PL223116B1

PL223116B1 - Sposób wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dwuniciowego DNA barwnikiem fluorescencyjnym oraz jego zastosowanie

Info

Publication number: PL223116B1
Application number: PL402764A
Authority: PL
Inventors: Sen Hou; Lili Sun; Stefan Wieczorek; Tomasz Kalwarczyk; Tomasz Kamiński; Robert Hołyst
Original assignee: Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2013-02-14
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2016-10-31
Also published as: PL402764A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dwuniciowego DNA barwnikiem fluorescencyjnym oraz jego zastosowanie.

Fluoroscencyjnie znakowane dwuniciowe DNA (dsDNA) jest szeroko stosowane w ilościowych badaniach biologicznych. Znakowane dsDNA na obu końcach pozwala na analizę w czasie rzeczywistym działania enzymu restrykcyjnego. Zwykle w takim eksperymencie zakładano 100% wydajność znakowania (Bacia et al. 2012, Chemphyschem 13: 1221-1231). Fluoroscencyjne dsDNA jest syntezowane poprzez wygrzewanie a następnie powolne chłodzenie komplementarnych pojedynczych nici DNA (ssDNA) znakowanych barwnikiem fluoroscencyjnym na przeciwnych końcach. Otrzymywana w tym procesie wydajność znakowania nigdy nie osiąga 100% i zależy od rodzaju zastosowanego barwnika (Proudnikov et al. 1996, Nucleic Acids Res 24: 4535-4542; Fujibayshi et al. 1999, Nucl Med Biol 26: 17-21). Dodatkowo fluorescencja barwnika może być obniżona w wyniku wysokiej temperatury stosowanej podczas wygrzewania komplementarnych nici ssDNA (na przykład degradacja barwnika) i końcowa wydajność znakowania dsDNA, może być niższa od wydajności próbki oryginalnej. Ponieważ znakowanie zachodzi z wydajnością niższą niż 100%, w końcowym roztworze mamy zawsze trzy składniki: dsDNA znakowane dwoma barwnikami na obu końcach, dsDNA znakowane jednym barwnikiem i nieznakowane dsDNA. Gdy dsDNA jest znakowane jednym barwnikiem (na przykład fluoroscencyjnym) powstaje problem z rozróżnieniem wyżej wymienionych składników tak powstałej mieszaniny. Dzieje się tak ze względu na podobne własności fotofizyczne (maksimum emisji fluoroscenccji przypada przy tej samej długości fali) jak i podobne masy cząsteczkowe.

Wydajność znakowania ssDNA wyznaczana jest z zastosowaniem materiałów radioaktywnych. Metoda ta wymaga znakowania za pomocą P obu składników roztworu: fluoroscencyjnego i niefluoroscencyjnego ssDNA i następnie rozdzielenie ich z zastosowaniem elektroforezy w celu ilościowego określenia poszczególnych składników. Podłączenie jednego barwnika do długich łańcuchów ssDNA nie powoduje mierzalnej zmiany mobilności elektroforetycznej. Metoda ta jest więc ograniczona do bardzo krótkich ssDNA, rzędu oligomerów (Proudnikov et al. 1996, Nucleic Acids Res 24: 4535-4542).

Pozostałe dwie metody pozwalające na ilościowe oznaczenie stężenia DNA i barwnika oparte są na absorpcji promieniowania UV lub fluorescencji (Oliveira-Brett et al. 2002, 373; 717-723; Emanuele et at. 2005, Chemphyschem 6: 1387-1392; Li et al, 2009, Biosens Bioelectron 24: 3281-3287). Absorpcja promieniowania UV przez roztwór DNA pozwala na wyznaczenie stężenia DNA. Przykładowo 1OD 260 nm odpowiada 50mg/L dsDNA. Metoda ta cechuje się jednak dużą niedokładnością rzędu 10-20%. Końcowa krzywa absorpcji UV odchyla się od liniowego prawa Beer'a (Cavaluzzi et al.

2004, Nucleic Acids Res 32; doi 10.1093/nar/gnh015) w wyniku absorpcji zanieczyszczeń, rozproszenia światła w mętnych roztworach jak i w przypadku reorientacji grup chromoforów. Druga metoda spektroskopowa oparta na pomiarze widma emisji fluoroscencji także pozwala na oznaczenie stężenia barwnika. W metodzie tej porównywane jest widmo emisji czystego barwnika z widmem emisji barwn ika przyłączonego do DNA (Kurata et al. 2001, Nucleic Acids Res 29: No 6, e34; Muruyama et al.

2005, Biotechnol Lett 27: 1349-1354). Metoda ta wykazuje podobne ograniczenia jak metoda absorpcji promieniowania UV.

Przedstawione powyżej trzy metody wyznaczania wydajności znakowania barwnikiem fluorescencyjnym DNA nie dają zadawalających wyników w zastosowaniu do wyznaczenia wydajności znakowania przy wytwarzaniu fluoroscencyjnego dsDNA znakowanego na obu końcach.

Twórcy niniejszego wynalazku proponują zastosowanie spektroskopii korelacji fluorescencji (Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS) do wyznaczenia wydajności znakowania dsDNA. W literaturze są doniesienia o różnym zastosowaniu FCS: np, stosowany jest do charakteryzowania fluoroscencyjnych białek (Schwille et al. 2000, Proceedings Natl. Acad, Sci. USA 97: 151 -156), pomiaru lepkości roztworów (Holyst et al. 2009, Phys. Chem. Chem. Phys. 11: 9025-9032), czy badaniu biologicznych reakcji (Kral et al. 2002, Cell Mol. Biol. Lett. 7: 203-211; 2005, J. Fluoresc. 15: 179-183;

2006, Chemoterapy 52: 196-199) na poziomie pojedynczych cząsteczek. Działanie FCS polega na rejestracji fluktuacji sygnału fluorescencji z objętości konfokalnej oświetlonej laserem (Elson et al. 1974, Biopolymers 13: 1-27; Magde et al. 1974, Biopolymers 13: 29-61). Zapisany sygnał jest następnie poddawany przez korelator procedurze autokorelacji (Hou et al. 2011, Soft Matter 7: 6967-6972), lub korelacji krzyżowej,(Kettling et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1416-1420) dając krzywą korelacyjną FCS. Otrzymana krzywa korelacyjna pozwala na wyznaczenie liczby próbników i czasu ich dyfuzji przez objętość ogniskową (Hou et al. 2011, Soft Matter 7: 6967-6972; Holyst et al. 2009, Phys.

