PL214648B1

PL214648B1 - Zastosowanie analogów saponiny OSW-1 o uproszczonej budowie wykazujacych dzialanie cytotoksyczne

Info

Publication number: PL214648B1
Application number: PL387235A
Authority: PL
Inventors: Jacek Witold Morzycki; Agnieszka Wojtkielewicz; Jana Oklestkova; Miroslav Strnad
Original assignee: Univ W Bialymstoku
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2013-08-30
Also published as: WO2010088866A3; NZ594217A; US20110311652A1; EP2393826B1; EP2393826A2; ZA201105443B; AU2010210218A1; PL387235A1; WO2010088866A2; AU2010210218B2; CA2751263A1; US8552161B2; CA2751263C

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są analogi saponiny OSW-1 o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza benzyl lub podstawiony benzyl, C_1-18 alkanoil. C_3-18 alkenoil, benzoil lub podstawiony benzoil, jako związki cytotoksyczne, potencjalnie przydatne do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych.

Saponiny są grupą naturalnych metabolitów składających się z części cukrowej połączonej ze steroidowym lub triterpenoidowym aglikonem. Związki te wykazują szerokie spektrum aktywności biologicznej i zastosowań. W przemyśle farmaceutycznym znalazły one zastosowanie między innymi jako:

• środki wspomagające wchłanianie właściwych preparatów farmaceutycznych (np. patent US 4501734 opisuje zastosowanie triterpenoidowych saponin z Sapindus mukurossi Gaertn. jako składnika wspomagających wchłanianie antybiotyków β-laktamowych) • leki wspomagające w szczepionkach przeciwko różnym chorobom (w tym celu powszechnie stosowane są triterpenowe glikozydy wyizolowane z Quillaja saponaria np. patent US 5057540, WO 91/04052, podobne zastosowanie znalazły także saponiny Quinoa. patent WO 9603998) • środki przeciwzapalne (np. aescin, saponina z nasion Aesculas hippocastanum; patent US 5118671) • środki przeciwwrzodowe (np. Glyceyrrhiza glabra saponiny; patent US 5166139) • leki przeciwnowotworowe (np. mieszanina steroidowych i triterpenoidowych saponin wyizolowanych m.in. z Quillaja saponaria Malina, zgłoszenie patentowe US 2005/0175623 A1, saponina OSW-1 patent CN 1951394, WO 2004091484, US 2005004044).

Saponina OSW-1, 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1 >3)-2'-O-acetylo-a-L-arabinopiranozyd 3e,16ei7a-trihydroksycholest-5-en-22-onu (wzór 2) należy do rodziny glikozydów cholestanowych wyizolowanych w 1992 roku przez grupę japońskich badaczy kierowaną przez Sashidę z cebulek śniedka 0rnithogalum saundersiae rosnącego w południowo-wschodniej Afryce (S. Kubo, Y. Mimaki, M. Terao, Y. Sashida, T. Nikaido, T. Ohmoto, Phytochemistry, 31, 3969 (1992)).

W testach National Cancer Institute przeprowadzonych na linii komórkowej ludzkiej leukemii HL-60, saponina OSW-1 wykazuje aktywność cytostatyczną w stężeniach nanomolowych (IC50 = 0.25 nM) i wielokrotnie przewyższa swoją aktywnością znane cytostatyki takie, jak adriamycyna, cisplatyna czy taksol. Jednocześnie jest stosunkowo mało toksyczna w stosunku do komórek zdrowych, np. dla normalnych

PL 214 648 B1 komórek płucnych IC50 = 1500 nM (Y. Mimaki. M. Kuroda, A. Kameyama, Y. Sashida, T. Hirano, K. Oka, R. Maekawa, T. Wada, K. Sugita. J. A. Beutler, Bioorg.& Med. Chem. Lett. 7, 633 (1997), Y. Zhou, C. GraciaPrieto, D.A. Carney, R. Xu, H. Pelicano, Y. Kang, W. Yu, C. Lou, S. Kondo, J. Liu, D.M. Harris, Z. Estrov. M.J. Keating, Z. Jin, P. Huang, J. Natl. Cancer Inst. 97, 1781 (2005)). Jej aktywność w porównaniu ze stosowanymi obecnie cytostatykami przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 2 przedstawia aktywność OSW-1 w stosunku do różnych komórek nowotworowych. Badania in vivo przeprowadzone przez Mimaki i współpracowników wykazały, że jednorazowa dawka 0,01 mg/kg tego związku przedłużyła o 59% życie myszy z leukemią P388. Skuteczność saponiny OSW-1 w badaniach in vivo przeprowadzonych na myszach wykazali również naukowcy amerykańscy w patencie WO 2004091484.

