ES2333312T3 - Diagnostico de la enfermedad de alzheimer por analisis de polimorfismos del gen il-10. - Google Patents
Diagnostico de la enfermedad de alzheimer por analisis de polimorfismos del gen il-10. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar la existencia de una predisposición a la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método analizar in vitro una muestra que lleva ADN tomada a partir de un sujeto animal para determinar las variantes alélicas presentes en uno o más de los loci de SNP en las posiciones -1082, -819 y -592 del gen que codifica IL-10.
Description
Diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer por
análilsis de polimorfismos del gen IL-10.
Esta invención se refiere al uso de
IL-10 en el diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer.
La causa principal del deterioro cognitivo en
los ancianos es la enfermedad de Alzheimer (AD). Debido al aumento
de la duración de la vida en todo el mundo, se espera que se
triplique el número de personas afectadas por AD durante los
próximos 50 años (1). La AD es un síndrome clínico caracterizado por
mecanismos patógenos complejos y heterogéneos. Los factores
genéticos reconocidos incluyen mutaciones del gen que codifica la
proteína precursora de amiloide (2), y la presenilina 1 y 2 (3, 4),
que son las responsables de una pequeña parte de los casos de AD
familiares y normalmente de inicio prematuro. También se han
asociado factores genéticos con la forma esporádica o no familiar
de la enfermedad y el alelo e4 de la apolipoproteína E (Apo E)
aumenta significativamente el riesgo de AD, pero no es necesario ni
suficiente para el desarrollo de la enfermedad
(5-7). Por lo tanto, es probable que estén
implicados otros factores genéticos y ambientales y se investigarán
activamente.
Las moléculas que intervienen en la cascada
inflamatoria tienen un gran interés debido a que se ha sugerido
repetidamente que la inflamación está asociada con el proceso
neurodegenerativo característico del cerebro con AD (8). De esta
manera, se observa astrocitosis reactiva tanto en la corteza como en
el hipocampo de estos pacientes y las células gliales también están
activadas dentro o cerca de las placas neuríticas. Un exceso de
expresión de citocinas y otras moléculas inflamatorias son
características comunes de la patología del cerebro con AD (9).
Además, los estudios epidemiológicos demostraron que el uso a largo
plazo de antiinflamatorios no esteroideos está asociado con una
reducción de la incidencia de AD en un estudio de control en gemelos
siameses (10) y otros diversos estudios clínicos confirmaron una
menor asociación de AD en individuos tratados con antiinflamatorios
(11), incluyendo inhibidores específicos de COX2 (12). Estos
descubrimientos confirman la hipótesis de que la inflamación podría
contribuir a la neurodegeneración asociada con la AD (13).
Con la intención de entender mejor la biología
de la AD, recientemente se ha investigado el posible papel de
varias citocinas y quimioquinas. Se ha sugerido que prácticamente
todos los mediadores analizados en estos estudios, incluyendo
IL-1b, IL-6,
TNF-\alpha, IL-8,
TGF-\beta y la proteína-1a
inflamatoria de macrófagos (MIP-1a), están
regulados positivamente en la AD en comparación con controles sin
demencia (14-18). Por el contrario, se obtienen
resultados conflictivos en relación con la citocina inmunomoduladora
IL-10, una citocina de tipo 2 que reprime a los
linfocitos T y la inmunidad mediada por células en seres humanos y
ratones y tiene potentes propiedades antiinflamatorias
(19-21).
Estos estudios consideraron cada citocina
independientemente como polimorfismos génicos y/o producción, pero
nunca investigaron la relación entre factores que actúan a favor y
en contra de la inflamación, tales como la IL-10 y
la IL-6 en la misma muestra de población.
Merece la pena recordar que se conocen
polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la región promotora de
estos dos genes. El gen que codifica IL-10,
localizado en el cromosoma 1 entre 1q31 y 1q32, es muy polimórfico.
La producción de IL-10 está correlacionada con
polimorfismos bialélicos en las posiciones: -1082 (sustitución de
guanina por adenina), -819 (sustitución de timina por citosina) y
-592 (sustitución de adenina por citosina). El polimorfismo en la
posición -1082 está dentro de un sitio de reconocimiento de tipo Ets
(específico de E-26) y puede afectar a la unión de
este factor de transcripción y por lo tanto alterar la activación de
la transcripción; el alelo -1082A se correlaciona con la generación
de IL-10 después de la estimulación de células T
in vitro (57), mientras que no parecen estar implicados
polimorfismos en las posiciones -819 y -592. El gen de la
IL-6 en seres humanos está organizado en cinco
exones y cuatro intrones y se localiza en el brazo corto del
cromosoma 7 (7p21) (50, 73). La implicación de la
IL-6 en muchas funciones biológicas tiene su
paralelo en asociaciones genéticas de sus variantes alélicas con
varias afecciones fisiológicas y patofisiológicas. Frecuentemente
se han usado dos de sus sitios polimórficos para estudios de
asociación genética: un número variable multialélico de
polimorfismos de repeticiones en tándem (VNTR) en la región
flanqueante 3' (repeticiones AT) y un polimorfismo bialélico de G a
C del promotor en la posición -174. El polimorfismo de un solo
nucleótido (SNP) G/C parece estar asociado con niveles sanguíneos y
velocidades de transcripción variables de IL-6 (54,
56, 68).
A la luz de estas consideraciones y basándose en
un estudio de asociación caso-control en pacientes
italianos con AD esporádica de inicio tardío y en controles sanos
(HC) equiparables, los presentes inventores evaluaron si los SNP de
IL-10 e IL-6 estaban relacionados
con el desarrollo de la AD. Los resultados arrojan más luz sobre la
hipótesis patogénica inflamatoria de la AD y sugieren una
predisposición genética independiente de la metabólica.
Estas variaciones alélicas están asociadas con
diferencias medibles en la producción de IL-10 e
IL-6 por linfocitos de sangre periférica
estimulados por antígeno y por mitógeno. De hecho, estos
polimorfismos se producen en la región reguladora del gen y están
asociados con una producción elevada, intermedia o baja de
IL-10 (22).
