PL216358B1 - Pochodna 1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3,4]-tiadiazolu - 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chloro- fenylo)amino-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]-tiadiazol, sposób jej wytwarzania, jej zastosowanie medyczne oraz kompozycja ją zawierająca - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pochodna 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]tiadiazol o wzorze 1 przedstawionym na rysunku, sposób jej wytwarzania oraz jej pierwsze zastosowanie medyczne związane z ujawnioną aktywnością przeciwbakteryjną oraz kompozycja ją zawierająca.

Poszukiwanie substancji przeciwdrobnoustrojowych, skutecznych w zapobieganiu lub zwalczaniu chorób bakteryjnych, jest obecnie bardzo ważnym elementem pracy badawczej. Nadmierne, niekontrolowane stosowanie związków o aktywności przeciwbakteryjnej, zarówno w terapii wielu schorzeń lub jako substancji odkażających oraz w wielu innych sferach życia człowieka (hodowle zwierząt, uprawy roślin, kosmetyki, przemysł spożywczy) doprowadziło do powstawania i rozpowszechnienia wśród drobnoustrojów potencjalnie lub warunkowo chorobotwórczych wielu mechanizmów oporności. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus), w stosunku do którego wykazano aktywność pochodnej będącej przedmiotem wynalazku, należy do patogenów wywołujących liczne infekcje, o zróżnicowanym przebiegu i lokalizacji. Jest on równocześnie ważnym czynnikiem etiologicznym zakażeń wewnątrzszpitalnych (m.in. posocznic, zakażeń ran operacyjnych, zapalenia opon mózgowordzeniowych). Stale narastająca oporność tego gatunku, zwłaszcza szczepów metycylinoopornych (MRSA; methicillin-resistant Staphylococcus aureus), na substancje przeciwdrobnoustrojowe stwarza bardzo dużo problemów klinicznych i terapeutycznych oraz powoduje coraz mniejsze możliwości eradykacji tego mikroorganizmu. Także szczepy metycylino-wrażliwe (MSSA; methicillin-sensitive Staphylococcus aureus) mogą być przyczyną szeregu problemów w związku ze znacznym ich udziałem w zakażeniach szpitalnych oraz opornością na różne grupy leków przeciwdrobnoustrojowych, np. makrolidy, linkozamidy, streptograminy B.

Otrzymana według wynalazku pochodna może również znaleźć zastosowanie do wytwarzania preparatów przeznaczonych do eradykacji zakażeń wywołanych warunkowo chorobotwórczymi (oportunistycznymi) bakteriami Gram-dodatnimi, występującymi w środowisku lub wchodzącymi w skład naturalnej flory człowieka (np. Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus Iub Micrococcus luteus). W normalnych warunkach mikroorganizmy te są obojętne lub przyjazne dla zdrowego organizmu, w zaburzeniach równowagi w mikroflorze lub w stanie miejscowego albo ogólnego obniżenia się odporności organizmu na skutek choroby lub po zastosowaniu leków immunosupresyjnych czy antybiotyków, mogą być czynnikami etiologicznymi zakażeń endogennych lub toksykoinfekcji. Mogą również, zwłaszcza przetrwalnikujące laseczki Bacillus spp., powodować zakażenia lub zatrucia pokarmowe w niektórych grupach zawodowych (garbarze, hodowcy, weterynarze). Jakkolwiek liczba zakażeń oportunistycznych (m.in. S. epidermidis, B. subtilis, B. cereus lub M luteus), jest mniejsza i znacznie rzadziej diagnozowana, w stanach obniżonej odporności organizmu mogą one być przyczyną endogennych infekcji niebezpiecznych dla zdrowia.

Dane literaturowe dowodzą, iż 3,6-dipodstawione pochodne 1,2,4-triazolo[3,4-b]1,3,4-tiadiazolu mogą wykazywać aktywność przeciwbakteryjną, zarówno w stosunku bakterii patogennych, jak i oportunistycznych (G.L. Almajan, S.F. Barbuceanu, G. Bancescu, I. Saramet, G. Saramet, C. Draghici, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 6139-6146; V. Mathew, J. Keshavayya, V.P. Vaidya, D. Giles, Eur. J. Med. Chem. 42 (2007) 823-840; P. Karegoudar, D.J. Prasad, M. Ashok, M. Mahalinga, B. Poojary, B.S. Holla, Eur. J. Med. Chem. 43 (2008) 808-815; G.V.S. Kumar, Y.R. Prasad, B.P. Mallikarjuna, S.M. Chandrashekar, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 5120-5129; V.S. Palekar, A.J. Damie, S.R. Shukla, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 5112-5116; N.F. Eweiss, A.A. Bahajaj, J. Heterocyclic Chem. 24 (1987) 1173-1182).