T a b e l a 1. Porównanie aktywności cytostatycznej saponiny OSW-1 i stosowanych klinicznie cytostatyków

Nazwa związku	PGI50 (średnia z 60 linii komórek rakowych)
cyklofosfamid	3,7
5-fluorouracyl	4,7
cisplatyna	5,7
adriamycyna	6,9
taksol	7,9
OSW-1	9,1

T a b e l a 2. Aktywność cytostatyczna OSW-1 i niektórych stosowanych cytostatyków do wybranych linii komórek rakowych

Linia komórek nowotworowych	IC50 gg/ml)
OSW-1	mitomycyna	adriamycyna	cisplatyna	kamptotecyna	taksol
CCD-19Lu	1.5	2	2	10	2	2
P388	0.00013	0.01	0.003	0.05	0.005	0.01
P388/ADM	0.00077
P388/CPT	0.00010
FM3A	0.00016
A-549	0.00068
Lu-65	0.00020
Lu-99	0.00020	0.01	0.002	0.001	0.001	0.002
RERF-LC-AI	0.00026
CCRF-CEM	0.00016	0.02	0.01	0.005	0.005	0.001
CCD-19Lu (human normal pulmonary cell) A-549 (human pulmonary adenocarcinoma) P388 (mouse leukemia) Lu-65 (human pulmonary large cell carcinoma) P388/ADM (adriamycin-resistant P388) Lu-99 (human pulmonary large cell carcinoma) P388/CPT (camptothecin-resistant P388) RERF-LC-AI (human pulmonary squamous cell carcinoma) FM3A (mouse mastrocarcinoma) CCRF-CEM (human leukemia)

Profil działania saponiny OSW-1 nie pasuje do żadnego z sześciu wyróżnionych przez badaczy amerykańskich mechanizmów działania cytostatycznego (środki alkilujące, inhibitory topoizomerazy I, inhibitory topoizomerazy II, antymetabolity RNA/DNA, antymetabolity DNA, środki antymitotyczne). W 2005 roku ukazały się pierwsze dane dotyczące mechanizmu jej działania w organizmie. Ustalono, że saponina OSW-1 powoduje zniszczenie błony mitochondrialnej i cristae w komórkach rakowych, zwiększa stężenie wapnia w cytoplazmie i indukuje Ca²⁺-zależną apoptozę (Y. Zhou, C. Gracia-Prieto, D.A. Carney. R. Xu, H. Pelicano, Y. Kang, W. Yu. C. Lou. S. Kondo, J. Liu, D.M. Harris, Z. Estrov, M.J. Keating, Z. Jin, P.

PL 214 648 B1

Huang, J. Natl. Cancer Inst. 97, 1781 (2005), J. Zhu, L. Xiong, J. Wu, Mol. Pharmacol. 68. 1831 (2005)).

Odmienny w porównaniu do innych cytostatyków mechanizm działania saponiny OSW-1 pozwala przypuszczać, że może okazać się ona skuteczna w walce z lekoopornymi odmianami nowotworów.

Do tej pory opisano kilka alternatywnych dróg syntezy tego naturalnego produktu (patenty: CN 101029070, CN 1844138, US 6753414; inne publikacje: S. Deng, B. Yu. Y. Lou. Y. Hui. J. Org. Chem. 64, 202 (1999), C. Guo, P.L. Fuchs, Tetrahedron Lett. 39, 1099 (1998), W. Yu, Z.J. Jin. Am. Chem. Soc. 123. 3369 (2001); ibid. 124, 6576 (2002), J.W. Morzycki, A. Wojtkielewicz. Carbohydr. Res. 337, 1269 (2002). Q. Xu, X. Peg, W. Tian, Tetrahedron Lett. 44, 9375 (2003), J.X.P. Liu, Y. Pan. Z. Guo, J. Org. Chem. 73, 157 (2008), M. Tsubuki, S. Matsuo, T. Honda, Tetrahedron Lett. 49, 229 (2008)). Jednakże tylko dwie z nich nie przewidują użycia na jednym z etapów syntezy, toksycznego i drogiego reagenta - czterotlenku osmu, co wydaje się być szczególnie istotne przy ewentualnym wykorzystaniu metody w przemyśle farmaceutycznym. Jedna z nich została zaproponowana przez zespół amerykański w 2002 roku (US 6753414). W drugiej metodzie opracowanej przez nasz zespół kluczowym etapem jest otwarcie pierścienia epoksydowego za pomocą H2O2/LiOH. Szczegółowe dane syntetyczne dotyczące tej metody zamieszczono w następujących publikacjach: J.W. Morzycki, A. Gryszkiewicz, I. Jastrzębska, Tetrahedron 57, 2185 (2001), J.W. Morzycki. A. Wojtkielewicz, Carbohydr. Res. 337, 1269 (2002) oraz w patencie PL 191517 B1.