PL 223 116 B1

Chem. Chem. Phys. 11: 9025-9032). Ze znajomości geometrii objętości ogniska konfokalnego, możliwe jest obliczenie stężenia próbnika fluoroscencyjnego. Dużą zaletą pomiarów z zastosowaniem FCS są małe objętości próbek (krople o objętości kilkudziesięciu mikrolitrów) zawierające niezwykle niskie stężenia analitu rzędu nanomoli.

Próbki DNA obecnie dostępne na rynku do zastosowania w analizie biochemicznej występujące w postaci dwóch próbek (proszku) do zmieszania, zawierają jednoniciowe DNA znakowane na jednym końcu barwnikiem, przy czym jednoniciowe DNA w jednej próbce jest komplementarne do tego w drugiej próbce. Po zmieszaniu obu próbek w roztworze ma tworzyć się dwuniciowe DNA, które powinno mieć barwnik na dwóch końcach. Tak jednak nie jest, a po zmieszaniu obu próbek zwykle mi eszanina zawiera obok podwójnie znakowanego DNA również pojedynczo znakowane DNA oraz nieznakowane DNA.

Jeżeli użyjemy takiej mieszaniny do badania reakcji biochemicznych i dokonamy detekcji za pomocą metod spektroskopowych to część reakcji, które zajdą w próbce nie będzie zaobserwowana. Dlatego ważne jest by dokładnie określić stężenie podwójnie znakowanego DNA w takiej próbce.

Dlatego też celem obecnego wynalazku jest opracowanie nowego sposobu wyznaczania w ydajności znakowania DNA barwnikiem fluoroscencyjnym i zastosowania sposobu wyznaczania wydajności znakowania DNA w analizie biochemicznej. W szczególności w proponowanym sposobie nie jest wymagana znajomość wydajności wyznakowania fluorescencyjnego jednoniciowych DNA stosowanych w tym sposobie.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem, sposób wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dwuniciowego DNA barwnikiem fluorescencyjnym, w ilościowej analizie biochemicznej, charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące kroki;

a) przygotowuje się próbkę 1 poprzez wygrzewanie, a następnie powolne chłodzenie mieszaniny dwóch komplementarnych jednoniciowych DNA: znakowanego ssDNA A i znakowanego ssDNA B, barwnikiem fluorescencyjnym, oraz

b) przygotowuje się próbkę 2 poprzez wygrzewanie, a następnie chłodzenie mieszaniny złożonej z nieznakowanego jednoniciowego ssDNA A i nieznakowanego jednoniciowego ssDNA B, oraz znakowanego jednoniciowego ssDNA A i znakowanego jednoniciowego ssDNA B barwnikiem fluorescencyjnym, przy czym w obu próbkach 1 i 2 stężenie i ilość wszystkich stosowanych składników są takie same; potem

c) dokonuje się pomiaru intensywności fluorescencji oddzielnie dla powyższych próbek 1 i 2 z zastosowaniem spektroskopii korelacji fluorescencji na mikroskopie fluorescencyjnym, w wyniku tego pomiaru uzyskuje się krzywe funkcji autokorelacyjnych G(t), gdzie τ oznacza czas przebywania cząstki w ognisku konfokalnym, z których to krzywych odczytuje się parametry stanowiące wartości G₁(0), G₂(0) funkcji autokorelacyjnych dla każdej z próbek w punkcie τ = 0, a także wartości frakcji stanów trypletowych p1 i p2, po czym

d) wylicza się wartości G_a(0) i G_B(0) wyrażone poniższymi wzorami:

G_a(0)/ = G,(0)(1 -p,) G_s(0) = G₂(0)(1 -p₂) oraz

e) następnie wyznacza się wydajność x podwójnego znakowania dwuniciowego DNA, na podstawie uzyskanych z pomiaru w etapie c) i wyliczonych w etapie d) wartości ze wzoru:

r — 1 gdzie r = G_a(0)/G_b(0) oraz wartość r spełnia nierówności 1< r < 4/3, uzyskując wartość x, będącą ułamkiem właściwym określającym wydajność podwójnego znakowania dwuniciowego DNA,

W sposobie według wynalazku stosuje się dwie komplementarne nici DNA zawierające do 200 nukleotydów, korzystnie 66 nukleotydów.

Wynalazek ponadto obejmuje zastosowanie sposobu wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dwuniciowego DNA barwnikiem według wynalazku w ilościowej analizie biochemicznej, zwłaszcza w analizie aktywności enzymu, oraz do weryfikacji zmierzonej wartości wydajności podwójnego znakowania DNA, jak również w badaniach cięcia łańcucha DNA.

