PL219576B1

PL219576B1 - Sposób wytwarzania termowrażliwego hydrożelu chitozanowego zawierającego wapń i fosfor

Info

Publication number: PL219576B1
Application number: PL393007A
Authority: PL
Inventors: Zofia Modrzejewska; Roman Zarzycki; Agata Skwarczyńska
Original assignee: Politechnika Łódzka
Priority date: 2010-11-22
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2015-05-29
Also published as: PL393007A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania termowrażliwego hydrożelu chitozanowego zawierającego wapń i fosfor w stosunku atomowym zbliżonym do tego W jakim występują w naturalnym hydroksyapatycie, przeznaczonego zwłaszcza na materiał na rusztowania (skaffoldy) do hodowli komórkowej.

Znany jest sposób wytwarzania termowrażliwych żeli chitozanowych z soli chitozanowych, głównie chlorku chitozanu, przy użyciu soli disodowej β-glicerofosforanu jako substancji neutralizującej i umożliwiającej wzrost oddziaływań międzycząsteczkowych i tworzenie struktury sieciowej 3D. Żele te formuje się pod wpływem fizjologicznej temperatury ciała ludzkiego tj. w temperaturze około 37-40°.

Z czasopism Journal of Materials Science; Materials in Medicine, 15, 3, 2004, 255 - 260, European Polymer Journal, 42, 12, 2006, 3171-3179, Acta Biomaterialia, 5, 4, 2009, 1182-1197, Materials Science & Engineering C, 28, 3, 2008, 434-437 oraz Materials Letters 62, 19, 2008, 3376-3378 jest znany sposób wytwarzania wysokoporowatych kompozytów chitozanowo-hydroksyapatytowych, polegający na wprowadzeniu mikro- bądź nanogranulek hydroksyapatytowych do soli chitozanowej, a następnie uzyskaniu struktury 3D metodą separacji faz bądź wymrożenia i suszenia liofilizacyjnego lub następczo obydwu procesów.

Znany jest także, z czasopism Advances in Tissue Engineering, 1,2009, Journal of Membrane Science, 273,2006,124-126 oraz Acta Biomaterialia Volume 2, Issue I, January, 2006, pp.75-84, sposób wytwarzania hydrożelowego skaffoldu chitozanowego zawierającego hydroksyapatyt, w drodze wymiany jonowej. Skaffold chitozanowy umieszcza się w komorze między dwiema membranami, kationo- i anionowymienną.

W komorze, od strony anody i membrany kationowymiennej znajduje się roztwór azotanu (V) wapnia (Ca(NO3)2), natomiast od strony membrany anionowymiennej i katody roztwór dwuwodorofosforanu V sodu (NaH2PO4). Pod wpływem przyłożonego napięcia następuje wymiana jonowa i w strukturze skaffoldu wytrąca się hydroksyapatyt. Aby umożliwić ruch jonów skaffold nasącza się roztworem chlorku sodu, który jednocześnie służy jako środek porotwórczy.

Znane jest także umieszczanie hydroksyapatytu w strukturze żelowej membrany chitozanowej przy wykorzystaniu transportu jonów na drodze dyfuzji. Membranę chitozanową umieszcza się między membraną kationo- i anionowymienną, jako roztwory zawierające jony fosforanowe i jony wapnia wykorzystuje się roztwór dwuwodorofosforanu V sodu (NaH2PO4) i chlorku wapnia CaCl2.

Znane jest również wytwarzanie skaffoldów chitozanowych w postaci hydrożelu lub W formie zliofilizowanej, zawierających hydroksyapatyt w którym hydroksyapatyt tworzy się w trakcie formowania skaffoldu. W sposobie tym kwas fosforowy (H3PO4) dodaje się do roztworu soli chitozanowej (octanu chitozanu), a następnie wprowadza do suspensji wodorotlenku wapnia (Ca(OH)2). Sposób ten jest opisany w czasopiśmie BioMedical Materials and Engineering, 19, 2-3, 2009.

Skaffold chitozanowy w postaci hydrożelu lub w formie zliofilizowanej, zawierający W strukturze hydroksyapatyt uzyskuje się również wprowadzając do roztworu soli chitozanowej azotan wapnia [Ca(NO3)2] i wodorofosforan V amonu [(ΝΗ4)2Η PO4], azotan wapnia i kwas fosforowy (H3PO4) bądź dwuwodorofosforan potasu (KH2PO4), po czym roztwór wymraża się, liofilizuje, w niektórych przypadkach neutralizuje w Na- OH, oraz poddaje końcowemu odmyciu (czasopisma European Polymer Journal 42, 2006, 3171-3179, Biomaterials, Volume 25, Issue 5, February 2004, 779-785 i Carbohydrate Polymers Volume, 80, issue 3, May 5, 2010, 860-865.

