PL217162B1

PL217162B1 - Sposób otrzymywania ektoiny

Info

Publication number: PL217162B1
Application number: PL395782A
Authority: PL
Inventors: Zofia Stępniewska; Agnieszka Kuźniar; Anna Pytlak
Original assignee: Katolicki Univ Lubelski Jana Pawła Ii
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2014-06-30
Also published as: PL395782A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ektoiny (kwas 1,4,5,6-tetrahydro-2-metylo-4-pirymidynokarboksylowy) przy udziale konsorcjum bakterii metanotroficznych (w tym: Methylosinus, Methylocaldum, Methylocystis, Methylomicrobium), zasiedlających odpadowe skały przywęglowe.

Ektoina jest aminokwasem działającym ochronnie na komórki, poddane czynnikom stresowym. Działanie ochronne ektoiny polega na zapobieganiu denaturacji białek, kwasów nukleinowych, biomembran i ochronie całych komórek przed stresem cieplnym, zamarzaniem, wysychaniem, promieniowaniem, działaniem mocznika i wysokiego zasolenia.

Istota stabilizującego działania ektoiny była badana w różnych procesach enzymatycznych w wysokiej temperaturze lub w obecności czynników denaturujących. Działanie ochronne ektoiny występuje niezależnie od źródła stresu oksydacyjnego (Knapp S, Ladenstein R, Galinski EA. Extrinsic protein stabilization by the naturally occurring osmolytes beta-hydroxyectoine and betaine. Extremophiles 1999;3:191-8).

Działanie ektoiny wpływa na trwałość struktury DNA, poprzez zwiększenie jego termostabilności (Lapidot A, Ben-Asher E, Eisenstein M. Tetrahydropyrimidine derivatives inhibit binding of a Tat-like, arginine-containing peptide, to HIV TAR RNA in vitro. FEBS Lett 1995;367:33-8, 1995).

Ektoina zachowuje aktywność białek chroniąc je przed proteolizą wywołaną przez trypsynę lub trypsynogeny (Kolp S, Pietsch M, Galinski EA, Gutschow M. Compatible solutes as protectants for zymogens against proteolysis. Biochim Biophys Acta 2006;1764:1234-42).

Wykazano, że ektoina jest bardzo efektywnym inhibitorem tworzenia amyloid, formowanych podczas rozwoju choroby Alzheimera (AD) i encefalopatii, obniżając zarówno fazę inicjacji jak i elongacji w badaniach, gdzie zastosowano jako model amyloid insuliny in vitro (Arora A, Ha C, Park CB. Inhibition of insulin amyloid formation by small stress molecules. FEBS Lett 2004;564:121-5). Ektoina ogranicza apoptozę poprzez zmniejszenie zgrupowania i zmianę rozkładu wewnątrzkomórkowego cytotoksyn (Furusho K, Yoshizawa T, Shoji S. Ectoine alters subcellular localization of inclusions and reduces apoptotic cell death induced by the truncated Machado-Joseph disease gene product with an expanded polyglutamine stretch. Neurobiol Dis 2005;20:170-8).

Ektoina efektywnie chroni śluz jelitowy i mięśniowy poprzez obniżenie poziomu ceramidów, jako mediatorów apoptozy i współtworzących stres oksydacyjny, prowadzący do uszkodzenia mitochondriów, wprowadzając ochronną barierę śluzu (Wei L, Wedeking A, Buttner R, Kalff JC, Tolba RH, van Echten-Deckert G. A natura tetrahydropyrimidine protects small bowel from cold ischemia and. Pathobiology 2009;76:212-20). Ektoina zwiększa imunoodporność na virusa (HIV) potwierdzaną w badaniach (Roy S, Delling U, Chen CH, Rosen CA, Sonenberg N. A bulge structure in HIV-1 TAR RNA is required for Tat binding and Tat-mediated. Genes Dev 1990;4:1365-73.; Dingwall C, Ernberg I, Gait MJ, Green SM, Heaphy S, Karn J, et al. Skinner MA.HIV-1 tat protein stimulates transcription by binding to a U-rich bulge in the stem of the TAR RNA structure. EMBO J 1990;9:4145-53) tak, że może być zalecana jako potencjalny czynnik antywirusowy (Lapidot A, Ben-Asher E, Eisenstein M. Tetrahydropyrimidine derivatives inhibit binding of a Tat-like, arginine-containing peptide, to HIV TAR RNA in vitro. FEBS Lett 1995;367:33-8).