PL 223 116 B1

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których;

Fig. 1 przedstawia schemat ideowy aparatury spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS);

fig. 2 przedstawia proces wygrzewania i powolnego chłodzenia ssDNA z wydajnością znakowania a i b prowadzi do niezupełnego znakowania dsDNA. ssDNA znakowane ATTO 550 w końcu 5'. Obecność nieznakowanego ssDNA prowadzi do współistnienia w roztworze czterech rodzajów dsDNA pokazanych na rysunku. Liczba cząsteczek ssDNA lub dsDNA w ognisku konfokalnym FCS podana jest na rysunku. Ilość powstałego podwójnie znakowanego dsDNA równa jest Nab. W roztworze mamy także Na(1-b)+N(1-a)-b pojedynczo znakowanego dsDNA oraz N-(1-a)(1-b) nieznakowanego dsDNA. PDL(wydajność znakowania DNA) równa jest x=ab/(a+b-ab);

fig. 3 przedstawia widma absorpcji znakowanych próbnikiem fluoroscencyjnym ATTO 550: ssDNA A (linia czerwona - 2) i ssDNA B (linia niebieska - 3) oraz widma dwóch próbek nieznakowanych ssDNA A (linia brązowa - 4) i ssDNA B (linia zielona - 5). Figura 3a pokazuje widma absorpcyjne badanych próbek w zakresie 200-600 nm. Figura 3b - powiększony fragment widm absorpcji w zakresie 230-290 nm, w którym widmo ssDNA ma maksimum. Figura 3c - powiększony fragment widm absorpcji w zakresie 500-600 nm, w którym widmo barwnika ATTO 550 wykazuje maksimum. Stężenie wszystkich czterech próbek jest takie samo i wynosiło 864 nM, Dla tych samych stężeń DNA, stężenie ATTO 550 jest różne w próbkach ssDNA A i ssDNA B, co pokazują odpowiednie widma absorpcji (fig. 3c);

fig. 4 przedstawia schemat eksperymentalnej procedury do wyznaczania PDL (wydajności znakowania). Próbkę 1 przygotowano wygrzewając i następnie powolnie chłodząc mieszaninę dwóch komplementarnych ssDNA; 85 nM roztworu znakowanego ssDNA A i 85 nM roztworu znakowanego ssDNA B. Próbkę 2 przygotowano wygrzewając i następnie chłodząc mieszaninę złożoną z: 85nM nieznakowanego ssDNA A, 85 nM nieznakowanego ssDNA B, 85 nM znakowanego ssDNA A i 85 nM znakowanego ssDNA B. Wydajność znakowania próbek ssDNA A i ssDNA B wynosi odpowiednio a i b. Liczba każdego ze składników w objętości ogniska FCS przedstawiona jest jako funkcja N;

fig. 5 przedstawia krzywe otrzymane z FCS. (a), dla dsDNA otrzymanego z 2,8 nW nieznakowanego ssDNA A i 2,8 nM znakowanego ssDNA B; (b) dla dsDNA otrzymanego z 2,8 nM znakowanego ssDNA A i 2,8 znakowanego ssDNA B; (c) dla dsDNA otrzymanego z 2,8 nM nieznakowanego ssDNA A, 2,8 nM nieznakowanego ssDNA B, 2,8 nM znakowanego ssDNA A i 2,8 znakowanego ssDNA B, (wszystkie dsDNA uzyskano w trakcie wygrzewania i następnie powolnego chłodzenia). ssDNA A i ssDNA B były znakowane ATTO 550 na końcu 5'. Krzywa (a) dopasowywana równaniem 4 z j =1 i krzywe (b) i (c) równaniem 4 z j =2;

fig. 6 przedstawia (a) cięcie dsDNA za pomocą restrykcyjnego enzymu Hind III. Miejsce cięcia znajduje się pośrodku cząsteczki dsDNA. Produktem cięcia dsDNA są dwa fragmenty dsDNA, każdy równy połowie długości dsDNA przed cięciem, (b) Funkcje autokorelacyjne niedokładnie oznakowanego dsDNA podczas procesu cięcia łańcucha. Wydajność znakowania dla tej próbki wynosiła ~ 40%. Po upływie 100 minut krzywa autokorelacyjna nie ulega zmianie w czasie, co wskazuje na zakończenie procesu cięcia. Zmniejszenie amplitudy G(r=0) mierzonej w czasie t=0 min. do jej wartości w czasie t=120 min. wynosi 63%;

fig. 7 przedstawia schemat eksperymentalnej procedury przewidywania wydajności znakowania PDL na podstawie znajomości PDL w próbce wyjściowej xo. 1). Próbka dsDNA z wydajnością znakowania PDL xo przygotowana poprzez wygrzewanie i powolne chłodzenie (annealing) takich samych ilości (N) ssDNA A i ssDNA B. 2) Druga próbka dsDNA z nieznaną wydajnością znakowania Xc przygotowana przez dodanie dodatkowej ilości (N1-c)) nieznakowanego ssDNA A i ssDNA B do znakowanego ssDNA A i ssDNA 8 podczas procesu wygrzewania i powolnego chłodzenia; zaś fig. 8 przedstawia weryfikacja proponowanej metody przez porównanie mierzonej i oszacowanej wydajności podwójnego znakowania PDL. Przygotowujemy dsDNA (próbka 1). Następnie zwiększamy stężenie DNA dwukrotnie w próbce 2 i czterokrotnie w próbce 3 przez dodanie nieznakowanego ssDNA, jednocześnie utrzymując stężenie znakowanego DNA na poziomie próbki 1. PDL próbki 2 jest przewidywane z zmierzonej wartości próbki 1. PDL próbki 2 może być zmierzone z zastosowaniem proponowanej metody z danych próbki 2 i 3. Porównanie przewidywanej i zmierzonej wartości PDL może być użyte do sprawdzenia otrzymanych wyników.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

W opracowywaniu proponowanej metody wyznaczania wydajności podwójnego znakowania DNA barwnikiem fluoroscencyjnym używano aparaturę FCS, której schemat ideowy pokazany jest na fig. 1. W skład tej aparatury wchodzi mikroskop konfokalny (Nikon EZ-C1) wyposażony w układ FCS

PL 223 116 B1 typu PicoHarp 300 (PicoQuant, Niemcy). Dodatkowo w skład aparatury wchodzi układ termostatujący (Okolab) stabilizujący temperaturę z dokładnością 0,5°C. Światło lasera He-Ne o długości fali 543 nm przechodzi przez obiektyw (powiększenie 60 x, z immersją wodną) i pada na próbkę. Emitowane przez próbkę promieniowanie fluoroscencyjne jest następnie zbierane przez obiektyw i po przejściu przez lustro dichroiczne i pinhol o średnicy 30 gm jest równo dzielone (rozszczepiane) na dwa detektory.