Los presentes inventores investigaron la
producción de IL-10 e IL-6
estimulada por beta amiloide por linfocitos de sangre periférica
(PBMC) de pacientes con AD y de controles sanos de edades
equiparables. Como la generación de esta citocina estaba
significativamente reducida en los pacientes con AD, se analizaron
los polimorfismos de IL-10 en estos mismos
individuos. Los resultados demostraron que el alelo de alta
producción de IL-10 es extremadamente raro en los
pacientes con AD.
Específicamente, los genotipos de
IL-10 están distribuidos de diferente forma cuando
la AD se compara con HC (\chi^{2} = 16,007; p = 0,007). Por lo
tanto, los genotipos correspondientes a una producción reducida de
IL-10 tienen una distribución significativamente
mayor entre los sujetos con AD (tabla I). La presencia de genotipos
con baja producción de IL-10 está asociada con un
peor resultado clínico de AD entendido como se indica a
continuación: 1) menor edad de inicio de la enfermedad (tabla II); y
2) progresión más rápida de la enfermedad (puntuación del MMSE)
(tabla III).
\vskip1.000000\baselineskip
Las frecuencias de los diferentes genotipos
entre los pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) son
estadísticamente diferentes de las de los controles sanos (HC).
\chi^{2} = 16,700, df = 5, p = 0,007. Entre paréntesis, (c), se
proporcionan los correspondientes fenotipos de producción alta (H),
intermedia (M) y baja (L).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Correlación entre los diferentes genotipos en
pacientes con enfermedad de Alzheimer y la edad de inicio. ANOVA: p
= 0,042.
Correlación entre los diferentes genotipos en
pacientes con enfermedad de Alzheimer y ANOVA de MMSE: p =
0,010.
Se sugiere que la inflamación crónica está
implicada en el proceso neurodegenerativo característico de la AD
(24, 25); esta sugerencia procede de los criterios tanto in
vivo como ex adjuvantibus. De esta manera, se
observa que los mediadores inflamatorios y las células gliales
activadas están muy asociados con las placas neuríticas in
vivo. Además, ciertos datos recientes indican que la terapia
antiinflamatoria podría ser útil en la modulación de la progresión
de la enfermedad (10-12). A pesar de esta gran
cantidad de evidencias, las correlaciones biológicas de la AD aún
no están claras. Para arrojar luz sobre este problema, se centró la
atención en la IL-10. Esta citocina es una citocina
reguladora fundamental implicada en muchas facetas de la respuesta
inmune y está desregulada en enfermedades autoinmunes (26), malignas
(27-31) e infecciosas (32-35)
humanas. Más recientemente se ha demostrado que la presencia de
mayores niveles determinados genéticamente de la secreción de
IL-10 es un componente importante de la base
genética para el lupus eritematoso sistémico (36) y para el
resultado de enfermedades infecciosas (37). También se ha demostrado
que la secreción de IL-10, resultante de la
estimulación in vitro de leucocitos de sangre periférica
humana con LPS, varía notablemente entre individuos y que los
haplotipos de citocinas están asociados con diferentes niveles de
secreción (38). Además, las diferencias en la producción en suero
de IL-10 por células de pacientes y de sus
familiares de primer grado (37, 39), así como las diferencias en la
distribución de los alelos de IL-10, sugirió la
implicación de las diferentes isoformas del gen de
IL-10 como un locus de rasgos cuantitativos
importantes para la enfermedad humana en infecciones (37, 40),
enfermedades autoinmunes (26, 36, 41, 42) y enfermedades
malignas (43).
malignas (43).
Los presentes inventores analizaron inicialmente
la producción de IL-2 e IL-10
específica de LPS, Flu y péptido amiloide por células mononucleares
de sangre periférica (PBMC) de pacientes con AD y HC de edades
equiparables. Los resultados demostraron que: 1) la producción de
IL-2 por PBMC de pacientes con AD y controles fue
similar en todas las condiciones medidas; y 2) la generación de
IL-10 por PBMC estimuladas por LPS y Flu era
comparablemente similar entre los dos grupos de individuos. Por el
contrario, en los pacientes con AD estaba presente un deterioro
inmune específico de amiloide caracterizado por una reducción de la
generación de IL-10. La observación de que este
desequilibrio de citocinas no se veía en PBMC estimuladas por
mitógeno indica que las respuestas inmunes específicas de amiloide
están alteradas selectivamente en los pacientes con AD. Además, los
resultados que demostraban que la proliferación estimulada por Flu
era similar en los pacientes y controles indica que en estos
pacientes no son defectuosos el procesamiento y la presentación
antigénica en asociación con moléculas de HLA de clase II, y la
ruta de activación del sistema inmune autorrestringida por
CD4-HLA de clase II (44).
A continuación se analizaron polimorfismos en el
gen de IL-10 en el mismo grupo de sujetos. Los
resultados procedentes del análisis de la distribución de los
alelos de IL-10 en esta muestra italiana de
individuos sanos demostró una gran similitud con los presentados
para otras poblaciones caucásicas (45). Por el contrario, se
observó una frecuencia significativamente mayor de los genotipos
correspondientes a una producción reducida de IL-10
(ACC/ACC, ACC/ATA y ATA/ATA) en pacientes con AD. De esta manera, se
determinó una prevalencia aumentada de forma anómala de isoformas
de baja producción de IL-10 en la población con AD;
la correlación fenotípica de estas isoformas se volvió evidente
cuando se midieron respuestas inmunes específicas de amiloide.
