PL217339B1

PL217339B1 - Sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu

Info

Publication number: PL217339B1
Application number: PL395967A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Struszczyk-Świta; Łukasz Stańczyk; Mirosława Szczęsna-Antczak; Tadeusz Antczak; Stanisław Bielecki
Original assignee: Politechnika Łódzka
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2014-07-31
Also published as: PL395967A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu.

Z czasopisma Biotechnologia 2 (57), 193-206, (2002) jest znany sposób otrzymywania wewnątrzkomórkowego biokatalizatora, pochodzącego z pleśni Absidia orchidis, stosowanego w postaci rozpuszczonej w procesie hydrolizy chitozanu.

Z czasopisma Food Research International 38, 315-322, (2005) znany jest sposób otrzymywania zewnątrzkomórkowych biokatalizatorów pochodzących z pleśni Aspergillus CJ22, stosowanych w procesie hydrolizy chitozanu.

Z czasopisma FEMS Microbiology Letters vol. 95, 187-194, (1992) jest znany sposób otrzymywania dwóch wewnątrzkomórkowych biokatalizatorów (o aktywności endochitozanolitycznej), pochodzących z pleśni Mucor rouxii, stosowanych w postaci roztworu w procesie hydrolizy chitozanu i jego pochodnych.

Z opisu zgłoszenia patentowego P 385093 jest znany sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu, w drodze hodowli pleśni z rodzaju Mucor, polegający na tym, że szczepy pleśni Mucor circinelloides CH81 lub Mucor racemosus CH52, po inkubacji na wysterylizowanym i wychłodzonym podłożu stałym zawierającym chitozan lub chitooligosacharydy, agar, brzeczkę piwowarską o stężeniu 8-9°Be, hoduje się w temperaturze 29-31°C, w czasie 3-5 dni i zawiesinę zarodników zmytych z tego podłoża szczepi się wysterylizowane podłoże inokulacyjne i prowadzi hodowlę wstrząsaną w temperaturze 28-31°C, w czasie 18-26 godzin. Otrzymywanym w wyniku tej hodowli inokulum zaszczepia się, wysterylizowane i wstępnie napowietrzone podłoże hodowlane o składzie analogicznym jak podłoże w hodowli inokulum i prowadzi hodowlę produkcyjną w warunkach wgłębnych, w temperaturze 29-31°C, w czasie 42-72 godzin w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, w trakcie mieszania, doprowadzając powietrze, otrzymaną w wyniku hodowli produkcyjnej biomasę, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej, przemywa się acetonem i otrzymany nierozpuszczalny preparat enzymatyczny suszy się na powietrzu. Hodowlę inokulum i hodowlę produkcyjną prowadzi się na podłożu zawierającym oliwę z oliwek lub olej, namok kukurydziany, chitynę, N-acetyloglukozaminę lub chitozan oraz wodę destylowaną lub na podłożu zawierającym oliwę z oliwek lub olej, namok kukurydziany oraz wodę destylowaną względnie na podłożu zawierającym glukozę, bactopeptonu, ekstrakt drożdżowy, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4 x 7H2O, NaCl, CaCl2 oraz wodę destylowaną.

W kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej znajduje się, szczep Mucor circinelloides oznaczony symbolem CH81, wyodrębniony z pancerzy krewetek.

Sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu, w drodze hodowli pleśni Mucor circinelloides, polegający na hodowli zarodników pleśni na wysterylizowanym, stałym podłożu zawierającym agar i brzeczkę piwowarską o stężeniu 8°Be w temperaturze 30°C w czasie 4-6 dni, następnie zmyciu wyhodowanych zarodników sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem surfaktanta, zaszczepieniu zawiesiną zarodników wysterylizowanego, ciekłego podłoża aktywującego zawierającego oliwę z oliwek lub olej, korzystnie sojowy, słonecznikowy lub uniwersalny, chitynę, namok kukurydziany i wodę, o wyjściowym pH 4,6-5,0 i prowadzeniu w tym podłożu hodowli wstrząsanej inokulum w temperaturze 28-31°C w czasie 18 godzin przy stopniu napeł-1 nienia kolb 20% i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1, następnie zaszczepieniu otrzymanym inokulum wysterylizowanego i wstępnie napowietrzonego sterylnym powietrzem, ciekłego podłoża produkcyjnego zawierającego oliwę z oliwek lub olej, korzystnie sojowy, słonecznikowy lub uniwersalny, namok kukurydziany i wodę i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w temperaturze 28-31°C w czasie 72 godzin w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, w trakcie mieszania i napowietrzania sterylnym powietrzem doprowadzanym w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, oddzieleniu otrzymanego preparatu od cieczy pohodowlanej, odmyciu od rozpuszczalnych produktów metabolizmu oraz suszeniu, według wynalazku polega na tym, że preparaty otrzymuje się w drodze hodowli selektanta pleśni Mucor circinelloides CH81/3SC, którego zarodniki hoduje się na podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 20-30 części, brzeczki piwowarskiej 1000 części, a nadto 0,5-1 części koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek. Hodowlę inokulum selektanta prowadzi się w podłożu ciekłym zawierającym w częściach wagowych: oliwy z oliwek lub oleju 10-50 części, namoku kukurydzianego 30-73 części, koloidalnej chityny 0,2-1 części oraz 1000 części wody wodociągowej o barwie większej niż 5 mg Pt (PN-EN ISO 7887 : 2002),