Ze względu na fakt, że hydroksyektoinę charakteryzuje długi czas życia (czas połowicznego rozkładu 185 dni) może być stosowana jako wektor retrowirusowy w terapii genowej (Cruz PE, Silva AC, Roldao A, Carmo M, Carrondo MJT, Alves PM. Screening of novel excipients for improving the stability of retroviral and adenoviral vectors. Biotechnol Prog 2006;22:568-76).

Ektoina posiada nie tylko zdolność do stabilizacji białek i innych makromolekuł, lecz również jest w stanie chronić całe komórki, np. dodana do podłoża wstrzymuje inhibicję wzrostu E coli; zaistniałą w wyniku stresu temperaturowego i osmotycznego (Malin G, Lapidot A. Induction of synthesis of tetrahydropyrimidine derivatives in Streptomyces. J Bacteriol 1996;178:385-95). Ektoina służy również jako specyficzny osmoprotektant bakterii kwasu mlekowego Tetragenococus halophila, które są używane podczas fermentacji sosu sojowego. Wprowadzenie ektoiny powoduje wzrost prawidłowej kultury i wykorzystanie glukozy, oraz zapobiega wystąpieniu fermentacji alkoholowej przez Gram-ujemne bakterie Zymomonas mobilis (Zhang L, Lang Y, Wang C, Nagata S. Promoting effect of compatible solute ectoine on the ethanol fermentation by Zymomonas mobilis CICC10232. Proc Biochem 2008;43:642-6).

Ektoina może znaleźć zastosowanie w medycynie, do produkcji kremów, kosmetyków, a także do produkcji biopaliw.

PL 217 162 B1

W literaturze opisano także możliwość wprowadzenia ektoiny do produkcji biooleju, podczas enzymatycznej konwersji trójglicerydów, zawartych w oleju nasion bawełny (Wang Y, Zhang L. Ectoine improves yield of biodiesel catalyzed by immobilized lipase. J Mol CataI Enzym 2010;62:90-5).

Produkcja ektoiny na drodze syntezy chemicznej jest bardzo kosztowna.

Dotychczasowe badania dotyczyły wykorzystania kultur rosnących w osadach dennych zasolonych jezior.

W znanym stanie techniki jako pożywkę do namnażania bakterii stosuje się mieszaninę substancji, tworzących pożywkę NMS według Whittebury'ego (Whittenbury R, Phillips K, Wilkinson J. Enrichment isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. Journal of General Microbiology 1970; 61: 205-218).

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwa jest produkcja ektoiny z udziałem mikroorganizmów, pochodzących z odpadowych skał przywęglowych i metanu jako źródła węgla.

Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że skałę przywęglową najpierw rozdrabnia się do 0 < 2 mm i poddaje preinkubacji w temperaturze od 20 do 30°C przy pojemności wodnej 25-200% ppw, w atmosferze zawierającej 1-50% CH₄, korzystnie 10% CH₄, następnie inokuluje się pożywkę NMS (Whittenbury R, Phillips K., Wilkinson J. Enrichment isolation and some properties of methane utilizing bacteria. Journal of General Microbiology 1970; [90] 61: 205-218) wzbogaconą o NaCl w stężeniu od 1 do 6% w/v, korzystnie 4%, i namnaża się bakterie metanotroficzne w temperaturze 20-30°C, w atmosferze zawierającej 1 - 50% CH4 v/v, stale wytrząsając, do osiągnięcia wykładniczej fazy wzrostu. Następnie wyhodowane bakterie oddziela się od podłoża przez odwirowanie oraz przemywa 50 mM Tris - HCl o pH 8,0, zawiesza się w nowej porcji buforu i poddaje dezintegracji z wykorzystaniem ultradźwięków. Po czym ektoinę wytrąca się metanolem, powtarzając czynność kilkakrotnie. Uzyskany osad suszy się w próżni.

Produkcja ektoiny z udziałem mikroorganizmów, pochodzących z odpadowych skał przywęglowych i metanu jako źródła węgla w warunkach opisanych sposobem według wynalazku, czyni proces tanim i opłacalnym. Ponadto, sposób uzyskania ektoiny jest bardziej wydajny od znanych metod. Konsorcjum bakterii (w tym: Methylosinus, Methylocaldum, Methylocystis, Methylomicrobium), zasiedlających odpadowe skały przywęglowe charakteryzuje się wysoką aktywnością wiązania metanu i zdolnością do wzrostu na pożywce wzbogaconej w NaCl.