Zgłaszający prowadzili badania mające na celu uzyskanie nieznanych dotychczas, nie opisanych w literaturze fachowej pochodnych 1,2,4-triazolo[3,4-b]1,3,4-tiadiazolu, których aktywność przeciwbakteryjna przewyższałaby aktywność dotychczas znanych związków z tej grupy.

Związek będący przedmiotem wynalazku - 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-[1,2,4]-triazolo[3,4-b][1,3,4]tiadiazol o wzorze 1 - wykazuje aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec użytych w badaniu bakterii Gram-dodatnich, w tym również gronkowców MSSA i MRSA, i może znaleźć zastosowanie do wytwarzania leków i środków medycznych przeznaczonych do eradykacji zakażeń wywołanych patogennymi lub oportunistycznymi bakteriami.

W badaniach mikrobiologicznych, mających na celu oznaczenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej związku o wzorze 1, wykorzystywano szczepy referencyjne z kolekcji ATCC (American

Type Culture Collection) - 7 szczepów bakterii Gram-dodatnich (2 szczepy MSSA - Staphylococcus aureus ATCC 25923 i Staphylococcus aureus ATCC 6538 oraz I szczep MRSA - Staphylococcus

PL 216 358 B1 aureus ATCC 14001, ponadto Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 10876, Micrococcus luteus ATCC 10240) oraz 4 szczepy referencyjne bakterii Gram-ujemnych (Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Proteus mirabilis ATCC 12453, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027). Dla każdego szczepu przygotowywano zawiesinę bakteryjną (inokulum) o gęstości wyjściowej 0.5 w skali McFarlanda - 150 x 10⁶ CFU (Colony Forming Units)/mL w 0.85% NaCl. Roztwór podstawowy badanego związku o stężeniu 50 mg/mL otrzymywano po rozpuszczeniu pochodnej w DMSO (dimetylu sulfotlenek).

Aktywność przeciwbakteryjną związku będącego przedmiotem wynalazku oceniano metodą mikrorozcieńczeń badanej pochodnej w podłożu bulionowym Mueller-Hinton w oparciu o wartość MIC (minimal inhibitory concentration - najmniejsze stężenie hamujące) oraz MBC (minimal bactericidal concentration - najmniejsze stężenie bójcze). Wartość MIC, definiowaną jako najniższe stężenie badanego związku w podłożu, przy którym wzrokowo nie obserwowano wzrostu bakterii w porównaniu z ich namnażaniem na podłożu kontrolnym, oznaczano mikrometodą z zastosowaniem 96-dołkowych mikropłytek, w których metodą seryjnych rozcieńczeń roztworu wyjściowego w podłożu bulionowym uzyskiwano podwójne rozcieńczenia badanej pochodnej w zakresie stężeń końcowych od 0,49 do 1000 μg/mL. Następnie do każdego dołka dodawano po 2 μL zawiesiny drobnoustrojów o gęstości 0,5 w skali McFarlanda (objętość końcowa w każdym dołku wynosiła po 200 μΐ). Tak przygotowane mikropłytki inkubowano w temperaturze 35+2°C przez 18 godzin. Po inkubacji odczytywano wartość MIC wzrokowo i spektrofotometrycznie (BioTek ELx800) przy długości fali 600 nm (OD600), po odjęciu wartości OD600 dla substancji zawieszonej w bulionie bez dodatku bakterii. Po odczytaniu wartości MIC, z każdego dołka na mikropłytce przesiewano po 10 μ!, hodowli bez lub z dodatkiem odpowiedniego stężenia badanej pochodnej na podłoże agarowe Mueller-Hinton celem oznaczenia wartości MBC, definiowanej jako najmniejsze stężenie badanej substancji działające bójczo na co najmniej 99,9% komórek drobnoustrojów. Tak założone hodowle inkubowano w temperaturze 35 ± 2°C przez 24 h i wzrokowo odczytywano wzrost bakterii lub jego brak. Najmniejsze stężenie badanej pochodnej, przy którym nie uzyskano wzrostu bakterii, odczytywano jako wartość MBC. Jako substancji wzorcowej użyto wankomycynę, znany antybiotyk glikopeptydowy aktywny wyłącznie wobec bakterii Gram-dodatnich, którą dodawano do pożywki bulionowej Mueller-Hinton w zakresie stężeń 0,031-1000 μg/mL. Nie wykazano wpływu DMSO w zastosowanych stężeniach na namnażanie i wzrost badanych bakterii.