PL 217 339 B1 mętności nie większej niż 0,4 NTU (PN-EN ISO 7027 : 2003), przewodności nie większej niż

500 ąS/cm (PN-EN-27888 : 1999), pH w zakresie 7,1-7,4 (PN-90/C 04540.01), ChZT nie większym niż 1,75 (PN-ISO 15705 : 2005 PB-22.00 : 2009), twardości nie większej niż 15°n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l (PB-03.00 : 2008) i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l (PN-ISO 6332 : 2001).

Hodowlę produkcyjną selektanta prowadzi się na podłożu ciekłym zawierającym w częściach wagowych: oliwy z oliwek lub oleju 10-50 części, namoku kukurydzianego 30-73 części oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak podano wyżej, zaszczepionym inokulum użytym w ilości

10% objętościowych stosunku do objętości podłoża, przy mieszaniu zawartości fermentora z szybko-1 ścią obrotową 120 min^-1 za pomocą mieszadła, do którego przymocowuje się rozłącznie porowaty nośnik hodowanego selektanta, w postaci prostopadłościennych płatów pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej (tak zwanej pianki retykulowanej, uzyskiwanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, numer klasyfikacyjny TM23280), o wymiarach 250 x ₃

120 x 10 mm, charakteryzującej się gęstością 19-22 kg/m³, wytrzymałością na rozciąganie 70 kPa i średnicą porów 2,20-3,40 mm. Otrzymane w wyniku hodowli płaty pianki z przerośniętą biomasą selektanta Mucor circinelloides CH81/3SC oddziela się od cieczy pohodowlanej, przemywa wodą destylowaną w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu, odwadnia acetonem schłodzonym do temperatury 4°C, ekstrahuje eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej lub przemywa wodą destylowaną, zamraża do temperatury -45°C, liofilizuje, przemywa acetonem, eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej. Przemycie wodą monitoruje się pomiarem absorbancji A<0,05 dla długości fali λ=280 nm, odwodnienie acetonem prowadzi 3-krotnie stosując 15 części wagowych acetonu na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą w czasie 10 minut, w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 min^-1, zaś suszenie prowadzi się na powietrzu w czasie w czasie 12 godzin.

Selektant pleśni Mucor circinelloides CH81/3SC otrzymuje się ze szczepu pleśni Mucor circinelloides CH81, który poddaje się aktywacji na wysterylizowanym podłożu stałym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be, w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin, po czym wyrosle kolonie poddaje się selekcji w drodze hodowli wstrząsanej na wysterylizowanym podłożu ciekłym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części handlowej chityny, 10-50 części oliwy z oliwek lub oleju, korzystnie sojowego, słonecznikowego lub uniwersalnego, 30-73 części namoku kukurydzianego, 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak podano wyżej, o wyjściowym pH = 4,6-5,0 w temperaturze 29-31°C w czasie 24 godzin przy stopniu napełnienia kolb 20% objętościowych i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1, przy czym procedurę aktywowania i selekcji pleśni Mucor circinelloides powtarza się 3-krotnie. Otrzymany selektant przechowuje się na podłożu stałym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części koloidalnej chityny, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be, w temperaturze 4°C.

