PL214984B1 - Sposób okreslania obecnosci lub predyspozycji do choroby Alzheimera - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu okeślania obecności lub predyspozycji do choroby Alzheimera. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek zastosowania cytokiny interleukiny-10 w diagnostyce schorzenia neurodegeneracyjnego - choroby Alzheimera.

Podstawową przyczyną utraty funkcji poznawczych u osób starszych jest choroba Alzheimera (AD, z ang. Alzheimer's disease). Z powodu wzrostu długości życia w skali światowej oczekuje się, że liczba osób, których dotknie AD, potroi się w ciągu najbliższych 50 lat (1). AD jest zespołem klinicznym, cechującym się złożonymi i niejednolitymi mechanizmami patogenezy. Do rozpoznanych czynników genetycznych należą mutacje genów, kodujących białko prekursorowe amyloidu (2), preseniliny 1 i 2 (3, 4), które tłumaczą niewielką część rodzinnych i występujących wcześnie przypadków AD. Czynniki genetyczne wiązano również ze sporadyczną lub nierodzinną postacią choroby i allel e4 apolipoproteiny E (Apo E) znacząco podnosi ryzyko AD, ale nie jest ani konieczny, ani wystarczający do rozwoju choroby (5-7). Prawdopodobne jest zatem uwikłanie innych czynników genetycznych i środowiskowych, które są aktywnie poddawane badaniom.

Cząsteczki, które biorą udział w kaskadzie zapalnej, cieszą się wielkim zainteresowaniem, ponieważ wielokrotnie proponowano, że zapalenie jest związane z procesem neurodegeneracyjnym, charakterystycznym dla mózgu AD (8). Obserwuje się zatem reaktywną astrocytozę zarówno w korze, jak i hipokampie tych pacjentów, komórki glejowe w obrębie lub pobliżu płytek neurytowych są także zaktywowane. Nadekspresja cytokin i innych cząsteczek zapalnych jest ogólną cechą patologii mózgu AD (9). Ponadto badania epidemiologiczne wykazały, że długotrwałe używanie niesterydowych leków przeciwzapalnych jest związane z obniżeniem występowania AD w badaniach, w których grupę kontrolną stanowiły bliźnięta (10), a kilka innych badań klinicznych potwierdziło obniżenie występowania AD u pacjentów, leczonych lekami przeciwzapalnymi (11), w tym inhibitorami swoistymi dla COX-2 (12). Te odkrycia potwierdzają hipotezę, że zapalenie może mieć wkład w neurodegenerację, związaną z AD (13).

W próbie lepszego zrozumienia biologii AD zbadano ostatnio ewentualną rolę kilku cytokin i chemokin. Sugerowano, że aktywność praktycznie wszystkich spośród mediatorów, analizowanych w tych badaniach, włączając IL-1b, IL-6, TNF-α, IL-8, TGF-β i białko zapalne makrofagów-la (MIP- 1a, z ang. macrofage inflammatory protein) jest podniesiona w AD, w porównaniu do grupy kontrolnej, nie wykazującej demencji (14-18). W przeciwieństwie do tego, wzajemnie sprzeczne wyniki otrzymano dla cytokiny immunomodulatorowej IL-10, cytokiny typu-2, która hamuje limfocyty T i odporność komórkową u ludzi i myszy, a także posiada silne właściwości przeciwzapalne (19-21).

W tych badaniach rozważano każdą z cytokin niezależnie, pod względem polimorfizmów genów i/lub wytwarzania, ale nigdy nie badano związku pomiędzy czynnikami, działającymi w kierunku i przeciw zapaleniu, takich jak IL-10 i IL-6, w próbie z tej samej populacji.

Warto wspomnieć, że znane są polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP, z ang. single nucleotide polimorphism) w obszarach promotorowych tych dwóch genów. Gen kodujący IL-10, zmapowany na chromosomie 1 pomiędzy 1q31 i 1q32, jest wysoce polimorficzny. Wytwarzanie IL-10 jest związana z polimorfizmami biallelicznymi w pozycjach -1082 (podstawienie guanina na adeninę), -819 (podstawienie tymina na cytozynę) i -592 (podstawienie adenina na cytozynę). Polimorfizm w pozycji -1082 znajduje się w obrębie miejsca rozpoznawania podobnego do Ets (swoisty dla E-dwadzieścia sześć, z ang. E- twenty-six) i może wpływać na wiązanie tego czynnika transkrypcji, w ten sposób zmieniając aktywację transkrypcji; allel -1082 A koreluje się z tworzeniem IL-10 po stymulacji komórek T in vitro (57), podczas gdy polimorfizmy w pozycjach -819 i -592 nie wydają się mieć znaczenia. Gen IL-6 człowieka, zorganizowany w pięć eksonów i cztery introny, mapuje się na krótkim ramieniu chromosomu 7 (7p21) (50, 73). Uczestnictwu IL-6 w wielu funkcjach biologicznych towarzyszą asocjacje genetyczne jej wariantów ałlelicznych z kilkoma stanami fizjologicznymi i patofizjologicznymi. Do badań związków genetycznych często stosuje się dwa spośród jej miejsc polimorficznych: polimorfizm wieloalleliczny zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR, z ang. variable number tandem repeats) w obszarze flankującym 3' (powtórzenia AT) i bialleliczny polimorfizm G na C promotora w pozycji -174. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP, ang. single nucleotide polymorphism) G/C wydaje się być związany z różnymi poziomami we krwi i szybkościami transkrypcji IL-6 (54, 56, 68).

W świetle tych rozważań i na podstawie kontrolowanego badania asocjacji u włoskich pacjentów z AD sporadyczną, pojawiającą się późno, w którym grupa kontrolna, składała się z dobranych osób zdrowych (HC, z ang. healthy controls), niniejsi twórcy ustalili, czy SNP IL-10 i IL-6 mają związek

PL 214 984 B1 z rozwojem AD. Wyniki dostarczają dalszych potwierdzeń dla hipotezy o zapalnej patogenezie AD i podpowiadają istnienie predyspozycji genetycznej, niezależnej od metabolicznej.

Te różnorodności alleliczne są związane z mierzalnymi różnicami wytwarzania IL-10 i IL-6 przez limfocyty krwi obwodowej, stymulowane przez antygeny i mitogeny. W rzeczy samej polimorfizmy te występują w obszarze regulatorowym genu i są związane z wysoką, średnią lub niską produkcją IL-10 (22).

Niniejsi twórcy zbadali stymulowane przez amyloid beta wytwarzanie IL-10 i IL-6 przez limfocyty krwi obwodowej (PBMC, z ang. peripheral blood mononuclear cells) pacjentów AD i dobranych pod względem wieku zdrowych osób z grupy kontrolnej. Jako że wytwarzanie tej cytokiny u pacjentów AD zostało znamiennie obniżone, u tych samych pacjentów zbadano polimorfizmy IL-10. Wyniki wykazały, że allel wytwarzający dużo IL-10 jest u pacjentów AD skrajnie rzadki.

₂

Szczegółowo, genotypy IL-10 wykazują różną dystrybucję, gdy AD porównuje się z HC (χ = 16,007; p = 0,007). Genotypy, odpowiadające obniżonemu wytwarzaniu IL-10, mają znacząco podwyższoną dystrybucję pośród pacjentów AD (Tabela I). Obecność genotypów, wytwarzających IL-10 na niskim poziomie, wiąże się z pogorszeniem obrazu klinicznego AD, w taki sposób, że 1) choroba pojawia się wcześniej (Tabela II) i 2) postęp choroby jest szybszy (wynik MMSE) (Tabela III) .

T a b e l a I. Dystrybucja genotypów IL-10

Genotyp (c)	AD n = 47	HC n = 25	AD %	HC %
GCC/GCC (H)	1	7	2	28
GCC/ACC (M)	10	9	21	36
GCC/ATA (M)	11	3	23	12
ACC/ACC (L)	8	1	17	4
ACC/ATA (L)	12	4	26	16
ATA/ATA (L)	5	1	11	4

Częstości różnych genotypów pośród pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) są statystycznie ₂ różne od zdrowych osób z grupy kontrolnej (HC). χ² = 16, 007, df (stopień swobody, z ang. degree of freedom) = 5, p = 0,007. W nawiasach (c) podano odpowiadające fenotypy, wysoki (H, z ang. high), pośredni (M, z ang. medium), niski (L, z ang. Iow)

T a b e l a II. Dystrybucja genotypu IL-10 i wiek początku choroby

Genotyp	średnia	S. D.	SEM
GCC/GCC	76	/	/
GCC/ACC	75,00	8,57	3,03
GCC/ATA	67,33	8,2	2,73
ACC/ACC	76,20	8,79	3,93
ACC/ATA	77,7	4,07	1,66
ATA/ATA	65,75	1,71	0,85

Korelacja pomiędzy różnymi genotypami pacjentów z chorobą Alzheimera i wiekiem z początku choroby. ANOVA (analiza wariancji, z ang. analysis of ariance): p = 0,42.

T a b e l a III. Dystrybucja genotypu IL-10 i MMSE

Genotyp	średnia	S.D.	SEM
GCC/GCC	18
GCC/ACC	21,75	5,5	1,94
GCC/ATA	16,33	5,68	1,89
ACC/ACC	10,80	7,5	3,35
ACC/ATA	13,83	5,19	2,12
ATA/ATA	22,5	1,73	0,87

PL 214 984 B1

Korelacja pomiędzy różnymi genotypami pacjentów z chorobą Alzheimera. ANOVA MMSE: p= 0,010.

Sugeruje się, że w procesie neurodegeneracyjnym, charakterystycznym dla AD, uczestniczy przewlekły stan zapalny (24, 25), ta sugestia ma oparcie w kryteriach zarówno in vivo, jak i ex adjuvantibus. Stwierdza się więc, że substancje pośredniczące w reakcji zapalnej i zaktywowane komórki glejowe są ściśle związane z płytkami neurytowymi in vivo. Ponadto, dane uzyskane niedawno wskazują, że terapia przeciwzapalna może być przydatna do modulowania postępu choroby (10-12). Pomimo dużego zbioru danych, uwarunkowania biologiczne AD wciąż pozostają niejasne. By rzucić światło na tą kwestię, skupiono uwagę na IL-10. Ta cytokina jest kluczową cytokiną regulacyjną, zaangażowaną w wiele aspektów reakcji odpornościowej i ulega rozregulowaniu w chorobach autoimmunizacyjnych (26), nowotworowych (27-31) i zakaźnych (32-35) człowieka. Niedawno wykazano, że obecność zdeterminowanych genetycznie wyższych poziomów wydzielania IL-10 jest ważnym elementem genetycznego tła tocznia rumieniowatego układowego (36) i przebiegu choroby zakaźnej (37). Wykazano również, że wydzielanie IL-10, spowodowane stymulacją in vitro limfocytów krwi obwodowej człowieka za pomocą LPS, różni się znacząco pomiędzy poszczególnymi osobami oraz że haplotypy cytokin są związane z różnymi poziomami wydzielania (38). Ponadto różnice w wydzielaniu IL-10 do osocza przez komórki pacjentów i najbliżej z nimi spokrewnionych członków rodzin (37, 39), a także różnice dystrybucji alleli IL-10, podpowiadają, że zaangażowanie różnych izoform genu IL-10 może być ważną ilościową cechą Ioci chorób człowieka dla zakażeń (37, 40), chorób autoimmunizacyjnych (26, 36, 41, 42) i chorób nowotworowych (43).