Rozkład intensywności promieniowania lasera I, w objętości ogniska jest przybliżany trójwymiarową funkcją Gaussa:

I(x, y, z) = I₀exp(-2(x² + y²) /F² - 2z²/H²) (1) gdzie, F jest długością przekroju poprzecznego w płaszczyźnie x-y, H jest wysokością oświetlonego elementu objętości. Fluktuacja intensywności fluorescencji l(t)

I(t) = < I(t) > + SI(t) (2) jest przetwarzane przez cyfrowy korelator w funkcję autokorelacyjną:

(3)

Znormalizowana funkcja autokorelacyjna dla układu wieloskładnikowego (Rarbach et al. 2001, Methods 24: 104 - 116) dana jest równaniem (4):

G(t) =

Σ₌₁/ν₇·Β/ΰ₇·(τ) (Z”₌₁w₇ą·)²

-T/T_t ’

-p (4) gdzie: p jest frakcją barwnika, którego cząsteczki są w stanie trypletowym, τ - czas życia stanów trypletowych, Nj, średnia liczba j-tych cząstek w ognisku konfokalnym, τ czas przebywania cząstki w ognisku konfokalnym, Bj jaskrawość j-tej cząstki w objętości ogniska, a, Dj(t) wyrażone równaniem (5):

d j(0 = ( 1 + -L) - ¹ ( 1 + ^Tj,o ^κ2η,ο \-l/2 (5) oznacza czasowy zanik j-tej funkcji korelacyjnej spowodowanej molekularną dyfuzją cząsteczek j z czasem dyfuzji ₀, k, jest parametrem strukturalnym opisującym stosunek wielkości podłużnej do poprzecznej objętości ogniska.

Pomiary prowadzono z dwoma komplementarnymi niciami DNA zawierającymi 66 nukleotydów, obie syntezowane i czyszczone z zastosowaniem HPLC przez Eurofins MWG (Niemcy). ssDNA znakowane było barwnikiem ATTO 550 na końcu 5'. Sekwencje badanych DNA pokazane są na fig. 2. Badane fragmenty DNA przechowywane były w roztworze buforu TE (10 mmol/l Tris-HCI, 1 mmol EDTA, pH 7,5). W celu wytworzenia dsDNA, dwa komplementarne ssDNA o tym samym stężeniu, rozpuszczone w roztworze buforu, były wygrzewane w temperaturze 95°C przez 5 minut i następnie stopniowo chłodzone do temperatury 25°C z szybkością 0,5°C/min (annealing process). W celu zwiększenia wydajności prowadzonego procesu i ochrony fluoroscencyjnego barwnika do roztworu dodano 50 mM NaCl i 0,5 mM β-merkaptoetanolu.

PDL (wydajność znakowania DNA) jest wyrażona jako funkcja wydajności znakowania ssDNA (fig. 2). Dla uproszczenia opisu przyjmujemy, że procent barwnika zniszczony w czasie procesu wygrzewania i chłodzenia i oryginalna wydajność znakowania ssDNA jest zawarta w jednym parametrze - wydajność znakowania ssDNA. Zakładamy, że jeden składnik ssDNA (nić A) ma wydajność znak owania a i drugi komplementarny ssDNA (nić B) ma wydajność znakowania b. Zastosowanie równych ilości N, składników A i B prowadzi do otrzymania w roztworze różnie znakowanych dsDNA. Jeżeli N jest liczbą cząsteczek dsDNA to ilość podwójnie znakowanego dsDNA jest Nab. W roztworze znajduje się także Na(1-b)+N(1-a)-b pojedynczo znakowanego dsDNA i N(1-a)(1-b) nieznakowanego dsDNA. PDL (wydajność znakowania dsDNA) x=ab/(a+b-ab).

Na fig 2 przedstawiono proces wygrzewania i powolnego chłodzenia ssDNA z wydajnością znakowania a i b prowadzący do niezupełnego znakowania dsDNA. ssDNA znakowane ATTO 550 w końcu 5'. Obecność nieznakowanego ssDNA prowadzi do współistnienia w roztworze czterech rodzajów dsDNA pokazanych na rysunku. Liczba cząsteczek ssDNA lub dsDNA w ognisku konfokalnym FCS podana jest na rysunku. Ilość powstałego podwójnie znakowanego dsDNA równa jest N’ab. W roztworze mamy także Na(1-b)+N(1-a)-b pojedynczo znakowanego dsDNA oraz N(1-a)(1-b) nieznakowanego dsDNA. PDL(wydajność znakowania DNA) równa jest x=ab/(a+b-ab).