Wysoka aktywność biologiczna, selektywność działania oraz nowy mechanizm działania saponiny OSW-1 sprawiają, że może stanowić ona potencjalnie bardzo dobry lek. Użycie tego związku w terapii przeciwnowotworowej opisane zostało w patentach: CN 1951394, WO 2004091484, US 2005004044. Synteza saponiny OSW-1, ze względu na skomplikowaną budowę tego związku, jest wieloetapowa i stosunkowo mało wydajna. Z tego względu prowadzone są badania nad syntezą analogów saponiny OSW-1 o uproszczonej budowie, ale zachowujących wysoką aktywność i selektywność związku macierzystego. Do tej pory otrzymano szereg analogów saponiny OSW-1, posiadających zmodyfikowany aglikon lub różniących się częścią cukrową oraz wyznaczono ich aktywność w stosunku do wybranych linii komórek rakowych (patenty: CN 1010899008, CN 101029072, WO 2005082924; inne publikacje: C. Guo. T.G. LaCour, P.L. Fuchs, Bioorg. Med. Lett., 9, 419 (1999), X. Ma. B. Yu, Y. Hui. D. Xiao, J. Ding, Carbohydr. Res. 329, 495 (2000), X. Ma. B. Yu, Y. Hui, Z. Miao, J. Ding, Carbohydr. Res. 334, 159 (2001), X. Ma, B. Yu, Y. Hui, Z. Miao, J. Ding, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 11, 2153 (2001), H. Den, H. Wo, B. Yu, M.R. Jiang. J.R. Wu, Chin. J. Chem. 22, 994 (2004), J.W. Morzycki, A. Wojtkielewicz, S. Wolczyński, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 3323 (2004). L. Deng, H. Wu. B. Yu, M. Jiang, J. Wu, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 2781 (2004), Y. Matsuya, S. Masuda, N. Ohsawa, S. Adam, T. Tschamber, J. Eustachę, K. Kamoshita, Y. Sukenaga, H. Nemoto, Eur. J. Org. Chem. 797 (2005), B. Shi, P. Tang, X. Hu, J.O. Liu, B.Yu, J. Org. Chem. 70, 10354 (2005), P. Tang, F. Mamdani, X. Hu, J.O. Liu, B. Yu, Bioorg.& Med. Chem. Lett. 17, 1003 (2007); W. Peng. P. Tang, X. Hu, J.O. Liu, B. Yu. Bioorg.& Med. Chem. Lett. 17, 5506 (2007), T. Tschamber, S. Adam, Y. Matsuya, S. Masuda, N. Ohsawa, S. Maruyama, K. Kamoshita, H. Nemoto, J. Eustache, Bioorg.& Med. Chem. Lett. 17, 5101 (2007), A. Wojtkielewicz, M. Długosz, J. Maj, J.W. Morzycki, M. Nowakowski, J. Renkiewicz, M. Strnad, J. Swaczynova, A.Z. Wilczewska, J. Wójcik, J. Med. Chem. 50, 3667 (2007)).

W naszych dalszych badaniach okazało się, że przedstawione na wzorze 1 analogi saponiny OSW-1 ze zmodyfikowanym łańcuchem bocznym (23,24,25,26,27-pentanor-22-deokso-22-benzyloksy lub 23.24,25,26.27-pentanor-22-deokso-22-acyloksy pochodne saponiny OSW-1) wykazują znaczącą aktywność cytostatyczną w stosunku do różnych komórek rakowych. Związki te są łatwo dostępne z (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,21-triolu opisanego w publikacji: J.W. Morzycki, A. Gryszkiewicz, I. Jastrzębska, Tetrahedron 57, 2185 (2001); wzór 3).