Obecni twórcy początkowo zanalizowali swoiste wobec LPS, Flu i peptydu amyloidowego wytwarzanie IL-2 i IL-10 przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) pacjentów AD i dobranych pod względem wieku HC. Wyniki wykazały, że: 1) wytwarzanie IL-2 przez PBMC pacjentów AD i grupy kontrolnej było zbliżone dla wszystkich zastosowanych warunków oraz 2) wytwarzanie IL-10 przez PBMC stymulowane przez LPS i Flu było porównywalnie podobne pomiędzy obydwiema grupami osób. W przeciwieństwie do tego, w AD wystąpiło swoiste dla amyloidu zaburzenie odporności, charakteryzujące się obniżeniem wytwarzania IL-10. Obserwacja, że zaburzenia równowagi dla tej cytokiny nie stwierdzono w PBMC stymulowanych przez mitogen, wskazuje, że reakcje odpornościowe swoiste dla amyloidu są wybiórczo zaburzone u pacjentów AD. Ponadto wyniki, wykazujące, że proliferacja po stymulacji przez flu była zbliżona u pacjentów i w grupie kontrolnej, wskazują, że przetwarzanie antygenu i jego prezentacja w powiązaniu z cząsteczkami HLA klasy II oraz samoograniczający się szlak CD4-HLA klasy II aktywacji układu odpornościowego (44) nie są uszkodzone u tych pacjentów.

Następnie zanalizowano polimorfizmy w genie IL-10 w tej samej grupie pacjentów. Wyniki uzyskane z analizy dystrybucji alleli IL-10 w tej włoskiej grupie osób zdrowych wykazały bliskie podobieństwo z wynikami uzyskanymi dla innych populacji rasy białej (45). W przeciwieństwie do tego zaobserwowaliśmy znacząco wyższą częstość genotypów, odpowiadających obniżonemu wytwarzaniu IL-10 (ACC/ACC, ACC/ATA i ATA/ATA) u pacjentów AD. Stwierdzono zatem anormalnie podwyższoną obecność izoform o niskim wytwarzaniu IL-10 w populacji AD; fenotyp odpowiadający tym izoformom staje staje się oczywisty przy pomiarze reakcji odpornościowych swoistych dla amyloidu.

Dalsze analizy skoncentrowały się na możliwościach korelacji pomiędzy zaburzeniem wytwarzania IL-10 i objawami klinicznymi AD, przez ustalenie, czy obecność genotypów wytwarzających mało/średnio IL-10 nie byłaby związana z odmiennymi przebiegami choroby. Wyniki potwierdziły, że ma to miejsce. Obecność genotypów ATA/ATA i GCC/ATA jest więc skorelowana z wcześniejszym wiekiem pojawiania się choroby. Ponadto allele ACC/ATA i ACC/ACC (wszystkie one są genotypami wytwarzającymi mało/średnio IL-10) są związane z ostrzejszym zaburzeniem funkcji poznawczych, na co wskazuje niższy wynik MMSE.

Interesujące jest spostrzeżenie, że niedawna publikacja na temat włoskich stulatków, osób, które - z definicji - są mniej podatne na rozwój chorób związanych z wiekiem, wykazała że ekstremalna długowieczność jest związana ze znacząco wyższą częstością genotypów wytwarzających IL-10 na wysokim poziomie (46).

Wiadomo, że IL-10 ma silne właściwości przeciwzapalne (47); można zatem spekulować na temat scenariusza biologicznego, w którym obniżenie swoistego dla amyloidu wytwarzania IL-10 sprzyjałoby powstawaniu przewlekłego stanu zapalnego, obserwowanego w rozwoju AD. Wyniki te sugerują, że swoisty dla amyloidu i zachodzący za pośrednictwem IL-10 obwód hamującego sprzężenia zwrotnego, może być aktywny u osób, które nie są chore na AD; przerwanie tego obwodu może być

PL 214 984 B1 związane z, lub zapowiadać rozwój AD. Przekonywująca publikacja wykazała ostatnio, że obwód prozapalny IL-10, który działa wśród komórek wrodzonego układu odpornościowego, reguluje podatność na choroby autoimmunizacyjne (48). Rozszerzeniem tych wyników jest wykazanie, że zaburzenie tego obwodu występuje u pacjentów AD.

Obecni twórcy zidentyfikowali obszary polimorficzne, polimorfy których świadczą o zaburzeniu wytwarzania cytokin i są tym samym związane z podatnością na choroby autoimmunizacyjne, neurodegeneracyjne i przewlekłe choroby zapalne.

Obecnie chorobę Alzheimera diagnozuje się za pomocą uznanych kryteriów, takich jak DMS IV lub NINCDS-ADRDA (23), często w połączeniu z obrazowaniem mózgu za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI, z ang. magnetic resonance imaging) lub tomografii komputerowej (CT, z ang. computer aided tomography), służącymi identyfikacji charakterystycznych płytek amyloidowych i gruzłów neurofibrylarnych, wraz z atrofią obszaru hipokampa w mózgu.

Ostateczna diagnoza, potwierdzająca chorobę Alzheimera, jest możliwa jedynie za pomocą inspekcji wzrokowej dotkniętych obszarów mózgu podczas sekcji zwłok lub za pomocą biopsji mózgu (niezalecanej ze względu na brak skutecznych terapii).

Terapie i sposoby monitorowania choroby Alzheimera są pilnie poszukiwane. W miarę postępu w wysiłkach na rzecz zapobiegania lub opóźnienia neurodegeneracji i postępu choroby, wczesne wykrycie choroby Alzheimera oraz identyfikacja pacjentów podatnych zyskają na znaczeniu, ponieważ umożliwi to najszybsze wprowadzenie środków zapobiegawczych. Istnieje zatem potrzeba dostarczenia umożliwiających przewidywanie i wiarygodnych testów podatności na chorobę Alzheimera bez konieczności długotrwałych i subiektywnych badań zdolności poznawczych.

Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określenia obecności lub podatności na chorobę Alzheimera, obejmującego etapy pobierania próbki zawierającej DNA od osobnika będącego zwierzęciem i analizowania próbki, w celu ustalenia wariantów allelicznych, obecnych w jednym lub większej liczbie loci SNP w pozycjach -1082, -819 i -592 genu kodującego IL-10, albo, określając to inaczej, analizowania próbki pod kątem obecności lub nieobecność alleli z Fig. 2.

Korzystnie określany jest genotyp dla wszystkich trzech pozycji, -1082, -819 i -592.

Podczas gdy stwierdzono, że identyfikacja alleli na Fig. 2 jest przydatna w stwierdzaniu lub przewidywaniu choroby Alzheimera, ujawniono, że kombinacja alleli IL-10 i IL-6 daje lepsze przewidywanie podatności na chorobę Alzheimera i diagnostykę obecności choroby Alzheimera.

Apolipoproteina E (Apo-E) jest kojarzona ze sporadyczną lub nierodzinną AD. Zatem, w kolejnym aspekcie wynalazku, sposób diagnozowania choroby Alzheimera obejmuje etapy pozyskiwania próbki zawierającej DNA od zwierzęcia i identyfikacji obecności polimorficznego allelu IL-10, IL-6 i Apo-E.

Korzystnie allel polimorficzny jest jednym z alleli z Fig. 2.

Ponadto próbkę można badać na obecność/nieobecność polimorfizmów lub innych zmienności allelicznych innych cytokin, oprócz IL-10 i IL-6, na przykład IL-10 i IL-6 plus IL-4 i/lub IL-1.

Alternatywnie próbkę można badać na obecność/nieobecność polimorfizmów lub innych zmienności allelicznych IL-10 plus Apo-E lub IL-6 plus Apo-E.

Polimorfizm interleukiny 1 alfa (IL-1 alfa) jest kojarzony z chorobą Alzheimera (77). Zatem w jeszcze innym aspekcie wynalazku sposób diagnozowania choroby Alzheimera obejmuje etapy pozyskiwania próbki zawierającej DNA od zwierzęcia i identyfikacji obecności polimorficznego allelu IL-10, IL-6, Apo-E i IL-1.

Ogólnie, optymalną zdolność przewidywania uzyska się przez połączenie w teście jak największej ilości czynników przewidywania. Sposoby opisane tutaj, wraz z markerami takimi jak Apo-E i IL-1, umożliwiają opracowanie skutecznego sposobu diagnostycznego, który obejmowałby wszystkie markery biologiczne, dla których wykazano przydatność przewidywania rozwoju AD.

Niniejszym opisano również sposób leczenia choroby Alzheimera przez modulowanie, to jest wzmacnianie lub osłabianie funkcji genu, posiadającego jeden z polimorfizmów allelicznych IL-10, przedstawionych w Tabeli I, lub ujmując to inaczej, genu z polimorfizmem allelicznym z Fig. 2.

Na przykład, wytwarzanie IL-6 może być korzystnie obniżane, ale wytwarzanie IL-10 powinno być korzystnie podwyższane. Bardziej korzystnie wytwarzanie IL-6 ulega obniżeniu przy jednoczesnym podwyższeniu wytwarzania IL-10.

Alternatywnie, pacjentowi wykazującemu zapotrzebowanie na leczenie można podawać kompozycje farmaceutyczne, które hamują lub dostarczają odpowiednie cytokiny. Na przykład zamiast obniżania aktywności IL-6 na poziomie genetycznym, pacjentowi można podawać związki, które ha6

PL 214 984 B1 mują lub blokują działanie IL-6. Hamowanie lub blokowanie może zachodzić na etapie syntezy, w miejscu działania lub gdziekolwiek na szlaku metabolicznym IL-6. Podobnie IL-10 można podawać bezpośrednio, jako produkt pośredni, jako prekursor lub preprokursor, przez stymulację syntezy IL-10 ab initio lub przez podawanie kompozycji farmaceutycznych, które wzmagają lub hamują antygenowo swoiste wytwarzanie interleukiny-10 i ewentualnie jednej, lub większej liczby innych cytokin.

Inną cytokinę wybiera się korzystnie z grupy, składającej się z interleukiny-1 (a lub β), interleukiny-2, interleukiny-3, interleukiny-4, interleukiny-5, interleukiny-6, interleukiny-7, interleukiny-8, interleukiny-9, interleukiny-10, interleukiny-11, interleukiny-12, interleukiny-13, interleukiny-14, interleukiny15, interleukiny-16, interleukiny-17, interferonu-a, interferonu-β, TNF-a, TNF-β, G-CSF, GM-CSF, M-LSF i TGF-β.