Los análisis posteriores se centraron en
posibles correlaciones entre una producción alterada de
IL-10 y las manifestaciones clínicas de la AD
verificando si la presencia de genotipos de producción
baja/intermedia de IL-10 estaría asociada con
diferentes resultados de la enfermedad. Los resultados confirmaron
que éste era el caso. De esta manera, la presencia de los genotipos
ATA/ATA y de los genotipos GCC/ATA se correlacionaba con una menor
edad en el inicio de la enfermedad. Además, los alelos ACC/ATA y
ACC/ACC (todos éstos son genotipos de producción de
IL-10 baja/intermedia) estaban asociados con un
deterioro cognitivo más severo como se indica por una menor
puntuación en el MMSE.
Es interesante observar que un informe reciente
sobre centenarios italianos, individuos que, por definición, son
menor propensos a desarrollar enfermedades relacionadas con la edad,
ha demostrado que la extrema longevidad está asociada con una
frecuencia significativamente mayor de los genotipos de alta
producción de IL-10 (46).
Se sabe que la IL-10 tiene
potentes propiedades antiinflamatorias (47); por lo tanto, se podría
hipotetizar un escenario biológico en el que la reducción de la
producción de IL-10 específica de amiloide
favorecería el desencadenamiento del proceso inflamatorio crónico
observado en la progresión de la AD. Estos resultados sugieren que
en individuos sin AD puede estar activo un circuito de
retroalimentación inhibidor mediado por IL-10 y
específico de amiloide; la ruptura de este circuito podría estar
asociada o ser predictiva del desarrollo de AD. Recientemente, un
estudio convincente demostró que un circuito de
IL-10/proinflamatorio que gira alrededor de células
del sistema inmune innato regula la susceptibilidad a enfermedades
autoinmunes (48). Estos resultados se expanden demostrando que en
pacientes con AD está presente una alteración de este circuito.
Los presentes inventores han identificado
regiones polimórficas, siendo los polimorfos indicativos de una
disfunción de la producción de citocinas y por lo tanto estando
asociados con una predisposición a una enfermedad inflamatoria
autoinmune, neurodegenerativa o crónica.
En el momento actual, la enfermedad de Alzheimer
se diagnostica por criterios reconocidos tales como DMS IV o
NINCDS-ADRDA (23), a menudo junto con un examen por
imágenes de resonancia magnética (MRI) o por tomografía asistida
por ordenador (CT) del cerebro para identificar las placas amiloides
y los ovillos neurofibrilares característicos junto con la atrofia
del área del hipocampo del cerebro.
Sólo es posible un diagnóstico confirmatorio
definitivo de la enfermedad de Alzheimer por inspección visual de
las áreas afectadas del cerebro durante un examen post mortem o por
medio de una biopsia cerebral (no recomendada debido a la falta de
terapias eficaces).
Actualmente se están buscando urgentemente
terapias y métodos para la monitorización de la enfermedad de
Alzheimer. Según se progrese en los esfuerzos para prevenir o
retrasar la neurodegeneración y la progresión de la enfermedad,
ganarán importancia la detección precoz de la enfermedad de
Alzheimer y la identificación de pacientes susceptibles, ya que
esto permitirá emplear medidas preventivas tan pronto como sea
posible. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar ensayos
predictivos y fiables para la susceptibilidad a la enfermedad de
Alzheimer sin necesidad de evaluaciones prolongadas y subjetivas
del comportamiento cognitivo.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método para determinar la existencia o una
predisposición a la enfermedad de Alzheimer, enfermedades
autoinmunes u otras enfermedades neurodegenerativas, comprendiendo
el método las etapas de tomar una muestra que lleva ADN de un sujeto
animal y analizar la muestra para determinar las variantes alélicas
presentes en uno o más de los loci de SNP en las posiciones -1082,
-819 y -592 del gen que codifica IL-10, o dicho de
otra forma, analizar la muestra con respecto a la presencia o
ausencia de los alelos de la Figura 2.
Preferiblemente se determina el genotipo en las
tres posiciones -1082, -819 y -592.
Aunque se ha descubierto que la identificación
de los alelos de la Figura 2 es útil o predictiva en la
identificación de la enfermedad de Alzheimer, se ha descubierto que
una combinación de los alelos de IL-10 e
IL-6 es más predictiva de una predisposición a la
enfermedad de Alzheimer o un diagnóstico de la presencia de la
enfermedad de Alzheimer.
La apolipoproteína E (Apo-E) se
ha asociado con una AD esporádica o no familiar. Por lo tanto, en un
aspecto adicional de la invención, un método para diagnosticar la
enfermedad de Alzheimer comprende las etapas de obtener una muestra
que lleva ADN de un animal e identificar la presencia de un alelo
polimórfico de IL-10, de IL-6 y de
Apo-E.
Preferiblemente, el alelo polimórfico es uno de
los alelos de la Figura 2.
Además, la muestra puede analizarse con respecto
a la presencia/ausencia de polimorfismos u otras variaciones
alélicas de otras citocinas además de IL-10 e
IL-6, por ejemplo IL-10 e
IL-6 más IL-4 y/o
IL-1.
Como alternativa, la muestra puede ensayarse con
respecto a la presencia o ausencia de polimorfismos u otras
variaciones alélicas de IL-10 más
Apo-E, o IL-6 más
Apo-E.
Se ha asociado un polimorfismo de la
interleucina 1 alfa (IL-1 alfa) con la enfermedad de
Alzheimer (77). Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, un
método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer comprende las
etapas de obtener una muestra que lleva ADN de un animal e
identificar la presencia de un alelo polimórfico de
IL-10, IL-6, Apo-E e
IL-1.
\newpage
Generalmente, se obtendrá un valor predictivo
óptimo combinando tantos factores predictivos como sea posible en
el ensayo. Los métodos descritos en la presente memoria junto con
marcadores tales como Apo-E e IL-1
permiten el desarrollo de un método de diagnóstico poderoso que
incluya todos los marcadores biológicos que han demostrado tener un
valor predictivo del desarrollo de AD.