PL 214 648 B1

Aktywność cytostyczna tych związków była badana względem następujących linii komórek nowotworowych: białaczki T-Iimfoblastycznej (CEM); raka sutka (MCF-7), szpiczaka mnogiego (RPMI 8226), raka płuc (A-549), przewlekłej białaczki szpikowej (K562), raka szyjki macicy (HeLa), czerniaka złośliwego (G361), czerniaka (ARN 8), kostniakomięsaka (HOS). Patentowane związki okazały się wyraźnie mniej toksyczne w stosunku do komórek zdrowych (wartość IC50 dla prawidłowych ludzkich fibroblastów BJ była, w zależności od związku i linii komórek nowotworowych, 3-360 razy większa niż w przypadku komórek nowotworowych).

Wynalazek zostanie opisany na poniższych przykładach.

P r z y k ł a d 1.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-21-benzyloksy-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a-triolu (wzór 1; R = benzyl; związek 1)

Regioselektywne benzylowanie (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16β,17α,21 -triolu.

Do oziębionego do 0°C roztworu (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,21-triolu (0,5 g, 1,3 mmola, patent PL 191517 B1) w suchym THF (15 ml) dodano NaH (0,048 g, 1,5 eq) i mieszano przez 15 minut. Następnie dodano kroplami roztwór bromku benzylu (0,17 ml, 1,1 eq) w THF (2 ml) i kontynuowano mieszanie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie nadmiar NaH rozłożono wodą i produkt wyekstrahowano eterem dietylowym. Ekstrakt przemyto wodą. osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, rozpuszczalnik odparowano. Surowy produkt oczyszczono chromatograficznie stosując jako adsorbent żel krzemionkowy. Eter 21-0-benzylowy wyeluowano układem heksan-octan etylu (8 : 2).

(20R)-21-benzyloksy-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,-diol (0,43 g, 70%) IR (CHCis) v = 3606, 3440, 1455, 1091 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCla, 25°C, TMS), δ = 7,34 (m, 5H), 4,54 (s, 2H), 3,92 (bs, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,70 (t, J = 9,0, 1H), 3,43 (dd, J1 = 3,2, J2 = 9,2, 1H), 3,33 (s, 3H), 2,78 (m, 1H), 1,04 (s, 3H), 1,01 (s, 3H), 0,95 (d, J = 7,1, 3H), 0,66 (m, 1H), 0,44 (dd, J1 = 5,1, J2 = 8,0, 1H); ¹³CNMR (100 MHz, CDCl3, 25°C, TMS), δ = 137,3 (C), 128,6 (2CH), 127,9 (CH), 127,8 (2CH), 85,6 (C), 82,3 (CH), 80,9 (CH), 74,0 (CH2), 73,7 (CH2), 56,5 (CH3), 48,4 (CH), 47,6 (CH), 47,4 (C), 43,3 (C), 35,4 (C), 34,7 (CH2), 34,6 (CH), 34,5 (CH2), 33,37 (CH2), 33,36 (CH2), 30,4 (CH), 25,0 (CH2), 22,2 (CH2), 21,6 (CH), 19,3 (CH3), 13,4 (CH3), 13,0 (CH2), 12,9 (CH3) ppm.

Glikozylowanie za pomocą trichloroacetoimidu 2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozylu

Do roztworu (20R)-21-benzyloksy-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a-diolu (0,19 g, 0,41 mmola) i trichloroacetoimidu 2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozylu (0,46 g, 0,50 mmol; S. Deng, B. Yu, Y. Lou, Y. Hui, J. Org. Chem. 64, 202 (1999)) w suchym chlorku metylenu (10 ml) dodano 1,28 g sit molekularnych 4 A MS i mieszano przez 15 min w temperaturze pokojowej. Następnie obniżono temperaturę do -68°C (etanol/CO2) i dodano kroplami, w atmosferze argonu, 0,14 M roztwór TMSOTf (1,1 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -40°C (acetonitryl/CO2) przez 30 minut, po czym reakcję rozłożono trietyloaminą (0,5 ml), odsączono sita molekularne i odparowano rozpuszczalnik. Surowy produkt oczyszczono chromatograficznie, stosując jako adsorbent żel krzemionkowy. Żądany glikozyd wyeluowano układem heksan - octan etylu (95 : 5).