PL 223 116 B1

To, że nie wszystkie cząsteczki ssDNA są znakowane próbnikiem fluoroscencyjnym potwierdzono w pomiarach spektrometrycznych. Wykonano pomiary UV-Vis (Kuhnemuth et al. 2001, Single Mol 2: 251-254) i wykonano analizę porównawczą widm absorpcji ssDNA dla długości fali 260 nm i widm absorpcji przyłączonego próbnika przy długości fali 554 nm. Stężenie ssDNA jest proporcjonalne do wartości widma dla długości fali 260 nm. Na maksimum absorpcji w 260 nm nie wpływa obecność próbnika ATTO 550 przyłączonego do DNA (fig. 3b). Stężenia próbnika ATTO S50 jest proprcjonalne do wielkości widma absorpcji w 554 nm. Próbki nieznakowane ssDNA A i B nie wykazują maksimum w 554 nm (fig. 3c). Dla tych samych stężeń ssDNA A i ssDNA B wyznaczone stężenie próbnika ATTO 550 są różne w badanych próbkach A i B, otrzymane widma absorpcji dla 554 nm są różne (fig. 3c). Wynika z tego, że wydajność znakowania komplementarnych nici A i B jest różna i ssDNA A, zawierający mniej barwnika ATTO 550 jest niedokładnie oznakowany.

Na fig. 3 przedstawiono widma absorpcji znakowanych próbnikiem fluoroscencyjnym ATTO 550: ssDNA A (linia czerwona) i ssDNA B (linia niebieska) oraz widma dwóch próbek nieznakowanych ssDNA A (linia brązowa) i ssDNA B (linia zielona). Fig. 3a pokazuje widma absorpcyjne badanych próbek w zakresie 200-600 nm. Fig. 3b - powiększony fragment widm absorpcji w zakresie 230-290 nm, w którym widmo ssDNA ma maksimum. Fig. 3c - powiększony fragment widm absorpcji w zakresie 500-600 nm, w którym widmo barwnika ATTO 550 wykazuje maksimum. Stężenie wszystkich czterech próbek jest takie samo i wynosiło 864 nM. Dla tych samych stężeń DNA, stężenie ATTO 550 jest różne w próbkach ssDNA A i ssDNA B, co pokazują odpowiednie widma absorpcji (fig. 3c).

Sposób pomiaru PDL (procent znakowanego dsDNA w mieszaninie DNA) i zastosowaniem FCS według wynalazku

Proponowany sposób według niniejszego wynalazku oparty jest na porównaniu liczby fluoroscencyjnych cząsteczek w objętości ogniska FCS w dwóch specjalnie przygotowanych próbkach dsDNA.

Próbka 1: otrzymana w wyniku wygrzewania i następnie powolnego chłodzenia (annealing) 85 nM znakowanego ssDNA A i 85 nM znakowanego ssDNA B w celu wytworzenia dsDNA,

Próbka 2: otrzymana w wyniku wygrzewania i następnie powolnego chłodzenia (annealing) 85 nM znakowanego ssDNA A i 85 nM nieznakowanego ssDNA A oraz 85 nM znakowanego ssDNA B i 85 nM nieznakowanego ssDNA B.

W proponowanej metodzie kluczowe jest utrzymanie takiego samego stężenia w obu próbkach niedoskonale znakowanego ssDNA i podwojenie ogólnego stężenia ssDNA przez uzupełnienie nieznakowanym ssDNA drugiej próbki.

Na fig. 4 przedstawiono schemat eksperymentalnej procedury do wyznaczania PDL (wydajności znakowania). Próbkę 1 przygotowano wygrzewając i następnie powolnie chłodząc mieszaninę dwóch komplementarnych ssDNA; 85 nM roztworu znakowanego ssDNA A i 85 nM roztworu znakowanego ssDNA B. Próbkę 2 przygotowano wygrzewając i następnie chłodząc mieszaninę złożoną z: 85 nM nieznakowanego ssDNA A, 85 nM nieznakowanego ssDNA B, 85 nM znakowanego ssDNA A i 85 nM znakowanego ssDNA B. Wydajność znakowania próbek ssDNA A i ssDNA B wynosi odpowiednio a i b. Liczba każdego ze składników w objętości ogniska FCS przedstawiona jest jako funkcja N.

Stężenie wyjściowe ssDNA w próbkach 1 i 2 jest dowolne. Stężenie w próbkach badanych (dsDNA, po rozcieńczeniu próbek wyjściowych), jest wymuszone użytą techniką eksperymentalną, tj. FCS. Użycie techniki pomiarowej FC5 wymusza użycie próbek o stężeniu analitu w zakresie kilku nM. Niestety optymalna wartość stężenia analitu może być różna w zależności od użytego w pom iarach FCS obiektywu mikroskopowego oraz detektora. Dlatego też na jednej aparaturze FCS optymalnym stężeniem roboczym będzie stężenie ssDNA na poziomie 5 nM, a na innym - 50 nM. Zgodnie z wynalazkiem finalne stężenie użyte w pomiarach FCS wynosiło 2,8 nM (fig. 5) i było 30-krotnym rozcieńczeniem próbek wyjściowych.

Zakładamy, że dla pewnego stężenia cząsteczek (stężenie po rozcieńczeniu równe 2,8 nM) średnia liczba cząsteczek w ognisku konfokalnym wynosi N. Liczba każdego ze składników DNA (znakowane z obu końców, znakowane na jednym końcu i nieznakowane) w ognisku konfokalnym jest funkcją N (fig. 4). Znajomość dokładnej wartości N nie jest konieczna, ponieważ końcowa wartość PDL nie zależy od N.