Znane są w dziedzinie środki farmakologiczne, które mogą modulować wytwarzanie cytokin, na przykład białka szoku cieplnego (HSP, z ang. heat shock protein) i/lub oligonukleotydy immunomodulatorowe, zawierające motyw CpG. Wynikiem szczepienia cząsteczkami DNA z użyciem konstruktów kodujących białko szoku cieplnego człowieka o masie 60 kDa, hsp60 (phsp60), jest zwiększenie wytwarzania IL-10 (71). Wykazano, że CpG-DNA może indukować syntezę supresora białek sygnałowych cytokin (SOC, z ang. signal of cytokine). Białka SOC indukowane przez CpG-DNA hamują wytwarzanie IL-6 (72). Ponadto wykazano, że CpG-DNA wywołuje wytwarzanie IL-10 za pośrednictwem szlaku, w którym pośredniczy kinaza regulowana przez sygnał zewnątrz komórkowy (ERK, z ang. extracellular regulated kinase) (73). Oligonukleotydy CpG można modyfikować strukturalnie, aby uzyskać pożądany profil podatnych komórek i stymulowanych cytokin, przesuwając go albo w stronę szlaku komórek T pomocniczych Th1 (generującego interferon gamma, w którym pośredniczą komórki) lub Th2 (generującego przeciwciała, IL-10 i IL-14) (74). Do przykładów takich różnorodnych modulacji należą: profilowany na Th1 związek 7909, otrzymany przez Coley Pharmaceuticals i profilowane na Th2 związki, otrzymane przez Dynavax (75). Ponadto jako środki farmakologiczne, które wpływają na pożądany profil wytwarzania cytokin, można również wykorzystać oligonukleotydy immunomodulatorowe, typu CpG, w których motyw CpG zastąpiono przez motywy JPG lub CpR, lecz które posiadają obiecujące zdolności modyfikacji potencjału immunomodulatorowego przez swą strukturę chemiczną (76).

Niniejszym ujawniono także zastosowanie inhibitorów IL-6 i promotorów IL-10 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby Alzheimera.

Fragmenty DNA i fragmenty cDNA, kodujące polimorfizm alleliczny z Tabeli I, lub ujmując to inaczej polimorfizmy alleliczne z Fig. 2, mogą być stosowane w sposobie opisanym powyżej.

Te fragmenty DNA są przydatne do przesiewania i identyfikacji związków, które wiążą się, regulują lub wywierają w inny sposób efekt immunomodulatorowy na te allele, stymulując lub hamując tym samym syntezę produktów genów.

Zgodnie z tym, niniejszym ujawniono sposób przesiewania związków, które modulują IL-10 zaangażowane w chorobie Alzheimera, który to sposób obejmuje wprowadzanie sprawdzanego związku do fragentów DNA lub cDNA, kodujących polimorfizmy alleliczne z Tabeli I, lub ujmując to inaczej polimorfizmy alleliczne z Fig. 2 i ocenę hybrydyzacji pomiędzy związkiem i fragmentem.

Korzystnie zwierzę jest ssakiem, a bardziej korzystnie człowiekiem.

Przedstawione tu dane potwierdzają rolę procesów zapalnych w patogenezie AD, wzmacniają hipotezę, że neurodegeneracja u pacjentów AD jest ściśle związana z zaburzeniem antygenowo swoistej odpowiedzi immunologicznej, a także dostarczają dalszych podstaw dla zastosowania związków przeciwzapalnych w leczeniu tej choroby.

Następnie opisane zostaną, jedynie w postaci przykładów, postacie wykonania wynalazku, z odniesieniami do towarzyszących figur, spośród których

Fig. 1A-1D są wykresami słupkowymi, które ukazują stymulowane przez LPS i βamyloid (mieszanina 3 peptydów amyloidowych βΑ: fragment 25-35; βΑ: fragment 1-40 i β3 fragment 1-16) wytwarzanie IL-2 (panele A i C) oraz IL-10 (panele B i D) przez PBMC od 47 pacjentów AD (O) i 25 zdrowych osób z grupy kontrolnej, dopasowanych pod względem wieku i płci (O). Pokazane są wartości średnie + błędy standardowe. p<0,023;

Fig. 2 przedstawia paradygmatyczny przykład genotypowania IL-10 dla sześciu różnych próbek. Na każdym żelu najcięższe prążki odpowiadają amplikonom genu β-globiny człowieka, który jest stosowany jako standard wewnętrzny. Inne amplifikowane swoiście fragmenty DNA odpowiadają polimorfizmom genu IL-10: GCC/GCC (A), GCC/ACC (B), GCC/ATA (C), ACC/ACC (D), ACC/ATA (E), ATA/ATA (F), a

PL 214 984 B1

Fig. 3A-3D są wykresami słupkowymi, które ukazują stymulowane przez LPS i 3amyloid (mieszanina 3 peptydów amyloidowych βΑ: fragment 25-35; βΒ: fragment 1-40 i βθ: fragment 1-16) wytwarzanie IL-6 (panele A i C) oraz IL-10 (panele B i D) przez PBMC 47 pacjentów AD (O) i 25 zdrowych osób z grupy kontrolnej, dopasowanych pod względem wieku i płci (O). Wartości średnie + błędy standardowe. p<0,023;

P r z y k ł a d 1

Pacjenci i grupa kontrolna

Do badania nad chorobą Alzheimera włączono czterdzieścioro siedmioro pacjentów AD i 25 osób nie wykazujących demencji (HC). Pacjentów tych wybrano z większej populacji, badanej na Oddziale Geriatrycznym Ospedale Maggiore IRCCS Uniwersytetu Mediolańskiego, Włochy. Dla uzyskania diagnozy klinicznej AD przyjęto kryteria DMS IV i NINCDS-ADRDA (23). Zdolności poznawcze i zaburzenia oceniano według Mini-Mental State Evaluation (MMSE). Pacjenci AD oraz HC mieszkali w domu i w dniu pobrania krwi zostali szczegółowo zbadani, a ich historie choroby oceniane. W celu minimalizacji ryzyka klinicznych lub subklinicznych procesów zapalnych wszystkich pacjentów wybrano w następujący sposób: do badania włączono tylko AD i HC nie wykazujących klinicznych objawów stanu zapalnego (np. normalna temperatura ciała lub brak towarzyszącej choroby zapalnej). Uwzględniono również parametry chemiczne krwi i wyłączono pacjentów z niewłaściwym opadem erytrocytów lub zaburzeniami profilu albuminy we krwi lub transferyny w osoczu. Dalszej selekcji pacjentów AD dokonano na podstawie poziomu białka reaktywnego C (CRP, z ang. C reactive protein), nie włączając do badania pacjentów z CRP powyżej 5 mg/l (wartość średnia ± 2 odchylenia standardowe wartości kontrolnej).

Osoby z grupy kontrolnej i krewny każdego z pacjentów AD udzielili świadomej zgody na udział w badaniu.

Pobieranie próbek krwi

Krew pełną pobierano z żyły do probówek typu Vacutainer, zawierających EDTA (Becton Dickinson Co, Rutherford, NJ). Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oddzielono przez wirowanie w medium do rozdziału limfocytów (Organon Teknika Corp., Durham, NC) i przemyto dwukrotnie w PBS. Ilość żywych limfocytów wyznaczono za pomocą testu wyłączania barwnika trypan blue i hemocytometru.

Wytwarzanie cytokin in vitro

PBMC zawieszono przy 3 x 106/ml w RPMI 1640 i albo pozostawiono bez stymulacji, albo stymulowano za pomocą LPS (Sigma, ST. Louis, MI) (10 g/ml), następującą mieszaniną 3 różnych peptydów z białka b-amyloidowego b-A: fragment 25-35 (25 mg/ml); b-B: fragment 1-40 (150 ng/ml); b-C: fragment 1-16 (150 ng/ml) (Sigma, St. Louis, MI); lub szczepionką przeciw wirusowi grypy (A/Tajwan+A/Szanghaj+B/Victoria)(24 g/l; rozcieńczenie końcowe 1:1000)(Flu)(antygen kontrolny) w 37°C w wilgotnej atmosferze 7% CO2. Supernatanty zebrano po 48 godzinach do stymulacji LPS i po 5 dniach kultury do peptydów białka b-amyloidowego i Flu. Wytwarzanie IL-2 i IL- 10 przez PBMC oznaczono za pomocą dostępnych na rynku zestawów do testów ELISA (ACCUCYTE, Cytimmune Science, Inc, College Park, MD). Wszystkich zestawów do testów użyto według procedur zaproponowanych przez producentów.

Genotypowanie IL-10

DNA genomowe wyodrębniono z krwi obwodowej zadanej EDTA (10 ml) za pomocą standardowego sposobu z użyciem proteinazy K i fenolu/chloroformu. Stężenie i czystość DNA ustalono za pomocą analizy spektrofotometrycznej. Do zbadania genotypów IL-10 zastosowano metodologię swoistych sekwencyjnie starterów łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR-SSP, z ang. polymerase chain reaction-sequence specific primers). Amplifikację sekwencji w obszarze promotorowym genu IL-10 (pozycje polimorficzne -1082, -819, -592) wykonano za pomocą Cytokine genotyping Tray Method (One Lambda, Canoga Park, CA, USA); gen β-globiny człowieka został amplifikowany jako standard wewnętrzny preparatu DNA genomowego. Warunki PCR zostały podane przez program PCR One Lambda (OLI-1); wizualizację produktów PCR uzyskano za pomocą elektroforezy w 2,5% żelu agarozowym.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną wykonano za pomocą pakietu statystycznego SPSS (SPSS, Chicago, IL). Różnice w wytwarzaniu IL-10 uzyskano za pomocą procedur analitycznych, opartych na analizie nieparametrycznej (Mann-Whitney); porównań pomiędzy różnymi grupami pacjentów wykonano za pomocą dokładnego testu dwustronnego Fishera. Częstości w genotypie porównano pomiędzy grupami

PL 214 984 B1 ₂ badania za pomocą testu c², z ustalonym poziomem istotności testu poniżej 0,05. Porównania wartości średnich wieku pojawienia się choroby i MMSE w sześciu różnych grupach AD wykonano za pomocą jednostronne analizy wariancji (ANOVA).

Wiek, płeć i wyniki MMSE u pacjentów AD i u HC

Do badania włączono czterdzieścioro siedmioro pacjentów AD i 25 osób nie wykazujących demencj i (HC), dobranych pod względem wieku. Mini-Mental State Evaluation (MMSE) wykazała obecność zakresu utraty funkcji poznawczych od łagodnego ciężkiego u pacjentów AD. Te dane przedstawiono w Tabeli I.

Stymulowane przez MBP wytwarzanie IL-10 jest obniżone u pacjentów AD

PBMC od 47 pacjentów AD i 25 HC, dobranych pod względem wieku i płci stymulowano mitogenem (LPS); mieszaniną 3 peptydów amyloidowych (A: fragment 25-35; B: fragment 1-4 0 i C: fragment 1-16 (amyloid) Flu (zastosowaną jako antygen standardowy), a wytwarzanie IL-2 i IL-10 mierzono za pomocą metodyki ELISA. Nie stwierdzono różnic przy porównaniu wytwarzania IL-2 i IL-10 stymulowanego przez LPS lub Flu u pacjentów AD i HC. Stymulowane przez amyloid wytwarzanie IL-2 w obu badanych grupach osób również było podobne. W przeciwieństwie do tych wyników, stymulowane przez amyloid wytwarzanie IL-10 było znacząco obniżone (p = 0,023) u pacjentów AD w porównaniu z grupą kontrolną. Te dane przedstawia Fig. 1.

