010; Nakasonea et al. 2006). En particular, estos sensoresno son adecuados para análisis en la fuente, por ejemplo, en una fuente de agua, porque i) existen muchas cepas de bacterias en tales fuentes, de modo que detectar meramente una sola cepa es insuficiente, ii) para permitir la velocidad del ensayo, las bacterias enteras se deben detectar para negar la necesidad para la extracción de ADN y toxinas. Además, las 15pruebas que detectan toxinas solo pueden detectar cepas patógenas de bacterias. Para seguimiento de la calidad del agua, se deben detectar tipos de bacterias tanto patógenas como nopatógenas. Como resultado, las pruebas de flujo lateral (LFT) basadas en la detección de toxinas no se pueden aplicar para seguimiento de la calidad del agua. Las LFT que detectan el ADN de bacterias son difíciles de usar enel campo debido a la necesidad de 20extraer, aislar, y algunas veces incluso purificar el ADN usado para la prueba. Tales técnicas no las pueden usar trabajadores semicualificados de laboratorio o campo.Los beneficios de la presente invención incluyen la capacidad de detectar la mayoría sino todas las E. colique se producen en fuentes de aguas medioambientales, comparado con la 25detección de una única cepa de E. colien muestras de alimentos. Se ha desarrollado una prueba de flujo lateral (LFT) para la detección de E. colien agua (MERCK), pero esta LFT solo detecta una cepa de E. coli(0157:H7), y requiere 24 horas de precultivo. Por otra parte, la presente invención permite la detección de recuentos bajos de E. coli(1 ufc) en menos de 15 horas, comparadas con las 18 horas necesarias para el sistema de detección Colilert de 30E. coli, y las 24-48 horas necesarias para el método de filtración en membrana (método de referencia para la detección de E. coli). Además, la presente invención proporciona la detección de E. colienteras, sin necesidad de lisar las células.Por tanto, el solicitante ha investigado el desarrollo de un dispositivo diagnóstico inmediato y 35métodos para la detección de bacterias enteras por medio de reacciones anticuerpo
20policlonal-antígeno para capturar y detectar múltiples cepas de bacterias enteras en una fuente fluida. El dispositivo se desarrollópara detectar bacterias enteras consistentesen el grupo Enterobacteriaceae, que comprende una cualquiera o más deSalmonellasp., Shigellasp., Klebsiellasp., Escherichia coli(E. coli) sp. o Pseudomonassp. Preferiblemente, el dispositivo detectaE. coli.5En particular, losdispositivosdiagnósticosinmediatosdesarrolladospor el solicitante se dirigena permitir la detección de bajo costede bacterias enteras, incluyendo en la fuente, tal como una fuente de agua, de una manera que es más rápida de los que es actualmente alcanzable usando las tecnologías de detección disponibles actuales. Además, con el uso 10de anticuerpos policlonales sea como el anticuerpo de detección o captura, o ambos, el dispositivo se dirige a la detección de múltiples cepas de las bacterias que se van a detectar, ya que el anticuerpo policlonal puede unir múltiples epítopos. Tal dispositivo permitirá a los trabajadores de campo probar varias fuentes para bacterias y tomar decisiones más deprisa. Esto es especialmente importante durante situaciones de emergencia, como epidemias 15bacterianas, donde los esfuerzos de descontaminación se deben producir tan rápido como sea posible para prevenir la propagación de la enfermedad.Preferiblemente, el método indicador es un método indicador visual para asegurar que no requiere instrumentación de lectura adicional y se necesita poco o ningún entrenamiento del 20usuario para interpretar los resultados de la prueba. En particular, en el caso del dispositivo microfluídico basado en papel, el dispositivo se hace portátil y de bajo coste miniaturizando sus componentes y combinándolos en un sustrato de papel de peso ligero. Esto, combinado con tecnología de lectura de resultados sencilla, hace el dispositivo adecuado para análisis diagnósticos inmediato o de campo.25El término “anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpo policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos polirreactivos), y fragmentos de anticuerpos. Según esto, el término “anticuerpo” como se usa en esta especificación incluye, pero no está limitado a, cualquier miembro de unión 30específico, clase de inmunoglobulinas y/o isotipo (por ejemplo: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE e IgM) o un fragmento de anticuerpo de los mismos.Se entiende en la técnica que un anticuerpo es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están interconectadas por puentes 35disulfuro, o una porción de unión a antígeno de las mismas. Una cadena pesada comprende
21una región variable de la cadena pesada (VH) y una región constante de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Una cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera(VL) y una región constante de la cadena ligera(CL). Las regiones variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras comprenden regiones marco (FR) y regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las cuatro FR están relativamente conservadas mientras que 5las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) comprenden regiones hipervariables. Las FR y CDR están organizadas desde el extremo NH2al extremo COOH como sigue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Además, las regiones constantes pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos ofactores huéspedes.10También se incluyen en la definición de “anticuerpo” anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos generados de un animal transgénico no humano y anticuerpos seleccionados de bibliotecas usando tecnología de enriquecimiento disponibles para los expertos en la materia.15El término “epítopo” como se usa en el presente documento significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se puede unir al paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares 20y habitualmente tienen características tridimensionales estructurales específicas, así como características de carga específicas.Un “fragmento de anticuerpo” comprende una porción de un anticuerpo intacto, tal como la región de unión al antígeno o variable de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos 25de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmentos Fv, fragmentos scFV; diacuerpos; o anticuerpos lineales.La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos “Fab” idénticos o fragmentos de unión a antígeno, cada uno con un único de unión a antígeno, y un fragmento 30“Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento de anticuerpos con pepsinada un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y que retiene su capacidad para entrecruzar un antígeno.El término “Fv” se refiere al fragmento de anticuerpo mínimo que contiene in sitio completo 35de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Este fragmento contiene un dímero de
22un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. El plegamiento de estos dos dominios produce la formación de seis bucles hipervariables (tres bucles cada uno de la cadena H y L) que aportan los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso una única región variable (o la mitad de un Fv que 5comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque a una afinidad menor. “Fv monocatenario” (“sFv” o “scFv”) son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL unidos en una única cadena polipeptídica. El polipéptido sFv puede comprender además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que sFv forme la estructura deseada 10para la unión a antígeno.Los fragmentos“Fab” contienen el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilodel dominio 15CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en el presente documento para Fab’ en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 originalmente se producían como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas de la bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de 20anticuerpos también se conocen en la técnica.Tambiénse incluyen anticuerpos variantes en el ámbito de la invención. Por tanto, también se incluyen variantes de las secuencias enumeradas en la solicitud en el ámbito de la invención. Se pueden obtener variantes adicionales de las secuencias de anticuerpos que 25tienen afinidad mejorada usando métodos conocidos en la técnica y están incluidos en el ámbito de la invención. Los expertos en la técnicapueden modificar las secuencias de aminoácidos de un polipéptido utilizando métodos recombinantes y/o técnicas de química sintética para la producción de polipéptidos variantes. Por ejemplo, se pueden usar sustituciones de aminoácidos para obtener anticuerpos con afinidad mejorada 30adicionalmente. Alternativamente, se puede usar la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos para mejorar la eficacia de la traducción en sistemas de expresión para la producción del anticuerpo. Tales secuencias variantes de anticuerpo compartirán el 70% o más (es decir, el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de identidad de secuencia con las secuencias enumeradas en la solicitud. Tal identidad de 35
23secuencia se calcula con respecto a la longitud completa de la secuencia enumerada en la solicitud.Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo delimitación.5Ejemplo 1Detección de E. coli usando tecnología de flujo lateral y microfluídica basadaen papel: Fabricación de pruebas de flujo lateral de bajo presupuesto10Principio de trabajoEl sensor de flujo lateral prueba de concepto desarrollado consiste en cuatro secciones, cada una de las cuales se prepara en un tipo específico de papel, y se ensamblan juntas en unatarjetade refuerzo adhesiva. Se crea una conexión fluídica entra cada sección mediante 15solapamiento, lo que permite el flujo de lamuestra hacia las regiones de detección. Las cuatro secciones son la almohadilla de muestra, almohadilla de conjugado, una membrana de prueba de nitrocelulosa y una almohadilla/mecha absorbente. La almohadilla de muestra sirve para absorber y transferir lamuestra fluida sobre el dispositivo de prueba. La almohadilla de conjugado (una membrana de fibra de vidrio) se carga con anticuerpos anti-20E. colimarcados con oro, que se almacenan en un estado deshidratado. La membrana de prueba se cargacon dos anticuerpos diferentes. Un anticuerpo anti-E. coliforma la línea/mancha de prueba y un anticuerpo específicamente diseñado para detectar el anticuerpo en elconjugadoforma la línea/mancha control. La línea/mancha controlse usa para indicar si la muestra ha migrado a través de la longitud entera del dispositivo. El fin de 25la almohadilla o mecha absorbente es ayudar a arrastrar el fluido de muestra a lo largo de la tira de prueba. Se seleccionó el formato de ensayo sándwich para esta prueba ya que el analito (E.coli) muestra varios epítopos y por tanto permite la unión de dos anticuerpos en cada E. colisimultáneamente. El formato de ensayo sándwich también se presta a cuantificación debido a la relación proporcional que existe entre la concentración de analito 30en la muestra y la intensidad de color en la línea/mancha de prueba. Cuando se aplica una muestra a la almohadilla de muestra, el líquido migra hacia arriba de la prueba por fuerzas de capilaridad. El analito (E. coli) entra en contacto con los anticuerposde detección en la almohadilla de conjugado, y se “marca” con oro. Sin embargo, no todos los anticuerpos de detección se unen a E. coli, y siguen fluyendo sin unirse hacia arriba en la prueba. La E. coli35marcada es capturada en la línea de prueba, lo que produce el desarrollo de una señal de
24prueba roja. Tanto E. colimarcada como sin marcar con frecuencia compiten por los sitios de unión en la línea de prueba, y esto algunas veces produce el “efecto gancho”. Los anticuerpos marcados con oro que no han unido E. colipasan sobre la línea/mancha de prueba a la línea/mancha control y se unen. Estose produce ya quelos anticuerpos de la línea/mancha control se generan para dirigirse a los anticuerpos anti-E. colipresentes en el 5conjugado. Esto produce la formación de una señal enla línea control. Por tanto, la presencia de dos líneas/manchas en la prueba indica la presencia de E. colien la muestra, mientras que la formación de solo una línea/mancha control indica la ausencia de E. colien la muestra. Cualquier otra combinación de señal que se forme se considera error.10MaterialesSe usó un anticuerpo anti-E. colipoliclonal de conejo (Thermo Fisher Scientific, EEUU) en el conjugado y se usó un anticuerpo anti-E. colipoliclonal de conejo (ABD Serotec, RU) en la línea/mancha de prueba. Ambos de estos anticuerpos detectan todos los antígenos “O” y “K” 15de la bacteria E. coli. Se usaron anticuerpos anti-conejo de cabra (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc) en la línea/mancha control. Se compró solución de nanopartículas de oro, con un tamaño de partícula de 40 nm y una densidad óptica (DO) de unode Diagnostic Consulting Network (California, EEUU). Se compró tampón fosfato en polvo de Sigma Aldrich. El polvo se añadió a agua desionizada y se usó a una concentración de 6,92 mg/ml. 20Se disolvieron copos de seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma Aldrich) en tampón fosfato y se usaron a una concentración de 7 mg/ml.Se compraron casetes de diálisis de Thermo Fisher Scientific y se usaron para dializar los anticuerpos del conjugado en tampón borato (0,67 g/l) durante la noche. Esto se hizo para 25eliminar el exceso de sal contenido en el tampón de almacenamiento. El anticuerpo dializado se almacenó enalícuotas en un congelador a -18ºC hasta usarse. El papel usado para el desarrollo de la prueba de flujo lateral incluía lo siguiente. Para la almohadillade conjugado y muestra, se usó fibra de vidriode Millipore GO41. También se usaron una membrana de prueba de nitrocelulosa (HF80HP, GE Health) y una almohadilla absorbente30Surewick CFSP. Estos papeles se ensamblaron en unatarjetade refuerzo con adhesivo de PVC comprado de Kenosha CV (Países Bajos). Se compró una solución de bloqueo de Invitrogen, y se usó para bloquear la membrana de prueba.
25La instrumentación usada para este trabajo incluía un centrífuga de mesa Beckman Coulter Microfuge 16, un horno Ecotherm (Modelo 22, Labotec), un pH-metro (Eutech pH6+), un escáner de mesa (HPscanjet 2400) y una cámara digital Canon powershot G-11.Muestras5Las cepas ATCC de bacterias fueron amablemente proporcionadas por Natural Resources and Environment Unit (CSIR,Sudáfrica). Estas bacterias incluían Escherichia coliK12, E. coli0157:H7, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aueruginosa, Salmonella enteritidisyAcinetobacter.Las bacterias se cultivaron usando agar nutriente y caldo nutriente, ambos se 10compraron de Oxoid. E. coli0157:H7muerta por calor se compró de Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Todas las bacterias anteriores se manejaron en un laboratorio de bioseguridad, en una campana de gasesy cerca de una llama. Las muestras se crearon agregando las bacterias en tampón fosfato (PB). Una vez que la suspensión se volvió turbia, su turbidez se comparó con los estándares de McFarland, después de lo cual la absorbancia 15de la suspensión se determinó usando un espectrofotómetro de UV/VIS (Perkin Elmer). De esta manera, se determinó la concentración de bacterias en la muestra. Se usó la técnica de la dilución en serie para preparar muestras de diferentes recuentos bacterianos.Métodos20Preparación de conjugadoCantidad mínima de anticuerpo requerida para estabilizar las nanopartículas de oro25Las nanopartículas de oro usadas para preparar el conjugado se protegieron con citrato y por tanto mostraron una carga negativa. Cuando estánen suspensión, la repulsión electrostática asegura que las nanopartículas de oro permanecen bien dispersas y mantienen una distancia específica entre ellas. Esta dispersión es lo que produce que la solución de oro aparezca roja. Cuando se añade cloruro desodio a la solución de oro, los 30iones sodio cargados positivamente son atraídos a las partículas de oro cargadas negativamente. Esto fuerza las nanopartículas de oro adyacentes a agregar, produciendo que las propiedades ópticas de la solución de oro cambien. El color de la solución de oro cambia de rojo a púrpura/azul. Para prevenir tal agregación, las nanopartículas de oro se pueden recubrir con una capa de proteína, tal como con anticuerpos (Ac) o BSA. Estas 35proteínas actúan como un escudo electrostático, que previene que las nanopartículas
26interaccionen con los iones sodio. De esta manera, las proteínas sirven para estabilizar el nanooro en presencia de sal, y previene que se produzca cualquier cambio de color. Usando este fenómeno, se determinó la cantidad mínima de anticuerpo necesaria para estabilizar el oro. Se prepararon soluciones de anticuerpo (Ac) que variaban en concentración desde 0,01 mg/ml a 0,1 mg/ml en 670 µl de tampón fosfato (PB). Los anticuerpos eran anticuerpos anti-5E. colide conejo (Thermo Fisher Scientific). Cada solución de Ac se añadió a 3,33 ml de oro. Por tanto, se usó una proporción de volumen de anticuerpo respecto a oro de 1:5. Después de dejar la solución anticuerpo-oro incubar durante 30 minutos, se añadió una solución de sal al 10% (p/v) y la solución se siguió para cualquier cambio de color. Para confirmar los cambios de color observados, se usó espectrofotometría UV/VIS.10Proporción óptima de anticuerpo respecto a oroSe determinó la proporción óptima de volumen de oro respecto a anticuerpo (Ac) usando una técnica similar que la usada anteriormente. Se añadieron volúmenes variables de oro 15DO1 a un volumen fijo de anticuerpo. La concentración de anticuerpo en ese volumen fijo se mantuvo constante a la concentración óptima determinada anteriormente. La proporción de volumen de anticuerpo respecto a oro se varió de 1:1 a 1:20. Después de dejar incubar la solución de oro con el anticuerpo durante 30 minutos, se añadió una solución de sal al 10% (p/v) y la solución se siguió para cualquier cambio de color. Para confirmar cualquier cambio 20de color, se usó Image J (software de análisis de imágenes). Se capturó una imagen de cada solución, después de la adición de sal. Usando Image J, los valores RGB de cada solución se obtuvieron y se representaron juntas. De esta manera, la cantidad de color en cada vial se semicuantificó y usó para determinar el máximo volumen de oro que se podría usar sin producir que la solución Ac-oro se vuelva inestable.25Preparación de la almohadilla de conjugadoSe usó papel de conjugado Millipore GO41 como la almohadilla de conjugado. La almohadilla de conjugado se suministró como tiras que tienen 30 cm de longitud con una 30anchura de 1 cm. Antes de cargar el conjugado en la almohadilla de conjugado, el papel se bloqueó primero. Se sumerge en solución bloqueante de membrana, se secócon golpecitos usando toallas de papel, y después secadaen horno a 37ºC durante 1 hora. Bloquear el papel ayuda a prevenir unión no específica de bacterias en el papel y también ayuda a prevenir que el conjugado se fije permanentemente a la almohadilla de conjugado. El 35conjugado DO10 se cargó después en la almohadilla de conjugado bloqueada. Cada
27prueba contendrá aproximadamente manchas de 6 µl de conjugado. Para guiar el proceso de pipeteo, se usó un marcador para marcar la posición donde se debe cargar el conjugado. Cada tira de almohadilla de conjugadose colocó junto a una regla, para asegurar que las marcas están separadas 1 cm. Las marcas se localizaron en el bordesuperior o inferior de la tira de papel de conjugado de modo que se pudieron cortar antes de ensamblar la 5almohadilla de conjugado en las tiras de prueba de flujo lateral. Una vez cargado, el conjugado se secó en el sitio en un horno a 37ºC durante 30 minutos. Una vez seca la almohadilla de conjugado estaba lista para ensamblarse en el dispositivo final. Normalmente, se usan máquinas de rociado/rayado caraspara cargar el conjugado en la almohadilla de conjugado. Usando el método descrito anteriormente, el conjugado se puede 10cargar en la almohadilla de conjugado sinel uso de máquinas caras, lo que permite la demostración de prueba de concepto de una manera de bajo coste.Carga de las manchas de prueba y control15Se depositaron anticuerpos anti-E. colide conejo (ABD Serotec) en la membrana de prueba como el reactivo de señal de prueba. Se usaron anticuerpos anti-conejo de cabra (KPL) como el reactivo de la mancha control.Los reactivos de señal de prueba y control se cargaron en la membrana de prueba de 20nitrocelulosa, de modo que cada prueba contiene aproximadamente 1 µl de cada reactivo. Como se hizo con la almohadilla de conjugado, se usaron un marcador y una regla para marcar y guiar la posición de estas manchas en la membrana. Usando la regla, las manchas de prueba horizontalmente adyacentes se separaron 1 cm. Se usó el mismo espaciado para manchas control horizontalmente adyacentes. Las manchas control se colocaron ±1 cm 25verticalmente encima de las manchas de prueba. Por tanto, la mancha control se localizaba más cerca de la mecha en la tira de prueba de flujo lateral final. Mantenereste espaciado de 1 cm entre manchas de prueba horizontalmente adyacentes, manchas control horizontalmente adyacentes y manchas de conjugado horizontalmente adyacentes permite el alineamiento fácil de los tres reactivos en la tarjetade refuerzo. Esto es especialmente 30importante cuando las tiras de prueba individuales se cortan manualmente (usando un par de tijeras) y se necesita asegurar que cada tira de prueba contiene los tres reactivos. Cuando se usa una guillotina automatizada para cortar tiras de prueba individuales, la guillotina se puede programar para asegurar que cada tira es 1 cm. Sin embargo, como esta especificación se enfoca en técnicas de fabricación de bajo coste, las marcas o espaciado 35común entre manchas de reactivos adyacentes es importante. Cuando se usa una máquina
28de franjeado o rociado para depositar los tres reactivos, el espaciado de las manchas adyacentes se vuelve irrelevanteya que la almohadilla de conjugado o la membrana de prueba entera contiene reactivo, es decir, no hay huecos o secciones vacías entre ellas. Una vez cargadas en la membrana, las manchas de prueba y control se secan en un horno a 37ºC durante 30 minutos.5Como la membrana de prueba de nitrocelulosa es ligera y por tanto fácilmente propensa al daño, primero se colocó en unatarjetade refuerzo con adhesivo de PVC antes de que se añadieran las manchas de prueba y las manchas control. La prueba de flujo lateral (LFT) entera se ensambla después en estatarjetade refuerzo. Una vez los anticuerpos de la 10mancha control y la mancha de prueba se secaron en la membrana, la membrana se sumergió en una solución de bloqueo, se secó con una toalla y después de ello se secó durante 1 hora en un horno a 37ºC. Después de ello la membrana estaba lista para el ensamblaje final.15Ensamblaje y preparación de LFTUna vez la membrana de prueba y la almohadilla de conjugado están cargadas con sus respectivos reactivos, la LFT se ensambla. La membrana de prueba se aplica a la sección media delatarjetade refuerzo. La almohadilla absorbentese coloca en la sección superior 20delatarjetade refuerzo, y solapa con la membrana de prueba en al menos 2 mm. Este solapamiento crea una conexión fluídica entre las varias secciones de la LFT, y asegura que la muestra se arrastra de la almohadilla de muestra a la almohadilla absorbente. La almohadilla de conjugado se coloca de modo que solape con el extremo inferior de la membrana de prueba en al menos 2 mm. Usando las marcas enla almohadilla de 25conjugado y la membrana de nitrocelulosa, las manchas de conjugado se alinean con las manchas de prueba y control. Por último, la almohadilla de muestra se coloca en la posición inferior delatarjetade refuerzo, solapando con el extremo inferior de la almohadilla de conjugado. La tarjetade prueba enterase corta después en tiras de prueba individuales usando un par de tijeras afiladas. Por tanto, cada LFT contendrá una mancha de prueba, 30control y conjugado que están bien alineadas entre sí. Hasta la fecha, los inventores han encontrado que el corte manual no tiene efecto significativo en las propiedades de flujo del fluido muestra, de modo que el rendimiento del sensor no está afectado por el corte manual. Como resultado, las guillotinas automáticas, como las máquinas de rayadoy rociado, pueden no requerirse durante la fase de desarrollo de prueba de concepto. Estos 35descubrimientos demuestran que los laboratorios diagnósticos de bajos recursos pueden