Sposób według wynalazku zezwala na otrzymanie aktywnych i stabilnych preparatów enzymów hydrolizujących chitozan, z nowego selektanta Mucor circinelloides CH81/3SC, którego aktywność w reakcji hydrolizy chitozanu jest większa o 25% w porównaniu z aktywnością wyjściowego szczepu Mucor circinelloides CH81. Wytworzone sposobem według wynalazku preparaty lipaz osadzonych na porowatej piance poliuretanowej są elastyczne i trwałe. Można je przycinać do potrzebnych wymiarów, co umożliwia efektywne wypełnienie przestrzeni reaktora przeznaczonego do reakcji hydrolizy chitozanu.

Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady.

P r z y k ł a d I

Szczep pleśni Mucor circinelloides CH81, wyodrębniony z pancerzy krewetek, przeszczepiono na aktywujące podłoże stałe, wysterylizowane w temperaturze 121°C w czasie 15 minut, o składzie w częściach wagowych: 1 część koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be i hodowano na tym podłożu w temperaturze 30°C w czasie 72 godzin. Wyrosłe kolonie przenoszono za pomocą ezy na aktywujące podłoże ciekłe, wysterylizowane w temperaturze 121°C w czasie 20 minut, o składzie w częściach wagowych: 0,5 części chityny handlowej, 27 części oliwy z oliwek lub oleju, korzystnie sojowego, słonecznikowego, uniwersalnego, 37 części namoku kukurydzianego firmy Roquette, 1000 części wody wodociągowej o barwie nie większej niż 5 mg Pt, mętności nie większej niż 0,4 NTU, przewodności nie większej niż 500 μS/cm, pH w zakresie 7,1-7,4, ChZT nie większym niż 1,75, twardości nie większej niż 15°n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l, o wyjściowym pH =

PL 217 339 B1

4,6 i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze 29-31°C przez 24 godziny przy stopniu napeł-1 nienia kolb 20% objętościowych i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1. Procedurę hodowli pleśni na obu podłożach, stałym i ciekłym, powtarzano 3-krotnie.

Otrzymany w ten sposób selektant Mucor circinelloides oznaczony numerem CH81/3SC, wysiano na wysterylizowane termicznie, w czasie 15 minut w temperaturze 121°C, podłoże stałe o składzie w częściach wagowych: 0,5 części koloidalnej chityny, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be i po 3 dniach hodowli w temperaturze 29-31°C zarodniki selektanta _® zmywano sterylną solą fizjologiczną zawierającą 0,01% Tritonu^® Χ-100 stosując 8 ml soli fizjologicznej ma 1 skos. Otrzymaną zawiesiną zarodników szczepiono wysterylizowane, w czasie 30 minut w temperaturze 121°C, podłoże hodowlane o składzie w częściach wagowych: 0,5 części handlowej chityny, 27 części oliwy z oliwek, 37 części namoku kukurydzianego oraz 1000 części wody wodocią33 gowej o właściwościach jak podano wyżej, stosując 1 cm³ zarodników na 100 cm³ podłoża i prowadzono hodowlę wstrząsaną w temperaturze 28-31°C, w czasie 18 godzin, przy stopniu napełnienia kolb 20% objętościowych i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1. Otrzymanym w wyniku tej hodowli inokulum zaszczepiono uprzednio wysterylizowane, w czasie 30 minut w temperaturze 121°C. podłoże o objętości 18 litrów wprowadzone do fermentora o objętości całkowitej 24 l, wstępnie napowietrzone sterylnym powietrzem, o składzie analogicznym jak w hodowli inokulum, ale bez dodatku chityny, stosując 10% objętościowych inokulum w stosunku do objętości podłoża. Do mieszadła umieszczonego w fermentorze zamocowano w powtarzalny sposób prostopadłościenne płaty pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej (tak zwanej pianki retykulowanej, uzyskanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, numer klasyfikacyjny TM ₃

23280) charakteryzującej się następującymi parametrami fizykochemicznymi: gęstością 19-22 kg/m³, wytrzymałością na rozciąganie 70 kPa i średnicą porów 2,20-3,40 mm, o wymiarach: 250 x 120 x 10 mm (wysokość/szerokość/grubość). Hodowlę prowadzono w temperaturze 28-31°C w czasie 72 godzin, w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, przy mieszaniu z szybkością obrotową -1