Zgodnie z uzyskanymi wynikami (tabela 1), badaną pochodną charakteryzowała zróżnicowana aktywność wobec referencyjnych szczepów Gram-dodatnich bakterii patogennych (MIC = 0,49-1,95 μg/mL, MBC = 31,25-62,5 ng/mL) i oportunistycznych (MIC 0,98-7,81 μρ/mL, MBC = 1,95-15,63 μg/mL). Analizowana pochodna wykazywała aktywność bakteriostatyczną (MBC/MIC>4) wobec patogennych szczepów gronkowca złocistego, wśród których największą wrażliwością charakteryzował się S. aureus ATCC 6538 (MSSA; MIC=0,49 μρ/mL, MBC=31,25 μρ/mL, MBC/MIC = 16), nieco mniejszą dwa pozostałe szczepy S. aureus ATCC 25923 (MSSA; MIC=1,95 μg/mL, MBC = 31,25 μg/mL) i S. aureus ATCC 14001 (MRSA; MIC=1,95 μρ/mL, MBC = 62,5 μg/mL). Stosunek MBC/MIC<4 uzyskany wobec bakterii oportunistycznych wskazuje na aktywność bójczą analizowanej pochodnej wobec tej grupy drobnoustrojów. Najbardziej wrażliwe były S. epidermidis ATCC 12228 (MIC=0,98 ng/mL, MBC=3,91 ng/mL, MBC/MIC = 4) oraz B. subtilis ATCC 6633 (MIC = 1,95 μρ/mL, MBC=1,95 μg/mL, MBC/MIC = 1), natomiast dla pozostałych gatunków bakterii warunkowo chorobotwórczych M luteus ATCC 10240 i B. eereus ATCC 10876 uzyskano wartości MIC=3,91-7,81 μg/mL i MBC = 3,91-15,63 μg/mL przy stosunku MBC/MIC=1-2.

W użytym zakresie stężeń nie wykazano aktywności badanej pochodnej wobec szczepów referencyjnych bakterii Gram-ujemnych - E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 13883, P. mira-bilis ATCC 12453, P. aeruginosa ATCC 9027 (MIC >1000 mg/L).

Uzyskane wyniki pozwalają oczekiwać, że związek o wzorze 1 może być użyteczny w leczeniu infekcji bakteryjnych, zwłaszcza o etiologii gronkowcowej, w tym również wywoływanych przez gronkowce metycylinoopome. Związek o wzorze 1, będący przedmiotem zgłoszenia patentowego może znaleźć zastosowanie w zwalczaniu infekcji wywoływanych przez drobnoustroje oportunistyczne, w tym także, jak wykazano na przykładzie B. cereus ATCC 10876, wykazujących tolerancję wobec wankomycyny.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]tiadiazolu o wzorze ogólnym 1, polegający na tym, że 4-amino-5-(3chlorofenylo)-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazolo-3-tion o wzorze ogólnym 2 poddaje się reakcji z izotiocyjanianem 4-chlorofenylu o wzorze ogólnym 3, przy czym reakcję prowadzi się w stosunku molowym 1:1, w rozpuszczalnikach bezwodnych korzystnie pirydynie, etanolu, acetonie, N,N-dimetyloacetamidzie, Ν,Ν-dimetyloformamidzie, w temperaturze 60-80°C przez 18-24 godziny, po czym mieszaninę reak4

PL 216 358 B1 cyjną zalewa się nadmiarem wody, umieszcza w lodówce na 4-6 godzin, a powstały osad (produkt reakcji) odsącza się, przemywa zimnym rozpuszczalnikiem, korzystnie wodą destylowaną, po czym suszy się i krystalizuje z rozpuszczalnika polarnego, korzystnie z bezwodnego etanolu. Prowadzenie reakcji w temperaturze 60-80°C zapobiega tworzeniu niepożądanych produktów ubocznych, które powstają jeśli reakcja prowadzona jest w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika.

Przedmiotem wynalazku jest także pochodna 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,3,4-tiadiazolu, o wzorze 1 pokazanym na rysunku, do zastosowania jako lek.

Zastosowanie medyczne pochodnej 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,3,4-tiadiazolu do wytwarzania leku do leczenia zakażeń bakteryjnych, zwłaszcza o etiologii gronkowcowej, w tym również wywoływanych przez gronkowce metycylinooporne.

Kompozycja zawierająca jako substancję czynną, w połączeniu z co najmniej jednym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, pochodną 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,3,4-tiadiazol.