29desarrollar con éxito pruebas de flujo lateral sin el uso de equipo de fabricación caro. Tal equipo puede requerirse solo durante el desarrollo del prototipo, una vez que hay prueba de concepto. Esto evita inversiones innecesarias antes de que se haya mostrado que el sistema de detección realmente funciona.5Carrera de pruebas de flujo lateralPara probar cada LFT, se transfieren 200 µl de la muestra con adición a un tubo de ensayo de vidrio, en el que la LFT se coloca con su almohadilla de muestra sumergida. Un volumen de 200 µl de muestra demostró suficiente para absorberse a través de la longitud entera de 10la LTF. Este volumen también asegura que solo la almohadilla de muestra (y no la almohadilla de conjugado) hacen contacto directo con el fluido. La LFT absorbe la muestra, y tarda aproximadamente 10-15 minutos para formar una señalde línea/mancha de control y prueba fuerte.15Determinación de la concentración de anticuerpo de mancha control y mancha de prueba óptimaSe hicieron una serie de LFT, cada unade los cuales tenía concentraciones variables de anticuerpo sea en la mancha control o la mancha de prueba. Todos los otros parámetros de 20fabricación se mantuvieron constantes cuando cualquiera de estas concentraciones se varió. La concentración de la mancha control se varió de 0,2 mg/ml a 1 mg/ml, mientras se mantenía la concentración de la mancha de prueba constante. El fin de esto era identificar cómo influye la concentración del anticuerpo en la intensidad de señal de la mancha control. Para realizar esto, se usaron dos tipos de muestras, una muestra de 102ufc/ml de E. coli250157:H7 muertaporcalor y una muestra de tampón fosfato. Para determinar la concentración óptima de anticuerpo de la mancha de prueba, se hicieron una serie de LFT donde la concentración de anticuerpo de la mancha de prueba se varió a 4 mg/ml a 0,5 mg/ml, la concentración de anticuerpo de la mancha control se mantuvo constante. Se usó una muestra de 107ufc/ml de E. colipara este estudio. Se siguió el cambio en la intensidad 30de color de la mancha de prueba en relación a la concentración de anticuerpo de la mancha de prueba.Se usó el software informático Image J para analizar las intensidades de señal. Image J analiza una imagen capturada y usa análisis en escala de grises para evaluar la intensidad 35de color de esaimagen. Un valor alto en la escala de grises indica una imagen clara (o
30blanca) mientras que un valor bajo en la escala de grises indica una imagen oscura (o negra). Siguiendo el valor enla escala de grises de las señalas de la mancha de prueba y controlcon relación a su concentración de anticuerpo, se pudieron determinar las concentraciones de anticuerpo de la mancha de prueba y control óptimas.5Determinación del volumen óptimo de conjugadoLos inventores determinaron después cómo el volumen/cantidad de conjugado usado en una LFT influye en la intensidad de la señal de la mancha de prueba, así como el límite de detección del dispositivo. Se cargaron volúmenes de conjugado que variaban de 1µl a 10 µl 10en LFT separadas que se corrieron con una muestra de107ufc/ml de E. coli0157:H7 muerta por calor. La intensidad de color de la mancha de prueba se siguió tanto visualmente como usando Image J. Para determinar si usar un volumen de conjugado mayor mejoraría el límite de detección de la prueba, se hicieronun conjunto de LFT que contenían 10 µl de conjugado (en lugar de los habituales 6 µl) y se corrieron con concentraciones variables de 15muestras E. coli0157:H7. Las concentraciones de la muestra variaron desde 100ufc/ml a 109ufc/ml. La menor concentración de muestra que produjo una señal de prueba positiva se considera el límite de detección del dispositivo. El límite de detección obtenido usando 10 µl de conjugado se compara después con el límite de detección obtenido cuando se usan 6 µl de conjugado. Deesta manera, se observaría cualquier mejora en el límite de detección de 20la prueba como resultado directo de un volumen de conjugado aumentado.La influencia de la membrana de prueba en la intensidad de señalSe colocaron diferentes tipos de membranas en la región de prueba del dispositivo. Se 25depositaron manchas de prueba y control en cada una de estas membranas. Una vez ensambladas, cada prueba se corrió con muestras de 107ufc/ml de E. coli0157:H7 muerta por calor. El fin era examinar el efecto que diferentes tipos de membrana tienen en la intensidad de color de las manchas de prueba y control, y seleccionar el tipo óptimo.30Tabla 1: Membranas de nitrocelulosa usadas en la región de prueba de la LFTNombre del papelAbreviaturaWhatman AE 100AE100Whatman FF85FF85Sartorius CN 140CN140
31Whatman Fusion FiveF5Millipore NF240240WhatmanImmunopore FPFPWhatman Prima 125125Whatman FF60/100FF60Millipore HF075075Whatman AE98AE98Vivid 170 Pall nitrocellulosePallWhatman AE 99AE99Millipore HF135135Millipore HF090090Tiempos óptimos de prueba y secadoLos inventores consecuentemente determinaron: a) durante cuánto tiempo se deben correr las pruebas, para determinar la duración del tiempo durante el que las pruebas se deben 5mantener sumergidas en su muestra; y b) cuánto tiempo después de retirarla LFT de su muestra se deben leer los resultados de la prueba.Cuando las pruebas se retiran de sus muestras y se dejan expuestas a condiciones ambientales durante algún tiempo, elflujo de retorno de la muestra puede influir en la 10intensidad de la señal, y puede influir en el resultado de la prueba. El flujo de retorno de la muestra se produce cuando la almohadilla de muestra se vuelve más seca que la mecha, lo que fuerza al líquido a migrar de la mecha de vuelta hacia la almohadilla de muestra. Durante tal flujo de retorno, las nanopartículas de oro se pueden depositar de forma no específica en y alrededor de la mancha de prueba, creando una falsa señal positiva. 15Además, cuando se dejaexpuesta a condiciones ambientales durante demasiado tiempo, la membrana de prueba se seca y altera el verdadero color de las señales de prueba. Se ha encontrado que la señal cambia de rojo a púrpura. Este cambio en el color e intensidad de la señal puedeconducir a mala interpretación de los resultados de la prueba, y se puede volver especialmente problemático cuando se debe determinar una correlación entre intensidades 20de señal y concentración de la muestra.Para la investigación del tiempo de secado, las pruebas se dejaron en sus muestras (E. coli, 107ufc/ml) para correr durante aproximadamente 15 minutos. Una vez se retiraron de la muestra, las LFT se expusieron a condiciones ambientales. Se tomaron fotos de las pruebas 25
32cada 2 minutos después de que se retiraran de la muestra y usando el software image J, se siguieron para cambios en color e intensidad de la señal.Para el estudio del tiempode ensayo, las LFT se dejaron sumergidas en las muestras de E. coli(107ufc/ml) y muestras de tampón fosfato yse corrieron entre 30 segundos y 30 5minutos. Se examinaron las intensidades de señal tan pronto como las LFT se retiraron de sus muestras. Se examinaron señales de manchas control en esas pruebas corridas con PB solo, mientras que se examinaron señales demanchas de prueba en esas pruebas corridas con muestras ricas en E. coli.10Posición de la línea de pruebaEl fin de esta investigación era determinar cómo influye la posición vertical de la mancha de prueba en la longitud de la membrana en la potencia dela señal. Se hicieron varias LFT según lo habitual, sin embargo, no se usaron manchas control. Esto es para permitir el 15movimiento de la posición de la mancha de prueba a lo largo de la longitud entera de la sección de membrana. Se hicieron cuatro dispositivos. La mancha de prueba en cada dispositivo se colocó aproximadamente a 4 mm, 7 mm, 12 mm y 13 mm del borde superior de la almohadilla de conjugado. Se usaron muestras de E. colimuertaspor calor 107ufc/ml para correr estas pruebas. La diferencia en intensidad de señal entre las varias posiciones 20de la mancha de prueba se usó para a) determinar si la posición de la mancha de prueba influye en la intensidad de señal, y b) si lo hace, determinar la posición de la mancha de prueba óptima.El efecto que tiene una concentración aumentada de anticuerpo de mancha de prueba, y un 25volumen y concentración de conjugado aumentadosen el límite de detecciónLos inventores determinaron si una concentración aumentada de anticuerpo en la mancha de prueba y conjugado influiría el límite de detección de las LFT. Para examinar la influencia que tendrá una concentración aumentada en la mancha de prueba, se hicieron LFT con una 30concentración en la mancha de prueba de 4 mg/ml. Esta es la mayor concentración a la que este anticuerpo particular se suministra. Se usaron E. coli0157:H7 a concentraciones que variaban de 108ufc/ml a 100ufc/ml para probar estas LFT. Para determinar el efecto que tendrá una concentración de Ac aumentada en el conjugado, la concentración de los anticuerpos en el conjugado se aumentó a 0,12 mg/ml. Esto es casi 4 veces la cantidad de 35anticuerpo encontrada suficiente para la estabilización de oro. Estas pruebas se corrieron
33con muestras de E. coli0157:H7 muertascon calor que variaban de 108ufc/ml a103ufc/ml. Para realizar los estudios de volumen aumentado de conjugado, se fabricaron LFT con un volumen de conjugado aumentado de 10 µl. Esto está muy por encima del volumen de conjugado determinado como óptimo. Las LFT se corrieron con suspensiones deE. coli0157:H7 que variaban en concentración de 108ufc/ml a 100ufc/ml. En ambos estudios de 5conjugado se espera que como más anticuerpos están disponibles para marcar E. colien la muestra, más E. colimarcada se debe capturar en la mancha de prueba. Idealmente, esto debe permitir la detección de E. colia menores concentraciones de muestra. Lo mismo aplica a los estudios de concentración de mancha de prueba aumentada. Puesto que más anticuerpos están disponibles para capturar las bacterias marcadas en la mancha de 10prueba, el límite de detección de la prueba debe mejorar.Resultados y DiscusiónComentarios generales sobre el proceso de fabricación de bajo coste15Habitualmente las pruebas de flujo lateral tienen líneas de prueba y control y no manchas. Estas líneas se depositan en la membrana de nitrocelulosa usando máquinas de franjeado caras. Como esta invención se enfoca en métodos de fabricación de bajo coste para sensores de papel, se usó una pipeta en lugar de una máquina de franjeado para depositar 20los anticuerpos de prueba y control. Como resultado, las señales en la LFT tienen una forma circular y, por tanto, se denominan manchas de prueba y control. Mientras que es inhabitual, estas manchas redondeadas aún forman señales fuertes claramente visibles. La visualización de estas señales es todo lo que se necesita para confirmar la funcionalidad de mecanismo sensor y, por tanto, la funcionalidad de la LFT. Como resultado, no se requieren 25máquinas de franjeado. Para determinar si el uso de manchas en lugar de líneas influye negativamente el rendimiento de las pruebas de flujo lateral, un conjunto de LFT se hicieron externamente, usando máquinas de franjeado del estado de la técnica. El límite de detección de estas pruebas (con líneas) era el mismo que el delas pruebas con manchas. Por tanto, se cree que los dispositivos de flujo lateral se pueden optimizar a un nivel extremo 30sin tener que comprar máquinas de franjeado. Solo se hace difícil trabajar con las manchas cuando se requiere la cuantificación delas señales. Mientras que las intensidades de señal de la línea y mancha parecen similares a simple vista, la forma en cresta de la señal de la mancha la hace difícil de cuantificar. Esto es debido a la dificultad asociada con seleccionar un área de formairregular para el análisis de imagen. También se usó una pipeta para 35cargar el conjugado en la almohadilla de conjugado enuna manera de bajo coste.
34Normalmente se usa una máquina de rociado para este fin. Usar una pipeta para depositar el conjugado parece no tener efecto en el nivel de conjugado liberado de la almohadilla de conjugado. Queda poco o ningún residuo en la almohadilla de conjugado una vez que se corre la prueba. Para hacer una comparación, las LFT se fabricaron depositando el conjugado usandouna máquina de rociado y después evaluando el límite de detección de 5estas LFT. Las pruebas tenían el mismo límite de detección que las pruebas hechas con manchas de conjugado. Sin embargo, la distribución del conjugado a través de la anchura de la tira de prueba según fluye hacia arriba, se diferenciaba entre las dos. Cuando se usa una pipeta para depositar el conjugado, el conjugado se coloca en el centro de la almohadilla de conjugado. Como resultado, cuando se libera, el conjugado fluye hacia arriba 10principalmente a lo largo del centro de la anchura de la tira. Para reducir este efecto, el conjugado se puede cargar a lo largo de la anchura entera de la almohadilla de conjugado. No obstante, si la mancha de conjugado está bien alineada con la mancha de prueba y control, este problema se vuelve irrelevante. Por tanto, hacer manchas de conjugado es suficiente durante el desarrollo de la prueba de concepto. En resumen, se cree que las 15máquinas de franjeado/rociado no son esenciales para fabricar LFT durante la fase de prueba de concepto. Recomendamos que laboratorios de pocos recursos que están desarrollando sensores de papel no necesitan invertir en equipo de rayado/rociado antes de la prueba de concepto. Esto ayuda a reducir el riesgo financiero asociado con el desarrollo de cualquier dispositivo sensor nuevo.20Una de las mayores desventajas asociadas con el uso de manchas de prueba y control es el desarrollo de señales “con forma de cresta”. Habitualmente se esperan manchas completamente redondeadas, sin embargo, las crestas se forman como consecuencia de dos factores. El primero es el efecto anillo de café que experimenta la mancha de prueba 25durante el proceso de secado. En física, este patrón en anillo lo deja una gotita que contiene partículas una vez el líquido se ha evaporado. El patrón es debido al flujo capilar inducido a través de la gota como resultado de las velocidades de evaporación diferenciales. El líquido que se evapora del bordede una gotita se repone con líquido del interior. Este flujo hacia el bordede la gota lleva las partículas dispersas en la gota a los bordes. En el caso de la 30mancha de prueba de la LFT, esto implica que la mayoría del anticuerpo se concentra en los bordesexteriores de la mancha.Otro tipo de flujo inducido dentro dela gotita durante la evaporación se llama flujo de Marangoni. Si el flujo de Marangoni en la gotita es lo suficientemente fuerte, puede ayudar a 35redistribuir las partículas de vuelta hacia el centro de la gotita. El agua, el principal
35constituyente del tampón usado para diluir los anticuerpos de la mancha de prueba y control, tiene un flujo de Marangoni débil, lo que agrava este problema adicionalmente.El segundo factor está relacionado con el movimiento lateral de las bacterias hacia arriba de la prueba. Según las bacterias se mueven hacia arriba, hacen contacto primero con la región 5inferior del anillo de café, y se unen. Según más bacterias entran en contacto con esta región, se forma una acumulación de Ac-bacteria-Ac-oro. Cuanto mayor sea la afinidad que tiene el anticuerpo por las bacterias, más rápido y más denso se forma esta acumulación. Según más bacterias alcanzan esta área, o bien se añaden a esta acumulación, o se desvían lejos de la mancha de prueba completamente, moviéndose hacia los márgenes10exteriores de la LFT. Como resultado, algunas de las bacterias de la muestra se mueven hacia arribade la LFT a lo largo de los márgenes del dispositivo, evitando por completo la mancha de prueba. Como resultado, solo se observa una señal en forma de cresta, oscura ya que solo la parte inferior del anillo de café se une a E. colimarcada con oro. Una pequeña cantidad de bacteria podría alcanzar otras áreas de la mancha de prueba, aunque 15a pequeño nivel. Esto es evidente por el aspecto rojo claro de otras regiones en la mancha de prueba. Esta distribución desigual de la señal hace difícil cuantificar las señales enmancha. No obstante, se encontró que efecto anillo de café no previene que la intensidad de color de las crestas muestre una dependencia de los recuentos de E. colien la muestra, la concentración de Ac de las manchas de prueba y control, el volumen de Ac usado, etc. Esta 20dependencia del color se espera cuando se usa elformatode ensayo sándwich. Para cuantificar estas dependencias y por tanto cuantificar la influencia que diferentes parámetros de fabricación tienen en el rendimiento de la prueba, se usaron medidasen escala de grises de la región más oscura de las manchas de prueba y control. De esta manera, el diseño del sensor de papel se puede optimizar de una manera de bajo coste. Todas las técnicas 25anteriores permiten el desarrollo de dispositivos de prueba de concepto y optimización significativa del rendimiento de los dispositivos sin tener que hacer grandes inversiones financieras en nuevo equipo.Preparación de conjugado30La cantidad mínima de anticuerpo requerido para estabilizar las nanopartículas de oroBasado en las reacciones de cambio de color visible, la concentración mínima de anticuerpo que era capaz de estabilizar el oro y mantener su aspecto rojo después de la adición de sal, 35es 0,03 mg/ml. Esas soluciones agregadas con una concentración de anticuerpo de menos
36de 0,03 mg/ml se volvieron púrpuras después de la adición de sal. Esas soluciones de anticuerpo con una concentración por encima de 0,03 mg/ml, sin embargo, se mantuvieron rojas. La espectroscopía de absorbancia confirma esto. Las nanopartículas de oro habitualmente muestran un pico de absorbancia característico entre una longitud de onda de 500 nm y 600 nm. Cuando hay cambios en las propiedades ópticas del oro (tal como cuando 5se vuelve púrpura debido a la adición de sal), su pico de absorbancia característico desparece. La figura 1 muestra que los picos de absorbancia de esas curvas con concentraciones de anticuerpo por debajo de 0,03 mg/ml están ausentes. Esto implica que cuando se usaron esas concentraciones de Ac, las soluciones de oro se volvieron púrpura. Solo esas curvas con concentraciones de anticuerpo por encima de o iguales a 0,03 mg/ml 10retienen su aspecto rojo y por tanto muestran picos de absorbancia. Esto confirma que una concentración de anticuerpo de 0,03 mg/ml es la concentración mínima requerida para estabilizar la solución de oro. Para compensar por cualquier error de pipeteo cuando se crea el conjugado, y para servir como una medida de seguridad, se usará una concentración de anticuerpo de 0,05 mg/ml, ligeramente mayor que la concentración mínima requerida, para 15desarrollar el conjugado.Optimización de la proporción de volumen de anticuerpo respecto a oroLa figura 2 muestra el gráfico RGB que se usó para establecer la cantidad de color rojo y 20púrpura en cada uno de los viales usados para este estudio. Cada vial contenía una cantidad constante de anticuerpo, y volúmenes crecientes de oro. Una vez se añadesal a cada uno de estos viales, solo esas soluciones que son inestables cambian de rojo a púrpura. La figura 2 muestra como usando valores RGB, el cambio de color en cada uno de estos vialesse puede cuantificar indicando las intensidades de color rojo, azul y verde 25prevalentes en cada tubo. En la figura 2, la curva superior indica la intensidad de color rojo en las soluciones, la curva intermedia indica la intensidad del colorazul en la solución y la curva inferior indica la intensidad del color verde. Para indicar el desarrollo de cualquier color púrpura en estos viales, las curvas azul y roja solapan entre sí. Basado en la figura 2 proporciones de volumen de anticuerpo respecto a oro entre 1:1 y 1:13 permitirán el 30desarrollo de conjugados estables. Estoes evidente por la mayor intensidad del color rojo (que azul o verde) a esas proporciones de volumen. Por tanto, la solución de oro mantiene su aspecto rojo de proporciones de volumen de 1:1 a 1:13.Cuando el volumen de oro en el conjugado aumenta a más de 13x el del anticuerpo, el 35conjugado se vuelve inestable. Esto es un resultado de haber insuficiente anticuerpo
37disponible para unirse completamente a todas las nanopartículas de oro en solución. La proporción de volumen de Ac respecto a oro óptima está donde la curva roja se coloca bien por encima de la curva azul. A proporciones de volumen de 1:13 y mayores, estas dos curvas se cruzan lo que indica se produce un cambio de color a púrpura. A una proporción de volumen Ac-oro de 1:1, las curvas roja y azulestán colocadas bien lejos entre sí. Esta 5distancia se mantiene establemente hasta que se alcanza una proporción de volumen de 1:10.Entre las proporciones 1:10 y 1:13 las curvas empiezan a acercarse, insinuándose hacia el inicio de inestabilidades en lasolución de oro. La proporción de volumen Ac:oro óptimase 10selecciona, por tanto, como 1:10, ya que usando esta proporción se puede producir la máxima cantidad de conjugado por volumen de anticuerpo, mientras que aún se asegura la estabilidad del conjugado. por tanto, se usará una proporción de volumen de Ac respecto a oro de 1:10 para el desarrollo del conjugado.15Marcaje del anticuerpoComo se determinó anteriormente, se usó una concentración de anticuerpo de 0,05 mg/ml y una proporción de volumen de anticuerpo respecto a oro de 1:10 para preparar el conjugado. Una vez se añadió el anticuerpo al oro, los dos se pusieronen contacto durante 2030 minutos para fomentar el marcaje eficaz del anticuerpo por el oro. Después de 30 minutos, se añadió seroalbúmina bovina (7 mg/ml), en un proceso denominado bloqueo. Se dejó incubar la BSA con la solución oro-Ac en la nevera durante la noche. Durante el proceso de bloqueo la BSA es libre para unirse a cualquier sitio no ocupado en las nanopartículas de oro. Este proceso previene que el oro se una de forma no específica al 25papel mismo, a los anticuerpos de la línea de prueba o a la E. colien la muestra. El volumen de BSA añadido era igual al volumen de Ac usado, ya que se ha demostrado que esta cantidad es suficiente para este fin. La solución BSA-oro-Ac se centrifugó después a 13000 g durante 15 minutos para separar los anticuerposmarcados y no marcados entre sí. El precipitado (el conjugado) que se obtuvo después de la centrifugación se redispersó en una 30solución de BSA, pero se redispersó en un volumen que aseguraba un aumento 10x en la concentración de oro. Para hacer esto, el precipitado se resuspendió en un volumen que era aproximadamente 10x menor que el volumen original de orousado para fabricar el conjugado. Estoaumenta la densidad óptica (DO) del oro de DO 1 a DO 10. Usar un conjugado con una densidad óptica mayor en la prueba producirá señales de prueba que 35son más oscuras, más fuertes y por tanto más nítidas.