120 min^-1, doprowadzając powietrze w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty. Otrzymane w wyniku hodowli produkcyjnej płaty pianki poliuretanowej, przerośnięte biomasą Mucor circinelloides CH81/3SC, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej na drodze filtracji, przemywano wodą w celu odmycia rozpuszczalnych produktów metabolizmu monitorowanego pomiarem absorbancji A<0,05 dla długości fali λ=280 nm, zalewano kolejno 3 porcjami acetonu schłodzonego do temperatury 4°C, stosowanym w ilości 15 części wagowych na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą i odwadniano 10 minut w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybko-1 ści obrotowej 120 min^-1. Odwodnioną i odlipidowaną biomasę, zaadsorbowaną w porach pianki poliuretanowej, suszono na powietrzu w czasie 18 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów w ilości 22,3 g z 1 I podłoża, o aktywności endochitozanazy równej 432,5 unit/g oraz aktywności egzochitozanazy równej 0,118 U/g preparatu.

P r z y k ł a d II

Selektant Mucor circinelloides oznaczony numerem CH81/3SC otrzymano postępując jak w przykładzie I, ale stosując aktywujące podłoże stałe zawierające 0,005 części chityny koloidalnej i ciekłe podłoże aktywujące zawierające 1 część chityny handlowej. Dalej postępowano jak w przykładzie I.

Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów w ilości 21,4 g z 1 I podłoża, o aktywności endochitozanazy równej 415 unit/g oraz aktywności egzochitozanazy równej 0,125 U/g preparatu.

P r z y k ł a d III

Selektant Mucor circinelloides oznaczony numerem CH81/3SC otrzymano postępując jak w przykładzie I. Hodowlę wytworzonego selektanta prowadzono w fermentorze jak w przykładzie I. Otrzymane w wyniku hodowli produkcyjnej płaty pianki poliuretanowej przerośnięte biomasą Mucor circinelloides CH81/3SC, po oddzieleniu od cieczy pohodowlanej na drodze filtracji, przemywano wodą jak w przykładzie I, zamrożono do temperatury -45°C i poddano liofilizacji, produkt liofilizacji zalewano kolejno 3 porcjami acetonu schłodzonego do temperatury 4°C stosując 15 części wagowych acetonu na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą i ekstrahowano przez 10 minut w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 min^-1, następnie przemywano eterem naftowym i suszono na powietrzu w czasie 12 godzin w temperaturze pokojowej.

Otrzymano nierozpuszczalny preparat enzymów w ilości 20,6 g z 1 litra podłoża, o aktywności endochitozanazy równej 418,1 unit/g oraz aktywności egzochitozanazy równej 0,127 U/g preparatu.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania nierozpuszczalnych preparatów enzymów katalizujących hydrolizę chitozanu, w drodze hodowli pleśni Mucor circinelloides, polegający na hodowli zarodników pleśni na wysterylizowanym, stałym podłożu zawierającym agar i brzeczkę piwowarską o stężeniu 8°Be, w temperaturze 30°C w czasie 4-6 dni, następnie zmyciu wyhodowanych zarodników sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem surfaktanta, zaszczepieniu zawiesiną zarodników wysterylizowanego, ciekłego podłoża aktywującego zawierającego oliwę z oliwek lub olej, korzystnie sojowy, słonecznikowy lub uniwersalny, chitynę, namok kukurydziany i wodę, o wyjściowym pH 4,6-5,0 i prowadzeniu w tym podłożu hodowli wstrząsanej inokulum w temperaturze 28-31°C w czasie 18 godzin przy stopniu napeł-1 nienia kolb 20% i szybkości obrotowej wstrząsarki 180 min^-1, następnie zaszczepieniu otrzymanym inokulum wysterylizowanego i wstępnie napowietrzonego sterylnym powietrzem, ciekłego podłoża produkcyjnego zawierającego oliwę z oliwek lub olej, korzystnie sojowy, słonecznikowy lub uniwersalny, namok kukurydziany i wodę i prowadzeniu hodowli produkcyjnej w temperaturze 28-31°C w czasie 72 godzin, w obecności środków przeciwdziałających pienieniu, w trakcie mieszania i napowietrzania sterylnym powietrzem doprowadzanym w ilości 1 część objętościowa na 1 część objętościową podłoża w czasie 1 minuty, oddzieleniu otrzymanego preparatu od cieczy pohodowlanej, odmyciu od rozpuszczalnych produktów metabolizmu oraz suszeniu, znamienny tym, że preparaty otrzymuje się w drodze hodowli selektanta pleśni Mucor circinelloides CH81/3SC, którego zarodniki hoduje się na podłożu stałym zawierającym w częściach wagowych: agaru 20-30 części, brzeczki piwowarskiej 1000 części, a nadto 0,5-1 części koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek, hodowlę inokulum prowadzi się w podłożu ciekłym zawierającym w częściach wagowych: oliwy z oliwek lub oleju 10-50 części, namoku kukurydzianego 30-73 części, koloidalnej chityny 0,2-1 części oraz 1000 części wody wodociągowej o barwie większej niż 5 mg Pt, mętności nie większej niż 0,4 NTU, przewodności nie większej niż 500 μS/cm, pH w zakresie 7,1-7,4, ChZT nie większym niż 1,75, twardości nie większej niż 15°n, o zawartości azotanów nie większej niż 4 mg/l i żelaza nie większej niż 0,2 mg/l, hodowlę produkcyjną selektanta prowadzi się na podłożu ciekłym zawierającym w częściach wagowych: oliwy z oliwek lub oleju 10-50 części, namoku kukurydzianego 30-73 części oraz 1000 części wody wodociągowej o właściwościach jak podano wyżej, zaszczepionym inokulum użytym w ilości 10% objętościowych stosunku do objętości podłoża, przy mieszaniu zawartości fermentom z szybkością obrotową