Por consiguiente, la presente invención también
proporciona un método para explorar compuestos que modulan la
IL-10 implicada en la enfermedad de Alzheimer,
comprendiendo el método introducir el compuesto a explorar en
fragmentos de ADN o ADNc que codifican los polimorfismos alélicos de
la tabla I, o dicho de otra manera los polimorfismos alélicos de la
Figura 2, y evaluar la hibridación entre el compuesto y el
fragmento.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona compuestos que modulan la enfermedad de Alzheimer,
identificados por el método anterior.
Preferiblemente, el animal es un mamífero y más
preferiblemente un ser humano.
Los datos presentados en la presente memoria
confirman el papel de procesos inflamatorios en la patogénesis de
la AD; refuerzan la hipótesis de que en pacientes con AD la
neurodegeneración está muy asociada con una respuesta inmune
específica de antígeno aberrante; y apoyan adicionalmente el uso de
compuestos antiinflamatorios en la terapia de esta enfermedad.
A continuación se describirán realizaciones de
la invención a modo de ejemplo únicamente, haciendo referencia a
los dibujos adjuntos de los que las Figuras 1A-1D
son diagramas de barras en los que se muestran las producciones
estimuladas por LPS y \beta-amiloide (un grupo de
3 péptidos de \beta-amiloide: \betaA: fragmento
25-35; \betaB: fragmento 1-40; y
\betaC: fragmento 1-16) de IL-2
(paneles A y C) y de IL-10 (paneles B y D) por PBMC
de 47 pacientes con AD (O) y 25 controles sanos de edades y sexos
equiparables (O). Se muestran los valores medios \pm errores
típicos. p \leq 0,023;
la Figura 2 muestra un ejemplo paradigmático de
la genotipificación de IL-10 para seis muestras
diferentes. En cada gel, las bandas mas pesadas corresponden a los
amplicones del gen de la \beta-globina humana que
se usa como control interno. Los otros fragmentos de ADN
amplificados específicos corresponden a los polimorfismos del gen
de IL-10: GCG/GCC (A), GCC/ACC (B), GCC/ATA (C),
ACC/ACC (D), ACC/ATA (E), ATA/ATA (F), y
las Figuras 3A-3D son los
gráficos de barras que muestran la producción estimulada por LPS y
\beta-amiloide (un grupo de tres péptidos de
\beta-amiloide; \betaA, fragmento
25-35; \betaB, fragmento 1-40; y
\betaC, fragmento 1-16) de IL-6
(paneles A y C) e IL-10 (paneles B y D) por PBMC de
47 pacientes con AD (O) y 25 controles sanos de edades y sexos
equiparables (O). Medias \pm errores típicos; p \leq 0,023.
\vskip1.000000\baselineskip
En un estudio de la enfermedad de Alzheimer se
incluyeron cuarenta y siete pacientes con AD y 25 sujetos sin
demencia (HC). Estos pacientes se seleccionaron entre una muestra de
población de mayor tamaño seguida en el Departamento Geriátrico del
Hospital Maggiore IRCCS, Universidad de Milán, Italia (Geriatric
Department of the Ospedale Maggiore IRCCS, University of Milan,
Italy). Se adoptaron los criterios del DMS IV y del
NINCDS-ADRDA (23) para obtener el diagnóstico
clínico de la AD. Los comportamientos cognitivos y las alteraciones
cognitivas se evaluaron de acuerdo con el
Mini-Examen del Estado Mental (MMSE). Los pacientes
con AD y HC estaban viviendo en su casa, se sometieron a un examen
físico cuidadoso el día de la extracción de sangre y se evaluaron
sus registros clínicos. Para minimizar el riesgo de procesos
inflamatorios clínicos o subclínicos, todos los pacientes se
seleccionaron como se indica a continuación: sólo se incluyeron en
el estudio los pacientes con AD y HC sin signos clínicos de
inflamación (por ejemplo, temperatura corporal normal o ausencia de
enfermedad inflamatoria concomitante). También se evaluaron los
parámetros de química sanguínea y se excluyeron los sujetos con una
velocidad de sedimentación de glóbulos rojos anómala o un perfil
sanguíneo alterado de niveles plasmáticos de albúmina y
transferrina. Se realizó una selección adicional de pacientes con AD
de acuerdo con los niveles plasmáticos de proteína reactiva C (CRP)
y los pacientes con niveles de CRP por encima de 5 mg/l (valor medio
\pm 2 desviaciones típicas de los valores de control) no
se incluyeron en el estudio.
Se obtuvo un consentimiento informado para
realizar el estudio de los controles y de un familiar de cada
paciente con AD.
Se recogió sangre entera por punción venosa en
tubos Vacutainer que contenían EDTA (Becton Dickinson Co,
Rutherford, NJ). Se separaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) por centrifugación en medio de separación de
linfocitos (Organon Teknika Corp., Durham; NC) y se lavaron dos
veces en PBS. El número de linfocitos viables se determinó por
exclusión de azul tripán y un hemocitómetro.
Las PBMC se resuspendieron a 3x10^{6}/ml en
RPMI 1640 y se dejaron sin estimular o se estimularon con LPS
(Sigma, St. Louis, Ml) (10 g/ml), con un grupo de 3 péptidos
diferentes de la proteína \beta-amiloide que se
indican a continuación: \beta-A; fragmento
25-35 (25 mg/ml); \beta-B:
fragmento 1-40 (150 ng/ml);
\beta-C: fragmento 1-18 (150
ng/ml) (Sigma, St. Louis, MI); o con vacuna del virus de la gripe
(A/Taiwan+A/Shanghai+B/Victoria) (24 g/l; dilución final 1:1000)
(Flu) (antígeno de control) a 37ºC en una atmósfera húmeda con 7% de
CO_{2}. Los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas en el
caso de la estimulación con LPS y después de 5 días de cultivo en
el caso de los péptidos de proteína \beta-amiloide
y Flu. La producción de IL-2 e IL-10
por PBMC se evaluó con kits ELISA disponibles en el mercado
(ACCUCYTE, Cytimmune Sciences, Inc, College Park, MD). Todos los
kits de ensayo se usaron siguiendo los procedimientos sugeridos por
el fabricante.