38Para asegurar que la concentración de oro está de hecho aumentada de esta manera, se usó un espectrofotómetro de UV/VIS para medir la absorbancia del conjugado antes y después de que aumentara la concentración de oro. La diferencia en la absorbencia entre los dos indica el nivel de concentración. El oro concentrado (±DO 10) primero se diluye por 5un factor de 100 antes de colocarlo en el espectrofotómetro. Como resultado, el valor de absorbancia obtenido se debe multiplicar por 100 para determinar la absorbencia real del oro concentrado. La absorbencia del tampón fosfato y del sobrenadante obtenido después de centrifugar también se midió. Los resultados se muestran en la tabla 2.10Tabla 2: Valores de absorbancia para oro a DO1, DO 10 y el sobrenadante y tampón fosfatoMuestraAbsorbanciaDO11,094DO10(diluido 100x)0,095Sobrenadante0,031Tampón fosfato0,0365El valor de absorbancia del conjugado aumenta desde 1,094 (a DO 1) a 9,5 (0,095 x 100, a DO10). Esto indica un aumento de aproximado de10x en la densidad óptica del oro. Estos resultados demuestran que redispersando el precipitado de conjugado en un volumen 10x 15menor, se puede obtener un aumento 10x en la concentración de oro. La absorbencia del sobrenadante (eliminado del tubo después de centrifugar) y la del tampón fosfato simple es la misma. Esto indica que poco o nada de oro se pierde al sobrenadante durante el proceso de centrifugación, y que el oro de hecho se usó en la preparación del conjugado final.20Determinación de la concentración óptima de anticuerpo en la mancha controlSegúnla figura 3, la intensidad de la señal de la mancha control aumenta según aumenta la concentración de Ac. Esto se observa por el valor en la escala de grises decreciente de las señales con un aumento en la concentración de Ac. A una concentración de 1 mg/ml, la 25señal es la más nítida y más oscura. Se asume que la intensidad de la señal se puede mejorar más aumentando la concentración de Ac por encima de 1 mg/ml. Sin embargo, en este momento, la máxima concentración a la se suministra el Ac de la mancha control es 1 mg/ml. Como se esperaba, el coste del reactivo de la mancha control y por tanto la LFT sube según aumenta la concentración del anticuerpo en la mancha control. Por debajo de 30una concentración de 0,6 mg/ml, la señal control es casi invisible a simple vista y por tanto
39no se puede usar. Por tanto, aumentar la concentración de la mancha control de 0,2 a 0,6 mg/ml está justificado, independientemente de los 33 céntimos de aumento en el coste de anticuerpo. A una concentración de 0,8 mg/ml, la señal control es nítida y visible. Sin embargo, la intensidad de la señal es menor que la obtenida cuando se usa una concentración de Ac de 1 mg/ml. Esto es evidente por la disminución de 12,2 unidades en el 5valor de la escala de grisessegún aumenta la concentración de Ac de 0,8 mg/ml a 1 mg/ml. Un dispositivo fabricado usando una concentración en la mancha control (CS) de 1 mg/ml costará 17 céntimos más que un dispositivo hecho usando una concentración de Ac de 0,8 mg/ml. Considerando el hecho de que el dispositivo final debe costar ±R10,00 (10 rands sudafricanos), usando una concentración de Ac de 1 mg/ml en lugar de0,8 mg/ml 10contribuirá solo el 1,7% más al coste final del dispositivo. Una concentración de anticuerpo de 1 mg/ml producirá señales más fuertes, reduciendo cualquier ambigüedad o mala interpretación de los resultados de la prueba. Esto ayuda a mejorar la fiabilidad de la prueba. Por tanto, una concentración de anticuerpo en la mancha control de 1 mg/ml está justificada, y se seleccionó para el desarrollo de la LFT.15Determinación de la concentración óptima de anticuerpo en la mancha de pruebaSe observaron señales de prueba sobre el intervalo entero de concentraciones en la mancha de prueba investigado (de 0,5 mg/ml a 4 mg/ml). La intensidad de color de las 20manchas de prueba, juzgada a ojo, permaneció aparentemente constante entre concentraciones de anticuerpo de 4 y 2,5 mg/ml. Los valores de la escala de grises de estasseñales fluctúan en un simple 1-3,5% entre sí (figura 4). Esto indica que cuando se usa una concentración de Ac de 2,5 mg/ml en la mancha de prueba, la misma intensidad de señal es alcanzable que cuando se usa 4 mg/ml. Usar una concentración de Ac de 2,5 mg/ml también 25reducirá el coste de la prueba (en ±R1,39 cada una). El valor enla escala de grises de las señales de prueba aumenta en ±13% cuando la concentración de anticuerpo disminuye por debajo de 2,5 mg/ml. Esto implica que la señal de prueba se vuelve más débil. Sin embargo, a simple vista, estas señales son aun claramente visibles.Por tanto, se puede usar una concentración de Ac por debajo de 2,5 mg/ml, digamos 1,5 mg/ml, en la prueba de flujo 30lateral. Hacer esto ayudaría a reducir el coste por prueba en aproximadamente 92 céntimos. Sin embargo, según la figura 4, los valores enla escala de grises empiezan a fluctuar significativamente cuando la concentración del Ac se reduce por debajo de 2,5 mg/ml. Esto insinúa hacia la introducción de algún tipo de inestabilidad en el dispositivo, que podría finalmente afectar la reproducibilidad de las señales de prueba. Por tanto, mientras que usar 35concentraciones de anticuerpo por debajo de 2,5 mg/ml puede disminuir el coste del
40dispositivo, puede reducir la calidad y fiabilidad de las pruebas. Por tanto, se seleccionó una concentración de Ac en la mancha de prueba de 2,5 mg/ml para el desarrollo de este dispositivo ya que proporciona el equilibrio correcto entre coste y rendimiento.Determinación del volumen óptimo de conjugado5Este estudio se realizó para determinar el volumen óptimo de conjugado que se debe usar en las LFT. En la figura 5, el valor en la escala de grises de las señales de prueba fluctúa según aumenta el volumen del conjugado usado en las pruebas. Estos valores fluctúan en el 2,5%-10% entre sí. Como resultado de esta fluctuación, la influencia de volúmenes 10aumentados de conjugado en la intensidad de las señales de prueba es difícil de determinar. Ajustar una línea de tendencia polinómica a la curva de valor en escala de grises, sin embargo, ayuda a identificar una tendencia. La línea de tendencia indica una disminución global en los valores grises con un aumento en el volumen de conjugado. Por tanto, la intensidad de la señal de la mancha de prueba aumenta según aumenta la cantidad de 15conjugado usado en la LFT. Esto indica que aplicando más anticuerpos marcados en la prueba, más E. colimarcada con oro alcanza la línea de prueba, produciendo señales de prueba más fuertes. La pendiente de la línea de tendencia permanece más o menos constante según aumenta el volumen de conjugado hasta 7 µl. La línea de tendencia se vuelve más lineal entre 7 µl y 10 µl de conjugado. Esto implica que intensidad de la mancha 20de prueba alcanza su pico a 7 µl, y usar más conjugado en la prueba hace poco para mejorar la intensidad de la señal y aumentará el coste del dispositivo en 45 céntimos. Sin embargo, aumentando el volumen del conjugado por encima de 7 µl, la intensidad de la mancha control podría mejorar. Esto es debido a que más anticuerpo marcado está disponible para unirse a esta región.25Para probar esta teoría, se hicieron LFT que tenían manchas tanto de prueba como control, pero cargadas con cantidades variables de conjugado. Los volúmenes de conjugados se variaron desde 5 µl a 10 µl, y las pruebas se corrieron usando suspensiones de E. colide 108, 107y 106ufc/ml. Cuando se usan 5 µl de conjugado, se observan manchas control de 30débiles a ninguna a través de todas las concentraciones bacterianas investigadas. Cuando se usan de 6 µl a 10 µl de conjugado, sin embargo,se forman manchas control (de similar intensidad de color) para todas las concentraciones bacterianas. Por tanto, para formar manchas control nítidas, se debe usar un volumen de conjugado de 6 µl.35
41Aumentar el volumen de conjugado de 6 µl a 7 µl, sin embargo, solo puede estar garantizado si produce una mejora en el límite de detección del dispositivo. Esto es porque la intensidad de las manchas de prueba que se forman cuando se usan 6 µl y 7 µl de conjugado (basado en la línea de tendencia), no son significativamente diferentes. A ojo, esta diferencia es insignificante. Por tanto, si el volumen de conjugado aumentado no mejora 5la intensidad de color de la mancha de prueba, ni mejora el límite de detección del dispositivo, el coste aumentado de usar 7 µl de conjugado por prueba no se puede justificar.Prueba de diferentes tipos de membranas en la LFT10Se aplicaron diferentes tipos de membranas de nitrocelulosa en las pruebas de flujo lateral. Se depositaron manchas de prueba en las membranas que después se ensamblaron y corrieronusando muestras con E. coliañadida. Se siguió la velocidad de la prueba. Esto incluía el tiempo requerido para que la muestra se desplace por capilaridad alextremo opuesto de la tira, y el tiempo que se necesita para que se desarrolle una señal nítida.15Lo más importante, se examinó la intensidad de la mancha de prueba. Todos los tipos de papel, excluyendoWhatman fusion five, produjeron manchas de prueba. Algunos tipos de papel desarrollaron manchas de prueba completamente redondeadas, mientras que algunos produjeron crestas más que manchas. Esos papeles que produjeron manchas de prueba 20completamente redondeadas incluían CN140, FF60/100, HF075, AE99 y HF090. La diferencia más sorprendente entre estos papeles y los que produjeron crestas, es la velocidad de capilaridad. La velocidad de capilaridad de estos papeles variaba desde 0,025 a 0,06 cm/s. Las membranas que produjeron crestas eran 125, FP, 240 y AE98 y tenían velocidadesde capilaridad que varían desde 0,017 a 0,036 cm/s. Es posible que papeles 25con una velocidad de capilaridad mayor (y por tanto, una fuerza de capilaridad más fuerte) sean capaces de arrastrar los complejos E. coli-Ac-oro a través del margen inferior de la mancha de prueba más rápido, reduce su tiempo de contacto con estos Ac y por tanto limita el cambio de unión que se produce en este punto. Además, debido al efecto anillo de café experimentado durante el secado, los anticuerpos están más concentrados en los márgenes 30de las manchas. Podría ser que las membranas con velocidades de capilaridad más lentas permitan más tiempo de contacto entre el complejoE. coli-Ac-oro y el margen inferior de la mancha. Este tiempo de contacto aumentado podría ser lo suficientemente largo para unir permanentemente la E. colien su lugar en esta área. De ahí, la formación de una señal en forma de cresta. Además, las líneas en forma de cresta tienen una intensidad mucho más 35oscura que las manchas completamente redondeadas. Esto se puede explicar por el hecho
42de que las nanopartículas de oro están, en el casode las líneas con forma de cresta, concentradas en un área mucho menor comparadas con esas líneas en las manchas completamente redondeadas. Como resultado de estas pruebas se ha decido que se usarán membrana con un tamaño de poro mayor para el desarrollo de este dispositivo. Estos tipos de papeles permiten que la prueba corra más deprisa sin comprometer su sensibilidad, 5aseguranque las bacterias E. colide 2 µm viajarán a través del papel sin quedar atrapadas o atascadas, y ofrecen una posibilidad mayor de desarrollar manchas de prueba completamente redondeadas.La tinción de fondo es otro aspecto importante a considerar cuando se selecciona una 10membrana. Se producen dos tipos de tinción, tinción global de la membrana por nanopartículas de oro, y depósitono específico de oro en la mancha de prueba. Para prevenir tal tinción, las nanopartículas de oro y las membranas de prueba se bloquearon adecuadamente. Sin embargo, se encontró que el tipo de membrana usado en la LFT influye en el nivel de tinción. Cada tipo de papel experimenta un tipo específico de tratamiento. Por 15tanto, cada tipo de papelcontiene cantidades y tiposvariables de tensioactivos y otras sustancias químicas. Como resultado, propiedades tales como carga electrostática, humectabilidad, etc., son diferentes para cada membrana.Se encontró la membrana Whatman Prima 125 era la más óptima para esta aplicación. 20Produce el menor ruido de fondo, posee una velocidad de capilaridad rápida y produce manchas de prueba completamente redondeadas. Sin embargo, se encontró después que esta membrana ya no se fabrica. Se introdujo una membrana de sustitución (HF80HP de GE Health) y se considera la versión actualizada de Prima 125. Esta membrana se compró, y se encontró óptima para la aplicación particular.25Tiempo de prueba óptimoSe determinaron los valores en la escala de grises de las manchas de prueba que se formaron después de dejar varias LFT reposar en su muestra y correr durante 30 segundos 30a 30 minutos (datos no mostrados). Se encontró que los valores en la escala de grises disminuyen de 142 a 110 unidades según aumentó el tiempo de prueba de 0,5 a 8 minutos. Esto indica un aumento en la intensidad de color de la mancha de prueba. La mancha de prueba en la LFT probada a 8 minutos parece de menor tamaño que las manchas de prueba en las otras LFT. Como resultado, la intensidad de color en la mancha de prueba en esta 35LFT es mayor (teniendo un valor menor en la escala de grises). Por tanto, el punto de 8
43minutos se omite en este análisis ya que no se puede comparar equitativamentecon las otras intensidades de las señales de prueba. Entre tiempos de prueba de 6 y 16 minutos, los valores en la escala de grises dan una media de aproximadamente 119, fluctuando en ±10 unidades en la escala de grises. El valor en la escala de grises de la mancha de prueba alcanza su valor mínimo y por tanto mayor intensidad después de correr la LFT durante 18 y 520 minutos. Las LFT que se corrieron durante más de 20 minutos produjeron señales de prueba más débiles, cuyos valores de la escala de grises alcanzaron niveles similares al obtenido a 6 a 16 minutos. Esto podría haber ocurrido como resultado de la evaporación o flujo de retorno debido a los tiempos de carrera más largos. Por tanto, un tiempo de carrera de 20 minutos parece óptimo.10Tiempo de secadoóptimoEste estudio se realizó para determinar cuánto tiempo después de correr la prueba se deben ver e interpretar los resultados. Si se lee demasiado pronto, la mancha de prueba en la 15prueba de flujo lateral puede ser poco nítida(o subdesarrollada) ya que los Ac y el analito de muestra pueden haber tenido tiempo insuficiente para interaccionar. Alternativamente, las pruebas no se deben leer demasiado después de ser corridas, ya que el flujo de retorno de la muestra puede volverse problemático. Se encontró que la intensidad de la mancha de prueba aumentaba después de 2 minutos de secado. Esto está indicado por una 20disminución en el valor en la escala de grises desde 218,6 a 0,5 minutos a 206 a 2 minutos. Después de ello, el valor en la escala de grises permanece estable, fluctuando entre 206 y 201 unidades de escala de grises, hasta un tiempo de secado de 20 minutos. A los 22 minutos, la intensidad de la señal aumenta bruscamente, representado por una disminución repentina en elvalor en la escala de grises. Entre 22 y 30 minutos de secado, el valor en la 25escala de grises da una media a aproximadamente 194,5 unidades, el menor valor en la escala de grises observado durante este estudio. La intensidad de la señal de prueba se reduce después de una hora de secado, lo que indica que las LFT no se deben leer más de una hora después de haberse corrido. La intensidad de señal más débil se obtuvo después de menos de 2 minutos de secado. Por tanto, los resultados de la prueba no se deben leer 30antes de 2 minutos después de retirar la LFT de la muestra. Esta diferencia en valores en la escala de grises no se puede traducir en una mejor señal visual ya que la diferencia es demasiado pequeña para ser advertida a simple vista. Por tanto, para resultados cualitativos, la señal de prueba se puede leer 2 minutos después de haberse retirado de la muestra. Cuando se requiere cuantificación, sin embargo, la señal de prueba se debe leer 35solo después de 25 minutos de secado. De esta manera se determinaría la verdadera
44intensidad de la señal de prueba y se puede comparar a una curva de calibración para calibrar la concentración de analito en la muestra.Posición de la línea de prueba5Este experimento se realizó para determinar cómo influye la distancia entre la almohadilla de conjugado y la mancha de prueba en la intensidad de la señal de prueba final. Las manchas de prueba se colocaron para estar a 4 mm, 7 mm, 12 mm y 13 mm de la almohadilla del conjugado. A ojo, la intensidad de las señales de prueba parece aumentar según aumenta la distancia entre la mancha de prueba y la almohadilla del conjugado. La curva de valores en 10escala de grises confirma esto. Los valores grises obtenidos cuando las manchas de prueba se colocan a 13 mm y 12 mm son menores que los obtenidos cuando las manchas de prueba se colocan a 7 mm y 4 mm. Cuando la mancha de prueba se coloca más lejos de la almohadilla del conjugado, hay más tiempo disponible para que las bacterias y el conjugado interaccionen y se unan entre sí, antes de quedar atrapadas en la mancha de prueba. Este 15tiempo de reacción aumentado asegura que más E. colise marca y por tanto más E. colimarcadas quedan atrapadas en la mancha de prueba. Esto produce una señal de prueba más oscura y más fuerte. Por tanto, colocar la línea de prueba más lejos de la almohadilla del conjugado ayuda a aumentar la intensidad de color de las manchas de prueba. Sin embargo, considerando el pequeño tamaño del dispositivo y la necesidad de hacer espacio 20para una mancha control en la membrana, hay un límite a cómo de lejos se puede colocar la mancha de prueba de la almohadilla del conjugado. No obstante, esta información ayuda a que los desarrolladores sepan que maximizar la distancia entre el conjugado y la mancha de prueba puede ayudar amejorar las intensidades de la señal de prueba.25Efecto que tiene una concentración de anticuerpo en la mancha de prueba y conjugado aumentada y un volumen de conjugado aumentado en el límite de detección del dispositivoEl análisis en la escala de grises realizado durante la determinación de la concentración óptima de Ac en las manchas de prueba indica que las intensidades de señal de las 30manchas de prueba se pueden aumentar aumentando la concentración de anticuerpo de la mancha de prueba. Sin embargo, mientras que los valores en la escala de grises indican que las manchas de prueba formadas a 4 mg/ml son más oscuras que las formadas a 2,5 mg/ml, a ojo, la diferencia no se nota. Por tanto,ambas señales parecen igualmente visibles a simple vista. El uso de una concentración de Ac mayor de 2,5 mg/ml, por tanto, no se 35justificaba, ya que el beneficio no supera el coste aumentado del sensor. Sin embargo, si la