Dystrybucja genotypów wytwarzających wysoki, pośredni lub niski poziom IL-10 u pacjentów AD wykazuje odchylenie.

Fig. 2 przedstawia paradygmatyczny przykład sześciu różnych genotypów IL-10, uzyskany za pomocą PCR-SSP, a ich względna dystrybucja w typowej populacji rasy białej jest przedstawiona w Tabeli II.

W przeciwieństwie do dystrybucji zaobserwowanej u HC, częstości występowania pomiędzy pacjentami ₂

AD są znacząco odchylone c² = 16,007, z p = 0,007) (Tabela II). Genotypy, odpowiadające obniżonemu wytwarzaniu IL-10 (genotypy ACC/ACC, ACC/ATA, ATA/ATA) mają znacząco wyższą dystrybucję pomiędzy pacjentów AD (odpowiednio 17%, 26% i 11% wobec 4%, 16%, 4% w HC). Ponadto stosunek GCC/ACC do GCC/ATA (fenotyp pośredni) wynosi 1:1 w AD, a 3:1 w HC.

Niskie wytwarzanie IL-10 jest skorelowane z pogorszeniem przebiegu klinicznego AD

By zanalizować możliwe objawy kliniczne, towarzyszące obecności genotypu niskiego poziomu IL-10, zbadaliśmy następnie te sześć genotypów w związku z wiekiem wystąpienia AD (Tabela III) i postępem zaniku zdolności poznawczych (Tabela IV). Wyniki potwierdziły, że obecność genotypów, wytwarzających mało IL-10, jest rzeczywiście związana z pogorszeniem przebiegu klinicznego AD. Obecność genotypów ATA/ATA i GCC/ATA jest więc związana z wcześniejszym wiekiem wystąpienia choroby (analiza wariancji ANOVA: p = 0,042) (Tabela III); w dodatku wykryto korelację ujemną pomiędzy ACC/ATA i ACC/ACC, genotypami, wytwarzającymi niski poziom IL-10 i wynikiem MMSE (analiza wariancji ANOVA: p = 0,010) (Tabela IV).

T a b e l a IV. Dane Stowarzyszenia Genetycznego dla chorób autoimmunizacyjnych/zapalnych www.grc.nia.nih.g ov/b ra n ches/rrb/d na/geneticdata.htm

Chrom	CH- prążek	Gen	Choroba	Allel	Wartość P	Odnośnik	PubMedID
1	2	3	4	5	6	7	8
1	1q31.1	CD45	Stwardnienie rozsiane	C brak G w pozycji 77 eksonu 4 PTPRC.	P=1,5 10-4	Jacobsen M 0 0	11101853
1	1q31.1	CD45	Twardzina układowa	Delecja	brak	Kung C 00	10700239
	mysz	CD45	Autoimmunologiczne zapalenie nerek	Kwas glutaminowy 613 na argininę	brak	Majeti R 00	11163182
1	1q32.1	IL10	Toczeń rumieniowaty układowy	-4kb do 5'	P=0,0001	Gibson AW 01	11238636
1	1q32.1	IL10	Zespół Sjogrena	haplotyp-10 GCC (G-1082, C-819, i C-592 genu IL-10	P=<0,05	Hulkkonen J 01	11212157

PL 214 984 B1 cd. Tabeli IV

1	2	3	4	5	6	7	8
1	1q32.1	IL10	Reumatoidalne zapalenie stawów	genotyp -1082GG	P=<0,03	Huizinga TW 00	11085795
1	1q32.1	IL10	Reumatoidalne zapalenie stawów	haplotyp ATA, pacjenci z/>4 stawami	P=0,02	Crawley E 99	10366102
1	1q32.1	IL10	Choroba odrzucenia gospodarza	IL-10 (-)1064	P=<,001	Middleton PG 98	9808588
1	1q32.1	IL10	Choroba zapalna jelit/wrzodziejące zapalenie jelita	allel -1082*G (wysoka produkcja) rzadszy u pacjentów	P=0,03	Tagore A 99	10551422
2	2q12.2	IL1RA	Toczeń rumieniowaty układowy	Allel IL1RN*2	brak	Blakemore AL 94	7945503
2	2q12.2	IL1RA	Wrzodziejące zapalenie jelita grubego	Allel IL1RN*2	P=0,007	Mansfield JC 94	8119534
2	2q12.2	IL1RA	Polimialgia reumatyczna	Allel IL1RN*2	brak	Boiardi L 00	11138328
2	2q33.1	CTLA4	Reumatoidalne zapalenie stawów	A/G 49	P=0,009	Gonzalez MF 99	10203024
2	2q33.1	CTLA4	Choroba GravesaBasedowa	A/G 49	P=<0,01	Yabrakgawa T 97	9459626
2	2q33.1	CTLA4	Stwardnienie rozsiane	A/G 49	P=0,006	Harbo HF 99	10082437
2	2q33.1	CTLA4	Choroba Hashimoto	A/G 49	P=<0,003	Donner H 97	9398726
2	2q33.1	CTLA4	Cukrzyca insulinozależna	A/G 49	P=0,004	Takahiro A 99
2	2q33.1	CTLA4	Cukrzyca insulinozależna		brak	Yabrakgawa T 99	10052685
2	2q33.1	CTLA4	Cukrzyca insulinozależna	A/G 49	P=0,00002	Marron MP 97	9259273
5	5q31.1	IL4	Choroba GravesaBasedowa	Allel w pozycji 590 rzadszy w GD	P=0,00004	Hunt PJ 00	10843185
5	5q31.1	IL4	Podwyższenie IgE	Polimorfizm C+33T z podwyższeniem całkowitego IgE w surowicy	P=<0,05	Suzuki I 00	11122213
5	5q31.1	IL4	astma, FEV(1)	Genotyp promotora IL- 4 C-589T (TT)	P=0,013	Burchard EG 99	10471619
5	5q31.1	IL4	Reumatoidalne zapalenie stawów	-590C/T	P=0,001	Kawashima T 98	9643293
5	5q31.1	IL4	Reumatoidalne zapalenie stawów	IL-4(2) podwyższona w niedestruktywnym przebiegu choroby	P=0,0006	Buchs N 00	11035134
5	5q31.1	IL4	Stwardnienie rozsiane	Allel B1 IL-4, późne wystąpienie choroby	P=<0,001	Vandenbroeck K 97	9184650

PL 214 984 B1 cd. Tabeli IV

1	2	3	4	5	6	7	8
5	5q31.1	IL13	Astma	Gln110Arg	P=0,017	Heinzmann A 00	10699178
5	5q31.1	IL13	Astma	C na T w pozycji -1055 (TT)	P=0,002	van der Pouw Kraan TC 99	11197307
6	6p21.31	TNFa	Astma	G/A -308 TNF2	P=0,003	Albuquerque R 98	9645594
6	6p21.31	TNFa	Pierwotna żółciowa marskość wątroby	G/A -308 TNF1	P=0,02	Gordon M 99	10453936
6	6p21.31	TNFa	Sepsa	G/A -308 TNF2	P=0,007	Majetschak M 99	10450735
6	6p21.31	TNFa	Łuszczyca	G/A -308 TNF1	P=2,74 X 10 -8	Arias A 97	9395887
6	6p21 .31	TNFa	Trąd	G/A -308	P=, 02	Roy S 97	9237725
6	6p21 .31	TNFa	Choroba odrzucenia gospodarza	TNFd	P=,006	Middleton PG 98	9808588
6	6p21 .31	TNFa	Pylica krzemowa	G/A -308 TNF1	P=<0,05	Yucesoy B 01	11264025
6	6p21.31	TNFa	Toczeń rumieniowaty układowy	G/A -308 TNF1	brak	Sullivan KE 97	9416858
6	6p21.31	TNFa	Celiakia	G/A -308 TNF1	P=<0,001	McManus R 96	8655356
6	6p21.31	TNFa	Przewlekłe zapalenie oskrzeli	G/A -308 TNF1	P=<0,01	Huang S 97	9372657
6	6p21.31	TNFa	Łuszczyca	-238 TNF1	P=1,64 X 10 -7	Arias A 97	9395887
7	7p15.3	IL6	Cukrzyca insulinozależna	G,G(-174) podwyższone u pacjentów	P=<0,002	Jahromi MM 00	11054276
7	7p15.3	IL6	Toczeń rumieniowaty układowy	Minisatelita bogaty w AT w obszarze sąsiadującym z 3'	P=0,001	Linker-Israeli M 99	11197305
7	7p15.3	IL6	Reumatoidalne zapalenie stawów	Allele 622 i -174 wiek wystąpienia	brak	Pascual M 00	11196696
7	7p15.3	IL6	Stwardnienie rozsiane	Przeniesienie większych alleli A6->A9, przyspieszone wystąpienie	P=0,025
12	12q12	VDR	Choroba Gravesa-Basedowa	ekson 2 polimorfizm kodonu inicjacyjnego (VDR-FOK:I)	P=0,023	Ban Y 00	11134121
12	12q12	VDR	Reumatoidalne zapalenie stawów	genotyp BB/tt	brak	Garcia-Lozano JR 01	11251690
12	12q12	VDR	Stwardnienie rozsiane	Bb	P=0,0263	Fukazawa T 00	10465499
12	12q12	VDR	Choroba Leśniewskiego-Crohna	TT	P=0,017	Simmons JD 00 0	10896912
12	12q12	VDR	Cukrzyca insulinozależna	Bsml	P=0,015	Chang TJ 00	10792336

PL 214 984 B1 cd. Tabeli IV

1	2	3	4	5	6	7	8
12	12q21.1	IFNG	Astma	Polimorfizm powtórzeń CA wewnątrz pierwszego intronu	P=0,0018	Brakkao F 01	11240951
12	12q21.1	IFNG	Cukrzyca insulinozależna	Polimorfizm powtórzeń CA wewnątrz pierwszego intronu	P=0,039	Awata T 94	7867888
12	12q21.1	IFNG	Choroba Gravesa-Basedowa	Polimorfizm powtórzeń CA wewnątrz pierwszego intronu	P=<0,04	Siegmund T 98	9848715
12	12q21.1	IFNG	Reumatoidalne zapalenie stawów	Polimorfizm powtórzeń CA wewnątrz pierwszego intronu	P=<0,0001	Khani-Hanjani A 00	11022930
16	16p11.1	IL4R	Astma	Ile50Val	P=<0,0001	Mitsuyasu H 98	9620765
16	16p11.1	IL4R	Zespół hiper-IgE i ostra wysypka atopowa	Arg576G	P=0,001	Hershey GKK 97	9392697
16	16p11. I	IL4R	Stwardnienie rozsiane (pierwotne postępujące)	wariant R551 IL4R	P=0,001	Hackstein H 01	11164908

[DNA Array Unit] [IRP Home] [NIA Home]

P r z y k ł a d 2

Pacjenci i grupa kontrolna

Włączono sześćdzieśęcioro pięcioro pacjentów AD (44 K/21 M, średni wiek 80 ± 2) i 65 zdrowych osób nie wykazujących demencji, dobranych pod względem płci i wieku (HC). Pacjentów tych wybrano z większej populacji, badanej na Oddziale Geriatrycznym Ospedale Maggiore IRCCS Uniwersytetu Mediolańskiego, Włochy. Dla uzyskania diagnozy klinicznej AD przyjęliśmy kryteria DMS IV i NINCDS-ADRDA (23); dla każdej z osób badanych był dostępny wykonany niedawno pomiar rezonansu magnetycznego mózgu (MRI)/ tomografii komputerowej (CT). Zdolności poznawcze i zaburzenia oceniano według Mini-Mental State Evaluation (MMSE). Pacjenci AD oraz HC mieszkali w domu i w dniu pobrania krwi zostali szczegółowo zbadani, a ich historie choroby przejrzane.