Se extrajo ADN genómico de sangre periférica
tratada con EDTA (10 ml) usando un método convencional de proteinasa
K y fenol/cloroformo. La concentración y pureza del ADN se
determinaron por un análisis espectrofotométrico. Se utilizó la
metodología de cebadores con especificidad de secuencia para
reacción en cadena de la polimerasa (PCR-SSP) para
evaluar los genotipos de IL-10. La amplificación de
la secuencia en la región promotora del gen de la
IL-10 (posiciones polimórficas -1082, -819, -592) se
realizó usando el método de bandeja de genotipificación de
citocinas (One Lambda, Canoga Park, CA, USA); el gen de la
\beta-globina humana se amplificó como un control
interno de la preparación de ADN genómico. Las condiciones de PCR se
indicaron por el programa One Lambda PCR (OLI-1);
los productos de PCR después se visualizaron por electroforesis en
un gel de agarosa al 2,5%.
El análisis estadístico se realizó usando el
paquete estadístico SPSS (SPSS, Chicago, IL). Las diferencias en la
producción de IL-10 se debían a procedimientos
analíticos basados en análisis no paramétricos
(Mann-Whitney); las comparaciones entre diferentes
grupos de pacientes se realizaron usando el ensayo bilateral exacto
de Fisher. Se compararon las frecuencias genotípicas entre los
grupos de estudio por un ensayo c^{2} con un nivel de significado
observado del ensayo por debajo de 0,05. Las comparaciones entre los
valores medios de la edad al principio y el MMSE en los seis grupos
diferentes de AD se realizaron por un análisis ANOVA de una
vía.
En el estudio se incluyeron cuarenta y siete
pacientes con AD y 25 controles sanos de edades equiparables. El
mini-examen del estado mental (MMSE) demostró la
presencia de un deterioro cognitivo de leve a severo en los
pacientes con AD. Estos datos se muestran en la Tabla I.
Se estimularon PBMC de cuarenta y siete
pacientes con AD y de 25 HC de edades y sexos equiparables con un
mitógeno (LPS); un grupo de 3 péptidos
\beta-amiloides (\betaA: fragmento
25-35, \betaB: fragmento 1-40 y
\betaC: fragmento 1-16)
(\beta-amiloide) o Flu (usado como antígeno de
control) y se midió la producción de IL-2 e
IL-10 por métodos ELISA. No se observaron
diferencias cuando se comparó la producción de IL-2
e IL-10 estimulada por LPS o Flu en pacientes AD y
HC. La producción de IL-2 estimulada por amiloide
también fue similar en los dos grupos de individuos estudiados. En
contraste con estos resultados, la producción de
IL-10 estimulada por amiloide estaba
significativamente reducida (p = 0,023) en pacientes con AD en
comparación con los controles. Estos datos se muestran en la Figura
1.
En la Fig. 2 se muestra un ejemplo paradigmático
de los seis genotipos diferentes de IL-10, evaluados
por PCR-SSP, y en la tabla II se muestra su
distribución relativa entre una muestra de población caucásica
típica. A diferencia de la distribución observada en HC, la
frecuencia de los diferentes genotipos de IL-10
entre los pacientes con AD estaba significativamente sesgada
(c^{2} = 16,007 con p = 0,007) (tabla II). Por lo tanto, los
genotipos correspondientes a una producción de IL-10
reducida (genotipos ACC/ACC, ACC/ATA y ATA/ATA) tuvieron una
distribución significativamente mayor entre los sujetos con AD (17%,
26% y 11% respectivamente frente a 4%, 16% y 4% en HC). Además, la
relación entre GCC/ACC y GCC/ATA (fenotipo intermedio) fue de 1:1 en
AD mientras que fue de 3:1 en HC.
Para analizar las posibles correlaciones
clínicas de la presencia de un genotipo de baja producción de
IL-10, posteriormente se examinaron los seis
genotipos en relación con la edad de inicio de AD (tabla III) y la
progresión del deterioro cognitivo (tabla IV). Los resultados
confirmaron que la presencia de genotipos de baja producción de
IL-10 efectivamente está asociada con un peor
resultado clínico de la AD. De esta manera, la presencia de los
genotipos de ATA/ATA y GCC/ATA estaba asociada con una menor edad de
inicio de la enfermedad (ANOVA: p = 0,042) (tabla III); además, se
detectó una correlación inversa entre ACC/ATA y ACC/ACC, genotipos
de baja producción de IL-10 y la puntuación del
MMSE (ANOVA: p = 0,010) (tabla IV).
Se incluyeron sesenta y cinco pacientes con AD
(44 mujeres/21 hombres, edad media 80 \pm 2) y 65 controles sanos
de edades y sexos equiparables sin demencia (HC). Los pacientes se
seleccionaron de una muestra de población de mayor tamaño seguida
en el Departamento Geriátrico del Hospital Maggiore, IRCCS,
Universidad de Milán, Italia. Se aplicaron los criterios del DMS IV
y NINCDS-ADRDA (23) para obtener el diagnóstico
clínico de la AD; se obtuvo un examen reciente de imágenes de
resonancia magnética (MRI) cerebral/tomografía computarizada (CT)
de todos los sujetos. Los comportamientos y las alteraciones
cognitivas se evaluaron de acuerdo con el
mini-examen del estado mental (MMSE). Los pacientes
con AD y HC estaban viviendo en su casa, se realizó un examen
físico cuidadoso el día de la extracción de la sangre y se
consultaron sus registros clínicos.
Para minimizar el riesgo de procesos
inflamatorios clínicos o subclínicos, se seleccionaron los
siguientes sujetos: sólo se podían elegir AD y HC sin signos
clínicos de inflamación (por ejemplo, temperatura corporal normal,
sin inflamación concomitante). Se realizaron ensayos de química
sanguínea y se excluyeron los sujetos con una velocidad de
sedimentación anómala de glóbulos rojos o con niveles plasmáticos
alterados de albúmina y transferrina. Los pacientes con AD se
seleccionaron adicionalmente con sus niveles plasmáticos de proteína
C reactiva (CRP) y no se eligió ningún paciente con CRP por encima
de 5 mg/l (media + 2 desviaciones típicas de los valores de
control).