45concentración aumentada en la mancha de prueba mejorara el límite de detección de las LFT, incluso en unasolavez, su uso se justificaría. Anteriormente se mostró que aumentar el volumen de conjugado en las LFT aumenta la intensidad de señal de la mancha de prueba. Sin embargo, usar un volumen mayor de conjugado solo se justificará, como en el caso de aumentar la concentración de Ac en la mancha de prueba, si se puede traducir en 5un límite de detección mejorado.Se fabricaron LFT con un volumen de conjugado y concentración de anticuerpo en la mancha de pruebaaumentados para determinar la influencia queesto tendrá en el límite de detección del dispositivo. La concentración de anticuerpo en el conjugado también se 10aumentó para determinar si esto también tendría algún efecto en la sensibilidad del dispositivo. La concentración de la muestra probada en la LFT empezó a 108ufc/ml, y disminuyó en incrementos de 101ufc/ml hasta 100ufc/ml. Se corrió una prueba control negativo usando solo tampón fosfato. Se determinó que cuando se usó una mayor concentración en la mancha de prueba, el límite de detección del dispositivo permaneció en 15106ufc/ml. Este es el mismo límite de detección obtenido cuando se usó una concentración en la mancha de prueba de 2,5 mg/ml. Por tanto, usar una mayor concentración de Ac en la línea de prueba no está justificado incluso aunque la intensidad de la señal misma mejora.También se probaron LFT fabricadas con una concentración de Ac aumentada en el 20conjugado donde la concentración de la muestra usada en cada LFT aumentó de 103ufc/ml a 108ufc/ml. Se corrió una prueba control negativo con tampón fosfato. Estas pruebas se corrieron con E. coli0157:H7 muertas por calor y se encontró que el límite de detección era 105ufc/ml. Por tanto, no se produce cambio en el límite de detección con un aumento en el volumen de conjugado. La razón para el límite de detección disminuido de la carrera de LFT 25con E. colimuertas por calor comparadas con E. colivivas, es la afinidad aumentada que los anticuerpos en la prueba tienen por los organismos muertos por calor. Los animales usados para producir los anticuerpos usados en la LFT se inmunizaron realmente con E. colimuertas por calor. Como resultado, estos anticuerpos se produjeron en respuesta a los organismos muertos por calor y, por tanto, se unirán siempre a estos organismos más 30sensiblemente.También se corrieron pruebas con un volumen de conjugado aumentado. La concentración de la muestra disminuyó de 108ufc/mlhasta 100ufc/ml. Se corrieron pruebas control negativo con tampón fosfato.35
46Las LFT fabricadas usando un volumen de conjugado aumentado no mostraron mejora en el límite de detección, incluso aunque se produce una mejora en la intensidad de la mancha de prueba. En un intento final para mejorar el límite de detección del sensor, se hicieron LFT con una combinación de un volumen y concentración de anticuerpo de conjugado aumentados y una concentración de Ac en la mancha de prueba aumentada. Estas LFT 5tampoco demostraron mejora en el límite de detección. Por tanto, pareceque el sensor se ha optimizado por completoy no se puede hacer nada más para mejorar la sensibilidad del sensor. Se hizo un ELISA en los anticuerpos usados tanto en el conjugado como en la mancha de prueba del sensor. Se encontró que ambos Ac tenían un límite de detección de 106ufc/ml. Por tanto, se puede concluir que siempre que se use este par particular de Ac, y 10se use en el formato LFT estándar con nanopartículas de oro, el límite de detección no se puede cambiar.Conclusión15Se ha demostrado un método de bajo coste para la fabricación de sensores de flujo lateral basados en papel. Se cree que los sensores desarrollados usando este método sirven bien para la demostración de prueba de concepto. Usando estudios de optimización iniciales, cubiertos en este ejemplo, se puede calibrar el rendimiento final del sensor. Se encontró que aumentar la concentración y volúmenes de biorreactivo usado en la LFT indefinidamente, no 20se traduce en un rendimiento del sensor mejorado. Los valores óptimos para estos parámetros son los que alcanzan el equilibrio correcto entre rendimiento y coste de fabricación.Ejemplo 225Detección de E. coli usando tecnología de flujo lateral y microfluídica basada en papel: Evaluación del rendimiento de la prueba de flujo lateralSensibilidad y especificidad30La especificidad es una estimación estadística de la capacidad de la prueba para identificar una muestra negativa verdadera. Una prueba específica no producirá una señal de prueba positiva en presencia de bacterias diferentes que su diana, que eneste caso, es E. coli. Por tanto, la especificidad proporciona una indicación de la reactividad cruzada de la prueba. La 35sensibilidad es una estimación estadística de la capacidad de la prueba de identificar
47exactamente muestras positivas verdaderas. Por tanto, una prueba sensible siempre producirá resultadosde prueba positivos cuando están presentes bacterias diana y están dentro los límites de detección de la prueba. La sensibilidad y la especificidad se calculan como sigue:5Sensibilidad = Verdaderos positivos/(Verdaderos positivos + Falsos negativos) x 100%Especificidad = Verdaderos negativos/(Verdaderos negativos + Falsos positivos) x 100%Para el análisis específico en la prueba de flujo lateral, se usaron seis tipos diferentes de 10bacterias. Estas bacterias fueron amablemente proporcionadas por la unidad de Natural Resources and Environment (NRE) en elCSIR eincluyen: E. coliK12, E. coli0157:H7, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aueruginosa, Salmonella enteritidis yAcinetobacter.Cada tipo de bacteria se resuspendió en tampón fosfato para crear una solución de 10815ufc/ml y después se probó en pruebas de flujo lateral, que se siguieron para el desarrollo de una señal de prueba positiva. Se realizaron un total de 120 pruebas. Para determinar el límite de detección de la prueba, se usó dilución en serie para generar muestras que tenían concentraciones de E. coli0157:H7que variaban desde 108a 100ufc/ml. Estas muestras se probaron después en las LFT. La menor concentración bacteriana que produce una señal de 20prueba positiva se considera el límite de detección del dispositivo. Para determinarla sensibilidad de la prueba, se usaron suspensiones de E. coli0157:H7y K12 a concentraciones de muestra variables. Se realizaron un total de 300 pruebas.Detección de bacterias muertas25Para determinar si se pueden detectar bacterias muertas en las LFT, muestras de E. coliK12y 0157:H7, resuspendidas a 108ufc/ml, se bañaron con cantidades variables de cloro para matar las bacterias, y después se probaron en laLFT. Como no había disponible cloro líquido, se usó lejía doméstica para estos experimentos. La lejía contiene el 2% de 30hipoclorito de sodio, que se traduce a 20000 ppm de cloro disponible. Para variar las concentraciones de cloro a las que se expusieron las bacterias, se usó la ecuación (1).C1V1= C2V2(1)Por ejemplo, 20000 ppm (V1) = 8ppm (1250 µl)(1. 1)V1= 0,5 µl(1. 2)
48Por tanto, para exponer las bacterias a una concentración de cloro de 8 ppm, se añaden 0,5 µl de lejía a 1249,5 µl de la muestra de E. coli. De esta manera, las suspensiones bacterianas se expusieron a concentraciones de 2 ppm a 1000 ppm y en algunos casos incluso mayores. Las bacterias se pusieron en contacto con las diferentes concentraciones de cloro durante 30 minutos para matarlas. Para confirmar que las bacterias estabande 5hecho muertas, las bacterias bañadas en cloro se cultivaron en medio nutritivo durante la noche a 37ºC. La ausencia de crecimiento después de 24 horas confirmó que las bacterias estaban muertas. También se investigaron varios tiempos de contacto. Esto se hizo para determinar durante cuánto tiempo se necesita incubar juntos las bacterias y el cloro para asegurar que las bacterias mueren. Los tiempos de contacto investigados se variaron desde 101 minuto a 60 minutos, después de lo cual cada suspensión se hizo crecer en medio nutritivo durante la noche. Esas concentraciones de cloro y tiempos de contacto que demostraron eficacia en matar bacterias se usaron después para matar las bacterias usadas para realizar este estudio. Para realizar estas pruebas, se ensayaron200 µl de la solución cloro-E. colien la LFT.15El fin de esta investigación es primeramente identificar si las LFT detectan bacterias muertas, es decir, determinar si las LFT son capaces de distinguir bacterias muertas de vivas. En segundo lugar, si las LFT pueden distinguir bacterias muertas de vivas, el fin es determinar la dosis de cloro a la que esto se produce. Esta concentración se puede 20comparar después con la usada actualmente para desinfección en la industria de tratamiento de agua. Esto ayudará a determinar si solo las bacterias vivas serán detectadas cuando se usa LFT para analizar tales muestras medioambientales.Movimiento de bacterias a través de la matriz de papel25Este estudio se realizó para entender mejor cómo migran las bacterias de la almohadilla de muestra a la mancha de prueba de la prueba de flujo lateral. Los diferentes tipos de papel que hacen la LFT tienen estructuras complejas hechas de poros y fibras de celulosa elongadas, y se diferencian entre sí en varias maneras. La posibilidad de que las bacterias 30queden atrapadas en esta matriz compleja es alta, sin embargo, el nivel al que quedan atrapadas se desconoce. La información de este estudio ayudará a proporcionar conocimiento sobre si todas las bacterias contenidas en la muestra realmente alcanzan la mancha de prueba y experimentan detección. Si muchas bacterias quedan atrapadas antes de alcanzar la mancha de prueba, menos bacterias están disponibles para detección. Esto 35puede producir que el límite de detección descrito de la prueba sea peor de lo que realmente
49es. Por ejemplo, tome el caso de una LFT que produce una señal solo cuando un mínimo de 105ufc está contenido en la muestra. Asumiendo que las pérdidas de bacterias son significativas y solo 103ufc alcanzan la mancha de prueba, el límite de detección real de la prueba es 103ufc y no 105ufc, como se describirá. Idealmente, cuando se cargan 103ufc en la muestra, las 103ufc enteras experimentarán detección e indicarán el verdadero potencial 5del sensor que se analiza. Caracterizar el grado de atrapamiento de bacterias en el papel, por tanto, ayudará a los desarrolladores de sensores de papel a entender mejor las pérdidas de analito en un dispositivo, permitiéndoles construir o diseñar sus dispositivos de tal manera que se minimicen tales pérdidas.10Determinar el número exacto de bacterias atrapadas en las regiones inferiores de la LFT una vez ha cesado el movimiento de la muestra es de alguna manera difícil. Esto se debe principalmente a la estructura compleja del papel. Un método es liberar las bacterias atrapadas de diferentes regiones del papel en tampón mediante elución, cultivo del tampón de elución en agar nutritivo y recuento del número de bacterias que crece. Sin embargo, 15este método solo dará una idea de la cantidad de bacterias atrapadas en las varias regiones de la prueba. Determinar el número exacto es difícil ya que algunas bacterias pueden no liberarse del papel. Otra técnica que puede indicar el grado de atrapamiento es teñir o colorear E. coli(sea con unmarcador fluorescente o colorimétrico) y después enjuagar este a través de la prueba de flujo lateral. De esta manera, se puede visualizar el atrapamiento. 20Sin embargo, incluso este método es solo cualitativo. Una desventaja del análisis visual es que puede ser difícil ver las señales de las bacterias atrapadas marcadas en la superficie inferior del papel y en el refuerzo adhesivo, y por tanto se pierden. Esto es porque las señales colorimétricas visuales solo surgen de unos pocos micrómetros superiores dela superficie del papel.25Por tanto, determinar el número exacto de bacterias atrapadas en el papel es difícil. Sin embargo, usando estas técnicas puede ser posible obtener una idea del número de bacterias que se quedan atrapadas en la LFT y determinar elefecto que esto tiene en el rendimiento del sensor. De esta manera se pueden identificar esas regiones del sensor que 30producen el mayor atrapamiento de modo que se pueden tomar pasos para deducir esto. Esta información es útil especialmente últimamente, cuando la industria de sensores de papel recibe mucha atención. Hasta la fecha, no hemos encontrado información que ilustre el nivel de atrapamiento del analito en sensores de papel, y el efecto que esto tiene en el rendimiento del sensor. Esta información contribuye al desarrollo de sensores de alta 35calidad.
50Para los estudios de elución, se corrieron LFT con suspensiones de E. coliK12 que tenían concentraciones de108y 103ufc/ml. Una vez corridas las LFT, sus diferentes secciones se separaron asépticamente. Para la prueba de 103ufc/ml, se usaron la almohadilla de muestra, almohadilla de conjugado, mancha de prueba, mancha control y mecha. Para la 5prueba de 108ufc/ml, se usaron las mismas secciones, apartede la mecha. Las secciones separadas se colocaron en tubos de ensayo de vidrio separados que contenían 600 µl de PB y se agitaron con el vórtex suavemente para fomentar la liberación de las bacterias del papel en el tampón. Una vez se completó este paso de elución, el tampón se inoculó en placas Petri con medio nutritivo. Puesto que una placa individual solo se puede inocular con 10100 µl, se usaron 6 placas Petri por sección de la LFT para cultivar los 600 µl enteros del tampón de elución. Para determinar el número total de unidades formadoras de colonias liberadas de cada sección de la LFT, se sumaron las colonias que se forman en las 6 placas.15Para confirmar que E. coliestaba de hecho presente en las muestras usadas para este análisis, se cultivaron 100 µl de la muestra original y demostraron crecimiento positivo. Para servir como control negativo, se corrió tampón fosfato (sin E. coli) en una prueba de flujo lateral. Esta LFT también se separó en sus secciones constituyentes que se pasaron a través del proceso de elución, después de lo cual se cultivóel tampón de elución. Como se 20esperaba, no se observó crecimiento.Para todos los estudios anteriormente mencionados se corrieron suspensiones de E. coliK12 (108y 103ufc/ml) en un dispositivo de flujo lateral cargado con anticuerpos anti-E. coli-0157:H7 en el conjugado y anticuerpos anti-E. coli-“todo O y K” en la línea de prueba. 25Puesto que los Ac del conjugado eran específicos para la cepa 0157:H7, no se unirían a E. coliK12. Los Ac de la mancha de prueba (TS) detectan una gama más amplia de E. coliy por tanto es más probable que se unan a E. colien la mancha de prueba. Sin embargo, puesto que E. colino está marcada, no se observará una señal en la mancha de prueba. La posibilidad de la unión de E. colia la mancha de prueba se debe tener en cuenta cuando se 30da cuenta de las bacterias durante los estudios de elución.Para los estudios de tinción colorimétrica, E. coliK12 se cultivó en agar McConkey. En este agar E. colicrece como colonias rojas. Las colonias rojas de E. colise resuspendieron entampón fosfato a una concentración de aproximadamente 107ufc/ml y se corrieron en la 35
51prueba de flujo lateral. Las bacterias rojas se siguieron según se movían hacia arriba en la longitud de la tira de prueba.E. coli-0157:H7 (105ufc/ml) también se marcó fluorescentemente usando anticuerpos anti-E. coli-0157:H7 etiquetados con nanopartículas de poliacrilonitrilo chromeon 470 (Sigma 5Aldrich). Estas bacterias marcadas fluorescentemente se dejaron fluir arriba de una prueba de flujo lateral de media tira. Las pruebas de media tira se ensamblan solo con una membrana de nitrocelulosa (cargada con manchas de prueba y control) unidas a una mecha absorbente, ensamblando ambas en unatarjetade refuerzo adhesiva. No se incluyen almohadillas de conjugado y muestra.Para visualizar la fluorescencia después de correr las 10medias tiras, las tiras se secaron durante 10 minutos en un horno a 37ºC, se colocaron en un microscopio de fluorescenciainvertido, y se excitaron usando una longitud de onda de 470 nm. El colorante emite a una longitud de onda de 611 nm, que se visualizó en el microscopio. Usando todas las técnicas anteriores, se obtuvo una tendencia que representa el nivel de atrapamiento de bacterias en una prueba de flujo lateral.15Pruebas de flujo continuoLas pruebas de flujo continuo son otra forma rápida de pruebas diagnósticas inmediatas. En este formato de ensayo, una sección de la membrana de nitrocelulosa se carga con 20manchas de prueba y control y después se coloca encima de un trozo de almohadilla absorbente. El fluido de muestra se carga en la membrana, entra en contacto con las manchas de prueba y control, después sigue fluyendo hacia abajo en la almohadilla absorbente. Por tanto, las pruebas de flujo continuo no tienen almohadilla de muestra y conjugado, lo que implica que el atrapamiento de las bacterias en estas regiones no puede 25influir el rendimiento del sensor.Se hizo una prueba de flujo continuo para identificar la influencia que tiene el atrapamiento de bacterias en el rendimiento de las pruebasde flujo lateral. Para fabricar la prueba de flujo continuo, se usó una membrana de celulosa sin reverso reforzadode 1 cm por 1 cm. Se 30diluyó anticuerpo anti-E. colide conejo (ABD serotec) a 2,5 mg/ml y se cargó en la membrana, sirviendo como la mancha de prueba. La mancha de prueba se secó en el sitio durante 30 minutos a 37ºC, se bloqueó usando una solución de bloqueo de membrana y después se secó durante 1 hora a 37ºC. Se prepararon trozos de 1 cm por 1 cm de almohadilla absorbente. Para ensamblar la prueba de flujo continuo, la almohadilla 35absorbente se colocó directamente detrás de la membrana, y se emparedó entre 2 clips
52grandes. Los clips se elevan para prevenir que la almohadilla absorbente haga contacto con cualquier otra superficie que pueda influir el rendimiento del sensor.Las muestras se prepararon como sigue. Se hicieron suspensiones de E. coli0157:H7, que variaban en concentración de 108ufc/ml a 101ufc/ml. Se añadió un volumen de 200 µl de 5cada dilución a tubos de ensayo de vidrio, en los que se habían añadido 6 µl de conjugado de oro y dejó estar en contacto durante 7 minutos. El límite de detección de estas pruebas de flujo continuo se examinó y se discute en el ejemplo 2. Sin embargo, se debe considerar que la membrana usada para esteestudio era diferente a la membrana usada en las pruebas de flujo lateral. Esto es porque la membrana de la prueba de flujo lateral no tiene 10reverso reforzadoy no es adecuada para uso en un sistema de flujo continuo.Análisis por microscopía electrónicade barridoPara entender más cómo se mueven las bacterias a través de la matriz de papel de las 15pruebas de flujo lateral, se tomaron imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) de las diferentes secciones de la LFT. Se corrieron LFT con muestrasde E. coli0157:H7 muertas por calor (107ufc/ml) y con tampón sin nada agregado (esto sirvió como control negativo). Una vez corrida la prueba, las LFT se separaron asépticamente en sus partes constituyentes. Estas incluyen la almohadilla de muestra, almohadilla de conjugado, región 20de mancha de prueba y región de mancha control. Cada sección se recubrió por pulverización catódica con oro para mejorar su visibilidad en MEB y después se analizaron. Además de examinar las bacterias presentes en las diferentes secciones de la LFT, también se analizaron las características estructurales y morfológicas de los diferentes tipos de papel usados para crear la LFT. El fin de este trabajo era confirmar si las bacterias se quedaban 25atrás o no en las regiones inferiores de la LFT una vez corrida la prueba.Detección de un organismo único de E. colien la prueba de flujo lateralSegún la Organización Mundial de la Salud (OMS) y los Estándares Nacionales 30Sudafricanos (SANS 241, 2011), no debe haber E. colipresente en agua potable. Como resultado, para ser aplicable al análisis de agua potable, los sistemas de detección de E. colideben ser capaces de detectar tan poco como 1 ufc en una muestra de agua de 100 ml. Sin embargo, para el análisis de agua residual, esto puedecambiar. El nivel de microbios permitido en el efluente que sale de las instalaciones de tratamiento de agua residual está 35controlado por legislación gubernamental, y con frecuencia es específico para cada