P r z y k ł a d I.

Skałą przywęglową rozdrobnioną do 0 < 2 mm, poddano preinkubacji w temp. 30°C przy pełnej pojemności wodnej w powietrzu zawierającym 10% CH4, inokulowano 10 ml pożywki (NMS) o składzie według Whittenbury'ego (Whittenbury R, Phillips K, Wilkinson J. Enrichment isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. Journal of General Microbiology 1970; 61: 205-218), jak podano poniżej:

Składnik	Ilość (na 1 dm³)	Składnik	Ilość (na 1 dm³)
MgSO4 x 7H2O	1 g	KH2PO4x12H2O	0,272 g
Na2HPO4 x 12H2O	0,17 g	CaCl2 x 6H2O	2 g
KNO3	1 g	FeEDTA	5 mg
Roztwór pierwiastków śladowych	1 ml
Skład roztworu pierwiastków śladowych
Na2 EDTA	0,5 g	CUSO4 x 5H2O	0,03 g
FeSO4x7H2O	0,2 g	ZnSO4	0,01 g
H3BO4	0,03 g	MnCl2 x 4H2O	3 mg
CoCl2 x 6H2O	0,02 g	Na2MoO4 x 2H2O	3 mg
NiCl2 x 6H2O	2 mg

₃

Namnażanie bakterii prowadzono na ww. pożywce wzbogaconej w 4% NaCl (40 g/dm³) w temperaturze 30°C, w powietrzu zawierającym 10% CH4 v/v, przy 200 obr/min., przez 14 dni. Następnie hodowlę odwirowano 9000 x g przez 15 min., osad przemyto 2 ml 50 mM Tris - HCl o pH 8,0 i w nowej porcji buforu Tris - HCl poddawano dezintegracji ultradźwiękami (150W, 20kHz, 3x1 min), po czym mieszaninę odwirowano przy 9000 x g przez 15 min. Do supernatantu dodano 2 ml metanolu i utrzymywano przez 1 h w temp. pokojowej a następnie wirowano przy 9000 x g przez 30 min. w temp. 4°C.

PL 217 162 B1

Proces wytrącania metanolem powtarzano trzykrotnie. Uzyskany pelet suszono w próżni a następnie rozpuszczono w 1 ml sterylnej wody (D2O) i przechowywano w 4°C. Otrzymaną substancję poddano oznaczeniom jakościowym i ilościowym techniką NMR (Khmelenina V, Kalyuzhnaya M, Sakharovsky V, Suzina N, Trotsenko Y, Gottschalk G. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs. Arch Microbiol 1999; 172:321-329). Wykazano obecność ektoiny w ilości 619 μΜ.

Claims

1. Sposób otrzymywania ektoiny z udziałem bakterii namnażanych na pożywce NMS, znamienny tym, że skałę przywęglową rozdrobnioną do 0 < 2 mm poddaje się preinkubacji w temperaturze od 20 do 30°C, korzystnie 30°C, przy wilgotności odpowiadającej 25-200% pełnej pojemności wodnej w atmosferze zawierającej 1-50% CH4, następnie inokuluje się ww. pożywkę NMS wzbogaconą w 1-6% w/v NaCl i namnaża się bakterie metanotroficzne, a zwłaszcza: Methylosinus, Methylocaldum, Methylocystis, Methylomicrobium w temperaturze 20-30°C w atmosferze zawierającej 1-50% CH4 v/v do osiągnięcia wykładniczej fazy wzrostu, następnie wyhodowane bakterie oddziela się od podłoża i zawiesza w buforze 50 mM Tris - HCl o pH 8,0 i poddaje dezintegracji ultradźwiękami, po czym mieszaninę odwirowuje się, do supernatantu dodaje się metanol i utrzymuje przez około 1 h w temperaturze pokojowej a następnie wiruje w temperaturze około 4°C, tak uzyskany osad suszy się w próżni.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę przez inokulację skałą przywęglową prowadzi się na podłożu wzbogaconym w 4% w/v NaCl.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę przez inokulację skałą przywęglową prowadzi się w atmosferze zawierającej 10% metanu.