W celu minimalizacji ryzyka klinicznych lub subklinicznych procesów zapalnych wszystkich pacjentów wybrano w następujący sposób: do badania włączono tylko AD i HC nie wykazujących klinicznych objawów stanu zapalnego (np. normalna temperatura ciała lub brak towarzyszącej choroby zapalnej). Wykonano również parametry chemiczne krwi i wyłączono pacjentów z niewłaściwym opadem erytrocytów lub zaburzeniami profilu albuminy we krwi lub transferyny w osoczu. Dalszej selekcji pacjentów AD dokonano na podstawie poziomu białka reaktywnego C (CRP, z ang. C reactive protein), nie włączając do badania pacjentów z CRP powyżej 5 mg/l (wartość średnia ± 2 odchylenia standardowe wartości kontrolnej).

Wszystkie osoby badania, lub ich krewni udzielili świadomej zgody na udział w badaniu. Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego.

Pobieranie próbek krwi.

Krew pełną pobierano z żyły do probówek typu Vacutainer, zawierających EDTA (Becton Dickinson Co, Rutherford, NJ). Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) oddzielono przez wirowanie w medium do rozdziału limfocytów (Organon Teknika Corp., Durham, NC) i przemyto dwukrotnie w PBS. Ilość żywych limfocytów wyznaczono za pomocą testu wyłączania barwnika trypan blue i hemocytometru.

Genotypowanie

DNA genomowe wyodrębniono za pomocą standardowego sposobu z użyciem proteinazy K i fenolu/chloroformu. Stężenie i czystość DNA ustalono za pomocą analizy spektrofotometrycznej. Do zbadania genotypów IL-10 oraz IL-6 zastosowano metodologię swoistych sekwencyjnie starterów

PL 214 984 B1 łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR-SSP). Amplifikację sekwencji w obszarze promotorowym genów IL-10 (pozycje polimorficzne -1082, -819, -592) oraz IL-6 (pozycja polimorficzna -174) wykonano za pomocą cytokine genotyping tray method (One Lambda, Canoga Park, CA, USA); gen β-globiny człowieka został amplifikowany jako standard wewnętrzny preparatu DNA genomowego. Warunki PCR zostały podane przez program PCR One Lambda (OLI-1); wizualizację produktów PCR uzyskano za pomocą elektroforezy w 2,5% żelu agarozowym.

Genotypy ApoE określono przez amplifikację PCR fragmentu o wielkości 234 par zasad eksonu 4 genu ApoE, po którym następowało trawienie z użyciem Cfo1. Szlaki restrykcyjne otrzymano przez elektroforezę żelową.

Wytwarzanie cytokin in vitro

PBMC zawieszono przy 3 x 10⁶/ml w RPMI 1640 i albo pozostawiono bez stymulacji, albo stymulowano za pomocą LPS (Sigma, ST. Louis, MI) (10 μg/ml), następującą mieszaniną trzech peptydów z białka β-amyloidowego: β-Α, fragment 25-35 (25 g/ml); β-Β, fragment 1-40 (150 ng/ml); β-C, fragment 1-16 (150 ng/ml) (Sigma, St. Louis, MI); lub szczepionką przeciw wirusowi grypy (A/Tajwan+A/Szanghaj+B/Victoria)(24 μ-g/l; rozcieńczenie końcowe 1:1000)(Flu)(antygen kontrolny) w 37°C w wilgotnej atmosferze 7% CO₂. Supernatanty zebrano po 48 godzinach do stymulacji LPS i po 5 dniach kultury do peptydów białka β-amyloidowego. Wytwarzanie IL-10 i IL-6 przez PBMC oznaczono za pomocą dostępnych w handlu zestawów do testów ELISA (ACCUCYTE, Cytimmune Science, Inc, College Park, MD). Wszystkich zestawów do testów użyto według procedur zaproponowanych przez producentów.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną wykonano za pomocą pakietu statystycznego SPSS (SPSS, Chicago, IL).

₂

Częstości w genotypie porównano pomiędzy grupami badania za pomocą testu χ², z poziomem istotności poniżej 0,05. Wyliczono również iloraz szans (OR, z ang. odds ratio) i przedziały ufności 95% (Cl, z ang. confidence levels). Skorygowane wartości OR oszacowano za pomocą regresji logistycznej, z kontrolą statusu nośnika dla ApoE 4. Homogenność OR pomiędzy warstwami oceniono przez uwzględnienie w modelu odpowiednich członów oddziaływań. Różnice w wytwarzaniu IL-10 oraz IL-6 uzyskano za pomocą procedur analitycznych, opartych na analizie nieparametrycznej (MannWhitney); porównań pomiędzy różnymi grupami pacjentów wykonano za pomocą dokładnego testu dwustronnego Fishera.

Dystrybucja genotypów wytwarzających wysoki, pośredni lub niski poziom IL-10 u pacjentów AD wykazuje odchylenie

Genotyp i częstości alleli polimorfizmu biallelicznego w pozycji -1082 przedstawiono w Tabeli V. Ten SNP zmienia aktywację transkrypcyjną, z efektem związanym z dawkowaniem genu, tak że genotyp GG jest skorelowany z wysokim, GA z pośrednim, a AA z niskim wytwarzaniem IL-10 po stymulacji komórek T in vitro (57). Pacjenci AD wykazują znacząco wyższą częstość allelu -1082A o niskim wytwarzaniu, który powoduje odchylenie dystrybucji genotypu u AD w porównaniu z HC, ze znaczącym spadkiem genotypu -1082GG, o wysokim wytwarzaniu (Tabela V).

T a b e l a V. Częstość różnych genotypów i alleli IL-10, stwierdzonych u pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) i u zdrowych osób z grupy kontrolnej, dobranych pod względem wieku.

	Genotyp	Allel
G/G (H)a	G/A (M)	A/A (L)	A	G
AD	4 (6,4%)	28 (44,4%)	31 (49,2%)	90 (71,4%)	36 (28,6%)
HC	14 (22,2%)	29 (46%)	20 (31,8%)	69 (54,8%)	57 (45,2%)

^a Odnośne fenotypy: wysoki (H), pośredni (M), niski (L) są ukazane w nawiasach Genotyp: χ² = 7,946, df= 2, p = 0,019 Allel: χ² = 6,817, df= 1, p = 0,009

Ten SNP jest powiązany z dwoma innymi SNP w pozycjach - 819 i -592. Łączą się z allelami mikrosatelitarnymi, tworząc haplotypy, w których za różnicę w wytwarzaniu IL-10 odpowiedzialny jest głównie SNP -1082 (38, 42). Częstości genotypów i alleli SNP -819 CT i -592 CA mają podobną dystrybucję w naszych próbkach AD i HC (danych nie pokazano).

PL 214 984 B1

Allel -174C w genie IL-6 jest nadreprezentowany u pacjentów AD

Dystrybucja genotypów i alleli IL-6 u HC i AD jest przedstawiona w Tabeli 6. Ten polimorfizm funkcjonalny wydaje się również związany z poziomem IL-6 w osoczu (54). Wyniki dystrybucji genotypu w naszych próbkach AD i HC wykazują niższą częstość genotypu GG u pacjentów AD. Podobnie dystrybucja alleli pomiędzy dwiema grupami jest znacząca różna, z allelem C znacząco podwyższonym w AD (Tabela VI).

T a b e l a VI. Częstość różnych genotypów i alleli IL-6, stwierdzonych u pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) i u zdrowych osób z grupy kontrolnej, dobranych pod względem wieku.

	Genotyp	Allel
G/G (H)a	G/C (H)	C/C (L)	C	G
AD	17 (29%)	34 (57,6%)	8 (13,4%)	50 (42,4%)	68 (57,6%)
HC	32 (50%)	27 (42,2%)	5 (7,8%)	37 (28,9%)	91 (71,1%)

^a fenotypy: wysoki (H) i niski (L) są ukazane w nawiasach

Genotyp: χ² = 5,894, df = 2, p= 0,052 Allel: χ² = 4,300, df = 1, p= 0,038

Kombinacja alleli IL-10 oraz IL-6 i względne ryzyko rozwoju AD

Zbadaliśmy, czy jakaś z kombinacji alleli IL-10 GA i IL6 GC wpływa na ryzyko AD. Jednoczesna obecność alleli IL-10 A i IL-6 C znacząco podnosi ryzyko, niezależnie od statusu ApoE4 (Tabela VII). Oba genotypy IL-10 A/A i IL-6 C/C osobno niosą mniejszy wzrost ryzyka choroby (OR 5,8, Cl 1,7-20, p=0, 005; OR 3,0, Cl 0,9-10,6, p=0,087).

T a b e l a VII. Allele IL-10 i IL-6 i ryzyko choroby Alzheimera

IL-10	IL-6	OR	95% Cl	skor. OR	95% Cl
Allel G	Allel G	1		1
G	C	2,8	0,2 - 40	0,9	0,1 - 26,5
A	G	4,6	0,5 - 41	3,3	0,3 - 36,3
A	C	11,2*	1,3 - 97,3	10,3*	1,0 - 108

7* p >0.05;

OR: iloraz szans surowy; adj. OR: iloraz szans skorygowany za pomocą apolipoproteiny E ε4;

Cl: przedział ufności (z ang. confidence interval)

Stymulowane przez LPS, Flu i peptydy amyloidowe wytwarzanie IL-10 oraz IL-6 jest obniżone u pacjentów AD

PBMC od 47 pacjentów AD i 2 5 HC, dobranych pod względem wieku i płci stymulowano mitogenem (LPS); mieszaniną 3 peptydów β-amyloidowych ^A, fragment 25-35; βΒ, fragment 1- 40; βθ, fragment 1-16) lub z Flu, a wytwarzanie IL-6 i IL-10 mierzono za pomocą metodyki ELISA. Nie stwierdzono różnic przy porównaniu wytwarzania IL-6 i IL-10 stymulowanego przez LPS lub fiu u pacjentów AD i HC. W przeciwieństwie do tego, gdy zanalizowano stymulowane przez β-amyloid wytwarzanie IL-6 i IL-10, stwierdzono marginalny wzrost wytwarzania IL-6 i znaczące obniżenie wytwarzania IL-10 (p = 0,023) u pacjentów AD w porównaniu z HC, co sugeruje swoiste antygenowo zaburzenie wytwarzania tych cytokin. Te dane przedstawia Fig. 3.