120 min^-1 za pomocą mieszadła, do którego przymocowuje się rozłącznie porowaty nośnik wyhodowanego selektanta, w postaci prostopadłościennych płatów pianki poliuretanowej, zaś otrzymane w wyniku hodowli płaty pianki z przerośniętą biomasą selektanta Mucor circinelloides CH81/3SC oddziela się od cieczy pohodowlanej, przemywa wodą destylowaną, odwadnia acetonem schłodzonym do temperatury 4°C, ekstrahuje eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej lub przemywa wodą destylowaną, zamraża do temperatury -45°C, liofilizuje, przemywa acetonem, eterem naftowym i suszy w temperaturze pokojowej.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że selektant pleśni Mucor circinelloides CH81/3SC otrzymuje się ze szczepu pleśni Mucor circinelloides CH81, który poddaje się aktywacji na wysterylizowanym podłożu stałym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części koloidalnej chityny pochodzącej z pancerzy krewetek, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be w temperaturze 30°C w czasie 72 godz., a następnie kolonie wyrosłe na podłożu stałym poddaje się selekcji w drodze hodowli wstrząsanej na wysterylizowanym podłożu ciekłym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części chityny handlowej, 10-50 części oliwy z oliwek lub oleju, korzystnie sojowego, słonecznikowego lub uniwersalnego, 30-73 części namoku kukurydzianego, 1000 części wody wodociągowej o właściwościach określonych w zastrz. 1, o wyjściowym pH = 4,6-5,0 w temperaturze 29-31°C w czasie 24 godzin przy stopniu napełnienia kolb 20% objętościowych i szybkości obro-1 towej wstrząsarki 180 min^-1, przy czym procedurę aktywowania i selekcji pleśni Mucor circinelloides powtarza się 3-krotnie, a otrzymany selektant przechowuje się na podłożu stałym o składzie w częściach wagowych: 0,5-1 części koloidalnej chityny, 30 części agaru, 1000 części brzeczki piwowarskiej o stężeniu 8°Be, w temperaturze 4°C.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się płaty pianki poliuretanowej na bazie poliolu polieteru o całkowicie otwartej strukturze komórkowej - pianki retykulowanej uzyskiwanej w wyniku procesu termicznej retykulacji, o numerze klasy fikacyjnym TM23280, charakteryzującej się ₃ gęstością 19-22 kg/m³, wytrzymałością na rozciąganie 70 kPa i średnicą porów 2,20-3,40 mm, o wymiarach 250 x 120 x 10 mm.

PL 217 339 B1
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przemycie wodą płatów pianki z przerośniętą biomasą selektanta Mucor circinelloides CH81/3SC monitoruje się pomiarem absorbancji A<0,05 dla długości fali λ=280 nm, odwodnienie acetonem prowadzi 3-krotnie stosując 15 części wagowych acetonu na 1 część wagową pianki przerośniętej biomasą w czasie 10 minut w zakrytym naczyniu umieszczonym na wytrząsarce o szybkości obrotowej 120 min^-1, zaś suszenie prowadzi się na powietrzu w czasie w czasie 12 godzin.