Se obtuvo un consentimiento informado de todos
los sujetos o sus familiares. El protocolo de estudio se aprobó por
el Comité de Ética del Hospital Universitario.
Se recogió sangre entera por punción venosa en
tubos Vacutainer que contenían EDTA (Becton Dickinson Co.,
Rutherford, NJ). Se separaron las células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) por centrifugación en medio de separación de
linfocitos (Organon Teknika Corp., Durham, NC) y se lavaron
dos veces en PBS. Los linfocitos viables se contaron por exclusión
de azul tripán y un hemocitómetro.
Se extrajo ADN genómico usando el método
convencional de proteinasa K y fenol/cloroformo. La concentración y
la pureza del ADN se determinaron por un análisis
espectrofotométrico. Se utilizó el método de cebadores específicos
de secuencia para reacción en cadena de la polimerasa
(PCR-SSP) para evaluar los genotipos de
IL-10 e IL-6. La secuencia en la
región promotora de los genes de IL-10 (posiciones
polimórficas -1082, -819, -592) e IL-6 (posición
polimórfica -174) se amplificó usando el método de bandeja de
genotipificación de citocinas (One Lambda, Canoga Park, CA, USA);
el gen de la \beta-globina humana se amplificó
como un control interno para la preparación de ADN genómico. Las
condiciones de PCR se indicaron por el programa One Lambda PCR
(OLI-1) y los productos de PCR se visualizaron por
electroforesis en gel de agarosa al 2,5%.
Los genotipos de ApoE se determinaron por
amplificación por PCR de un fragmento de 234 pares de bases del
exón 4 del gen de ApoE, seguido de digestión con Cfo1. Los patrones
de restricción se obtuvieron por electroforesis en gel.
Se resuspendieron PBMC a 3x10^{6}/ml en RPMI
1640 y se dejaron sin estimular o se estimularon con LPS (Sigma,
St. Louis, Ml) (10 \mug/ml), con un grupo de los 3 péptidos
procedentes de la proteína \beta-amiloide
indicados a continuación: \beta-A, fragmento
25-35 (25 g/ml); \beta-B:
fragmento 1-40 (150 ng/ml);
\beta-C: fragmento 1-16 (150
ng/ml) (Sigma) o con vacuna del virus de la influenza
(A/Taiwan+A/Shanghai+B/Victoria) (24 \mug/l; dilución final
1:1000) (Flu) (antígeno de control) a 37ºC en una atmósfera húmeda
con 7% de CO_{2}. Los sobrenadantes se recogieron después de 48
horas para la estimulación con LPS y después de 5 días de cultivo
para los péptidos de proteína \beta-amiloide. La
producción de IL-10 e IL-6 por PBMC
se evaluó con kits ELISA comerciales (ACCUCYTE, Cytimmune Sciences,
Inc, College Park, MD). Todos los kits de ensayo se usaron
siguiendo las instrucciones del fabricante.
El análisis estadístico se realizó usando el
paquete estadístico SPSS (SPSS, Chicago, IL). Las frecuencias de
los genotipos en los grupos de estudio se compararon por el ensayo
\chi^{2} con un nivel de significado por debajo de 0,05.
También se calcularon la razón de probabilidades (OR) y los
intervalos de confianza de 95% (CI). Las OR ajustadas se estimaron
por regresión logística, controlando el estado portador de ApoE 4.
La homogeneidad de las OR entre los estratos se evaluó incluyendo
los términos de interacción apropiados en el modelo. Las
diferencias en la producción de IL-10 e
IL-6 se establecieron por procedimientos basados en
un análisis no paramétrico (Mann-Whitney); se
compararon diferentes grupos de pacientes usando el ensayo bilateral
exacto de Fisher.
En la tabla V se presentan las frecuencias de
genotipos y alelos del polimorfismo bialélico en la posición -1082.
Este SNP altera la activación de la transcripción con un efecto
relacionado con la dosificación del gen, de forma que el genotipo
GG se correlaciona con una alta producción de IL-10,
GA con una producción intermedia de IL-10 y AA con
una baja producción de IL-10 después de la
estimulación de células T in vitro (57). Los pacientes con
AD muestran una frecuencia significativamente mayor del alelo de
baja producción -1082 A, lo cual sesga la distribución genotípica
en AD en comparación con HC con una reducción significativa del
genotipo de alta producción -1082GG (tabla V).
Algunos SNP están ligados a otros dos SNP en las
posiciones -819 y -592. Se combinan con alelos microsatélite para
formar haplotipos donde la diferencia en la producción de
IL-10 se justifica principalmente por el SNP -1082
(3\beta, 42). Las frecuencias genotípicas y de alelos de los SNP
-819 C\rightarrowT y -592 C\rightarrowA se distribuyeron de
manera similar en las muestras de AD y HC de los presentes
solicitantes (datos no mostrados).
En la tabla 6 se muestra la distribución de
alelos y genotipos de IL-6 HC y AD. Este
polimorfismo funcional también parece relacionado con la
concentración plasmática de IL-6; sin embargo, no
está claro cómo influye este SNP en los niveles plasmáticos de
IL-6 (54). Los resultados de la distribución
genotípica en las muestras de AD y HC de los presentes solicitantes
indican una menor frecuencia de genotipo GG en pacientes con AD. De
forma similar, la distribución de alelos fue significativamente
diferente en los dos grupos, siendo el alelo C significativamente
mayor en AD (tabla VI).