16-0-{2-0(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1--3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-benzyloksy-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a-diolu (0,34 g, 66%)

IR (CHCl3) v = 3517, 3446, 3405, 1729, 1607, 1511, 1458, 1096, 909, 615 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3, 25°C, TMS), δ = 7,98 (d, J = 9,0, 2H), 7,32 (m, 5H), 6,91 (d, J = 9,0, 2H), 4,90 (m, 2H), 4,72 (d, J = 5,3, 1H), 4,57 (d, J = 12,0, 1H), 4,37 (d, J = 12,0, 1H), 4,18 (s, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,99 (m, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,87 - 3,59 (m, 6H), 3,47 (dd, J1 = 4,0, J2 = 7,8, 1H), 3,32 - 3,25 (m, 3H), 3,30 (s, 3H), 2,74 (m, 1H), 1.85 (s, 3H), 1,10 (d, J = 7,2, 3H), 1,01 - 0,87 (m, 34H), 0,67 - 0,54 (m, 19H), 0,40 (dd, J1 = 5,1, J2 = 8,0, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3, 25°C, TMS), δ = 168,7 (C), 164,6 (C), 163,3 (C), 137,9 (C), 131,8 (2CH), 128,4 (3CH), 128,1 (3CH), 127,8 (CH), 122,7 (C), 113,3 (2CH), 102,5 (CH), 100,7 (CH), 90,6 (CH), 87,3 (C), 82,4 (CH), 75,9 (CH2), 73,7 (2CH2), 73,5 (CH), 71,0 (CH), 70,8 (CH), 68,7 (CH), 64,6 (CH2), 56,4 (CH3), 55.4 (CH3), 48,0 (CH), 47,5 (CH), 46,6 (C), 43,3 (C), 35,5 (C), 35,0 (CH2), 34,5 (CH2), 33,9 (CH), 33,3 (CH2), 32,9 (CH2), 30,3 (CH), 25,0 (CH2), 22,3 (CH2), 21,7 (CH), 20,8 (CH3), 19,2 (CH3), 13,7 (CH3), 13,5 (CH3), 12,9 (CH2), 6,9 (3CH3), 6,83 (3CH3), 6,80 (3CH3), 5,03 (3CH2), 5,00 (3CH2), 4,9 (3CH2) ppm.

PL 214 648 B1

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Do otrzymanego w poprzednim etapie glikozydu (0,018 g, 0,014 mmola) rozpuszczonego w mieszaninie: dioksan (2,8 ml) - woda (0,4 ml) dodano p-TsOHxH2O (0,002 g) i mieszano przez 1.5 godziny w 75°C. Następnie mieszaninę reakcyjną wylano do wody i produkt wyekstrahowano octanem etylu. Saponinę (0,015 g, 93%) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną dichlorometan - metanol (97:3).

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozyd (20R)-21-benzyloksy-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a-triol (związek 1)

IR (CHCI3) v = 3434, 1738, 1722, 1606, 1512, 1454, 1068, 845 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCI3, 25°C, TMS), δ = 8,02 (d, J = 8,7, 2H), 7,28 (m, 5H), 6,96 (d, J = 8,7, 2H), 5,31 (brs, 1H) 4,90 (dd, J1 = 4,9, J2 = 6,7, 1H), 4,84 (dd. J1 = 6,8, J2 = 7,3, 1H), 4,70 (d, J = 6,5, 1H), 4,51 (d, J = 12,0, 1H), 4,19 (d, J = 12,0, 1H), 4,16 (dd, J1 = 4,5, J2 = 11,6, 1H), 4,02 (s, 1H), 3,94 (m, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,87 (m, 3H), 3,72 (m, 2H), 3.52 (m, 4H), 3,45 - 3,38 (m, 4H), 2,85 (m, 1H), 1,81 (s, 3H), 1,01 (s, 3H), 0,99 (d, J = 9,0, 3H), 0,77 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCI3, 25°C, TMS), δ = 169,3 (C), 166,3 (C), 164,1 (C), 140,6 (C), 137,6 (CH), 132,2 (2CH), 128,4 (2CH), 128,2 (2CH), 127.9 (CH). 121,6 (CH), 121,3 (C), 113,9 (2CH), 101,9 (CH), 101,8 (CH). 90,5 (CH), 87,2 (C), 80,4 (CH), 75,4 (CH2), 74,5 (CH), 74,0 (CH2), 73,6 (CH), 71,8 (CH), 70,7 (CH), 69.7 (CH), 66,4 (CH), 64,6 (CH2), 63,3 (CH2), 55,5 (CH3), 49,7 (CH), 48,3 (CH), 46,2 (C), 42,3 (CH2, C), 37,2 (CH2), 36,4 (C), 35,1 (CH2), 33,8 (CH). 32,4 (CH2), 31,9 (CH), 31,6 (CH2), 29,7 (CH2), 20,6 (CH2, CH3), 19,4 (CH3),13,7 (CH3), 12,9 (CH3) ppm, ESI-MS m/z (%) 917,4 (MNa⁺).