Badając próbkę 1 w ognisku konfokalnym znajdują się dwa składniki fluoroscencyjne: N(a+b2ab) cząsteczek dsDNA znakowanych jednym próbnikiem i Nab cząsteczek dsDNA znakowanych dwoma próbnikami. Zgodnie z równaniem 4 i 5 funkcja autokorelacyjna jest;

PL 223 116 B1

Gi(t) =

N ab S/D, (τ) + N (a + b — 2ab) B₂D₂(t) (N ab B₁ + N (a + b — 2ab) B₂)² fl +-^—e~^TW V 1 - pi J (6) gdzie, Bi jest jasnością dsDNA znakowanego dwoma próbnikami, B₂ jest jasnością dsDNA znakowanego jednym próbnikiem, pi frakcja cząstek w stanie trypletowym, i czas zaniku stanów trypletowych w próbce 1, Mamy również zależność:

Bi = 2B₂ (7)

Łącząc równania 6 i 7 otrzymamy:

Gi(t) =

Ą-N ab ϋ,_:(τ) + N (a + b — 2ab) D₂ (τ) (2N ab + N (a + b — 2ab) B₂))² (8)

Dla τ= 0

Gi(0) =

2ab + a + b

N (a + b)² (9)

Definiujemy,

G_a(0) = 6^0)(1 -_Pl) =

2ab + a + b N (a + b)² (10)

W próbce 2, w ognisku konfokalnym znajdują się dwa składniki fluoroscencyjne: N(a+b-ab) cząsteczek dsDNA znakowanych jednym próbnikiem i Nab/2 cząsteczek dsDNA znakowanych dwoma próbnikami. Zgodnie z równaniami 4 i 5 funkcja autokorelacyjna jest:

N 1/2 ab B^DIt) + N (a + b — ab) B₂D₂(t)

P2 (N 1/2 ab B-i + N (a + b — ab) B₂)² 1 — p₂ ₃-r/T2,t ’ (11) gdzie p₂frakcja cząstek w stanie trypletowym, x₂,_t czas zaniku stanów trypletowych w próbce 2. Łącząc równania 7 i 11 otrzymujemy

G₂(j) =

Dla τ= 0

Definiujemy,

2N ab D,(t) + N (a + b — ab) D₂(t) (N ab + N (a + b — ab))²

Gi(0) = ab + a + b N (a + b)²

G_B(0) = G₂(0)(l-p₂) =

P2 ~P2 (12) (13) ab + a + b ab

N (a + b)² (14)

Z równań 10 i 14 znajdujemy PDL = x =a+b-ab

Wyrażając x w wielkościach mierzonych GA i GB otrzymujemy ab G_A(O)/G_B(O) - 1 ab a + b

Jeżeli zdefiniujemy r, jako r = G_a(0)/G_b(0)

2G_a(0)/G_b(0) (15) (16)

Wartość r spełnia nierówności 1< r < 4/3. Parametr r jest mierzony w pomiarach FCS. PDL jest wyrażone prostą zależnością od r, r — 1 — 2r (17)

PL 223 116 B1

Wielkości Gi(0), G₂(0), p₁ i p₂ są otrzymywane z dopasowywania krzywych autokorelacyjnych FCS za pomocą odpowiednich funkcji autokorelacji. Wielkości GA(0), G_B(0) i r są obliczane. Stosując tę metodę otrzymaliśmy r = 1,21 ±0,01 i PDL 37±2%.

Oczywiste jest, że podaną wartość PDL w %, uzyskuje się gdy otrzymaną wartość x pomnożymy przez 100%.

Krzywe autokorelacyjne otrzymane w pomiarach FCS są dopasowywane równaniami 8 i 12 (fig. 5). Pojedynczo znakowany dsDNA użyliśmy do wykalibrowania FCS, Krzywe z FCS są dopasowywane modelem dyfuzji jedno-składnikowej: równanie 18 (równanie 4 z j=1), = (18) wskazuje, że jest tylko jeden fluoroscencyjny składnik - pojedynczo znakowany dsDNA (krzywa a na fig. 5). Krzywe b i c na fig. 5 dopasowywane są modelem dyfuzji dwuskładnikowej (równanie 4 j = 2, równania 8 i 12). Funkcje te opisują próbki, w których są obecne pojedynczo znakowane jak i podwójnie znakowane DNA. Pojedynczo jak i podwójne znakowany dsDNA ma prawie taką samą masę cząsteczkową, co powoduje, że ich współczynniki dyfuzji są bardzo podobne. W konsekwencji w filtrowaniu zakładamy D₁(t) = D₂(t) co prowadzi do uproszczenia równań 8 i 12 do postaci:

G_ź(t) = ί/_έΖ)(τ)(1 + (19) ¹ Pi gdzie gt czas zaniku stanów trypletowych w próbce 1 (i = 1) i w próbce 2 (i = 2)

Figura 5 przedstawia krzywe otrzymane z FCS, (a), dla dsDNA otrzymanego z 2,8 nM nieznakowanego ssDNA A i 2,8 nM znakowanego ssDNA B; (b) dla dsDNA otrzymanego z 2,8 nM znakowanego ssDNA A i 2,8 znakowanego ssDNA B; (c) dla dsDNA otrzymanego z 2,8 nM nieznakowanego ssDNA A, 2,8 nM nieznakowanego ssDNA B, 2,8 nM znakowanego ssDNA A i 2,8 znakowanego ssDNA B, (wszystkie dsDNA uzyskano w trakcie wygrzewania i następnie powolnego chłodzenia). ssDNA A i ssDNA B były znakowane ATTO 550 na końcu 5'.

Barwnik ATTO 550 jest znakiem towarowym firmy ATTO-TEC GmbH, Niemcy. Dla specjalisty będzie oczywiste, że można zastosować dowolny barwnik stabilny w pomiarach FCS, korzystnie ATTO 550. Dobór barwnika uzależniony jest od dostępnego układu pomiarowego, w tym laserów i filtrów. Maksimum pasma absorpcji barwnika powinno przypadać dla w tej samej długości fali co dostępny w aparaturze pomiarowej laser. Z kolei maksimum pasma fluorescencji barwnika powinno przypadać dla takich długości fali, aby filtry dostępne w aparaturze mogły transmitować światło do detektorów. Wybór barwnika w pomiarze nie powinien wpływać na jakość metody tu opisanej.