Przyczynowa rola przewlekłego zapalenia w patogenezie AD pozostaje wciąż zasadniczo spekulatywna (24, 25). Niemniej zaproponowano „cykl cytokinowy (19), w którym cytokiny przeciwzapalne (IL-4, IL-10 i IL-13) regulują wywołane przez β-amyloid reakcje zapalne mikrogleju/makrofagów i modyfikują aktywność mikrogleju, otaczającego amyloidowe płytki neurytowe (52). Te cytokiny mogą hamować indukcję IL-1, TNF-α i MCP-1 w zróżnicowanych monocytach człowieka, a ponad wszystko IL-10 powoduje zależne od dawki hamowanie wydzielania IL-6, wywołane przez β-amyloid w tych komórkach i w mikrogleju myszy (19).

Z klinicznego punktu widzenia IL-10 uczestniczy w chorobach autoimmunizacyjnych (41, 42, 26) i nowotworowych (31, 27, 43), gdzie wyższe poziomy cytokin zależą od tła genetycznego (59), ale mają również wpływ na przebieg infekcji (34, 40, 37).

Spójniejsze są dowody co do roli IL-6 w patogenezie AD. Zaobserwowano podwyższenie immunoreaktywności IL-6 w pobliżu płytek neurytowych w mózgach tych pacjentów (67); IL-6 indukuje

PL 214 984 B1 syntezę białka prekursorowego β-amyloidu (69), a w modelach myszy transgenicznych podwyższone poziomy IL-6 w OUN powodują efekty neuropatogenne i niedobory funkcji poznawczych (51).

Opublikowano redukcję aktywności cytokin przez allel C VNTR w genie IL-6 (61). Skorelowano allel C VNTR w genie IL-6 z opóźnieniem pojawiania się i obniżeniem ryzyka AD w populacji niemieckiej (63). Polimorfizm funkcjonalny -178 obszaru promotorowego może również mieć wkład do rozwoju fenotypu AD, ze względu na jego związek ze stężeniem cytokiny w osoczu (54). Jednak dla dwóch grup klinicznych o różnym pochodzeniu etnicznym wyniki były dyskusyjne (49).

W naszej próbie dane z analizy SNP wykazały, że HC posiada dystrybucję alleli IL-10 i IL-6 podobną do populacji włoskiej (65). Co ważniejsze, niniejsze wyniki wskazują na znacząco wyższy odsetek nosicieli IL-10 -1082A pośród przypadków AD. Niedawna publikacja o włoskich stulatkach, którzy są oczywiście mniej podatni, niż osoby młodsze, na choroby związane z wiekiem, wykazała że ekstremalna długowieczność jest znacząco związana z genotypami wytwarzającymi dużo IL-10 (58).

Jak donosiliśmy uprzednio, wyniki dotyczące SNP IL-6 są bardziej sprzeczne. Allel G IL-6 wydaje się istotny w AD u Japończyków (66), a także w południowych Włoszech (64), gdy tymczasem w naszej próbie to allel C jest nadreprezentowany.

W celu powiązania tych różnorodnych ujawnień, należy rozważyć kilka kwestii. Pochodzenie etniczne może mieć silny wpływ na rolę genetycznych czynników ryzyka, tak jak i dystrybucja wariantów genów w populacjach różnych krajów europejskich, lub nawet z różnych obszarów w tym samym kraju (53, 55, 60, 62, 70). Ponadto związek pomiędzy AD i SNP IL-6 może być ograniczony do szczególnej grupy wiekowej, a w naszej próbie zarówno wszyscy pacjenci AD, jak i HC byli starzy.

Wreszcie musimy rozważyć rolę, którą odgrywa gen lub kilka genów w zaburzeniu równowagi dla powiązania z tą mutacją: dla Niemców opisano silne zaburzenie równowagi pomiędzy SNP -174 i polimorfizmem VNTR obszaru sąsiadująceo z 3' genu IL-6 (49).

Głównym ujawnieniem tego badania była identyfikacja grupy pacjentów z dużym ryzykiem AD o późnym początku, na podstawie jednoczesnej obecności alleli -1082A IL-10 i -174 IL-6. Zbadaliśmy również oddziaływania pomiędzy Apo E i genami IL-10 i IL-6, ale nie znaleźliśmy dowodów na obecność efektów synergicznych, co sugeruje, że te allele związane z zapaleniem są dodatkowym i niezależnym czynnikiem ryzyka dla AD.

By rzucić więcej światła na wyniki genetyczne, twórcy zanalizowali również swoiste dla LPS, Flu i peptydu β-amyloidowego wytwarzanie IL-10 i IL-6 przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) w podgrupie pacjentów AD i dobranych pod względem wieku HC. Wyniki wykazały, że: 1) wytwarzanie IL-6 przez PBMC pacjentów AD i grupy kontrolnej nie różniło się znacząco dla wszystkich zastosowanych warunków oraz 2) wytwarzanie IL-10 przez PBMC stymulowane przez LPS i Flu było porównywalne pomiędzy obydwiema grupami osób, gdy tymczasem w AD wystąpiło swoiste dla β-amyloidu zaburzenie odporności, charakteryzujące się obniżeniem wytwarzania IL-10. Obserwacja, że zaburzenia równowagi dla tej cytokiny nie stwierdzono w PBMC stymulowanych przez mitogen, wskazuje, że reakcje odpornościowe swoiste dla amyloidu są wybiórczo zaburzone u pacjentów AD. Ponadto wyniki, wykazujące, że proliferacja po stymulacji przez flu była zbliżona u pacjentów i w grupie kontrolnej, wskazują, że przetwarzanie antygenu i jego prezentacja w powiązaniu z cząsteczkami HLA klasy II oraz samoograniczający się szlak CD4-HLA klasy II aktywacji układu odpornościowego (44) nie są uszkodzone u tych pacjentów. Można zatem pomyśleć o scenariuszu biologicznym, w którym obniżenie swoistego dla amyloidu wytwarzania IL-10 sprzyjałoby powstawaniu przewlekłego stanu zapalnego, obserwowanego w mózgu AD. U osób, które nie są chore na AD może być aktywny obwód hamującego sprzężenia zwrotnego swoisty dla amyloidu, w którym pośredniczy IL-10, przerwanie tego obwodu może być związane z, lub zapowiadać rozwój AD. Przekonywująca publikacja wykazała ostatnio, że obwód prozapalny IL-10, który działa wśród komórek wrodzonego układu odpornościowego, reguluje podatność na choroby autoimmunologiczne (48). Nasze wyniki rozszerzają tą koncepcję, wykazując, że zaburzenie tego obwodu występuje u pacjentów AD. Całość danych potwierdza teorię, według której o całkowitym ryzyku rozwoju AD może decydować „profil podatności, który odzwierciedla połączone efekty dziedziczenia wielu alleli wysokiego ryzyka i rzuca światło na kluczową rolę SNP IL-10 i IL-6 w tym profilu.

Stan zapalny bierze udział w patogenezie choroby Alzheimera (AD), a interleukina przeciwzapalna interleukina-10 (IL-10) może przeciwdziałać aktywności IL-6 w mózgu. Jako że promotor tych genów jest polimorficzny, u 65 pacjentów AD i 65 zdrowych osób z grupy kontrolnej (HC) zbadano allele -1082 GA IL-10 i -174 GC IL-6. W kilku przypadkach zbadano również wytwarzanie IL-10 i IL-6 przez PBMC. Dla IL-10 stwierdzono znacząco wyższy poziom genotypu -1082GG (p=0,019) w AD niż HC, a dla IL-6 genotyp

PL 214 984 B1

G/G był rzadszy, a allel C częstszy (p<0,005). Współwystępowanie alleli IL-10 A i IL-6 C znacząco podnosi ryzyko AD (iloraz szans: OR 11,2, przedział ufności: Cl 1,3-97,3; p<0,05) niezależnie od ApoE4 (skorygowany OR 10,3, Cl 1-108; p<0,05). Tylko stymulowane przez amyloid wytwarzanie IL-10 różniło się pomiędzy AD i HC (p=0,023). Te wyniki są sprzeczne z teorią zapalną w AD, wskazując na kluczową rolę polimorfizmów IL-10 i IL-6 i wybiórcze zaburzanie tej sieci.

P r z y k ł a d 3

Analiza genotypowa interferonu-γ i TNF-a.

Sposoby, opisane w poprzedzających Przykładach zostały użyte do wykonania analizy genot ypowej interferonu-γ i TNF-α u pacjentów AD i zdrowych osobach z grupy kontrolnej. Podsumowanie wyników przedstawiają tabele VIII i IX.

T a b e l a VIII. Dystrybucja genotypu IFN-γ

	Genotyp (c)	Allel
T/T (H)	T/A (I)	A/A (L)	T	A
AD	11 (15,5%)	35 (49,3%)	25 (35,2%)	57 (40%)	85 (60%)
HC	11 (18%)	31 (51%)	19 (31%)	53 (43%)	69 (57%)

Częstości poszczególnych genotypów pośród pacjentów chorych na chorobę Alzheimera (AD) nie różnią się statystycznie od zdrowych osób z grupy kontrolnej (HC).

χ² = 0,305, df = 2, p = 0,859.

W nawiasach (c) podano odpowiednie fenotypy wysoki (H), pośredni (M) i niski (L).

Allel: χ² = 0,174, df = 1, p = 0,676.

T a b e l a IX. Dystrybucja genotypu TNF-a

	Genotyp	Allel
G/G (L)a	G/A (H)	A/A (H)	C	G
AD	60 (82%)	12 (16,5%)	1 (1,5%)	132 (90%)	14 (10%)
HC	32 (69%)	13 (28%)	1 (3%)	77 (84%)	15 (16%)

Częstości poszczególnych genotypów pośród pacjentów chorych na chorobę Alzheimera (AD) nie różnią się statystycznie od zdrowych osób z grupy kontrolnej (HC) a wysokie (H) i niskie (L) fenotypy podano w nawiasach

Genotyp: χ² = 2,568, df = 2, p = 0,277

Allel: χ² = 1,792, df = 1, p = 0,181.

Nie ma istotnych statystycznie różnic, gdy porównuje się pacjentów AD i osoby z grupy kontrolnej, co wskazuje, że ani interferon-γ, ani TNF-a nie są związane z prawdopodobieństwem rozwoju choroby Alzheimera.

W przeciwieństwie do tego niniejszy wynalazek wykazuje, że IL-10 i IL-6 dają wysoką skuteczność przewidywania wystąpienia choroby Alzheimera i być może również przewidywania postępu choroby. Najlepszą zdolność przewidywania uzyska się przez połączenie testów genotypowych na wiele polimorfizmów genów, np. IL-10, IL-6, Apo-E i inne, dla których wykazano związek z chorobą Alzheimera.