P r z y k ł a d 2.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1--3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-21-benzoilo-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (wzór 1; R = benzoil; związek 2)

Usunięcie grupy benzylowej z 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1 - 3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-benzyloksy-20-metylo-6e-metoksy-3α,5α-cyklopregnano-16β,17α-diolu

Do mieszanego magnetycznie roztworu gIikozydu (0,5 g, 0,4 mmoIa) rozpuszczonego w mieszaninie octanu etyIu i bezwodnego etanoIu (v/v 1:1; 20 mI) dodano 10% Pd/C (0,53 g) i trietyloaminę (0,18 mI). Reakcje prowadzono w atmosferze wodoru (5 MPa) w 50°C przez 20 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną przesączono przez celit w celu usunięcia katalizatora i odparowano. Żądany aIkohoI (0,38 g, 82%) otrzymano w wyniku chromatografii koIumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną heksan - octan etyIu (8 : 2).

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1 — 3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,21-triolu (0,38 g, 82%)

IR (CHCl3) v = 3688, 3486, 1725, 1607, 1511, 1458, 1255, 1096 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3, 25°C, TMS), δ = 7,99 (d, J = 9,0, 2H), 6,91 (d, J = 9,0, 2H), 4,96 (dd. J1 = 4,9, J2 = 7,1, 1H), 4,91 (dd, J1 = 5,5, J2 = 6,9, 1H), 4,39 (d, J = 5,3, 1H), 4,36 (d, J = 4,9, 1H), 4,14 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,68 - 3,78 (m, 6H), 3,54 (dd, J1 =3,1, J2 = 11,0, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,32 (s, 3H), 3,24 (dd, J1 = 7,7, J2 = 11,4, 1H), 2,76 (m, 1H), 1,90 (s, 3H), 0,86 - 1,07 (m, 34H), 0,53 - 0,66 (m, 19H), 0,42 (dd, J1 = 5,1, J2 = 7,9, 1H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3. 25°C, TMS), δ = 169,1 (C), 164,8 (C),

163.3 (C), 131,9 (2CH), 122,6 (C), 113,4 (2CH), 102,3 (CH), 101,1 (CH), 89,5 (CH), 88,1 (C), 82,3 (2CH), 74,2 (CH), 71,3, (CH), 70,8 (CH), 67,7 (2CH2), 64,7 (CH2), 56,4 (CH3), 55,4 (CH3), 48,0 (2CH), 47,5 (2CH), 47,0 (C), 43,4 (C), 35,5 (C), 35,4 (CH), 34,71 (CH2), 34,67 (CH2), 33,3 (CH2), 32,9 (CH2),

30.3 (CH), 25,0 (CH2), 22,2 (CH2), 21,6 (CH), 20,8 (CH3), 19,2 (CH3), 13,6 (CH2), 13,0 (CH3), 12,4 (CH3), 6,9 (3CH3), 6,83 (3CH3), 6,81 (3CH3), 5,1 (3CH2), 5,0 (3CH2), 4,8 (3CH2) ppm.

Estryfikacja kwasem benzoesowym

Roztwór 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e, 17a,21-triolu (0,049 g, 0,042 mmola), kwasu benzoesowego (0,006 g 0,049 mmola), DCC (0,01 g, 0,049 mmola) i DMAP (0,5 mg, 0,004 mmola) w chlorku metylenu (5 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Po zakończeniu reakcji N,N-dicykloheksylomocznik odsączono, a przesącz przemyto 5% roztworem kwasu octowego, wodą i wysuszono nad MgSO4. Rozpuszczalnik odparowano. Produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną heksan - octan etylu (8,5 :1.5). Uzyskano 0,047 g (89%) 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1— 3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd}

PL 214 648 B1 (20R)-21-benzoilo-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,21-triolu [¹H NMR (400 MHz, CDCl3. 25°C, TMS), δ = 7,96 (m, 4H), 7,52 (m, 1H), 7,43 (m, 2H), 6,85 (d, J = 9,0, 2H), 5,06 (dd. J1 = 5,6, J2 = 8,1, 1H), 4,94 (t, 1H), 4,71 (d, J = 5,5, 1H), 4,36 (m, 2H), 4,01-4,08 (m, 5H), 3,85 (s, 4H), 3,40 - 3,71 (m, 6H), 3,31 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 1,83 (s, 3H), 0,88 - 1,26 (m, 34H), 0,42 - 0,65 (m, 20H)], który bez dalszej identyfikacji poddano reakcji usunięcia grup zabezpieczających.