53instalación de tratamiento de agua. Los niveles aceptables habitualmente están guiados por la localización de la planta, y el cuerpo de agua al que entra el efluente. El nivel de E. coligeneralmente permitido en efluente de aguas residuales es 1000 bacterias por 100 ml de agua. Esto implica que para análisis de aguas residuales, los sistemas de detección de E. colideben tener la capacidad de detectar 1000 E. colipor muestra de 100 ml. Sin embargo, 5la mayoría de los sistemas empleados para análisis de aguas residuales aún tienen la capacidad de detectarun único organismo.Para este estudio, se investigó la capacidad de la prueba de flujo lateral para detectar una única bacteria E. coli. Se encontró que el límite de detección de la LFT era 106ufc/ml. Por si 10misma, la LFT puede, por tanto, solo aplicarse para análisis de agua durante estallidos de emergencia, cuando son prevalentes grandes cantidades de bacterias. Se decidió que incorporando un paso de preenriquecimiento, la LFT podría potencialmente detectar una única E. coli. Durante el preenriquecimiento, las bacterias se colocan en medio rico en nutrientes, se exponen a temperaturas favorables para el crecimiento y de esta manera se 15cultivan a niveles que son detectables en la LFT (106ufc/ml). Debido a la incorporación de este paso, sin embargo, la duración del procedimiento de prueba se vuelve más largo. Sin embargo, si el tiempo requerido para detectar una única bacteria es menor que el requerido durante métodos de detección convencionales de E. coli, la prueba será todavía ventajosa para la industria de control de agua. Un tiempo más rápido al resultado implica que la 20información respecto a la seguridad de las fuentes de agua potables es obtiene antes, lo que ayuda a prevenir la propagación de la enfermedad. Para determinar si el preenriquecimiento permite que la LFT detecte una E. coli, se hizo lo siguiente.Una suspensión de E. coli0157:H7 de 2,7 x 108ufc/ml se diluyó en serie a concentraciones 25de 2,7 x 102ufc/ml, 2,7 x 101ufc/ml y 2,7 x 100ufc/ml. Se inoculó 1 ml de cada una de las tres suspensiones en 11 placas Petri cada una de las cuales contenía 5 ml de caldo nutriente no selectivo. Las placas Petri se incubaron después a 37ºC durante 11 horas. Después de cada 1 hora de incubación, 1 placa Petri para cada concentración se probó usando 3 pruebas de flujo lateral. Esto se hizo hasta que la LFT desarrolló una señal de 30prueba positiva. Se inocularon tres placas Petri adicionales que contenían 5 ml de caldo con 1 ml de cada concentración muestra, y se probaron sin haber tenido incubación. Esto sirvió como un control experimental. Ninguna de estas LFT produjo señales de prueba positivas.Para asegurar que las muestras de 102, 101y 100ufc/ml realmente contenían estas 35cantidades de bacterias, se cultivó 1 ml de cada muestra en agar nutriente. Como 1 placa
54Petri solo se puede inocular con 100 µl, se usaron 10 placas por muestra. Por tanto, para determinar el número total de colonias por ml de muestra (para cada concentración), se sumaron las colonias que se forman en las 10 placas.Análisis de muestras de agua medioambientales5Para determinar la capacidad de la prueba de flujo lateral para manejar muestras de agua medioambientales, se recogieron muestras de efluentes de una instalación de tratamiento de aguas residuales local (Tshwane Water) y seanalizaron. Como el contenido en E. coliera bajo en estas muestras (menor de 100 ufc por 100 ml de muestra), se incluyó el paso de 10preenriquecimeinto durante este análisis.Para asegurar que la muestra de efluente fluye a través de la prueba de flujo lateral y produce una mancha de prueba si está presente E. coli, a las muestras de efluentes se les agregó E. coli0157:H7 y se probaron. Se prepararon suspensiones de E. colicon 15concentraciones que variaban desde ±108ufc/ml a 100ufc/ml. Este estudio se hizo para asegurar que el efluente fluye a través del papel sin atascarlo y que cualquier compuesto químico y/o biológico en el efluente no impide el desarrollo de la señal o produce ruido de fondo alto.20Para asegurar que las cepas y serotipos de E. colien el efluente se pueden detectar en la LFT, se obtuvo una muestra de la entrada de la planta. La entrada contendrá todos los tipos diferentes de E. colique se podrían posiblemente producir en el efluente tratado, aunque a una concentración mucho mayor. Eneste ejemplo, las LFT solo se probaron usando 2 cepas de E. coli, 0157:H7 y K12. El ejemplo 4 expone si cepas medioambientalmente comunes de 25E. colise podrían detectar en la LFT. Hay poca probabilidad de que haya grandes cantidades de E. coli0157:H7 (una cepa normalmente encontrada en alimentos) o E. coliK12 (una cepa de laboratorio) en la muestra de entrada. Por tanto, cualquier señal de prueba positiva que surja sería debido a la detección de cepas diferentes de estas.30El procedimiento combinado de preenriquecimiento y prueba en LFT se usó para analizar la muestra de efluente. Como es estándar en la industria del agua, se probaron muestras de efluente de 100 ml. Se filtraron veinticuatro muestras de efluente de 100 ml a través de filtros de celulosa de 0,45 µm separados. Cada filtro se colocó en su propia placa Petri relleno con caldo nutriente y se incubó durante varias horas. Durante la incubación, el caldo se probó en 35una LFT cada hora hasta que se obtuvo una señal de prueba positiva. Se colocaron 12
55filtros en medio nutriente general, y se colocaron 12 en medio selectivo de coliformes y E. coli.Comparación con otros kits comerciales: sensibilidad, especificidad, bacterias muertas5Se hizo una comparación de rendimiento entre la prueba de flujo lateral de la presente invención y otros 3 sistemas de detección de E. colicomerciales. Se evaluaron E. colilert (IDEXX Laboratoiries, 2011), Microsnap (Hygiena Inc, 2013) y el kit de prueba rápida para E. coli0157:H7 de Cell Biolab (Cell Biolabs, 2011) conrespecto a lo siguiente: (1) capacidad para distinguir bacterias muertas de vivas, (2) límitede detección/sensibilidad y (3) 10especificidad/reactividad cruzada.Este análisis se hizo para determinar cómo de bien rinde la LFT desarrollada en relación a sistemas que han experimentado validación del mercado. Algunos de estos sistemas de hecho han sido aprobados para la detección de E. colien fuentes de agua globalmente. La 15información recogida de esta investigación proporcionará una indicación de cómo es devendible la prueba de flujo lateral, y que aspectos de la prueba aún requieren mejora.Colilert y Microsnap dependen de la capacidad de dos enzimas, β-glucuronidasa (encontrada en E. coli) y β-galactosidasa (encontrada en todas las coliformes) para cortar 20sustratos específicos que liberan compuestos cromógenos y fluorógenos. Por consiguiente, se usan cambiosde colorpara indicar la presencia de estas bacterias. La prueba de flujo lateral de Cell Biolabs, como la prueba de flujo lateral desarrollada, emplea unión anticuerpo-antígeno para la detección.25Para las pruebas Colilert, se prepararonmuestras de 100 ml de Pseudomonas aueruginosa, Enterobacter cloacae, Salmonella enteritidisyE. coli0157:H7a una concentración de 1,5 x 101ufc/ml. El sustrato Colilert se disolvió en cada muestra de 100 ml y después se transfirió asépticamente en bandejas cuantitativas Colilert. Después de 18-24 horas de incubación a 37ºC, se leyeron los resultados. Se siguió un procedimiento similarcuando se probaron 30muestras de bacterias muertas.Para determinar el límite de detección de las pruebas de flujo lateral de Cell Biolabpara E. coli0157:H7, se hicieron suspensiones de esta bacteria a concentraciones que variaban de 108ufc/ml a 100ufc/ml. Se diluyeron 150 µl de cada muestra con 150 µl del tampón del 35fabricante. Las muestras estaban entonces listas para usar. Se siguió un procedimiento
56similar cuando se probaron muestras de bacterias muertas. Cuando se usó con muestras que tenían una baja concentración de bacterias, las muestras se filtraron primero para capturar las bacterias en una membrana que después se incuba durante las 18-24 horas prescritas. Se extraen después 150 µl de la muestra enriquecida y se diluyen en 150 µl de tampón antes de correrlas en las tiras de prueba. Cuando se probaron estas LFT para 5especificidad, muestras de no E. coli0157:H7sehicieron en suspensiones de 107ufc/ml. Se diluyeron 150 µl de estas suspensiones en tampón antes de correrlas en las LFT.Para analizar el sistema Microsnap, se prepararon suspensiones bacterianas a 104 ufc/ml dePseudomonas aueruginosa, Enterobacter cloacae, Salmonella enteritidisyE. coliK12. Se 10filtraron 100 ml de cada suspensión a través de un filtro de 0,45 µm que se incubó en el caldo nutriente suministrado por el fabricante durante 8 horas. Después de ello, se transfirieron 200 µl de cada muestra enriquecida a pruebas Microsnap individuales, se incubaron durante 10 minutos a 37ºC (según las instrucciones del fabricante) y después se leyeron los resultados usando el luminómetro Ensure (lector) proporcionado. Se siguió el 15mismo procedimiento cuandose analizaron muestras de bacterias muertas.Resultados y discusiónSensibilidad y especificidad20El límite de detección de la prueba de flujo lateral se determinó que era 106 ufc/ml. Una revisión por Peruski et al. (2003) manifiesta que las pruebas de flujo lateral para microorganismos, basadas en tecnología de inmunoensayo, tienen límites de detección que varían desde 108 a 105 ufc/ml. Esto indica que la LFT rinde dentro de límites aceptables.25Para el análisis de especificidad, las bacterias enumeradas anteriormente se probaron en las LFT. La producción de una señal de prueba positiva en la LFT indicaba reactividad cruzada entre los anticuerpos y las bacterias no diana. Para determinar la sensibilidad de la prueba de flujo lateral, se probaron suspensiones de E. coliK12 y E. coli0157:H7. El 30número de resultados falsos negativos se usó como una indicación de la sensibilidad de la prueba. Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 3.Tabla 3: Resultados de las pruebas de sensibilidad y especificidadMicrorganismoNo. de pruebas realizadasNo. de positivosNo de negativos
57E. coli0157:H71501500E. coliK121501500Enterobacter cloacae30030Pseudomonas aueruginosa30300Salmonella enteritidis301020Acinetobacter30030Total42034080Tabla 4: Resumen de los resultados de sensibilidad y especificidad5Por tanto,10Sensibilidad= VP/(VP+FN) x 100= 300/(300+0) x 10= 100%Especificidad= VN/(VN+FP) x 10015= 80/(80+40) x 100= 67%Estos resultados indican que la prueba de flujo lateral ofrece una sensibilidad del 100% cuando el recuento de E. colien la muestra está por encima de su límite de detección de 106 20ufc/ml. En el momento de este análisis solo dos serotipos de E. coli, K12 y 0157:H7 estaban disponibles para ensayar. Los anticuerpos usados en la prueba de flujo lateral pueden detectar todas las cepas O y K de E. coli. Estasson las cepas más comunes de E. colique existen en el medio ambiente. Todos los tipos conocidos de E. colihasta la fecha contienen el antígeno O. Esto implica que la LFT podría potencialmente detectar todos los tipos de E. 25coli, dependiendo en la capacidad del anticuerpo para detectar las cadenas de antígeno O tanto de longitud larga como corta. Como muchos de estos tipos de E. coli, por tanto, necesitan probarse en la LFT para predecir más realísticamente la verdadera sensibilidad MicrorganismoVerdaderos positivosFalsos NegativosFalsos positivosVerdaderos negativosE. coli3000--No-E. coli--4080
58del dispositivo. Esto es importante ya que indicaría el nivel de sensibilidad que se puede esperar cuando se prueban muestras de agua medioambientales.Se obtuvo un resultado de especificidad del 67% y es principalmente debido a la interacción no específica de la LFT con la bacteria Pseudomonas aueruginosa. Se observó reactividad 5cruzada con Salmonella enteritidis, que se producía en el 33,3% de las pruebas realizadas. Esto puede ser debido a que hay menos sitio de unión antigénica en la bacteria lo que reduce la probabilidad de unirse cada vez, o los epítopos se esconden en algunos casos. No se observó otra reactividad cruzada. Para asegurar que la mayoría de las cepas de E. colison detectadas por la LFT, se emplearon anticuerpos monoclonales para detección. Debido 10a su naturaleza inherente, los anticuerpos policlonales tienden a mostrarreactividad cruzada, y según el fabricante, se sabe que este anticuerpo particular da reacción cruzada con otras enterobacterias. Este se debe probablemente a que estas bacterias comparten sitios antigénicos comunes con E. coli, y sirve como una explicación para la reactividad cruzada con Salmonella enteritidis(una enterobacteria). Se sabe que los anticuerpos anti-E. 15colipueden dar reacción cruzada con Pseudomonas aueruginosadebido a los antígenos de superficie comunes compartidos entre estas dos bacterias. Esta podría ser la razón para las débiles señales de prueba obtenidas con Pseudomonas aueruginosaen la LFT. La reactividad cruzada con enterobacterias puede no influir negativamente en el rendimiento de las pruebas, ya que una señal de prueba positiva aún indicará que la fuente de agua es 20insegura. Esta es la principal intención de este dispositivo.Un estudio reciente por Luyt et al. (2012) indica que la especificidad del sistema de detección Colilert es del 92,8%, sin embargo, Colilert solo puede detectar el 56,4% de todas las cepas de E. coliconocidas. Como mencionan Guo et al. (2005), los antígenos O que son 25diana y se usan para detección por la LFT existen en la mayoría, si no en todos los tipos de E. coli. Esto implica que la LFT desarrollada tiene un gran potencial para detectar más del 56,4% de todas las E. coliencontradas en el medio ambiente. Para examinar más el rendimiento de la prueba de flujo lateral, se someterá a ensayos decampo en Tshwane Water (Sudáfrica). Durante los ensayos de campo, el rendimiento de la prueba de flujo 30lateral, con respecto a su sensibilidad, especificidad y velocidad de análisis, se comparará con métodos de detección de E. coliconvencionales y más recientes.Detección de bacterias muertas en LFT35
59En las instalaciones de tratamiento de agua, se alcanza desinfección adecuada cuando se usa una dosis de cloro entre 5 ppm y 7 ppm junto con un tiempo de contacto de 30 minutos. En el laboratorio, se dosificaron soluciones de E. coli(108ufc/ml) con concentraciones de cloro que variaban de 1 ppm a 8,5 ppm, se incubaron durante 60 minutos y después se cultivaron en medio nutriente. No se observó crecimiento de E. colien ninguna de las 5placas, lo que indica que incluso a concentraciones de cloro tan bajas como 1 ppm, las bacterias se convierten en metabólicamente inactivas (muertas). La solución original de E. coliusada para este estudio (sin empapar con cloro) confirmó que se usaron bacterias vivas en este estudio. Estas placas demostraron crecimiento positivo.10Para determinar el tiempo de contacto requerido, se empaparon suspensiones de E. colicon 5 ppm de cloro y se pusieron en contacto durante 2 a 60 minutos. Se seleccionó una concentración de cloro de 5ppm ya que es comúnmente usada en plantas de tratamiento de agua y se ha confirmado que mata las bacterias. Después de cultivar, ninguna muestra demostrócrecimiento. Esto implica que a una concentración de cloro de 5 ppm, 2 minutos 15de tiempo de contacto es suficiente para matar las bacterias. El control positivo (la muestra de E. coliusada para este estudio), demostró crecimiento positivo.Por tanto, estos parámetros se usaron para matar la E. coliusada para evaluar la capacidad de la LFT para distinguir E. coliviva de muerta. Las bacterias muertas podrían estar en un 20estado viable pero no cultivable (VBNC) o completamente disgregadas.Este estudio se hizo para seguir si la LFT desarrolla una señal de prueba positiva cuando se prueban bacterias muertas.También se empaparon muestras de E. coli0157:H7vivas con las siguientes 25concentraciones de cloro: 10 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 2500 ppm y 3000 ppm. Estas concentraciones hacen las bacterias no cultivables, sin embargo, no se sabe si estas concentraciones son adecuadas para disgregar las bacterias. Para que los anticuerpos en la LFT no detecten E. coli, sus antígenos de superficie deben estar ausentes. Esto es porque los anticuerpos usados en la LFT se dirigen a antígenos o epítopos que están en la 30superficie externa de la bacteria E. coli. Puesto que se determinó que 1-8,5 ppm de cloro hace las bacterias no cultivables, cualquier concentración mayor que esta debe hacer lo mismo. Estas altas concentraciones de cloro se usaron para identificar a) la dosis de cloro a la que la LFT ya no detecta la E. coli(implicando que las bacterias se pueden haber disgregado por completo), y b) cómo se compara esta dosis a la usada en la industria de 35tratamiento de agua.
60Después de poner en contacto E. coliy cloro durante 30 minutos, las muestras se probaron en la LFT. Ninguna de las pruebas produjo señales de prueba positivas, incluyendo la muestra inoculada con 10 ppm de cloro. Mientras que la mancha de prueba en la prueba de 10 ppm demostró una niebla rosa, no se puede considerar como una señal de prueba 5verdadera especialmente cuando se compara con la intensidad de señal oscura de la LFT usada como control positivo (corrida con una muestra rica en E. colisin clorar). Esto se observa además por al altovalor en la escala de grises de la prueba de 10 ppm en contrasteal menor valor en la escala de grises dela LFT control positiva (resultados no mostrados). No se observaron manchas de prueba en las LFT restantes.10Estos resultados indican que concentraciones de cloro deo por debajo de 10 ppm puede producir que las bacterias E. colise rompan y no sean detectadas en la LFT.A continuación, muestras de E. coli0157:H7vivas (108ufc/ml) se empaparon con 2 ppm a 1530 ppm de cloro. Se observaron señales de prueba positivas fuertes para concentraciones de cloro entre 2 ppm y 10 ppm. A 12 ppm, la intensidad de la señal de prueba se debilita significativamente, y permanece de esa manera hasta una concentración de cloro de 20 ppm. A concentraciones de cloro de 30 ppm y mayores, la señal de prueba desaparece por completo. El descenso en la intensidad de señal a 12 ppm indica que a esta concentración 20las bacterias pueden empezar a disgregarse, proporcionando una explicación para la intensidad de señal debilitada.Por tanto, las LFTsolo son capaces de distinguir convincentemente bacterias muertas de vivas a concentraciones de cloro por encima de 30 ppm. El cambio en la intensidad de la 25señal a 12 ppm se podría usar junto con una curva de calibración (que indica qué aspecto debe tener una señal positiva), sin embargo, 12 ppm aunque cerca, todavía está por encima de las concentraciones de cloro usadas durante el tratamiento de agua. No obstante, puesto que los recuentos de E. colien agua tratada siempre estarán muy por debajo del límite de detección del dispositivo (106ufc/ml), siempre se requerirá preenriquecimiento. Mediante el 30preenriquecimiento, la LFT siempre detectará solo bacterias viables (vivas), ya que solo estas bacterias se pueden cultivar y por tanto detectar. Por tanto, se previene el riesgo de bacterias muertas que produzcan resultados de prueba falsos positivos. El preenriquecimiento es un requisito de la mayoría de las pruebas microbiológicas debido a la necesidad de detectar tan poco como 1 ufc en 100 ml de agua. Estepaso de 35preenriquecimiento asegurará que la LFT detectesolo E. colivivas en una muestra.