Literatura

1. Ernst, R.L. i J.W. Hay. 1994. The US economic i social costs of Alzheimer's disease revised. Am. J. Public Health. 84:1261.

2. Goate, A., M.C. Chartier-Harlin, M. Mullan, J. Brown, F. Crawford, L. Fidani, L. Giuffra, A. Haynes, N. Irving, L. James, R. Mant, P. Newton, K. Rook, P. Roques, C. Talbot, M. Pericak-Vance, A. Roses, R. Williamson, M. Rossor, M. Owen i J. Hardy. 1991. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349:704.

3. Levy-Lahad, E., W. Wasco, P. Poorkaj, D. M. Romano, J. Oshima, W.H. Pettingell, C.E. Yu, P.D. Jondro, S.D. Schmidt, K. Wang, A.C. Crowley, Y.H. Fu, S.Y. Guenette, D. Galas, E. Nemens, E.M. Wiisman, T.D. Bird, G.D. Schellemberg i R.E. Tanzi. 1995. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus. Science. 269: 973.

PL 214 984 B1

4. Sherrington, R., E.I. Rogaev, Y. Liang, E.A. Rogaeva, G. Levesque, M. Uveda, H. Chi, C. Lin, G. Li, K. Holman, T. Tsuda, L. Mar, J.F. Fonci, A.C. Bruni, M.P. Montesi, S. Sorbi, I. Rainero,

L. Pinessi, L. Nee, I. Chumaken, D. Pollen, A. Brookes, P. Sanseau, R.J. Polinsky, W. Wasco, H.A.R. Da Silva, J.L. Haines, M.A. Pericak-Vance R.E. Tanzi, A.D. Roses, P.E. Fraser, J.M. Rommens i P.H. George-Hyslop. 1995. Cloning of a gene bearing missense mutation in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375:754.

5. Blacker, D., J.L. Haines, L. Rodes, H. Terwedow, R.C.P. Go, L.E. Harrel, R.T. Perry, S.S. Basset, G. Chase, D. Meyers, M.S. Albert i R. Tanzi. 1997. ApoE-4 and age at onset of Alzheimer's disease: The NINH Genetics Initiative. Neurology. 48:139.

6. Poirier, J., J. Davignon, D. Bouthillier, S. Kogan, P. Bertrand i S. Gauthier. 1993. Apolipoprotein E polymorphism and Alzheimer's disease. Lancet. 342:697.

7. Saunders, A.M., W.J. Strittmatter, D. Schmechel, P.H. George-Hyslop, M.A. Pericak-Vance, S.H. Joo, B.L. Rosi, J.F. Gusella, D.R. Crapper-MacLachlan i M.J. Alberts. 1993. Association of apolipoprotein E allele epsilon 4 with Iateonset familial and sporadic Alzheimer's disease. Neurology.. 43:1467.

8. Fassbender, K., C. Masters i K. Beyreuther. 2000. Alzheimer's disease: an inflammatory disease?. Neurobiology of Aging. 21:433.

9. McGeer, P.L. i E.G. McGeer. 2001. Inflammation, autotoxicity and Alzheimer disease. Neurobiology of Aging. 22:799.

10. Zandi, P.P i J.C.S. Breitner. 2001. Do NSAIDs prevent Alzheimer's disease? And, if so, why? The epidemiological evidence. Neurobiology of Aging. 22: 811.

11. Rogers, J., L.C: Kirby, S.R. Hempelman, D.L. Berry, P.L. McGeer, A.W. Kasniak, J. Zalinski,

M. Cofield, L. Mansukhani, i P. Willson. 1993. Clinical trial of indomethacin in Alzheimer's disease. Neurology. 43:1609.

12. Hauss-Wegrzyniak, B., L.B. Willard, P. Del Soldato, G. Pepeu i G.L. Wenk. 1999. Peripheral administration of novel anti-inflammatories can attenuate the effects of chronic inflammation within the CNS. Brain Res. 815:36.

13. Neuroinflammation Working Group. 2000. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 21: 383.

14. Licastro, F., S. Pedrini. L. Caputo, G. Annoni, L.J. Davis, C. Ferri, V. Casadei i L.M.E. Grimaldi. 2000. Increased plasma levels of interleukin-1, interleukin-6 and a-1-antichymotrypsin in patients with Alzheimer's disease: peripheral inflammation or signals from brain?. Journal of Neuroimmunology. 103: 97.

15. Mrak, R.E. i W.S.T. Griffin. 2001. Interleukin-1, neuroinflammtion, and Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 22: 903.

16. Perry, R.T., J.S. Collins, H. Wiener, R. Acton i R.C.P. Go. 2001. The role of TNF and its receptors in Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 22:873.

17. Wyss-Coray, T., E. Masliah, M. Mallory, L. McConlogue, K. Johnson-Wood, C. Lin i L. Mucke.

1997. Amyloidogenic role of cytokine TGF-betal in trangenic mice and in Alzheimer's disease. Nature. 389:603.

18. Meda, L., P. Baron, E. Prat, E. Scarpini, R. Delgado, A. Catania, J.M. Lipton i G. Scarlato. 1999. Proinflammatory profile of cytokine production by human monocytes and murine microglia stimulated with beta-amyloid. J. Immunol. 93: 45.

19. Szczepanik, A.M., S. Funes, W. Petko i G.E. Ringheim. 2001. IL-4, IL-10 i 11-13 modulate A beta (1-42)-induced cytokine and chemokine production in primary murine microglia and a human monocyte cell line. J. Neuroimmunol. 113:49.

20. Lombardi, V.R., M. Garcia, L. Rey i R. Cacabelos. 1999. Characterization of cytokine production, screening of lymphocyte subset patterns and in vitro apoptosis in healthu i Alzheimer's Disease (AD). J Immunol. 97:163.

21. Engelborghs, S., M. De Brabander, J. De Cree, R. D'Hooge, H. Geerts, H. Verhaegen i P.P. De Deyn. 1999. Unchanged levels of interleukins, neopterin, interferon-gamma and tumour necrosis factor-alpha in cerebrospinal fluid of patients with dementia of the Alzheimer type. 34: 523.

22. Hutchinson, I. V., V. Pravica i P.J. Sinnot. 1998. Genetic regulation of cytokine synthesis: consequences or acute and chronic organ allograft rejection. Graft. 1:15.

23. McKhann, G., D. Drachman, M. Folstein, R. Katzman, D. Proce, E.M. Stadlan. 1984. Clinical diagnosis of Alzheimer's disease. Neurology. 34: 939.

PL 214 984 B1

24. Eikelenboom, P., S.S. Zhan, W.A. van Goll i D. Allsop D. 1994. Inflammatory mechanisms in Alzheimer disease. Trends Pharmacol Sci 15:447.

25. Rogers, J., S. Webster, i L. F. Lue. 1996. Inflammation and Alzheimer's disease pathogenesis. Neurobiol Aging 17:686.

26. Llorente, L., W. Zou, Y. Levy, Y. Richaud-Patin, Y. Wijdenes, J. Alcocer-Varela, B. MorelFourrier, J.C. Brouet, D. Alarcon-Segovia, P. Galanaud. 1995. Role of interleukin-10 in the B lymphocyte hyperactivity and autoantibody production of human systemic lupus erythemattosus. J. Exp. Med. 181: 839.

27. Luscher, U., L. Filgueira, A. Juretic, M.Zuber, L.J. Luuscher, M. Heberer i G.C. Spagnoli. 1994. The pattern of cytokine gene expression in freshly excised human metastatic melanoma suggests a state of reversible anergy of tumorinfiltrating lymphocytes. Int. J. Cancer. 57: 612.

28. Matsuda, M., F. Slazar, M. Petersson, G. Masucci, J. Hansson, Q.C. Zhang, M.G. Masucci i R. Kiessling. 1994. Interleukin 10 pretreatment protects target cells from tumor- and allo-specific cytottoxic T cells and downregulates HLA class I expression. J. Exp. Med .180: 2371.

29. Kim, J., R.L. Modlin, R.L. Moy, S.M. Dubinett, T. McHugh, B.J. Nickloff i K. Uyemura. 1995. IL-10 production in cutaneous basal and squamos cell carcinomas. A mechanism for evading the local T cell immune response. J. Immunol. 155: 2240.

30. Suzuki, T., H. Tahara, S. Narula, K.W. Moore, P.D. Robbins, i M.T. Lotze. 1995. Viral interleukin 10 (IL-10), the human herpes virus 4 cellular IL-10 homologue, induces local anergy to allogenic and syngenic tumors. J. Exp. Med. 182:447.

31. Fortis, C., M. Foppoli, L. Gianotti, L. Galli, G. Citterio, G. Consogno, O. Gentilini i M. Braga. 1196. Increased interleukin-10 serum levels in patients with solid tumors. Cancer Lett. 104:1.

32. Murray, P. J., L. Wang, R.C. Onufry, R.I. Tepper i R.A. Young. 1997. T cell-derived IL-10 antagononizes macrophage function in mycobacterial infection. J. Immunol. 158: 315.

33. Lehmann, A.K., A. Halstenen, S. Sornes, O. Rokkeand A. Waage. 1995. High levels of interleukin 10 in serum are associated with fatality in meningococcal disease. Infect. Immun. 63: 2109.

34. Clerici, M., T.A. Wynn, J.A. Berzofsky, R.L. Coffman, A. Sher, G.M. Shearer. 1994. Role of Interleukin-10 (IL-10) in T Helper Cell Dysfunction in Asymptomatic Individuals Infected with the Human Immunodeficiency Virus (HIV-1). J. Clin. Invest. 93:768.

35. VanFurth, A.M., E.M. Seijmonsbergen, J.A.M. Langermans, P.H.P. Groeneveld, C.E. Debel i R. VanFurth. 1995. High levels of interleukin 10 and tumor necrosis factor alpha in cerebrospinal fluid during the onset of bacterial meningite. Clin. Infect. Dis. 21:220.

36. Llorente, L., Y. Richaud-Patin, J. Couderc, D. Alarcon-Segovia, R. Ruiz-Soto, N. Alcocer-Castillejos, J. Alcocer-Varela, J. Granados, S. Bahena, P. Galanaud i D. Emilia. 1997. Dysregulation of interleukin-10 production in relatives of patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 38: 1429.

37. Westendorp, R.G.J., J.A.M. Langermans, T.W.G. Huizinga, A.H. Elouali, C.L. Verwej i J.P. Vandenbroucke. 1997. Genetic influence on cytokine production and fatal meningococcus disease. Lancet. 349:170.

38. Eskdale, J., G. Gallagher, C.L. Vermeij, V. Keijsers, R.G.J. Westendorp i T.W.J. Huizinga.

1998. Interleukin 10 secretion in relation to human IL-10 locus haplotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 9465-9470.

39. Derkx, B., A. marchant, M. Goldman, R. Biilmer i S. Van de Venter. 1995. High levels of interleukin-10 during the initial phase of fulminant meningococcal septic shock. J. Infect. Dis. 171: 229.