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Do otrzymanego w poprzednim etapie estru (0,047 g, 0,037 mmola) rozpuszczonego w mieszaninie: dioksan (2,8 ml) - woda (0,4 ml) dodano p-TsOHxH2O (0,002 g) i mieszano przez 1,5 godziny w 75°C. Następnie mieszaninę reakcyjną wylano do wody i produkt wyekstrahowano octanem etylu. Saponinę (0,030 g, 88%) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, eluując mieszaniną dichlorometan - metanol (97 : 3). 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-Dksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozyd (20R)-21-0-benzoilo-20-metylopregn-5-eno-3e,-16e,17a,21-tetraol (związek 2)

IR (KBr) v = 3448, 1717, 1605, 1512, 1459, 1259, 1049 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃/MeOD, 25°C, TMS), δ = 7,80 (m, 4H), 7,45 (t, J = 7,4, 1H), 7,31 (m, 2H), 6,73 (d, J = 8,8, 2H), 5,18 (m, 1H),

4.94 (dd, J1 = 7,3 J2 = 9,2, 1H), 1H), 4,76 (t, 1H), 4,44 (d, J = 7,0, 1H) 4,23 (d, J = 7,2, 1H) 4,14 (m, 1H), 4,06 (m, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,73 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,44 - 3,59 (m, 5H), 3,35 (m, 2H), 3,17 (m, 1H), 1,67 (s, 3H), 0,94 (d, J = 6,9, 3H), 0,87 (s, 3H) 0.71 (s, 3H). ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3. 25°C, TMS), δ = 169,4 (C), 166,6 (C), 166,1 (C), 164,0 (C), 140,6 (C), 133,0 (CH), 132,1 (2CH), 130,1 (C), 129,4 (2CH), 128,5 (2CH), 121,5 (CH), 121,2 (C), 113,9 (2CH), 101,9 (CH), 101,3 (CH), 88,5 (CH), 86,9 (C), 79,7 (CH), 74,3 (CH), 73,5 (CH), 71,7 (CH), 70,5 (CH), 69,7 (CH), 68,8 (CH2), 66,7 (CH), 64,3 (CH2), 63,7 (CH2), 55,5 (CH3), 53,4 (CH2), 49,7 (CH), 48,5 (CH), 46,7 (C), 42,3 (CH2), 37,2 (CH2), 36,4 (C). 34,1 (CH), 32,5 (CH2), 31,8 (CH), 31,7 (CH2), 31,6 (CH2). 29,7 (CH2), 20,6 (CH3), 19,4 (CH3), 13,0 (CH3), 12,2 (CH3) ppm; ESI-MS m/z (%) 931,4 (MNa⁺); dla C49H64O16Na, obliczono: 931,40866; znaleziono: 931,40631.

P r z y k ł a d 3.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksy/op/ranozy/o-(1 -3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-21-0-(4-metoksybenzoilo)-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu ((wzór 1; R = 4-metoksybenzoil; związek 3)

Estryfikacja kwasem 4-metoksybenzoesowym

Estryfikacja 16-0-{2-0(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1->3)-2'0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,21-triolu kwasem 4-metoksybenzoesowym została przeprowadzona analogicznie jak w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: heksan - octan etylu (84 :16)) otrzymano żądany ester z wydajnością 65%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-(4-metoksybenzoilo)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5acyklopregnanoo-16e,17a,21-triolu [¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, 25°C, TMS), δ = 8,07 (d, J = 8,8, 2H),

7.95 (d, J = 8,8, 2H), 6,96 (d, J = 8,8, 2H), 6,86 (d, J = 8,8, 2H), 5,06 (m, 1H), 4,95 (t, J = 6,1, 1H), 4,74 (m, 1H), 4,36 (m, 2H), 4,25 (dd, J1 = 3,4, J2 = 11,1, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 3,85 (s, 4H), 3,60 - 3,75 (m, 4H), 3,37 (m, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 1,85 (s, 3H), 0,86 - 1,27 (m, 34H), 0,53 - 0,66 (m, 19H), 0,42 (m, 1H) ppm], który bez dalszej identyfikacji poddano reakcji usunięcia grup zabezpieczających.