61Se compraron bacterias muertas por calor como un control positivo del suministrador del anticuerpo. Se confirmó que estas bacterias retenían su estructura celular entera, pero son metabólicamente inactivas por completo. A concentraciones iguales o por encima del límite de detección de la LFT, se observan señales de prueba positivas intensas cuando se 5ensayan estas bacterias. Por interés, estas bacterias muertas por calor se bañaron con 1 ppm a 3500 ppm de cloro, se incubaron durante 30 minutos, y después se probaron en las LFT. Solo cuando la muestra se baña con niveles de cloro por encima de 1000 ppm, para la formación de señales positivas. Como las bacterias muertas por calor experimentan varios tratamientos para perder su patogenicidad,pero retienen suestructura celular entera, la 10bacteria puede ser menos susceptible a la disgregación que una bacteria E. colinormal. Como resultado, se requiere una concentración de cloro más alta para romper por completo las células. Esto proporciona evidencia adicional de que incluso si las bacterias están metabólicamente muertas, los anticuerpos solo dejarán de detectarlas una vez se han disgregado por completo.15Movimiento de E. colia través de la LFTPara entender los patrones de crecimiento de E. coli, se inocularon varias placas Petri con de 101 a 107ufc de E. coli. Las placas con recuentos de E. colientre 107 a 105ufc mostraron 20“crecimiento en césped”. Cuando se produceeste patrón de crecimiento, no se pueden contar colonias individuales. Las colonias individuales solo se observaron en placas inoculadas con 104 a 100ufc.Estos patrones de crecimiento se usaron como una guía en estimar el número de E. coli25eluidas de las diferentes secciones de la LFT. Esto es importante especialmente cuando se obtiene crecimiento en césped y no se pueden contar colonias individuales.Como se corrieron 200 µl de una muestra de 108ufc/ml en la LFT, aproximadamente 107ufc estaban contenidos en esta muestra. Después de cultivar, todos los tampones de elución 30para cada sección de la LFT mostraron “crecimiento en césped”. Esto es similar al patrón de crecimiento observado en las placas Petri inoculadas con entre 107 a 105ufc. Por tanto, este resultado implica que entre 107 (el 100% de la muestra origina) a 105ufc (el 1% de la muestra original) se eluyó de cada sección de la LFT. Si se hubieran liberado menos de 105ufc de cualquiera de las secciones, se podrían haber observado colonias individuales. Este 35resultado implica que bien entre el 1% al 100% de todas las bacterias en la muestra entra en
62contacto con la mancha de prueba y experimenta detección, indicando que se produce atrapamiento extenso o escaso de E. colia lo largo de la longitud de la prueba. Para conseguir una mejor indicación de atrapamiento, se usó una muestra de 103ufc/ml, de modo que 102ufc de E. coliestaban contenidas en la muestra de 200 µl corrida en la LFT.5El tampón de elución de todas las secciones de esta LFT demostró crecimiento de colonias únicas. Los resultados se enumeran en la tabla 5, y se muestran gráficamente en la figura 6. El menor número de E. colise liberó de la sección de la LFT más alejada de la almohadilla de muestra (la mecha), mientras que la mayoría de las bacterias se liberaron de la almohadilla de muestra. Esto indica que la mayoría de E. coliqueda atrapada en las 10regiones inferiores de la LFT (almohadillasde muestra y conjugado), o porque la mayoría de las bacterias están unidas al sitio por el anticuerpo de la mancha de prueba.Usando espectrofotometría, se determinó que la muestra original contenía ±1200 unidades formadoras de colonias. Se liberaron un total de 168 ufc de la LFT entera, implicando que 15solo el 14% de las bacterias de la entrada están representadas. Las bacterias restantes probablemente no se eluyeron del papel. Si la elución dura (agitación con vórtex) no puede forzar a las bacterias fuera de la matriz del papel se puede estar produciendo atrapamientointenso. Esto podría estar reduciendo el movimiento de E. coliy por tanto previniendo que alcance la mancha de prueba. De las bacterias que se eluyeron, el 44,6% y el 32,1% se 20liberaron de la almohadilla de muestra y conjugado, respectivamente, las secciones de la LFT en contacto más íntimo a la muestra. Esto es de interés ya que implica que el 10,75% de las bacterias de entrada definitivamente no alcanzan la mancha de prueba. Sin embargo, ya que el material en las almohadillas de conjugado y muestra está diseñado para liberarel conjugado, podrían estar eluyendo más bacterias durante la elución. Así mientras los 25resultados indican que más bacterias están atrapadas en la almohadilla de la muestra y conjugado, puede ser solo que la membrana de nitrocelulosa atrapa la misma cantidad de bacteria, pero no las libera tan bien durante la elución. Además, la mancha de prueba misma podría tener E. coliunida, previniendo que eluyera y respondiendo de esta manera de algo de las bacterias no eluidas. La unión anticuerpo-antígeno parece losuficientemente fuerte 30para soportar el tipo de agitación usada para la elución. Cuando una LFT con una mancha de prueba visible se agitó con vórtex, la mancha de prueba permaneció visible después de la agitación, lo que implica que las bacterias marcadaspermanecieron unidas.También se realizaron estudios de tinción colorimétrica y fluorescente. La tinción 35colorimétrica demostró que E. coliciertamente se queda atrapada en las almohadillas de
63muestra y conjugado de la LFT. Esto se observa por la tinciónroja de estas secciones de la LFTcomparadas con el resto de la prueba. La almohadilla de muestra se sumerge directamente en la muestra y, por tanto, es la región donde probablemente se produce más atrapamiento. La tinción roja, como la observada en las almohadillas de muestra y conjugado, no era tan predominante en el resto de la prueba. Se observó una acumulación 5de color rojo en el principio de la membrana, indicando que alguna bacteria podría haber quedado atrapada aquí. El desarrollo de una señal de prueba, sin embargo, implica que E. colimarcada aún alcanza la mancha de prueba. Sin embargo, debido a las pérdidas aparentes al principio de la LFT, el número de E. colique alcanza la mancha de prueba es menor que el contenido en la muestra. La mecha también se cribó para tinción roja, y no se 10observó ninguna. Esto podría implicar que poca o nada de E. colialcanza esta sección de la LFT.Se usó una prueba de media tira para el estudio fluorescente. La parte inferior de la membrana de prueba se sumergió en la muestra misma (debido a la ausencia de una 15almohadilla de muestra). Se encontró que se producía atrapamiento insignificante en la membrana ya que la masa de la fluorescencia se observó solo en la línea de prueba y margen superior de la membrana, cerca de donde estaba colocada la mecha. La mecha misma no se analizó. Se observó algo de fluorescencia en el margen de la muestra de la membrana, pero era mínimo. Estos resultados indican que las almohadillas de muestra y 20conjugado producen el mayor atrapamiento, ya que tanto el análisis colorimétrico como fluorescente no demostrarontinciónen la región inferior de la membrana. Sin embargo, confirmar esto es difícil ya que, si las bacterias están atrapadas en la membrana, es más difícil visualizarlas debido ala estructura densa de la membrana. Viendocomo las señales visuales solo surgen de la superficie superior, las bacterias perdidas en la profundidad de la 25membrana pueden ser más difíciles de ver, ya que estas fibras están empaquetadas estrechamente.No obstante, el fin de este experimento era mostrar que a) se produce atrapamiento de bacterias, y b) el número de E. colidisponible para detección en la mancha de prueba es 30menor que el que entra en la almohadilla de muestra. Estos resultados indican exactamente esto. La pregunta todavía sin contestar es cuánto de una concentración menor alcanza la mancha de prueba, y si es lo suficientemente significativo para afectar el límite de detección del sensor.35
64El método de movimiento fluido en sustrato de papel esconocido. Se sabe que películas líquidas masivas se mueven a través de papel pasando a través de canales formados por fibras solapantes y por el relleno masivo de poros de papel. Mientras que E. colison móviles debido a la presencia de flagelos, es improbable que su movimiento a través del sensor de flujo lateral se produzca nadando. Se ha ilustrado que las bacterias se mueven a través de 5una serie de “carreras y caídas”. Sin embargo, cuando se mueven a través de estructuras porosas. el diámetro limitado de los poros algunas veces es menor que la longitud de sus “carreras”. Esto reduce su difusividad a través del medio. Cuando el tamaño del poro es menor de 10 µm, su movimiento hacia adelante se puede pararpor completo. Puesto que los tamaños de los porosdel papel usado en la LFT varíanentre 12 a 15 µm, es seguro 10concluir que E. colino puede nadar arriba de la LFT. También se ha mostrado que las bacterias prefieren moverse en enjambres en lugar de individualmente. Considerando toda la información anterior, se cree que las bacterias pasan a través de la LFT en enjambres, moviéndose a lo largo de la LFT con el líquido masa (tampón). Según se extiende el líquido a través del papel, las bacterias resuspendidas también lo hacen y logranalcanzar la 15mancha de prueba y experimentar detección. Una vez la muestra se agota o el papel no puede absorber más fluido (lo que ocurra primero), el movimiento del fluido de muestra para,asícomo las bacterias. Por tanto, las bacterias permanecerán donde estaban colocadas por último,que podría ser en cualquier lugar a lo largo de la longitud de la tira de prueba. Si este método de movimiento es cierto, entonces enjugar la prueba con tampón adicional podría 20ayudar a transferir las bacterias restantes a la mancha de prueba, permitiéndolas entrar en contacto con los anticuerpos y experimentar detección. Por tanto, bacterias que de otra manera se hubieran “perdido” pueden contribuir ahora a la señal de detección. Sin embargo, si están disponibles o no anticuerpos libres en la mancha de prueba para unirse y detectar incluso más bacterias, no se sabe. Solo si los anticuerpos pueden detectar más bacterias, 25ayudará el enjuague de la LFT a mejorar el límite de detección.Para determinar esto, se realizó una prueba de flujo continuo. En este formato de prueba, el volumen de los reactivos usados para probar en la LFT permanece constante, pero las regiones donde se produce atrapamiento, es decir, las almohadillas de muestra y conjugado30se eliminaron. Si la prueba de flujo continuo ofrece una mejora en el límite de detección, se puede confirmar el atrapamiento como influyente en el rendimiento de la prueba de flujo lateral.Tabla 5: Número de E. coliencontradas en diferentes secciones de la LFT durante los 35estudios de elución
65LocalizaciónNo. total de colonias en cada sección de la prueba (número total de colonias de las 6 placas)% colonias de muestra totalAlmohadilla de muestra756,25Almohadilla de conjugado544,5Línea de prueba262,17Línea control100,83Mecha30,25Total16814%Se mencionó anteriormente que el límite de detección de la LFT es 106ufc/ml cuando se usan 200 µl de suspensión de bacterias para ensayar. En 200 µl, hay aproximadamente 105ufc de E. coli.5La prueba de flujo continuo consiste en una membrana de prueba cargada con el reactivo de la mancha de prueba, que está apoyado por una almohadilla absorbente o mecha. Se carga 1 µl del anticuerpo de la mancha de prueba en la membrana y se seca en el sitio, como se hace en una LFT regular. La almohadilla absorbente soporta la membrana (desde atrás) y ayuda a arrastrar la muestra a través de la membrana. Se hacen muestras de E. colique 10varían en concentración de 108 a 100ufc/ml. Se mezclan 200 µl de cada muestra con 6 µl de conjugado, se dejan en contacto 7 minutos, y después se cargan en la membrana de prueba. En una LFT regular, se usan 6 µl de conjugado, y el tiempo durante el que la bacteria se pone en contacto con el conjugado antes de alcanzar la mancha de prueba, es aproximadamente 7 minutos. Esto asegura una comparación justa entre la LFT y la prueba 15de flujo continuo. El tiempo de contacto entre las bacterias y el conjugado en una LFT está controlado por la velocidad de absorción de la almohadilla absorbente. Esto puede ser diferente en la prueba de flujo continuo.Se encontró que las pruebas de flujo continuo ofrecen el mismo límite de detección que las 20LFT, es decir 106ufc/ml (105ufc). Esto indica que el número de E. colique realmente alcanzan la región de prueba de la LFT puede realmente ser el contenido en la muestra, y el atrapamiento que se produce no tiene influencia en el límite de detección de la LFT. Cuando se cargaron 104ufc en el dispositivo de flujo continuo, no se produjo señal de prueba. Esto implica que incluso si las pérdidas en laLFT (cuando se corre con 105ufc) son lo 25suficientemente grandes para disminuir el número de E. colique alcanza la mancha de prueba hasta 104ufc, no se observaría señal de prueba. Puesto que se forma una señal de
66prueba en la LFT cuando se colocan 105ufc en la LFT, se puede confirmar que 105ufc alcanzan la mancha de prueba. Esto indica que incluso aunque se produzca atrapamiento de bacterias lo hace a un nivel limitado.Este estudio se realizó en una prueba de flujo lateral fabricada usando papel estándar de 5industria. Cuando se usan sensores de papel mayores, o cambia el tipo de papel, el atrapamiento de bacterias/analito puede ser lo suficientemente significativo para influir negativamente en el límite de detección del sensor. Para esta prueba de flujo lateral, las pérdidas de bacterias habrían afectado solo el rendimiento de prueba si el límite de detección hubiera sido menor de 1000 ufc. Por ejemplo, si el límite de detección hubiera sido 10100 ufc y se hubieran cargado 100 ufc en la LFT, se podía no haber producido una señal de prueba positiva. Esto es porque el estudio de atrapamiento demostró que ±129 ufc quedaban atrapadas en las secciones inferiores de la LFT. Por tanto, se recomienda que los desarrolladores de sensores de papel realicen un análisis tal como este para asegurar que el rendimiento de la prueba no está limitado como resultado de las pérdidas de bacteria en 15el sensor mismo.Por tanto, se mostró que las matrices complejas de sustratos de papel pueden reducir la cantidad de analito que realmente experimenta detección, pero puede no reducir necesariamente el rendimiento de un sensor, dependiendo de su tamaño y límite de 20detección. Esto demuestra que los sensores de papel ofrecen buen potencial como sustratos sensores de bajo coste.Análisis pormicroscopía electrónica de barrido25La almohadilla de muestra, almohadilla de conjugado, mancha de prueba y mancha control de unaLFT corrida con E. coli0157:H7 muertas por calor se analizaron en este estudio. También se analizaron la mancha de prueba de una prueba de flujo lateral corrida con tampón y un trozode membrana de nitrocelulosa suministrada por el fabricante. La membrana del fabricante (usada en la región de prueba de la LFT) no se expuso a E. coli, 30reactivos de bloqueo o tampón y por tanto, se denomina la “membrana sin tratar” en esta discusión.Las diferencias estructurales entre los diferentes tipos de papel usados para fabricar la LFT son aparentes. Cada tipo de papel mostraba una estructura compleja que consistía en 35bastones fibrosos sólidos y poros huecos. Las almohadillas de conjugado y muestra
67mostraban una estructura más porosa, mientras que las fibras de membrana estaban empaquetadas más íntimamente. La membrana sin tratar demostró un residuo orgánico en su superficie, que presumiblemente resulta del proceso de fabricación. Tales membranas experimentan varios tratamientos durante la fabricación para asegurar funcionalidad óptima para aplicaciones especializadas, tal como diagnóstico médico. El residuo aparece como 5una combinación de estructuras esféricas y una malla fibrosa, delgada. En su superficie, estas estructuras esféricas tienen estructuras ovales incluso menores (±330 nm) sobre ellas. La presencia del residuo hace difícil visualizar organismos de E. coliindividuales. Sinembargo, el residuo es ligeramente mayor que un organismo de E. coli. Tienen un tamaño de aproximadamente 4 µm por 2 µm, comparado con una E. colique tiene 10aproximadamente 2 µm por 0,5 µm. El residuo también se diferencia de una estructura de E. colien que tiene una superficie muy irregular, áspera, de márgenes dentados, en contraste con la superficie más lisa, más regular de una E. coli. Basado en estas diferencias estructurales, usando MEB, se identificó E. colien las distintas secciones de la LFT.15No se identificó E. colien la mancha de prueba de la LFT corrida con solo tampón fosfato. Sin embargo, el residuo era aún prevalente. Esto indica que incluso enjuagando la prueba con tampón o dando vueltassuavemente la membrana en una solución de bloqueo,el residuo no se puede eliminar. Tampoco se observó E. colien la membrana sin tratar, pero el residuo era aún aparente.20Durante los estudios de tinción colorimétrica, se mostró que alguna E. coliquedaba atrapada en las almohadillas de muestra y conjugado de la LFT y, por tanto, no alcanzan la mancha de prueba. Durante los análisis porMEB, se identificaron E. colien estas regiones, más que en cualquier otra sección de la LFT. Esto podría ser debido al hecho de que las fibras en las 25almohadillas de muestra y conjugado están más dispersas y porosas, haciendo más fácil la visualización de los organismos individuales. También se encontraron bacterias atrapadas en otras regiones de la LFT, tal como mancha de prueba e incluso en la mancha control.Algunas delas E. coliobservadas en la mancha de prueba de la LFT (corrida con E. coli) 30parece haberse alojado en esta región al azar, mientras que muchas parecen estar unidas a los anticuerpos. Sin embargo, confirmar que la E. coliestá unida a anticuerpo es difícil debido a la presencia del residuo orgánico. Las bacterias que se observaron en la región de la mancha control de la LFT parecían haberse alojado allí aleatoriamente. La mayoría de las bacterias aleatoriamente localizadas están enmarañadas entre fibras de papel o solo están 35en la superficie del papel. Parecen haberse colocadoaquí cuando el fluido de muestra dejó
68de fluir. Esto confirma la teoría de que una vez el fluido deja de fluir, el movimiento de las bacterias se detiene también. Por tanto, puede ser posible que el enjuague adicional de la prueba (una vez que la muestra entera se ha absorbido) ayudará a transportar las bacterias dejadas detrás en las almohadillas de muestra y conjugado a la mancha de prueba. Sin embargo, esto puede no mejorar el límite de detección de la LFT desarrollada, pero puede 5hacerlo para sensores con límites de detección menores.Se observaron algunos agregados de E. colien las almohadillas de muestra y conjugado. Estos agregados se pueden haber formado en la muestra original, antes de cargarla en la LFT. A diferencia de los organismos individuales identificados anteriormente, estos 10agregados realmente aparecen enmarañados o entre las fibras de celulosa. Los agregados son de tamaño grande y por tanto con gran riesgo de enmarañarse antes de entrar en contacto con la mancha de prueba. Para reducir tal agregación, la muestra se puede sonicar durante un intervalo corto antes de correrla.15La sección transversal de la almohadilla del conjugado se examinó inclinando la pletina del microscopio. Esto se hizo para confirmar que las bacterias también fluyen a través de la sección transversal del, papel, y no solo a lo largo de la superficie. Mientras se inclina la pletina, se confirmó que las fibras de celulosa eran estructuras cilíndricas sólidas. Por tanto, no hay posibilidad de que E. colise pierda en la sección interna de las fibras.20Se observó E. colien la sección transversal del papel. Esto implica que algo de E. colino viaja a lo largo de la superficie del papel, y evita los anticuerpos. Es posible que algunos anticuerpos puedan penetrar en la sección transversal del papel. Sin embargo, incluso si estos anticuerpos se unen a las bacterias que fluyen a través de la sección transversal de la 25LFT, la señal se pierde ya que no se puede observar desde debajo de la superficie de la membrana. Por tanto, muchas bacterias quedan sin detectar. El gran número de E. colien la sección transversal de la membrana (comparado con su superficie) indica que las bacterias pueden preferir viajar dentro de la sección transversal del papel. Esto puede deberse a la estructura muy porosa de la sección transversal, que sirve como el camino de menor 30resistencia.Se analizó una imagen de los poros de la LFTcorrida con E. coli. Se observaron muchas estructuras con forma cilíndrica/bastones en estos poros, que implica que están la sección transversal del papel. Debido a que su superficie entera no se puede ver, es difícil confirmar 35si estas estructuras son E. coli. Se observaron estructuras similares en los poros de la
69membrana alrededor de la mancha control en la LFT corrida con E. coli. Por comparación, se analizó la mancha de prueba en la LFT corrida con tampón. No se observaron estructuras cilíndricas. Similarmente, no se encontraron ninguna de estas estructuras en la membrana sin tratar. Esto confirma que las estructuras en los poros son E. coli. Además, como E. coli, estas estructuras tienen una superficie lisa. Esto es evidencia adicional de cómo E. colise 5transfiere a través de la sección transversal de la LFT.La información anterior ayudará a los desarrolladores de sensores de papel rápidos a pensar en maneras de reducir la transferencia del analito a través de la sección transversal del sustrato de papel bien bloqueando partes de la sección transversal del papel, o 10simplemente reduciendo el espesor del papel usado. Esto asegurará que más analito está expuesto y disponible para detección en la superficie superior de la membrana, que es especialmente importante cuando se usan señales colorimétricas.Todos los resultados anteriores confirman que se pueden transferir bacterias E. colienteras 15a través de la LFT y lo hacen alcanzando las áreas de detección del sensor (las manchas de prueba y control). Mientras que alguna E. colise pierde en la sección transversal del papel, y queda “atascada” en las almohadillas de muestra y conjugado, esto no reduce significativamente el número de E. colique alcanza la mancha de prueba. Como resultado, no influye en el límite de detección del sensor desarrollado.20Detección de un organismo de E. coliEl preenriquecimiento o preconcentración de muestras de agua antes del análisis microbiológico es práctica común en la industria del agua. Esto es porque el recuento 25bacteriano en la mayoría de las fuentes de agua es demasiado bajo para que los sensores lo detecten directamente. Cuando se usan métodos de detección convencional, los periodos de enriquecimientorequeridos varían entre 18 a 24 horas para detectar un organismo. El fin de esta investigación era determinar si elpreenriquecimiento de la muestra permitiría que la LFT detectara una única E. coli, y si es así, determinar la duración del enriquecimiento 30requerido. La esperanza es que el tiempo de enriquecimiento estará muy por debajo del tiempo actual requerido de 18a 24 horas.Una única bacteria requiere entre 20 y 30 minutos de incubación para replicarse (Spelberg et al. 2008), es decir, el tiempo requerido para que una E. colise convierta en dos. 35Seleccionando un tiempo de replicación medio de 25 minutos, se creó una hoja de cálculo
70para aproximar el tiempo de incubación requerido para que cada solución caldo-bacteria que se ensaya alcance una concentración de solución 107ufc/ml. Se seleccionó una concentración de 107ufc/ml ya que desarrolla una señal positiva fuerte, no ambigua en la LFT. Los resultados computados indican que se podríannecesitar±7,5 horas de incubaciónpara detectar la muestra de 102ufc/ml, ±8,75 horas para detectar la muestra de 101ufc/ml, y 5aproximadamente 10,42 horas para detectar la muestra de 100ufc/ml. Usando estas aproximaciones, se realizó este estudio, en donde se agregó E. colien tampón fosfato y se incubó. Después de 7 horas de incubación, la muestra de 102ufc/ml produjo una señal de prueba positiva. Este resultado se corresponde fielmente a los cálculos computados. Después de 9 horas de incubación, la muestra de 101ufc/ml produjo una señal de prueba 10positiva y la muestra de 100ufc/ml hizo lo mismo a T=10 horas. Cada concentración se volvió a ensayar de una placa diferente unahora después de obtener las señales positivas. Esto se hizo para confirmar que las señales positivas eran de hecho, resultados de prueba verdaderos. La intensidad de las señales producidas por las muestras incubadas se comparó con la producida por una muestra de 107ufc/ml conocida.15Se encontraron las intensidades de señal comparables y por tanto confirma que las muestras incubadas producían señales de prueba positivas verdaderas. Se confirmó que las muestras usadas para este estudio contenían 102, 101y 100ufc/mlincubando 1 ml de cada muestra en agar durante la noche. Los resultados se enumeran en la tabla 6. Para reducir el 20tiempo de incubación más, se hizo un estudio en donde el volumen de caldo usado se redujo de 5 ml a 1 ml. Usando menos caldo, la concentración de bacterias inoculadas en el caldo se vuelve mayor, lo que implica que se puede requerir un periodo de incubación más corto para alcanzar 107ufc/ml.25Tabla 6: Recuentos reales de E. colideterminados de recuento de placaConcentración esperada basada en espectrofotometríaConcentración real obtenida270 cfu/ml232 cfu/ml27 cfu/ml19 cfu/ml2,7 (3) cfu/ml6 cfu/mlPor ejemplo, cuando se usa 1 ml de caldo con 1 ml de una muestra de 100ufc/ml, entonces la concentración inicial sería:C1V1= C2V230