Se investigó si cualquier combinación de los
alelos GA de IL-10 y GC de IL-6
afectaba al riesgo de padecer AD. La presencia concomitante de
alelos IL-10 A e IL-6 C elevó
significativamente este riesgo, independientemente del estado de
ApoE 4 (tabla VII). Tanto el genotipo de IL-10 A/A
solo como el genotipo de IL-6 C/C solo conferían un
menor aumento en el riesgo de padecer la enfermedad (OR 5,8, CI
1,7-20, p = 0,005; OR 3,0, CI
0,9-10,6, p = 0,087).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimularon PBMC de 47 pacientes con AD y 25
pacientes HC de edades y sexos equiparables con un mitógeno (LPS),
con un grupo de tres péptidos \beta amiloides (\betaA, fragmento
25-35; \betaB, fragmento 1-40;
\betaC, fragmento 1-16) o con Flu y se midió la
producción de IL-10 e IL-6 con
métodos ELISA. No hubo diferencias en la producción de
IL-6 e IL-10 estimulada con LPS o
Flu en AD y HC. Por el contrario, cuando se analizó la producción
de IL-6 e IL-10 estimulada por
\beta-amiloide, se observó un aumento marginal en
la producción de IL-6 y una reducción significativa
de la generación de IL-10 (p = 0,023) en los
pacientes con AD en comparación con HC, lo que sugiere una
alteración específica de antígeno en la producción de estas
citocinas. Estos datos se muestran en la Figura 3.
El papel causante de la inflamación crónica en
la patogénesis de la AD es principalmente especulativo (24, 25).
Sin embargo, se ha propuesto un "ciclo de citocinas" donde (19)
las citocinas antiinflamatorias (IL-4,
IL-10 e IL-13) regulan las
respuestas inflamatorias de microglía/macrófagos inducidas por
\beta-amiloide y modifican la actividad
microglial que rodea a las placas neuríticas amiloides (52). Estas
citocinas pueden inhibir la inducción de IL-1,
TNF-\alpha y MCP-1 en monocitos
humanos diferenciados y, sobre todo, la IL-10
produce una inhibición dependiente de la dosis de la secreción de
IL-6 inducida por \beta-amiloide
en estas células y en la microglía murina (19).
Desde un punto de vista clínico, la
IL-10 está implicada en enfermedades autoinmunes
(41, 42, 26) y en malignidades (31, 27, 43) donde los mayores
niveles de la citocina dependen de la base genética (59) pero
también influyen en el resultado de las infecciones (34, 40,
37).
Es más consistente la evidencia de un papel de
la IL-6 en la patogénesis de la AD. Se observó una
inmunorreactividad elevada de IL-6 cerca de las
placas amiloides en el cerebro de estos pacientes (67); la
IL-6 induce la síntesis de la proteína precursora
\beta-amiloide (69), y en modelos de ratones
transgénicos, los niveles elevados en el SNC de
IL-6 producen efectos neuropatogénicos y déficits
cognitivos (51).
Se notificó que el alelo C de un VNTR en el gen
de IL-6 reducía la actividad de la citocina (61), el
alelo C del VNTR de la IL-6 se ha correlacionado
con un retraso del inicio y una reducción del riesgo de AD en una
población alemana (63). El polimorfismo funcional -178 de la región
promotora también podría estar implicado en el desarrollo del
fenotipo de AD debido a su asociación con las concentraciones
plasmáticas de la citocina (54). Sin embargo, en dos series
clínicas de diferente origen étnico los resultados fueron
discutibles (49).
En la muestra de los presentes solicitantes, los
datos del análisis de SNP demostraron que HC tenía una distribución
de alelos de IL-10 e IL-6 similar a
la de una población italiana (65). Es más importante el hecho de que
los presentes resultados se dirijan a un porcentaje
significativamente mayor de portadores de -1082A de
IL-10 entre los casos de AD. Un informe reciente
sobre italianos centenarios, que claramente son menos propensos que
las personas más jóvenes a padecer enfermedades relacionadas con la
edad, demostró que la extrema longevidad está asociada
significativamente con los genotipos de alta producción de
IL-10 (58).
Como se ha notificado previamente, los
resultados sobre los SNP de IL-6 son más
contradictorios. El alelo G de IL-6 parece
significativo en la AD de los japoneses (66) y también de
poblaciones del sur de Italia (64), mientras que en la muestra de
los presentes solicitantes es el alelo C el que parece estar
representado en exceso.
Para asociar estos descubrimientos diferentes
tienen que considerarse varios puntos. La etnicidad puede influir
fuertemente en el papel de factores de riesgo genético, y por lo
tanto también lo puede hacer la distribución de variantes de genes
en las poblaciones de diferentes países europeos, o incluso entre
diferentes áreas del mismo país (53, 55, 60, 62, 70). Además, la
asociación entre AD y SNP de IL-6 puede limitarse a
edades particulares, y en las muestras de los presentes
solicitantes todos los sujetos AD y HC eran de edad avanzada.
Finalmente, se debe considerar el papel
desempeñado por un gen o por varios genes en el desequilibrio de
ligamiento con esta mutación: en alemanes se ha descrito un fuerte
desequilibrio entre SNP -174 y el polimorfismo VNTR de la región
flanqueante 3' del gen de IL-6 (49).
El descubrimiento principal de este estudio fue
la identificación de un grupo de sujetos con un alto riesgo de AD
de inicio tardío debido a la presencia concomitante de los alelos
-1082A de IL-10 y -174 C de e IL-6.
También se exploraron las interacciones entre los genes de
IL-10 o IL-6 y ApoE, pero no se
encontró ninguna prueba de efectos sinérgicos, lo que sugiere que
estos alelos relacionados con la inflamación son un factor de
riesgo adicional e independiente para la AD.
Para arrojar más luz sobre los resultados
genéticos, los inventores también analizaron la producción de
IL-10 e IL-6 específica de péptido
\beta-amiloide, LPS y Flu por células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) en una subserie de
pacientes con AD y HC de edades equiparables. Los resultados
demostraron que: 1) la producción de IL-6 por PBMC
de los pacientes con AD y los controles no difería
significativamente en ninguna condición; y 2) la generación de
IL-10 por PBMC estimuladas por LPS y Flu era
comparable en los dos grupos, mientras que en AD se detectó un
deterioro inmune específico de \beta-amiloide
caracterizado por una generación reducida de IL-10.