40. Llorente, L., Y. Richaud-Patin, R. Fior, J. Alcocer-Varela, J. Wijdnes, B. Morel-Fourrier, P. Galanaud i P. Emilie. 1994. In vivo production of interleukin-10 by non -T cells in rheumatoid arthritis, Sjogren's syndrome, and systemic lupus erythematosus. A potential mechanism of B lymphocytes hyperactivity and autoimmunity. Arthritis Rheum. 37: 1647.

41. Cash, J.J., J.B. Splawski, R. Thomas, J.F. McFarlin, H. Schulze-Koops, L.S. Davis, K. Fujita i P.E. Lipsky. 1995. Elevated interleukin-10 levels in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 38:96.

42. Eskdale, J. P. Wordsworth, S. Bowman, M. Field i G. Gallagher. 1997. Association between polymorphisms at the human IL-10 locus and systemic lupus erythematosus. Tissue Antigens. 49: 635.

43. Zheng, C., D. Huang, L. Liu, R. Wu, S. Bergenbrant Glas, A. Ostenborg, M. Bjorkholm, G. Holm, Q. Yi, A. Sundblad. 2001. Interleukin-10 gene promoter polymorphisms in multiple myeloma. Int. J. Cancer. 95: 184.

PL 214 984 B1

44. Via, C.S., G.C.Tsokos, N.I. Stocks, M. Clerici i G.M. Shearer. 1990. Human in vitro allogeneic responses: demonstration of three pathways of T helper cell activation. J. Immunol. 144:2524.

45. Hahn, A.B., J.C. Kasten-Jolly, D. M. Costantino, E. Graffunder, T.P. Singh, G.K. Shen i D.J. Conti. 2001. Tnf-a, 11-6, IFN-g, and IL-10 gene expression polymorphisms and the IL-4 receptor a-chain variant Q576R: effects on renal allograft outcome. Transplantation. 72:660.

46. Lio, D., G. Candore, A. Colombo, G. Colonna Romano, F. Gervasi, V. Marino, L. Scola i C. Caruso. 2001. A genetically determined high setting of TNF-alpha influences immunologic parameters of HLA-B8, DR3 positive subjects: implications for autoimmunity. Hum Immunol. 62:705.

47. Akdis, C.A., i K. Blaser K. 2001. Mechanisms of interleukin-10-mediated immune suppression. Immunol. 103:131.

48. Segal, B.M., B.K. Dwyer i E.M. Shevach. 1998. An interleukin (IL)-10/IL-12 immunoregulatory circuit controls susceptibility to autoimmune disease J Exp Med 187:537.

49. Bagli M, Papassotiropuolos A, Knapp M, Jessen F, Rao ML, Maier W, Heun R. association between an interleukin-6 and 3' flanking region haplotype and reduced Alzheimer's risk in German population. Neurosci Lett 2000; 283: 109-112.

50. Bowcock AM, Kidd JR, Lathrop GM, Daneshvar L, May LT, ray A, Sehgal PB, Kidd KK, Cvalli-Sforza LL. The human interferon-beta 2/hepatocyte stimulating factor/IL-6 gene: DNA polymorphism studies and localization to chromosome 7p21. Genomics 1988; 3(1): 8-16.

51. Campbell IL, Stalder AK, Chiang CS, Bellinger R, Heyser CJ, Steffensen S, Masliah E, Powell HC, Gold LH, henriksen SJ, Siggins GR. Transgenic models to assess the pathogenic actions of cytokines in the central nervous system. Mol Psychiatry 1997; 2: 125-129.

52. Chao CC, Molitor TW, Hu S. Neuroprotective role of IL-4 against activated microglia. J Immunol 1993; 151: 1473-1481.

53. Falcone E, Spadafora P, De Luca M, Ruffolo R, Brancati C, De Benedictis G. DYS19, D12S67, and D1S80 polymorphisms in population sample from southern Italy and Greece. Hum Biol 1995; 67 (5) : 689-701.

54. Fishman D, Faulds G, Jeffery R, Mohamed-Ali V, Yudkin JS, Humphries S, Woo P. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis. J Clin Invest 1998; 102 (7): 1369-76.

55. Goris A, Epplen C, Fiten P, Andersson M, Murru R, sciacca FL, Ronsse I; jackel S, Epplen JT, Marrosu MG, Olsson T, Grimaldi LM, Opdenakker G, Billiau A, Vandenbroeck K. Analysis of IFNgamma gene (IFNG) polymorphism in multiple sclerosis in Europe: effect of population structure on association with disease. J Interferon Cytokine Res 1999; 19(9): 1037-1046.

56. Kilpinen S, Hulkkonen J, Wang XY, Hurme M. The promoter polymorphism of the IL-6 gene regulates IL-6 production in neonates but not in adults. Eur Cytokine Netw 2001; 12 (1): 62-8.

57. Kim JM, Brannan Cl, Copeland NG, Jenkins NA, Khan TA, Moore KW. Structure of the mouse IL-10 gene and chromosomal localisation of the mouse and human genes. Journal of Immunology 1992; 148: 3618.

58. Lio D, Scola L, Crivello A, Colonna-Romano G, Candore G, Bonafe M, Cavallone L, Franceschi C, Caruso C. Genderspecific association between -1082 IL-10 promoter polymorphism and longevity. Genes and Immunity 2002; 3: 30-33.

59. Llorente L, Richaud-Patin Y, Couderc J, Alarcon-Segovia D, Ruiz-Soto R, Alcocer-Castillejos N, Alcocer-Varela J, Granados J, Bahena S, Galanaud P, Emilia D. Dysregulation of interleukin-10 production in relatives of patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1997; 38(8): 1429-35.

60. Mateo I, Sanchez-Guerra M, Combarros O, Llorca J, Infante J, Gonzalez-Garcia J, del Molino JP, Berciano J. Lack of association between cathepsin D genetic polymorphism and Alzheimer disease in a Spanish sample. Am J Med Genet 2002; 114 (1): 31-3.

61. Murray RE, McGuigan F, Grant SF, Reid DM, Ralston SH. Polymorphisms of the interleukin-6 gene are associated with bone mineral density. Bone 1997; 21: 89-92.

62. Pallaud C, Stranieri C, Sass C, Siest G, Pignatti F, Visvikis S. Candidate gene polymorphimss in cardiovascular disease: a comparative study of frequencies between a French and an Italian population. Clin Chem Lab Med 2001; 39(2): 146-54.

63. Papassotiropoulos A, Hock C, Nitsch RM. Genetics of interleukin 6: implications for Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging 1999; 22: 863-871.

PL 214 984 B1

64. Pola R, Flex A, Gaetani E, Dal Lago A, Gerardini L, Pola P, Bernabei R. The -174 G/C polymorphism of the interleukin - 6 gene promoter is associated with Alzheimer's disease in an Italian population. Neuroreport 2002; 13: 1645-1647.

65. Poli F, Nocco A, Berra S, Scalamogna M, Taioli E, Longhi, Sirchia G. Allele frequencies of polymorphisms of TNF-α, IL-6, IL-10 and IFNG in an Italian Caucasian population. European journal of Immunogenetics 2002; 29: 237-240.

66. Shibata N, Ohnuma T, Takahashi T, Baba H, Ishizuka T, Ohtsuka M, Ueki A, Nagao M, Arai H. Effect of IL-6 polymorphism on risk of Alzheimer disease: genotype-phenotype association study in Japanese cases. American Journal of Medical Genetics 2002; 114: 436-439.

67. Strauss S, Bauer J, Ganter U, Jonas U, Berger M, Volk B. detection of IL-6 and alpha 2-macroglobulin immunoreactivity in cortex and hippocampus of Alzheimer's disease patients. Lab Invest 1992; 66: 223-30.

68. Terry CF, Loukaci V, Green FR. Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin 6 transcriptional regulation. J Biol Chem 2000; 275 (24): 18138-44.

69. Vandenabeele P, Fiers W. Is amyloidogenesis during Alzheimer's disease due to an IL-1/IL-6 mediated acute phase response in the brain?. Immunol Today 1991;12:217-19.

70. Vandenbroeck K, Hardt C, Louage j, Fiten P, Jackel S, Ronsse I, Epplen JT, Grimaldi LM, Olsson T, Marrosu MG, Billiau A, Opdenakker G. Lack of association between the interferon regulatory factor-1 (IRF1) locus at 5p31.1 and multiple sclerosis in Germany, northern Italy, Sardinia and Sweden. Genes Immun 2000; 1(4): 290-2.

71. Quintana FJ. Carmi P. Cohen IR. DNA vaccination with heat shock protein 60 inhibits cyclophosphamide-accelerated diabetes. Journal of Immunology. 169(10):6030-5, 15 listopada 2002.

72. Dalpke AH. Opper S. Zimmermann S. Heeg K. Suppressors of cytokine signaling (SOCS)-1 i SOCS-3 are induced by CpG-DNA i modulate cytokine responses in APCs. Journal of Immunology. 166(12):7082-9, 15 czerwca 2001.

73. Yi AK. Yoon JG. Yeo SJ. Hong SC. English BK. Krieg AM. Role of mitogen-activated protein kinases in CpG DNA-mediated IL-10 i IL-12 production: central role of extracellular signal-regulated kinase in the negative feedback loop of the CpG DNA-mediated Th1 response. Journal of Immunology. 168(9):4711-20, 1 maja 2002.

74. G. Hartmann i wsp., CpG DNA: A potent signal for growth, activation, and maturation of human dendritic cells, Proceedings of the National Academy of Sciences, 96:9305-10, 199.

75. Hollon T. Coley Toxin's Hidden message: from a 19^th century mystery comes a potential new class of drugs: CpG oligonucleotides. The Scientist 15(5): 2001, 5 marca.

76. Komunikat prasowy firm Hybridon z 7 maja 2003 na temat danych, zaprezentowanych podczas First Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies odbytym w Bostonie w dn. 4 maja do 7 maja 2001, Poster #271 Modulation of immunostimulatory activity of CpG-oligonucleotides by incorporation of site-specific chemical modifications: Significance of internucleoside negative charge Poster #229 Oligonucleotides containing YpG or CpR motifs as potent immunostimulatory agents, znalezione na: http://www.nrp-euro.com.

77. Du Y. i wsp. Association of an interleukin 1 alpha polymorphism with Alzheimer's disease. Neurology 55(4): 464-5 22 sierpnia 2000.

Claims (4)

1. Sposób okeślania obecności lub predyspozycji do choroby Alzheimera, znamienny tym, że obejmuje analizowanie in vitro pobranej od osobnika będącego zwierzęciem próbki zawierającej DNA, aby określić warianty alleliczne obecne w jednym lub większej liczbie loci SNP w pozycjach -1082, -819 i -592 genu kodującego IL-10.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że określa się genotyp we wszystkich trzech pozycjach -1082, -819 i -592.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje ponadto analizę próbki, aby określić allele obecne w genach kodujących IL-6 i Apo-E.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje ponadto analizę próbki, aby określić allele obecne w genie kodującym IL-1.