71(3 x 100)(1) = C2(2)C2= 1,5 cfu/mlCuando se usan 5 ml de caldo, la concentración inicial de bacterias es 0,5 ufc/ml. La reducción esperada en el tiempo de incubación podría, sin embargo, estar contrarrestada 5por los efectos de crecimiento más lento debido a la disponibilidad de menos nutrientes por organismo. Sin embargo, como se esperaba, el tiempo de incubación se redujo de 10 horas para detectar una única E. coli, a 9 horas. Similarmente, se espera una hora de reducción en el tiempo de detección cuando se analizan las muestras de 101y 102ufc/ml.10Por tanto, las LFT tienen el potencial de aplicarse para análisis de agua potable y residual, ya que se puede detectar una única E. coli. Además, el tiempo requerido por las LTF para detectar una única E. colies menos de la mitad del tiempo requerido por los métodos de detección convencionales. Por tanto, este sistema ofrece mejor protección para los consumidores de agua ya que se les puede avisar de suministro de agua contaminada 15antes, reduciendo de esta manera el riesgo de contraer enfermedades de transmisión hídrica. Empleado el uso de un lector colorimétrico de bajo coste, el tiempo para la detección se puede reducir incluso más debido a la capacidad del lector de identificar la presencia de señales antes. Estas señales más tempranas pueden ser demasiado débiles para advertirlas a simple vista.20Análisis de muestras de agua medioambientalPara determinar si la LFT puede manejar muestras medioambientales crudas, sin procesar, se probaron muestrasde efluente con cantidades variables de E. coli0157:H7 agregadas en 25la LFT. Se añadió tampón fosfato en polvo a estas muestras. Las muestras se absorbieron en la longitud entera de la prueba sin evidencia de obstrucción. La concentración mínima de E. coliagregada que produjo una señal de prueba era 106ufc/ml, igual que la obtenida cuando se agrega E. colia agua desionizada. Esto implica que la LFT se puede usar para ensayar muestras de efluente directamente, sin la necesidad de pretratar la muestra. 30Además, no se encontró cualquier sustancia química que pueda estar contenida en la muestra interfiriera con la carrera de la prueba. Si en algunas ocasiones se encuentra que el efluente contiene piezas grandes de suciedad y restos, se puede requerir prefiltración.También se analizó una muestra de entrada de agua de Tshwane. La muestra estaba 35principalmente libre de grandes trozos de restos ya que se recogió de un punto en la línea de entrada después de la filtración en malla. Puesto que no había experimentado
72tratamiento, esta muestra contiene grandes cantidades de bacterias. La muestra se ensayó antes y despuésde una dilución en serie de 1 a 10 veces. La muestra se diluyó en caso de que el nivel de E. colifuera tan alto que la unión competitiva en la mancha de prueba puede producir resultados falsos negativos en la LFT. Sin embargo, ninguna de las muestras, incluso antes de la dilución, produjo resultados de prueba positivos. Esto implica que los 5niveles de E. colien la muestra pueden de hecho ser menoresque el límite de detección de la prueba. Este es un descubrimiento inesperado, ya que se pensaba que la entrada contenía niveles muy altos de bacterias.Para verificar esto, se filtraron diez volúmenes de 100 ml de la muestra de entrada, después 10de lo cual cada filtro se colocó en medio nutritivo y se incubó durante varias horas. Se ensayó una muestra cada hora, y después de tres horas, una señal de prueba positiva se desarrolló en la LFT. Esto indica que el recuento de E. colien la entrada estaba ligeramente por debajo de 106ufc/ml. Para determinar la concentración de la entrada, y por tanto determinar exactamente por qué se necesitan 3 horas de incubación para detectarla, la 15muestra de entrada se ensayó usando Colilert. Se diluyó y después se ensayó, puesto que Colilert solo puede detectar ≥2400 ufc por 100 ml. Se encontró que la entrada contenía 107ufc/100 ml, que equivale a 105ufc/ml. Esto está ligeramente por debajo del límite de detección de la LFT, y explica la necesidad para la incubación de 3 horas. Esta concentración de la entrada se confirmó por ensayo independiente en agua de Tshwane.20Como la muestra de la entrada se colocó en caldo selectivo para E. coliy coliformes, solo estas bacterias se podrían haber cultivado a niveles detectables en la LFT. Para asegurar que la señal de prueba positiva surgió de la detección de E. coliy no debido a que los anticuerpos dieran reacción cruzada con otras coliformes, se hizo lo siguiente. La muestra 25de la entrada se cultivó en un agar específico de E. coli, después de lo cual las colonias de E. colise aislaron y usaron en un ELISA con los anticuerpos de la LFT. Los anticuerpos tanto del conjugado como de la mancha de prueba se unieron a las cepas medioambientales de E. coli, con un límite de detección de106ufc/ml. Esto confirma que la señal producida en la LFT tras incubar la muestra de entrada durante 3 horas era un resultado de la unión de E. 30coli. Esto demuestra la capacidad de la LFT para detectar cepas medioambientales y serotipos de E. coli, diferentes de K12 y 0157:H7. Esto indica la aplicabilidad de las pruebas para análisis de agua medioambiental.También se analizó una muestra de efluente. Después de 24 horas de incubación, no se 35obtuvieron señales de prueba positivas cuando se usó caldo nutriente general. Mientras que
73el crecimiento era aparente (el caldo se volvió turbio), no se formaron señales de prueba positivas en la LFT. Sin embargo, cuando se usa caldo selectivo, se observó una señal de prueba positiva después de 18 horas de incubación.Según Tshwane Water, la muestra de efluente contenía ±20 ufc/100 ml ese día particular. Basado en resultados anteriores, 20 ufc deberían haberse detectado en ±9 horas cuando se usa medio no selectivo. La razón por la 5que E. colise detecta en el caldo selectivo y no en el caldo no selectivo puede ser un resultado de crecimiento competitivo. El caldo no competitivo habría fomentado el crecimiento de todas las bacterias en la muestra, incluyendo todas las bacterias no E. coli. Como resultado, estas bacteriasno E. colihabrían superado a E. colipara nutrientes, previniendo que se multiplicara a niveles detectables en la LFT. El efecto de hacinamiento 10puede haber reducido su nivel de crecimientoadicional. Como resultado, se puede requerir siempre caldo selectivo cuando se analizan muestras de efluente, solo para asegurar que E. colise cultiva, y puede por tanto ser detectada.El largo tiempo de detección requerido por el caldo selectivo, sin embargo, plantea una 15desventaja significativa. El largo periodo deenriquecimiento puede ser debido al hecho de que tal medio contiene aditivos que suprimen el crecimiento de algunas bacterias no diana. Estos supresores podrían estar reduciendo la velocidad de replicación de las bacterias diana.20Considerando lo anterior, se necesita ensayar la capacidad de varios medios selectivos para fomentar la replicación más rápida. De esta manera, el tiempo de enriquecimiento para detectar una única bacteria puede reducir optimistamente al obtenido cuando se analizan muestras de laboratorio. Alternativamente, se puede usar separación inmunomagnética para extraer solo E. colide una muestra de efluente. La E. coliextraída se puede enriquecer 25después en caldo nutriente no selectivo ya que no estarán presentes bacterias no E. coli. Elmedio no selectivo ayudará a reducir el tiempo total de enriquecimiento requerido para la detección. Este método está actualmente en investigación. En conclusión, la LFT tiene gran potencial para uso en la industria de seguimiento de agua. La LFT es fácilde usar e interpretar, de bajo coste, y puede detectar las cepas comunes de E. colique existen en 30muestras medioambientales.Comparación con pruebas comercialmente disponiblesSe evaluó el rendimiento deColilert, Microsnap y de pruebas de flujo lateral Cell Biolab para 35E. coli0157:H7. Para determinar el límite de detección de estas pruebas, se prepararon
74suspensiones de E. coli0157:H7 que variaban de 108a 100 ufc/ml. Las muestras se prepararon según las instrucciones del suministrador y se ensayaron. Se encontró que el límite de detección de las LFT comerciales era el mismo que el de la LFT desarrollada, es decir, 106ufc/ml. Esto implica que la LFT desarrollada rinde igual de bien que una prueba de flujo lateral comercialmente disponible (y por tanto optimizada) para E. coli0157:H7. Los 5anticuerpos usados en la LFT comercial solo se dirigen a la cepa de E. coli, 0157:H7, mientras que los anticuerpos de la LFT desarrollada se dirige a un grupo mucho más amplio, es decir, todos los serotipos O y K. Deforma interesante, el anticuerpo más amplio alcanza el mismo límite de detección que el más específico. Cuando se prueba con E. coliK12, la LFT desarrollada aún ofrece un límite de detección de 106ufc/ml, aunque hubo una 10reducción en la intensidad de las señales de prueba. Como resultado, la posibilidad de que el anticuerpo más amplio tenga una mayor afinidad por la cepa común 0157:H7 se puede descartar. Para asegurar que el límite de detección de 106ufc/ml en la LFT desarrollada se mantiene cierto paratodas las cepas de E. coli, se debe ensayar una lista más exhaustiva de cepas. No obstante, el resultado anterior es una buena indicación del rendimiento de la 15LFT de esta invención. Incorporando un paso de preenriquecimiento, tanto la LFT comercial como la desarrollada pueden detectar una única bacteria de E. coli. La LFT de Cell Biolab puede detectar 1 E. colien 18 a 24 horas. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, la LFT desarrollada podría detectar potencialmente una E. colien menos de 15,sin embargo, se requieretrabajo adicional con muestras de agua realesantes de que 20esto se pueda confirmar. La LFT comercial no se puede aplicar para análisis de agua debido a su incapacidad para detectar múltiples cepas de E. coli, y de hehco, actualmente se comercializa solo para análisis de alimentos.También se realizaron otros dos estudios en las pruebas de flujo lateral de Cell Biolab. Se 25hizo un análisis de especificidad y también se investigó la capacidad de las pruebas para detectar bacterias muertas. Para el análisis de especificidad, se usaron los diferentes tipos de bacterias enumerados en el ejemplo 1. No se observó reactividad cruzada en las LFT comerciales, incluyendo E. coliK12. Se encontró que las LFT desarrolladas mostraban reactividad cruzada con Salmonella enteritidisyPseudomonas aueruginosa. Por tanto, la 30prueba de Cell Biolab demuestra ser más específica que la LFT desarrollada y esto se puede atribuir a la mayor especificidad del anticuerpo usado en estas pruebas. Este anticuerpo se dirige solo a una única cepa de E. coli, comparada con las múltiples cepas y serotipos a que se dirige el anticuerpo de la LFT desarrollada. Podría haber bacterias con las que la prueba de Cell Biolab dierareacción cruzada, pero esto solo se puede determinar 35ensayando con más tipos de bacterias.
75También se probaron las LFT comerciales usando suspensiones de E. colique se habían matado por calor y cloro. Se usó lejía doméstica para obtener las bacterias muertas por cloro. En la industria del agua, las bacterias muertas deben pasar inadvertidas ya que solo las bacterias vivas plantean una amenaza para los consumidores de agua. Las tiras de 5pruebas comerciales produjeron señales de prueba positivas cuando se probaron con las muestras de E. colimuertas. Por tanto, estas pruebas no pueden distinguir bacterias muertas de vivas, similar a la LFT desarrollada. Esto se debe principalmente al hecho de que cuando se convierten en metabólicamente muertas, las bacterias pueden permanecer todavía intactas o grandes fragmentos de la membrana con sus antígenos de superficie son 10todavía accesibles para que el anticuerpo se una. Sin embargo, ambas tiras de prueba pueden superar este problema mediante el uso del paso de preenriquecimiento.También se analizó el rendimiento del sistema Colilert. Para ensayo de especificidad, se prepararon suspensiones de Pseudomonas aueruginosa ySalmonella enteritidis. También 15se prepararon suspensiones de Enterobacter cloacaey E. coli0157:H7 y sirvieron como controles positivos. La formación de pocillos amarillos en la bandeja Colilert después de 18 horas de incubación indica la presencia de coliformes en la muestra. Para indicar la presencia de E. colien la muestra, estos pocillos fluorescen cuando se exponen a luz UV.20Como se esperaba las muestras de Enterobacter cloacaey E. coliprodujeron pocillos amarillos en la bandeja de Colilert. Cuando se exponen a luz UV, los pocillos en la prueba de E. colifluorescieron, confirmando la presencia de E. coli. La prueba usando suspensiones deSalmonella enteritidisno produjo pocillos coloreados o fluorescentes, como se esperaba. La prueba con Pseudomonas aueruginosa produjo resultados falsos positivos, 25aunque a un nivel limitado en donde solo dos pocillos se volvieron amarillos. Pseudomonas aueruginosa no es ni parte de la especie de E. colini del género coliforme/enterobacterias y por tanto debe pasar inadvertida en la prueba Colilert. Los pocillos en las pruebas de Pseudomonas aueruginosa no fluorescieron, confirmando el resultado como una prueba positiva falsa para la presencia de coliformes. El resultado falso indica la posibilidad que 30Pseudomonas aueruginosa pueda contener/secretar la enzima responsable para producir el color amarillo, B-galactosidasa. La prueba de flujo lateral desarrollada también mostró reactividad cruzada con Pseudomonas aueruginosa.Sin embargo, puesto que la prueba de flujo lateral no se basa en reacciones enzimáticas, la B-galactosidasa no puede ser responsable de la interacción no específica. Tras investigación adicional, se encontró que 35ciertas cepas y serotipos de Pseudomonas aueruginosa poseen la enzima B-galactosidasa
76(Kong et al. 2005; Marne C et al. 1988; Rohlfing 1968). Esto explica la reactividad cruzada observada en la prueba Colilert. También se descubrió que Pseudomonas aueruginosa comparte antígenos de superficie comunes con ciertas cepas de E. coli(King et al., 2008), que podría servir como una explicación para la reactividad cruzada observada en la prueba de flujo lateral. Viendo como Colilert, un método considerado un nuevo estándar para la 5detección de E. colino está libre de reactividad cruzada, el problema de las interacciones no específicas en la LFT puede no ser perjudicial para el éxito de la prueba, si se produce a un nivel limitado. Un estudiode Luyt et al (2012) indica que la especificidad de Colilert es el 92,8%, sin embargo, Colilert solo puede detectar el 56,4% de todas las cepas de E. coli. Como mencionan Guo et al (2005), los antígenos O que son dianas y se usan para la 10detección por la LFT existen en la mayoría, si no en todos los tipos de E. coli. Esto implica que la LFT desarrollada tiene un gran potencial para detectar más del 56,4% de todas las E. coliencontradas en el medio ambiente. Además, si se produce reactividad cruzada con otras bacterias patógenas o relacionadas con las aguas residuales en la LFT, la intención de la prueba, identificar fuente de agua inseguras, aún se mantiene cierta.15El sistema Colilert puede detectar tan poco como 1 ufc en una muestra de 100 ml de agua, pero requiere un periodo de preenriquecimiento prolongado de 18 horas para lograr esto. Este bajo límite de detección hace el sistema Colilert adecuado para ensayo de agua, sin embargo, su largo tiempo de detección no es ideal.20La LFT de la presente invención ha demostrado su potencial para detectar 1 ufc en 9 horas, y puesto que la mayoría de las cepas medioambientales de E. coliposeen el antígeno O (Guo et al. 2005), la LFT debe detectar potencialmente más del 60% de todas las E. coli. El paso de preenriquecimiento de 9 horas también permite que la LFT distinga bacterias 25muertas de vivas.Por último, se analizó el sistema de detección de E. coliMicrosnap. El sistema Microsnap es bastante nuevo, y no se ha encontrado información respecto a su implementación en plantas de tratamiento de agua o autoridades de ensayo de agua medioambiental. El sistema de 30detección de coliformes y E. coliMicroSnap está principalmente diseñado para dar una evaluación rápida y semicuantitativa de E. coliy coliformes en muestras de alimentos (Meighan et al., 2014). Por tanto, mientras que el sistema se puede aplicar para ensayo de agua, se requiere validación adicional con muestras de agua medioambiental. Hasta ahora, solo se han realizado estudios de validación usando agua embotellada con adición (Meighan 35et al., 2014). El producto también se vende como un sistema para la cuantificación y
77detección de niveles de bajos a medios tanto de E. colicomo coliformes. Esto implica que durante estallidos bacterianos medioambientales (cuando se producen recuentos bacterianos altos), este sistema puede no ser adecuado para servir como un sistema de aviso temprano. El sistema de LFT desarrollado es adecuado para tales casos, proporcionando resultados en 15 minutos o en menos de 3 horas. El método de Microsnap 5de usar enzimas para detectar las especies bacterianas diana, e incluso más, correlacionar la cantidad de enzima con la cantidad de bacterias presentes, todavía es un campo en desarrollo. Se necesita validación adicional del sistema antes que se pueda implementar para ensayo de agua globalmente. Este sistema Microsnap detecta E. colibasado en la actividad entre la enzima B-glucoronidasa (encontrada en E. coli) y un sustrato 10bioluminógeno. El producto de la reacción se lee usando un luminómetro que correlaciona las unidades relativas de luz de la muestra con el número de unidades formadoras de coloniasque contiene. El sistema se analizó para su límite de detección, especificidad (usando las bacterias enumeradas en el ejemplo 1) y su capacidad de diferenciar entre bacterias muertas y vivas. Para el último estudio, una suspensión de E. colise mató 15poniéndola en contacto con cloro. Los resultados se muestran en la tabla 7.Tabla 7: Resultados de la prueba MicrosnapMuestraE. colien la muestra(ufc)Descritas(ufc)E. coliK12 100<10E. coliK12102<100E. coliK12103<5000E. coliK12muertas por cloro104<100Tampón fosfato0<50Salmonella enteritidis 103<100Pseudomonas aeruginosa 1030Enterobacter cloacae 103<20Los resultados indican que Microsnap muestra reactividad cruzada ligera con bacterias no E. 20coli. Salmonella contiene la enzima diana B-glucuronidasa (Tryland et al., 1997), que explica el resultado no específico. La reactividad cruzada con Enterobacter cloacae se produce a un menor grado, con solo el 1% de las bacterias en la muestra original descritas que son E. coli. Pseudomonas aeruginosa nomuestra reactividad cruzada. Se describió que la muestra de E. colimuerta por cloro contenía <100 ufc. La muestra original realmente contenía el 25doble de esta cantidad. Esto podría implicar que estaban presentes bacterias vivas en la
78muestra ensayada, sin embargo, cuando se cultivaron en agar, no crecieron bacterias confirmando que todas las bacterias estaban muertas.Se describió que la muestra de control negativo (tampón) contenía <50 ufc de E. coli. Esto se produjo en cada una de las ocasiones separadas que el sistema se probó. Se evaluó el 5tampón para contaminación por cultivo y se confirmó libre de E. coli. Es posible que los soportes de filtro usados para el estudio se puedan haber contaminado cuando se filtraron muestras ricas en E. colia través de ellos. Sin embargo, esto es improbable ya que se enjuagan y lavan con etanol cada vez antes del uso. Además, si este fuera el caso, es improbable que se produjera cada vez que se realiza esta prueba, que en este caso, era en 10días diferentes. Cuando se ensayó con 100, 102y 103ufc, el sistema Microsnap lo describió como tal. Por tanto, Microsnap parece capaz de detectar menos de 10 ufc en una muestra en 6-8 horas. Además, su capacidad de detectar solo E. coli(especificidad) y su capacidad para distinguir bacterias muertas de vivas requiere análisis adicional. Además, los resultados falsos positivos obtenidos con tampón indican que se requieren más análisis y verificación 15de este sistema para determinar completamente su fiabilidad e idoneidad para análisis de agua.Tabla 8: Resumen de la comparación de sistemasMicrosnapLFTCell BiolabsColilertParámetroConenriquecimientoDistingue bacterias muertas de vivas SíSíSíSíCapacidad para detectar 1 ufc en 100 mlSíSíSíSíLímite de detección (ufc)1111Tiempo de incubación requerido (horas)6-89 (potencialmente)18-2418-24Sin incubación Límite de detecciónN/A106ufc/ml106ufc/mlN/AAplicabilidad global a ensayo de aguaSí, si la validación con muestras medioambientales demuestra éxitoSí, si la validación con muestras medioambientales demuestra éxitoNoSí
79ConclusiónSe ha desarrollado una prueba de flujo lateral para E. coli. La LFT epitomiza muchas de las características deseadas en un sistema de detección de E. colimoderno para seguimiento 5de seguridad de agua. Es de bajo coste, sencillo de operar, y los resultados los pueden interpretar trabajadores de campo semicualificados. Esto los autoriza a tomar decisiones respecto a la seguridad de las fuentes de agua, la eficacia de los procesos de tratamiento, y sirve como un método de ensayo rápido en casos de estallidos bacterianos cuando los niveles de E. colise vuelven muy altos.10La prueba tiene un límite de detección de 106ufc/ml, pero cuando se combina con un paso de enriquecimiento, puede detectar un único organismo. La prueba tiene el potencial para detectar una única E. colien menos de la mitad del tiempo requerido por métodos convencionales. Las diferencias en el tiempo de enriquecimiento requerido para la detección 15de diferentes concentraciones de la bacteria pueden servir potencialmente como un método de cuantificar los resultados de la prueba. Además, el enriquecimiento también ayuda a asegurar que las LFT solo detectan bacterias vivas, un requisito importante en la industria del agua.20Mientras que existen LFT para E. colienteras, muchas de ellas solo detectan una cepa específica de la bacteria, tal como la prueba Singlepath de Merck para E. coli0157:H7. Como resultado, no se pueden aplicar al análisis de agua.Ejemplo 325Desarrollo de un sensor basado en papel para la detección de E. coli en fuentes de agua: de flujo lateral a microfluídicosbasados en papelPrincipio de trabajo30La figura 7 muestra una imagen deldispositivo microfluídico basado en papel desarrollado. Una muestra acuosa rica en E. colientra en el dispositivo en la entrada de muestra. Esta entrada se hizo ligeramente más ancha que el resto del dispositivo, para acomodar y facilitar mezclar el tampón en polvo en la mezcla de agua. El tampón ayuda a prevenir la producción35de resultados de prueba falsos positivos. Cuando la muestra entra en el dispositivo, su