Sposób wytwarzania termowrażliwego hydrożelu chitozanowego zawierającego wapń i fosfor w stosunku atomowym zbliżonym do tego w jakim występują w naturalnym hydroksyapatycie, z soli chitozanowych, przy użyciu glicerofosforanu, według wynalazku polega na tym, że sporządza się roztwór wodny soli chitozanu z chitozanu o stopniu deacetylacji powyżej 70%, roztwór ten schładza się do temperatury korzystnie poniżej 10°C, łączy w trakcie intensywnego mieszania z roztworem wodnym α-, β- lub α,β-glicerofosforanu, także schłodzonym do temperatury korzystnie poniżej 10°C, następnie odpowietrza w czasie do 24 godzin utrzymując temperaturę poniżej 10°C i wytworzony w ten sposób żel odmywa się w wodzie lub buforze o pH powyżej 6, o temperaturze korzystnie powyżej 30°C, przy czym schłodzony roztwór soli chitozanu, W trakcie intensywnego mieszania, łączy się także z roztworem wodnym soli wapnia schłodzonym do temperatury korzystnie poniżej 10°C, bądź żel wytworzony z soli chitozanu i α-, β- lub α,β-glicerofosforanu, po odmyciu w wodzie lub buforze, umieszcza się w roztworze wodnym soli wapnia na czas umożliwiający dyfuzję jonów wapnia do całej struktury żelu, po czym odmywa buforem o pH powyżej 6. Roztwory soli chitozanu, soli wapnia i glicerofosforanu łączy

PL 219 576 B1 się w naczyniu umożliwiającym nadanie powstającemu żelowi oczekiwanego kształtu. Jako sól chitozanu stosuje się chlorek, octan, mleczan, glutaminian lub mrówczan chitozanu. Stosuje się roztwór wodny chlorku, azotanu lub fosforanu wapnia. Stosuje się roztwór wodny soli wapnia i roztwór wodny glicerofosforanu zawierające takie ilości soli wapnia i glicerofosforanu, aby stosunek ilości wapnia do ilości fosforu w nich zawartych był równy powyżej 1.

Żele wytworzone według wynalazku spełniają wszystkie wymagania jakie stawia się rusztowaniom z przeznaczeniem na wszczep tj. nietoksycznością, biozgodnością, bioresorbowalnością, nietoksycznymi i łatwo usuwalnymi produktami rozkładu, stopniem porowatości powyżej 90% i odpowiednimi własnościami mechanicznymi, nadto nie powodują reakcji alergicznych, kancerogenezy, są nieaktywne immunologicznie i możliwa jest ich sterylizacja. Nadto stanowią środowisko sprzyjające do namnażania komórek.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d I.

g chitozanu o masie cząsteczkowej 380 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono się w 18 ml 0,1 M roztworu wodnego kwasu solnego, po czym schłodzono w temperaturze 10°C. Jednocześnie sporządzono roztwór 4 g β-glicerofosforanu w 2 ml redestylowanej wody, który także schłodzono w temperaturze 10°C. Następnie obydwa roztwory połączono przy intensywnym mieszaniu w naczyniu, umożliwiającym uzyskanie kształtu walca i odpowietrzano w ciągu 24 h w temperaturze

10°C. Wytworzony żel, W postaci walca o promieniu 17 mm i wysokości 30 mm, odmyto w wodzie ₃ o temperaturze 37°C, umieszczono w roztworze wodnym chlorku wapnia o stężeniu 80 g/dm³ na czas h, po czym odmyto buforem o pH =7.

Otrzymany żel zawierał około 4% wapnia, zaś stosunek ilości wapnia do fosforu był w nim równy 1.

P r z y k ł a d II.