El hecho de que este desequilibrio de citocinas no se observara en
las PBMC estimuladas por mitógeno indica que las respuestas inmunes
específicas de \beta-amiloide están alteradas
selectivamente en AD. Además, el descubrimiento de que la
proliferación estimulada por Flu era similar en pacientes y
controles indica que el procesamiento y la presentación antigénica
en asociación con las moléculas de HLA de clase II, y la ruta
autorrestringida por CD4-HLA de clase II de
activación del sistema inmune (44), no son defectuosos en los
pacientes con AD. De esta manera, es concebible un escenario
biológico en el que la reducción de la producción de
IL-10 específica de amiloide favorece el
desencadenamiento del proceso inflamatorio crónico observado en el
cerebro con AD. En los individuos sin AD podría estar activo un
circuito de retroalimentación inhibidora mediado por
IL-10 y específico de amiloide, y una ruptura de
este circuito podría estar asociada o ser predictiva del desarrollo
de AD. Un estudio reciente demostró convincentemente que un circuito
proinflamatorio/IL-10 que gira alrededor de las
células del sistema inmune innato regula la susceptibilidad a
enfermedades autoinmunes (48). Los resultados de los presentes
solicitantes amplían este concepto demostrando que en pacientes con
AD este circuito está alterado. Los datos en conjunto confirman la
teoría de que el riesgo total de desarrollar AD puede estar
gobernado por un "perfil de susceptibilidad" que refleja la
influencia combinada de heredar múltiples alelos de alto riesgo, y
arroja luz sobre el papel central de los SNP de la
IL-10 y la IL-6 en
este perfil.
este perfil.
La inflamación está implicada en la patogénesis
de la enfermedad de Alzheimer (AD), la citocina antiinflamatoria
interleucina-10 (IL-10) podría
contrarrestar la actividad de la IL-6 en el cerebro.
Como el promotor de estos genes es polimórfico, los presentes
solicitantes investigaron en los 65 pacientes con AD y los 65
controles sanos (HC) los alelos -1082 GA de IL-10 y
-174 GC de IL-6. En varios casos, también evaluaron
la producción de IL-10 e IL-6 por
PBMC. En el caso de la IL-10 hubo un nivel
significativamente mayor del genotipo -1082GG (p = 0,019) en HD en
comparación con HC, mientras que en el caso de la
IL-6 el genotipo G/G era menor y el alelo C mayor
(p<0,005). La concomitancia de los alelos A de
IL-10 y C de IL-6 elevó
significativamente el riesgo de AD (razón de probabilidades: OR
11,2, intervalo de confianza: CI 1,3-97,3;
p<0,05) independientemente de la ApoE 4 (OR ajustada 10,3, CI
1-108; p<0,05). Sólo la producción de
IL-10 estimulada por amiloide difería en AD y HC (p
= 0,023). Estos resultados son conflictivos con la teoría
inflamatoria en AD, indicando un papel central de polimorfismos de
IL-10 e IL-6 y una alternancia
selectiva en esta red.
\newpage
Los métodos descritos en los ejemplos anteriores
se usaron para realizar análisis de genotipos sobre el
interferón-\gamma y el
TNF-\alpha en pacientes con Alzheimer y controles
sanos. En las tablas VIII y IX se muestra un resumen de los
resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las frecuencias de los diferentes genotipos
entre pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) no fueron
estadísticamente diferentes de las observadas en los controles
sanos (HC).
- \chi^{2} = 0,305, df = 2, p = 0,859.
Entre paréntesis, (c), se muestran los
correspondientes fenotipos de producción elevada (H), intermedia (M)
y baja (L).
Alelo:
- \chi^{2} = 0,174, df = 1, p = 0,676.
\vskip1.000000\baselineskip
No hay diferencias estadísticamente
significativas cuando se comparan los pacientes con Alzheimer y los
controles, lo que indica que ni el
interferón-\gamma ni el
TNF-\alpha están asociados con la probabilidad de
desarrollar la enfermedad de Alzheimer.
Por el contrario, la presente invención
demuestra que la IL-10 y la IL-6 son
altamente predictivas del desarrollo de Alzheimer y posiblemente
también predicen la progresión de la enfermedad. El mejor valor
predictivo se conseguirá combinando ensayos de genotipos para
múltiples polimorfismos génicos, por ejemplo, IL-10,
IL-6, ApoE y otros que según se ha demostrado están
asociados con la enfermedad de Alzheimer.
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activity of CpG-oligonucleotides by incorporation of
site-specific chemical modifications: Significance
of internucleoside negative charge" Poster #229
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immunostimulatory agents", found on:
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Neurology 55(4): 464-6 2000,
Aug 22.
Claims (5)
1. Un método para determinar la existencia de
una predisposición a la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el
método analizar in vitro una muestra que lleva ADN tomada a
partir de un sujeto animal para determinar las variantes alélicas
presentes en uno o más de los loci de SNP en las posiciones -1082,
-819 y -592 del gen que codifica IL-10.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se determina el genotipo en las tres posiciones -1082,
-819 y -592.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
o la reivindicación 2, que comprende además analizar la muestra
para determinar los alelos presentes para los genes que codifican
IL-6 y ApoE.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
que comprende además analizar la muestra para determinar los alelos
presentes para el gen que codifica IL-1.
5. Uso de los fragmentos de ADN o ADNc que
codifican el gen de IL-10 y que comprenden los
polimorfismos alélicos GCC/GCC, GCC/ACC, GCC/ATA, ACC/ACC, ACC/ATA
y ATA/ATA en un método de exploración de compuestos con respecto a
su capacidad de modular o prevenir la enfermedad de Alzheimer.
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