Krzywa (a) dopasowywana równaniem 4 z j =1 i krzywe (b) i (c) równaniem 4 z j =2.

~a + b + 2ab ——-—— dla próbki 1

N(a + b)^{2 K} a + b + ab

-—— dla próbki 2

L N(a + b)^{2 K} (20)

Obecność stanu trypletowego w próbniku fluoroscencyjnym powoduje obniżenie (zmniejszenie) funkcji autokorelacyjnych FCS o okofo 20%. Nie uwzględnienie stanu trypletowego w obliczeniach może pogorszyć dokładność otrzymanych wyników (Kettling et al, 1998, Proc, Natl. Acad. Sci, USA 95: 1416-1420). Funkcje stanu trypletowego uwzględniamy w naszych obliczeniach wprowadzając je do równań 10 i 14.

Zastosowanie PDL w badaniach cięcia łańcucha DNA

Wydajność podwójnego znakowania ma znaczący wpływ na ilościowe pomiary biochemiczne. Jako przykład takiego eksperymentu przeprowadziliśmy pomiary z użyciem restrykcyjnego enzymu Hind III (Hou et al, 2011, Soft Matter 7: 3092-3099).

Na fig. 6 przedstawiono (a) cięcie dsDNA za pomocą restrykcyjnego enzymu Hind III. Miejsce cięcia znajduje się pośrodku cząsteczki dsDNA. Produktem cięcia dsDNA są dwa fragmenty dsDNA, każdy równy połowie długości dsDNA przed cięciem. (b) Funkcje autokorelacyjne niedokładnie oznakowanego dsDNA podczas procesu cięcia łańcucha. Wydajność znakowania dla tej próbki wynosiła ~40%. Po upływie 100 minut krzywa autokorelacyjna nie ulega zmianie w czasie, co wskazuje na zaPL 223 116 B1 kończenie procesu cięcia. Zmniejszenie amplitudy G(t=0) mierzonej w czasie t=0 min. do jej wartości w czasie t=120 min. wynosi 63%.

Cząsteczki dsDNA mają miejsce cięcia dla restrykcyjnego enzymu Hind III w środku łańcucha. Po cięciu jedna cząsteczka dsDNA jest podzielona na dwa krótsze fragmenty, które mogą zawierać fluoroscencyjny próbnik lub nie (fig. 6a). Produktem cięcia dsDNA znakowanego dwoma próbnikami są dwa fluoroscencyjne fragmenty dsDNA, każdy równy połowie długości dsDNA przed cięciem. W idealnej sytuacji, kiedy podwójne znakowanie dsDNA wynosi 100%, cięcie DNA powinno podwoić stężenie fluoroscencyjnych DNA. W takim przypadku amplituda krzywych autokorelacyjnych FCS powinna zmniejszyć się o 50%. W praktyce jednak w wyniku niedokładnego znakowania, niektóre cząsteczki dsDNA są znakowane tylko jednym próbnikiem. Cięcie takiego DNA nie powoduje wzrostu liczby fluoroscencyjnych DNA. To z kolei odbija się na amplitudzie krzywych autokorelacyjnych FCS, które zmniejszają się po cięciu o mniej niż 50%. Takie obniżenie amplitudy jest ściśle powiązane z wydajnością znakowania (PDL) i jest opisane równaniem 21, ^g2(0) ₌ x + l Λ ~ Pi\

6(0)_χ 3x + 1 \1 — p₂/ ^{1 }} gdzie G₂(0) i G₁(0) są amplitudami funkcji autokorelacyjnych FCS przed cięciem i po cięciu, p-t i p₂ są odpowiednimi frakcjami w stanie trypletowym, x wielkością PDL znakowanego dsDNA. W trakcie przeprowadzonego eksperymentu frakcje cząsteczek w stanie trypletowym nie ulegały zmianie i wydajność znakowania x wynosiła ~ 40%, Zgodnie z równaniem 21 przewidujemy, że amplituda krzywej autokorelacyjnej powinna zmniejszyć się do 64% wartości początkowej. Zmierzona wartość amplitudy w przeprowadzonym eksperymencie wyniosła 63% wartości początkowej (fig. 6b). Przeprowadzony eksperyment cięcia łańcucha DNA restrykcyjnym enzymem Hind III dodatkowo weryfikuje proponowaną w wynalazku procedurę pomiaru wydajności podwójnego znakowania cząsteczek DNA.

Przykłady zastosowania sposobu według wynalazku

Proponowana w wynalazku procedura wyznaczania PDL - wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dsDNA może być zastosowana w szeregu oznaczeń biochemicznych.

W biochemicznych pomiarach często wymagane jest przygotowanie próbek dsDNA o różnej wydajności znakowania. Takim przykładem jest analiza aktywności enzymu w czasie której, bada się szereg próbek dsDNA o różnej wydajności znakowania. Takie próbki przygotowywane są przez dodanie dodatkowej ilości nieznakowanego ssDNA do mieszaniny reakcyjnej podczas procesu wygrzewania i powolnego chłodzenia (Kettling et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95; 1416-1420). Znając wydajność znakowania PDL jednej próbki dsDNA (oznaczona jako x0), może być wyznaczona PDL kolejnych próbek dsDNA (PDL tych próbek oznaczone jako xc). Zgodnie z fig. 7 PDL x0 może być wrażona jako: x₀ = — a+b-ab ab

Natomiast x_c jako: x_c =--—. Znając x₀ można wyznaczyć x_c z:

a+b-ab/c x_c/x₀ ab _c_ a + b — ab/c ab a + b — ab (22) i po odpowiednich przekształceniach otrzymujemy zależność:

= —,-7 c/x₀ + c - 1 (23) gdzie stężenie próbki dsDNA jest c razy większe niż stężenie dsDNA w próbce wyjściowej o znanej wydajności znakowania x0.