2.5 g chitozanu o masie cząsteczkowej 5 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 18 ml 0,12 M roztworu wodnego kwasu mlekowego i schłodzono w temperaturze 6°C. Jednocześnie sporządzono roztwór 3 g α-glicerofosforanu w 2 ml redestylowanej wody, który także schodzono w temperaturze 6°C. Następnie obydwa roztwory połączono przy intensywnym mieszaniu, wylano na powierzchnię płaskiej kuwety i odpowietrzano w ciągu 24 h w temperaturze 6°C. Wytworzony żel, w postaci płaskiej membrany, odmyto w buforze o pH=6 i temperaturze 37°C, umieszczono w roztworze ₃ azotanu wapnia o stężeniu 50 g/dm³ na czas 24 h, po czym odmyto buforem o pH =7. Wytworzony żel zawierał około 10% wagowych wapnia i stosunek ilości wapnia do fosforu był w nim równy 1.

P r z y k ł a d III.

1.5 g chitozanu o masie cząsteczkowej 150 kDa i stopniu deacetylacji 95% rozpuszczono w 18 ml 0,15 M roztworu wodnego kwasu solnego i schłodzono w temperaturze 6°C. Jednocześnie sporządzono roztwór 3 g α,β-glicerofosforanu w 2,5 ml redestylowanej wody i schłodzono go w temperaturze 6°C. Obydwa roztwory połączono przy intensywnym mieszaniu w naczyniu umożliwiającym uzyskanie kształtu walca, po czym odpowietrzono w ciągu 24 h w temperaturze 6°C. Wytworzony żel, w postaci walca, odmyto w wodzie o temperaturze 37°C, umieszczono w roztworze chlorku wapnia ₃ o stężeniu 80 g/dm³ na czas 1 h i w końcu odmyto buforem o pH =7. Wytworzony żel zawierał około 7% wagowych wapnia i stosunek ilości wapnia do fosforu był w nim równy 1.

P r z y k ł a d IV.

g chitozanu o masie cząsteczkowej 5 kDa i stopniu deacetylacji 83% rozpuszczono w 16 ml

0,12 M roztworu wodnego kwasu mlekowego, schłodzono w temperaturze 6°C i dodano 5 ml roztworu ₃ wodnego chlorku wapnia o stężeniu 5 g/dm . Jednocześnie sporządzono roztwór 2 g β-glicerofosforanu w 2 ml redestylowanej wody, który także schłodzono w temperaturze 6°C, po czym połączono roztwory przy intensywnym mieszaniu, wylano na płaską kuwetę i odpowietrzono w ciągu 24 h w temperaturze 6°C.

Wytworzony żel, w postaci płaskiej membrany, odmyto w wodzie o temperaturze 37°C.

Wytworzony żel zawierał około 5% wagowych wapnia i stosunek ilości wapnia do fosforu był w nim równy 1,6.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania termowrażliwego hydrożelu chitozanowego zawierającego wapń i fosfor w stosunku atomowym zbliżonym do tego w jakim występują w naturalnym hydroksyapatycie, z soli

PL 219 576 B1 chitozanowych, przy użyciu glicerofosforanu, znamienny tym, że sporządza się roztwór wodny soli chitozanu z chitozanu o stopniu deacetylacji powyżej 70%, roztwór ten schładza się do temperatury korzystnie poniżej 10°C, łączy w trakcie intensywnego mieszania, z roztworem wodnym α-, β- lub α,β-glicerofosforanu, także schłodzonym do temperatury korzystnie poniżej 10°C, następnie odpowietrza w czasie do 24 godzin utrzymując temperaturę poniżej 10°C i wytworzony w ten sposób żel odmywa się w wodzie lub buforze o pH powyżej 6, o temperaturze korzystnie powyżej 30°C, przy czym schłodzony roztwór soli chitozanu, w trakcie intensywnego mieszania, łączy się także z roztworem wodnym soli wapnia schłodzonym do temperatury korzystnie poniżej 10°C, bądź żel wytworzony z soli chitozanu i α-, β- lub α,β-glicerofosforanu, po odmyciu w wodzie lub buforze, umieszcza się w roztworze wodnym soli wapnia na czas umożliwiający dyfuzję jonów wapnia do całej struktury żelu, po czym odmywa buforem o pH powyżej 6.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sól chitozanu stosuje się chlorek, octan, mleczan, glutaminian lub mrówczan chitozanu.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór wodny chlorku, azotanu łub fosforanu wapnia.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór wodny soli wapnia i roztwór wodny glicerofosforanu zawierające takie ilości soli wapnia i glicerofosforanu, aby stosunek ilości wapnia do ilości fosforu w nich zawartych był równy powyżej 1.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwory soli chitozanu, soli wapnia i glicerofosforanu łączy się w naczyniu umożliwiającym nadanie powstającemu żelowi oczekiwanego kształtu.