P r z y k ł a d:

0,01 mola (2,26 g) 4-amino-5-(3-chlorofenylo)-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazolo-3-tionu oraz 0,01 mola (1,7 g) izotiocyjanianu 4-chlorofenylu rozpuszczono w bezwodnym Ν,Ν-dimetyloformamidzie i ogrzewano przez 24 godziny w temperaturze 80°C, przy jednoczesnym mieszaniu przy użyciu mieszadła magnetycznego. Po ochłodzeniu mieszaninę reakcyjną wlano do zlewki z zimną wodą destylowaną i całość pozostawiono na 6 godzin w lodówce (temperatura 4-8°C). Wytrącony po tym czasie osad odsączono, przemyto wodą destylowaną wysuszono i przekrystalizowano z bezwodnego etanolu. ₁

Właściwą budowę związku oraz jego czystość potwierdzono poprzez wykonanie widm MS, IR, ¹H

NMR oraz analizy elementarnej (wyniki przedstawione poniżej)

Parametry fizykochemiczne i dane spektralne 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]tiadiazolu

Wydajność: 76%

Temperatura topnienia: 250-252°C ¹H NMR (250 MHz) (CDCis) 8 (ppm): 7.13 (d, 2H, Ar-H, J=S.6 Hz), 7.27-7.33 (m, 1H, Ar-H), 7.40-7.49 (m, 2H, Ar-H), 7.76 (d, 2H, Ar-H, J=8.6 Hz), 7.84 (s, 1H, Ar-H), 9.92 (br s, 1H, NH).

IR (KBr, v, cm^-1): 3219 (NH), 3066 (CH_arom), 1577 (C=N).

Mass m/z: 361 (M⁺, 11%), 363 (M+2,4%).

Analiza elementarna: teoretyczny skład pierwiastkowy (%) C 49.74, H 2.50, N 19.33. Oznaczono (%) C 49.80, H 2.64, N 19.30.

Aktywność przeciwbakteryjna 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]1,3,4-tiadiazolu wobec bakterii Gram-dodatnich, oznaczona w oparciu o wartość MIC (minimal inhibitory concentration) i MBC (minimal bactericidal concentration) metodą mikrorozcieńczeń w podłożu bulionowym.

Gatunek	3-(3-chiorofenyio)-6-(4-chiorofenyio) amino-1,2,4-triazoio[3,4-b] 1,3,4-tiadiazoi	Wankomycyna
MIC ąg/mL)	MBC ąg/mL)	MBC/MIC	MIC ąg/mL)	MBC ąg/mL)	MBC/MIC
Staphylococcus aureus ATCC 25923	1,95	31,25	16	0,98	7,81	8
Staphylococcus aureus ATCC 6538	0,49	31,25	64	0,49	1,95	4
Staphylococcus aureus ATCC 14001	1,95	62,5	32	0,98	3,91	4
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228	0,98	3,91	4	0,98	1,95	2
Bacillus subtilis ATCC 6633	1,95	1,95	1	0,25	0,49	2
Bacillus cereus ATCC 10876	7,81	15,63	2	0,98	31,25	32
Micrococcus luteus ATCC 10240	3,91	3,91	1	0,25	0,49	2

PL 216 358 B1

Claims (5)

1. Pochodna 1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3,4j-tiadiazolu-3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b][1,3,4|-tiadiazol o wzorze ogólnym 1.

2. Sposób otrzymywania 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,3,4-tiadiazolu o wzorze ogólnym 1, znamienny tym, że 4-amino-5-(3-chlorofenylo)-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazolo-3-tion o wzorze ogólnym 2 poddaje się reakcji z izotiocyjanianem 4-chlorofenylu o wzorze ogólnym 3, przy czym reakcję prowadzi się w stosunku molowym 1:1, w rozpuszczalnikach bezwodnych, korzystnie jak pirydyna, etanol, aceton, N,N-dimetyloacetamid, Ν,Ν-dimetyloformamid, w temperaturze 60-80°C przez 18-24 godziny, po czym mieszaninę reakcyjną zalewa się nadmiarem wody, umieszcza w lodówce na 4-6 godzin, a powstały osad będący produktem reakcji odsącza się, przemywa zimnym rozpuszczalnikiem, korzystnie wodą destylowaną, po czym suszy się i krystalizuje z rozpuszczalnika polarnego, korzystnie z bezwodnego etanolu.

3. Pochodna 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,3,4-tiadiazolu, o wzorze 1 pokazanym na rysunku, do zastosowania jako lek.

4. Zastosowanie medyczne pochodnej 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo-[3,4-b]-1,3,4-tiadiazolu do wytwarzania leku do leczenia zakażeń bakteryjnych, zwłaszcza o etiologii gronkowcowej, w tym również wywoływanych przez gronkowce metycylinooporne.

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną w połączeniu z co najmniej jednym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem farmaceutycznym, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera 3-(3-chlorofenylo)-6-(4-chlorofenylo)amino-1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,3,4-tiadiazol.