Na fig. 7 przedstawiono schemat eksperymentalnej procedury przewidywania wydajności znakowania PDL na podstawie znajomości PDL w próbce wyjściowej x0. 1). Próbka dsDNA z wydajnością znakowania PDL x0 przygotowana poprzez wygrzewanie i powolne chłodzenie (annealing) takich samych ilości (N) ssDNA A i ssDNA B, 2). Druga próbka dsDNA z nieznaną wydajnością znakowania xc przygotowana przez dodanie dodatkowej ilości (N(1-c)) nieznakowanego ssDNA A i ssDNA B do znakowanego ssDNA A i ssDNA B podczas procesu wygrzewania i powolnego chłodzenia.

PL 223 116 B1

Sposób według wynalazku pozwala również na użycie przewidywanej wydajności znakowania do weryfikacji mierzonej wartości PDL. Schemat ideowy takiego pomiaru pokazany jest na fig. 8. W pierwszym etapie eksperymentu przygotowujemy dwie próbki DNA (próbkę 1 i 2) w celu zmierzenia wydajności podwójnego znakowania (PDL) próbki 1. Próbkę 2 przygotowujemy przez wygrzewanie i następnie powolne schładzanie znakowanego ssDNA o takim samym stężeniu jak w próbce 1, przy równoczesnym podwojeniu ogólnego stężenia ssDNA w stosunku do próbki 1 (dodana dodatkowa ilość nieznakowanego ssDNA, fig. 8). Znając, z pomiaru PDL próbki 1, oszacowujemy PDL próbki 2. Następnie przygotowujemy próbkę 3 w celu zmierzenia PDL próbki 2. Próbka 3 powstaje w trakcie wygrzewania i chłodzenia znakowanego ssDNA o takim samym stężeniu, przy równoczesnym podwojeniu ogólnego stężenia ssDNA w porównaniu do próbki 2 (fig. 8). Porównanie, zmierzonego i oszacowanego PDL próbki 2 pozwala na weryfikację proponowanej metody. W przeprowadzonym doświadczeniu zmierzona wartość PDL dla próbki 2 wynosi 17,7±1,9%, a oszacowana 15,6±1,0%. Obie wartości są w zakresie ~16%, ta dobra zgodność potwierdza, że zmierzona wartość PDL jest poprawna.

Na fig. 8 pokazano weryfikację sposobu według wynalazku przez porównanie mierzonej i oszacowanej wydajności podwójnego znakowania PDL.

Przygotowujemy dsDNA (próbka 1). Następnie zwiększamy stężenie DNA dwukrotnie w próbce 2 czterokrotnie w próbce 3 przez dodanie nieznakowanego ssDNA, jednocześnie utrzymując stężenie znakowanego DNA na poziomie próbki 1. PDL próbki 2 jest przewidywane z zmierzonej wartości próbki 1. PDL próbki 2 może być zmierzone z zastosowaniem proponowanej metody z danych próbki i 3.

Porównanie przewidywanej i zmierzonej wartości PDL może być użyte do sprawdzenia otrzymanych wyników.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dwuniciowego DNA barwnikiem fluorescencyjnym, w ilościowej analizie biochemicznej, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) przygotowuje się próbkę 1 poprzez wygrzewanie, a następnie powolne chłodzenie mieszaniny dwóch komplementarnych jednoniciowych DNA: znakowanego ssDNA A i znakowanego ssDNA B, barwnikiem fluorescencyjnym, oraz

b) przygotowuje się próbkę 2 poprzez wygrzewanie, a następnie chłodzenie mieszaniny złożonej z nieznakowanego jednoniciowego ssDNA A i nieznakowanego jednoniciowego ssDNA B, oraz znakowanego jednoniciowego ssDNA A i znakowanego jednoniciowego ssDNA B barwnikiem fluorescencyjnym, przy czym w obu próbkach 1 i 2 stężenie i ilość wszystkich stosowanych składników są takie same; potem

c) dokonuje się pomiaru intensywności fluorescencji oddzielnie dla powyższych próbek 1 i 2 z zastosowaniem spektroskopii korelacji fluorescencji na mikroskopie fluorescencyjnym, w wyniku tego pomiaru uzyskuje się krzywe funkcji autokorelacyjnych G(t), gdzie τ oznacza czas przebywania cząstki w ognisku konfokalnym, z których to krzywych odczytuje się parametry stanowiące wartości G₁(0), G₂(0) funkcji autokorelacyjnych dla każdej z próbek w punkcie τ = 0, a także wartości frakcji stanów trypletowych p1 i p2, po czym

d) wylicza się wartości GA(0) i GB(0) wyrażone poniższymi wzorami:

G_a(0) = G,(0)(1 -pi) G_s(0) = G₂(0)(1 -p₂) oraz

e) następnie wyznacza się wydajność x podwójnego znakowania dwuniciowego DNA, na podstawie uzyskanych z pomiaru w etapie c) i wyliczonych w etapie d) wartości ze wzoru:

r — 1 gdzie r = G_a(0)/G_b(0) oraz wartość r spełnia nierówności 1< r < 4/3, uzyskując wartość x, będącą ułamkiem właściwym określającym wydajność podwójnego znakowania dwuniciowego DNA,

PL 223 116 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dwie komplementarne nici DNA zawierające do 200 nukleotydów, korzystnie 66 nukleotydów.
3. Zastosowanie sposobu wyznaczania wydajności podwójnego znakowania dwuniciowego DNA barwnikiem fluorescencyjnym jak określono w zastrz. 1 albo 2 w ilościowej analizie biochemicznej, zwłaszcza w analizie aktywności enzymu, oraz do weryfikacji zmierzonej wartości wydajności podwójnego znakowania DNA, jak również w badaniach cięcia łańcucha DNA.