80velocidad de flujo se reduce (debido al área mayor de la cámara de mezclado) para permitir tiempo suficiente para que el tampón en polvo se disuelva en la mezcla. Después de mezclar,barreras de cera hidrofóbica guían la muestra hacia las zonas de detección, que consisten en los reactivos del conjugado, mancha de prueba y mancha control. La E. colien la muestra primero interacciona con el conjugado y se marca por anticuerposanti-E. colide 5conejo etiquetados con oro. La E. colimarcada fluye hacia laregión de estrechamiento del dispositivo, que sirve para dirigir todo el fluido de muestra sobre las regiones de mancha de prueba y control. Por tanto, esta región que se estrecha asegura que poco a nada de complejo oro-Ac-E. colievita la mancha de prueba y control del dispositivo. De esta manera, no se pierden bacterias marcadas con oro (que contribuyen a la intensidad de color de la 10señal). La mancha de prueba contiene anticuerpos anti-E. colide conejo y la mancha control contiene anticuerpos anti-conejo de cabra. Los complejos E. coli-oro-Ac y oro-Ac son forzados luego en la región de mancha de prueba y control del dispositivo, donde se unen en el sitio. Como resultado de la formación del sándwich Ac-E. coli-Ac en la mancha de prueba, se produce una señal de color rojo. Los restantes anticuerpos del conjugado son 15capturados después en la mancha control, formando una segunda señal de color rojo. Puesto que la muestra se absorbe continuamente a través del dispositivo, incluso después de formarse las señales en la mancha de prueba y control, sirve como un mecanismo de lavado que elimina cualquier conjugado libre que está aleatoriamente en la prueba, especialmente en las manchas de prueba y control. Esto permite la visualización más fácil 20de las señales de prueba. Por tanto, la presencia de una mancha de prueba y control indica unresultado de prueba positivo para E. coli.Materiales25Todos los dispositivos se diseñaron usando un programa de dibujo asistido por ordenador, Design CAD 3D MAX 21. Para imprimir los diseños en papel, se usó una impresora de cera sólida Xerox Color-Qube 8870. Esta impresora operacalentandocartuchos de cera sólida basados en resina (estos sustituyen a los cartuchos de tinta encontrados en impresoras de mesa estándar) hasta que se funden y después deposita las gotitas de cera fundida en la 30superficie de papel. Una vez que la cera entra en contacto con el papel, se enfría rápidamente, previniendo cualquier difusión adicional de la cera en el papel. Los diseños se imprimieron en hojasde 20 cm x 20 cm de papel de cromatografía Whatman (No. 1). Se seleccionó papel de cromatografía ya que está fácilmente disponible, es relativamente económico y se puede fabricar reproduciblemente.35
81Para crear los canales de flujo en papel, el dispositivoimpreso se coloca en una fuente de calor (sea un horno o una placa calefactora) para permitir que la cera se funda y penetre en la sección transversal del papel. Se usó un horno Ecotherm (Modelo22, Labotec) y una placa calefactoraStableTemp, DLM 51806-15, (Cole Parmer). Una vez fundida, el dispositivo se deja enfriar durante <10 s, y está entonces listo para usar. Los reactivos 5sensores usados para la detección de E. coliincluyeron los siguientes. Se usó un anticuerpo anti-E. colipoliclonal de conejo (Thermo Fisher Scientific, EEUU) en el conjugado y se usó un anticuerpo anti-E. colipoliclonal de conejo (ABD Serotec, RU) en la mancha de prueba. Ambos de estos anticuerpos detectan todos los antígenos “O” y “K” de la bacteria E. coli. Se usaron anticuerpos anti-conejo de cabra (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc) en la 10mancha control. Se compró solución de nanopartículas de oro, con un tamaño de partícula de 40 nm y una densidad óptica (DO) de uno de Diagnostic Consulting Network (California, EEUU). Este oro se usó para marcar los anticuerpos del conjugado. Para más detalles sobre la preparación del conjugado se hace referencia al ejemplo 1. Se compró tampón fosfato en polvo de Sigma Aldrich. Se compró una solución de bloqueo de Invitrogen, y se 15usa para bloquear el papel para prevenir la unión no específica.Las cepas ATCC de E. coli0157:H7 fueron amablemente suministradas por Natural Resources and Environment Unit (CSIR,Sudáfrica). las bacterias se cultivaron usando agar nutriente y caldo nutriente, ambos de los cuales se compraron de Oxoid. Para determinar la 20concentración de bacterias de las muestras se usaron los estándares de McFarland, junto con espectrofotometría UV/VIS (Perkin Elmer). Se usó dilución en serie para preparar muestras de diferentes recuentos bacterianos para ensayos.Métodos25Determinación de la anchura de línea impresa óptimaSe imprimieron líneas de diferente anchura de diseño (la anchura introducida en Design CAD), que variaba de 30 µm a 100 µm y después se fundieron en una placa calefactora a la 30misma temperatura y durante el mismo periodo de tiempo. Se examinó la imagen formada en el reverso o lado inferior de la superficie impresa (llamada la superficie fundida). La anchura de línea óptima es la que forma la imagen más oscura y nítida en la superficie fundida. Esto indica que la cera de la superficie impresa ha penetrado con éxito a través de la profundidad del papel. Para analizar más la penetración de la cera, se hizo un análisis de 35la sección transversal del papel. La anchura de línea menor que produjo penetración vertical
82completa de la cera a través de la sección transversal del papel se consideró la anchura de línea óptima.Comparación de la eficacia de fusión entre un horno y una placa calefactora5Se fundieron líneas impresas usando tanto un horno como una placa calefactora a temperaturas que variaban de 50ºC a 250ºC, en aumentos de 50ºC. Las imágenes formadas en la superficie fundida a cada temperatura se compararon para cada uno de los dos procesos de fusión. Se seleccionó la fuente de calor óptima como la que forma la imagen más oscura en la superficie fundida a cada temperatura investigada.10Determinación de la temperatura de fusión óptimaSe fundieron líneas de diferente anchura a temperaturas que variaban de 50ºC a 250ºC, en aumentos de 50ºC. Aunque la anchura de línea óptima ya se identificó, usar una gama de 15anchuras de línea ayuda a entender mejor la influencia de la temperatura en la formación de barreras. Se seleccionó la temperatura de fusión óptima después de analizar la oscuridad de la imagen formada en la superficie fundida para cada una de las temperaturasinvestigadas.Determinación del tiempo de fusión óptimo20Se fundieron líneas impresas de anchura variable a la misma temperatura durante diferentes intervalos de tiempo que variaban de 1 minuto a 7 minutos. Se seleccionó el periodode tiempo de fusión óptimo probando la imagen formada en la superficie fundida para cada periodo de tiempo de fusión investigado.25Determinar la eficacia de barrerasSe imprimieron cuadradosde 5 mm por 5 mm con diferentes anchuras de línea que variaban desde 50 µm a 1000 µm. Cada cuadrado se fundió después a 200ºC durante 1 minuto en 30una placa calefactora para formar barreras hidrofóbicas en la sección transversal del papel. Se pipetearon 10 µl de colorante alimentario diluido en las cámaras del cuadrado impreso y se siguió cualquier fuga durante 10 minutos.Desarrollo de un dispositivo microfluídico basado en papel preliminar (PBM)35
83Se fabricó un dispositivo microfluídicobasado en papel preliminar basado en los resultados de los estudios de optimización descritos anteriormente. El dispositivo desarrollado no mostró signos de fuga de fluido a través de las barreras hidrofóbicas, y contuvo el fluido durante más de 30 minutos. Esto indica la formación de barreras hidrofóbicas funcionales y canales hidrofílicos funcionales. Los anticuerpos usados para desarrollar la prueba de flujo 5lateral (descritos en el ejemplo 1) se añadieron después al dispositivo basado en papel como sigue.La zona del conjugado del dispositivo se bloqueó primero usando un bloqueador de membrana comercial. El exceso de bloqueador se secó con golpecitos con una toalla, y 10después se secó durante 1 hora a 37ºC. Se añadió después el conjugado y se secó en elsitio durante 30 minutos a 37ºC. A continuación, se cargaron 1 µl de los anticuerpos de señal de prueba y control en sus respectivas regiones de detección y se secaron durante 30 minutos a 37ºC. Después de ello, se bloquearon y secaron durante 1 hora a 37ºC. Todas las concentraciones de anticuerpos se mantuvieron constantesrespecto a las usadas en la 15prueba de flujo lateral. Antes de usar, se añadió tampón fosfato en polvo al dispositivo, que después se emparedó entre dos trozos de adhesivo plástico. El límite de detección del dispositivo PBM se determinó probándolo con varias concentraciones de E. coli0157:H7.Resultados y Discusión20Desarrollo de un dispositivo microfluídico basado en papel para detección de E. colien aguaUsando una anchura de líneaóptima (500 µm), un tiempo de fusión óptimo de 1 min y una temperatura de fusión óptima de 200ºC, se fabricó un dispositivo PBM. Esto se demuestra 25en la figura 7.Se desarrolló una escala de calibración basada en las intensidades de señal obtenidas cuando se prueban varias concentraciones de bacterias. Esta escala de color se imprimió en el dispositivo mismo, para demostrar lo simple que los resultados colorimétricos se pueden 30lograr.Se probaron dispositivos PBM con suspensiones de E. colique variaban de 108 a105ufc/ml.Se obtuvieron señales de prueba positivas de 108 ufc/mla106ufc/ml.Se usó tampón fosfato como control negativo, y no se observó señal de prueba. Estos resultados son similares a 35los obtenidos en la prueba de flujo lateral, donde se observó un límite de detección de 106
84ufc/ml.Esto indica que el dispositivo PBM no reduce la funcionalidad o rendimiento del mecanismo sensor optimizado en modo alguno. Sin embargo, las intensidades de las señales de prueba positivasproducidas en el dispositivo PBM son más débiles que las obtenidas en la prueba de flujo lateral. Para determinar si esto se debe al cambio del tipo de papel, se hizo una prueba de flujo lateral usando papel de cromatografía como membrana 5de prueba. Cuando se probó con contracciones variables de E. coli, todavía se obtuvieron señales de prueba débiles. Tras examen cercano, se determinó que cuando las manchas de prueba y control se aplican a papel de cromatografía, se absorben en el papel más rápidamente y por tanto se difunden a un nivel mayor de lo que se produce cuando se usan membranas de nitrocelulosa regulares. Como resultado, las manchas de prueba y control 10aparecen de mayor tamaño, lo que implica que hay una concentración de anticuerpo disminuida por mm2de papel comparado con cuando se usa nitrocelulosa. Esto podría ser por lo que se observan manchas de prueba más débiles en papel de cromatografía. Para reducir este efecto, las barreras hidrofóbicas en la región de la mancha de prueba se pueden colocar más próximas para reducir el área disponible en el que los reactivos pueden 15difundir. Esto podría aumentar la concentración de anticuerpo por mm2de área de papel, y mejorar la intensidad de las señales.La liberación del conjugado del papel de cromatografía también era mala. Una cantidad significativa del conjugado no se liberó por completo, implicando que no contribuyó a la 20formación de señal. Esto podría ser otra razón para la intensidad de la señal de prueba debilitada. El material de la almohadilla de conjugado usado enlas LFT está hecho de fibra de vidrio y se desarrolló específicamente para liberar conjugado en pruebas de flujo lateral. De hecho, las fibras de vidrio tienen un factor de liberación de más del 90%. Se desarrolló cromatografía para realizar separaciones cromatográficas, y por tanto en lugar de liberar 25conjugado intentar disminuir su movimiento hacia arriba de la prueba. Aumentar el nivel de bloqueo puede ayudar a mejorar la liberación del conjugado, sin embargo, esto requiere investigación adicional.Conclusión30Se desarrolló un dispositivo microfluídico basado en papel para la detección de E. colien fuentes de agua. Debido a la naturaleza inherente del papel usado para crear este dispositivo, la intensidad de las señales de prueba obtenidas era más débil que la observada en las pruebas de flujo lateral. No obstante, el dispositivo PBM ofrecía el mismo límite de 35detección que la prueba de flujo lateral, es decir, 106ufc/ml.
85Los estudios de fabricación demostraron que la anchura de línea original es el parámetro de fabricación más importante en crear barreras de cera eficaces. Se seleccionó una anchura de línea óptima de 500 µm, sin embargo, cualquier anchura de línea por encima de 300 µm demostró ser capaz de formar barreras de cera impermeables. El efecto de la temperatura 5en la eficacia de fusión solo se observó para líneas más estrechas de 300 µm, pero se cree que la temperatura también influye en líneas más anchas. Se seleccionó una temperatura de fusión óptima de 200ºC, ya que dio la mejor penetración de cera para líneas estrechas. Sin embargo, si se usan líneas más anchas de 300 µm, se puede usar una temperatura de fusión más baja. Los tiempos óptimos de fusión dependen en gran parte de la temperatura 10de fusión. Se seleccionó un tiempo óptimo de 1 minuto cuando se usa una temperatura de fusión de 200ºC. Los tiempos de fusión de más de 1 minuto no mejoraron la penetración de la cera, sin embargo, periodos de fusión más cortos disminuyen significativamente el nivel de penetración de cera. Se encontró que una placa calefactora era una fuente de calor más eficaz ya que permite el contacto directo entre la placa calefactora y la cera. La prueba de 15eficacia de barrera confirma que anchuras de líneas por debajo de 300 µm no pueden formar barreras hidrofóbicasimpermeables en papel. Se mostró que la resolución de línea disminuye según se fabricanlos dispositivos, especialmente después de las fases de fusión. Para crear un dispositivo con una dimensión deseada, se debe considerar la difusión de la cera, que podría producir líneas que son del 13% al 25% más anchas. Esta difusión también 20imponela distancia mínima que debe existir entre dos líneas de cera paralelas durante la fase de diseño. Además, las líneas más estrechas de 300 µm son difíciles de imprimir, debido a las capacidades de resolución de la impresora. Se mostró que temperaturas de fusión más altas y tiempos de fusión más largos pueden afectar negativamente la resolución de la línea, y no mejora significativamente la penetración vertical de la cera. Una 25temperatura de fusión por encima de 200ºC no se puede usar para crear barreras más estrechas de 300 µm ya que la difusión lateral domina la difusión vertical. Se encontró que la orientación de las fibras en el papel influye en la difusión de la cera tanto vertical como lateralmente a través del papel, con este efecto volviéndose más pronunciado para líneas más estrechas de 300 µm. Se encontró que las líneas verticales forman barreras de cera 30más eficaces, incluso aunque muestran mayor difusión lateral. Por tanto, todas las fases de fabricación usadas para crear dispositivos microfluídicos basados en papel se optimizaron totalmente, y el uso de estos descubrimientos asegurará el desarrollo rápido de dispositivos diagnósticos completamente funcionales, de bajo coste.35Ejemplo4
86Análisis de muestras obtenidas de trabajos de tratamiento de aguas residuales de Tshwane (Daspoort, Sudáfrica)Se recogieron muestras de los trabajos de tratamiento de aguas residuales de Daspoort 5(WWTW) para análisis microbiológico.Las muestras se recogieron en la salida de la balsa de sedimento (SP) secundaria y del efluente tratado (E) que existe en la planta. El laboratorio microbiológico de Daspoort ensayael contenido en E. coliy coliformes del efluente a diario. El método desarrollado busca sustituir el método que usan actualmente para estos análisis (filtración en membrana), con una prueba más rápida, de bajo coste y 10sencilla.La muestra de la balsa de sedimento se analizó para demostrar que la LFT puede detectar cepas medioambientales comunes de E. coli. El agua de la balsa de sedimentos no se trata con UV, pero ha experimentado algún nivel de tratamiento con cloro. Como el efluente 15experimenta tanto UV como dosificación con cloro, la balsa de sedimento debe contener mayoresrecuentos de bacterias (especialmente E. coli). Resultados preliminares en el CSIR indican que la balsa de sedimentos no contiene mayores recuentos de E. coli/coliformes, y se puedehaber tratado con menos cloro que el efluente. Las muestras de la balsa de sedimentos también se analizaron para determinar si se puede desarrollar unarelaciónentre 20el contenido en bacterias y la dosis de cloro.Se analizaron la balsa de sedimento y el efluente usando tres métodos (figura 14). Para evaluar si la LFT puede detectar tipos de E. colique se producen tanto en el efluente como en la balsa de sedimento, se realizaron “análisis de 24 horas”. Se cargaron placas Petri con 25muestras de efluente y balsa de sedimento (figura 14a, b), se incubaron durante 24 horas y después de ello se probaron en una LFT. Cualquier bacteria contenida en estas muestras crecería a niveles detectables en la LFT en este tiempo.También se realizó una “prueba de tiempo” para determinar la duración de tiempo requerida 30para detectar diferentes recuentos de E. colien matrices tanto del efluente (E) como de la balsa de sedimento (SP). Para hacer esto, al agua recogida de la balsa de sedimento y el efluente se le agregaron varios recuentos de E. coli0157:H7 (figura 14c), se incubó durante 24 horas,tiempo durante el cual una prueba de flujo lateral se corrió cada hora. Para todos estos estudios, se usó un medio selectivo para E. coliy coliformes (Colilert, IDEXX) para el 35cultivo. El caldo se hizo en tampón fosfato dibásico (pH 8,5). El caldo Colilert se vuelve
87amarillo en presencia de E. coliy coliformes, típicamente después de 18 horas de incubación. Las LFT usadas para estos estudios se hicieron usando anticuerpos anti-E. colide conejo “todo O y K” que se marcaron con el elemento indicador colorimétrico, nanooro.Resultados del análisis de 24 horas5La figura 15 confirma que la LFT puede detectar los tipos/cepas de E. coliencontrados tanto enla balsa de sedimento como en el efluente. En el 82% de los análisis de la balsa de sedimento, se detectó E. colien la LFT. En el 60% de los análisis de efluente, se detectó E. coli. Esto es como se esperaba ya que en WWTW Daspoort, la balsa de sedimento está 10antes de varios procesos de tratamiento y por tanto contendrá más E. colique el efluente. El efluente, después de haber pasado a través de los trabajos de tratamiento completos, habitualmente se dice que contiene menos de 30 ufc/100 ml, y en varias ocasiones, contenía 0 ufc/100 ml (según resultados obtenidos en el laboratorio de Daspoort). Es probableque en el 40% de los casos que no se detectó E. colien el efluente, el efluente 15contuviera 0 ufc/100 ml ese día. De hecho, durante la recogida de muestras en ciertos días, se olían vapores de clorofuertes. Las altas concentraciones de cloro matarían cualquier bacteria contenida en el efluente. Por tanto, los resultados de LFT muestran una fuerte correlación con lo que se espera de cada tipo de muestra, y con resultados obtenidos en los laboratorios de Daspoort. En conjunto, estos resultados demuestran que el método actual es 20capaz de detectar tipos de E. coliprevalentes en agua sudafricanas.Resultados de los estudios de tiempoEl siguiente análisis se realizó para determinar si el método y dispositivo de la presente 25invención pueden detectar E. colien periodos de tiempo más cortos que lo que se logra actualmente. Esto se hizo agregando a muestras de aguas residuales [de la balsa de sedimento (SP) y el efluente (E)] con E. coli0157:H7, con recuentos entre 100y105ufc.Como control, también se agregaronestas concentraciones de E. colia tampón fosfato (PB). Las muestras con agregación se incubaron y se ensayaron cada hora. Los resultados se 30muestran en la figura 16. La figura 16a se considera el mejor caso, en donde se muestra el tiempo más corto para detección registrado para cada concentración. La figura 16b se considera el peor caso, en donde se muestra el tiempo más largo para detección registrado para cada concentración. Las diferencias en el tiempo requerido para la detección para cada concentración se deben a compuestos que interfieren contenidos en las muestras mismas. 35
88Estos compuestos son diferentes en diferentes días, y su impacto en el tiempo requerido para la detección se discute posteriormente.La figura 16 demuestra cómo un aumento en elrecuento de bacterias disminuye el tiempo total requerido para la detección en la LFT. También indica que el tiempo requerido para 5detectar un recuento de bacterias específico es independiente de la matriz de la muestra, siempre que la matriz de la muestra no contenga aditivos que puedan matar las bacterias agregadas, o impedir su crecimiento en algún modo. Como ejemplo, el recuento de 103ufc en las 3 matrices (PB, SP y E) requiere ±8,5 horas para la detección en el peor de los casos. La tabla 9 resume eltiempo medio requerido para detectar diferentes recuentos de E. coli. 10Estos tiempos se promedian a través de las muestras de matrices investigadas (SP, E y PB).Tabla 9: Tiempo de detección total requerido por LFT para detectar diferentes recuentos de bacterias15Recuento de bacterias (ufc)Tiempo requerido para la detección: mejor caso (h)Tiempo requerido para la detección: peor caso (h)1055510368,510112131001517Los resultados de una comparación para el tiempo requerido para la detección en la LFT para el estado de la técnica actual en prueba de detección de E. coli(Colilert) se presentan en la figura 17. Este análisis se hizo comparando el tiempo requerido para que el caldo Colilert se volviera amarillo (indicando la presencia de E. coliy coliformes), con el tiempo 20requerido que obtener una señal de prueba positiva en la LFT. La figura 17a muestra los tiempos más cortos registrados para la detección para cada concentración bacteriana tanto en la LFT de la presente invención como en la prueba Colilert, mientras que la figura 17b indica los tiempos más largos registrados para la detección en ambas pruebas.25En el mejor de los casos (Figura 17a), la prueba de flujo lateral proporcionó resultados antes que Colilert en la mayoría de los recuentos de E. coliinvestigados. En el peor de los casos, la LFT aún supera la prueba Colilert en la mayoría de los recuentos bacterianos. Sin embargo, hubo casos en que la prueba Colilert proporcionó resultados antes. Los resultados obtenidos a altos recuentos bacterianos parecen prometedores (véase la caja en la figura 30
8917). La LFT proporcionó resultados de prueba positivos en un periodo de tiempo significativamente más corto que la prueba Colilert, una indicación prometedora de su capacidad para servir comoun sistema de aviso temprano. Un sistema de aviso temprano tal como este no existe actualmente.5Por tanto, los resultados de la presente prueba de flujo lateral parecen prometedores, demostrando la capacidad de la prueba para servir como un sistema de detección de E. colide bajo coste, rápido y sencillo. La prueba se ha demostrado capaz de detectar cepas medioambientales de E. coli, y varios recuentos de la bacteria en periodos de tiempo más cortos que los alcanzables por los sistemas de detección de E. coliactuales.10ReferenciasByrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., & O’Kennedy, R. (2009). Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors15(Basilea, Suiza), 9(6), 4407–45. doi:10.3390/s90604407Dungchai, W., Chailapaku, O. y Henry, C. S. (2011). A low-cost, simple, and rapid fabrication method for paper-based microfluidics using wax screen-printing. Analyst, Vols. 136 Pg 77-82.Govindasamy, K., Potgieter, S., Land K., y Muzenda. E., Fabrication of Paper Based 20Microfluidic Devices. In: Proceedings of the World Congress on Engineering, Londres, RU, 4-6 Julio 2012.Guo, H., Yi, W., Shao, J., Lu, Y., Zhang, W., Song, J., & Wang, P. G. (2005). Molecular Analysis of the O-Antigen Gene Cluster of Escherichia coli O86 : B7 and Characterization of the Chain Length Determinant Gene (wzz), 71(12), 7995–8001. doi:10.1128/AEM. 71. 12. 257995. Hossain, S., Ozimok, C., Sicard, C., Aguirre, S., Ali, M., Li, Y. y Brennan, J. D. (2012). Multiplexed paper test strip for quantitative bacterial detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 403, 1567. Jokerst, J. C., Adkins, J. A. Bisha, B., Mentele, M. M., Goodridge, L. D. y Henry, C. S. A 30Paper-Based Analytical Device for the colorimetric detection of foodborne pathogenic bacteria. En: Proceedings of the 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, 2116 (2011). King, J. D., Mulrooney, E. F., Vinogradov, E., Kneidinger, B., Mead, K., & Lam, J. S. (2008). lfnA from Pseudomonas aeruginosa O12 and wbuX from Escherichia coli O145 encode 35membrane-associated proteins and are required for expression of 2,6-dideoxy-2-acetamidino-L-galactose in lipopolysaccharide O antigen. Journal of Bacteriology, 190(5), 1671–9. doi:10.1128/JB. 01708-07. Kong, K., Jayawardena, S. R., Dayaram, S., Puerto, A., Koh, C., Høiby, N., Kong, K., et al. (2005). Pseudomonas aeruginosa AmpR Is a Global Transcriptional Factor That Regulates 40Expression of AmpC and PoxB βand Other Virulence Factors Pseudomonas aeruginosa AmpR Is a Global Transcriptional Factor That Regulates Expression of AmpC and PoxB β-Lactamases. American Society for Microbiology, 49(11), pp. 4567–4575.