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Otrzymany w poprzednim etapie ester poddano reakcji z kwasem p-toluenosulfonowym, zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej za żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: chlorek metylenu - metanol (94 : 6)) żądaną saponinę uzyskano z wydajnością 90%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-(4-metoksybenzoilo)-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (związek 3)

IR (CHCl3) v = 3588, 3384, 1738, 1724, 1715, 1607, 1512, 1259, 1196 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz. CDCl3/ MeOD, 25°C, TMS), δ = 7,91 (d, J = 8,8, 2H), 7,87 (d, J = 8,8, 2H), 6,88 (d, J = 8,9, 2H), 6,85 (d, J = 8,9, 2H), 5,30 (m, 1H), 5,06 (dd, J1 = 6,7, J2 = 8,4, 1H), 4,89 (J1 = 7,0, J2 = 7,6. 1H), 4,63 (d, J = 6,5, 1H), 4,35 (d, J = 6,6, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,11 (dd, J1 = 3,5. J2 = 11,0, 1H), 4,05 (dd, J1 = 4,5, J2 = 11,7, 1H), 3,95 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,82 (s, 3H), 3,61 - 3,71 (m, 4H), 3,45 (m, 2H), 3,34 (dd, J1 = 8,6, J2 = 11,6, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,01 (d, J = 7,0, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,83 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz,

PL 214 648 B1

CDCl3/MeOD, 25°C, TMS), δ = 169,5 (C), 166,6 (C), 165,7 (C), 163,8 (C), 163,5 (C), 140,6 (C), 131,9 (2CH), 131,4 (2CH), 122,4 (C),121.6 (C), 121,5 (CH), 113,71 (2CH), 113,69 (2CH), 102,4 (CH), 101,7 (CH), 88,4 (CH), 86,7 (CH), 79,7 (CH), 74,0 (CH), 73,1 (CH), 71,5 (CH), 70,5 (CH), 69,4 (CH), 68,5 (CH2), 67,4 (CH), 64,53 (CH2), 64,45 (CH2), 55,40 (CH3), 55,39 (CH3), 53,38 (C), 48,5 (CH), 46,6 (C), 42,0 (CH2), 37,2 (CH2), 36,4 (C), 35,1 (CH2), 34,0 (CH), 32,5 (CH2), 31,74 (CH), 31,69 (CH2), 31,3 (CH2), 20,5 (CH2), 20,4 (CH3), 19,3 (CH3), 12,9 (CH3), 12,1 (CH3) ppm; ESI-MS m/z (%) 961,4 (MNa⁺); dla C50H66O17Na, obliczono: 961,4198; znaleziono: 961,4209.

P r z y k ł a d 4.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-21-pentanoilo-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (wzór 1; R = pentanoil;

związek 4)

Estryfikacja kwasem pentanowym

Estryfikacja 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano16e,17a,21-triolu kwasem pentanowym została przeprowadzona analogicznie jak w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: heksan - octan etylu (85 : 15)) otrzymano żądany ester z wydajnością 89%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1-3)-2'-0-acetylo-4-0trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-pentanoilo-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano16e,17a,21-triolu [¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, 25°C, TMS), δ = 7,99 (d, J = 8,9, 2H), 6,90 (d, J = 8,9, 2H), 4,96 (m, 2H), 4,74 (d, J = 5,3, 1H), 4,30 (d, J = 5,7, 1H), 4,00 - 4,22 (m, 6H), 3,87 (s, 3H), 3,66 3,82 (m, 4H), 3,31 (s, 3H), 3,24 (m, 3H), 2,75 (m, 1H), 2,46 (t, J = 7,4, 2H), 1,90 (s, 3H), 0,85 - 1,02 (m, 40H), 0,56 - 0,65 (m, 19H), 0.42 (m, 1H)], który bez dalszej identyfikacji poddano reakcji usunięcia grup zabezpieczających.

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Otrzymany w poprzednim etapie ester poddano reakcji z kwasem p-toluenosulfonowym, zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: chlorek metylenu - metanol (95 : 5), żądaną saponinę uzyskano z wydajnością 90%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1--3)-2'-0-acetylo--a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-pentanoilo-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (związek 4)

IR (CHCis) v = 3590, 3468. 1728, 1606, 1512, 1259, 1170 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, 25°C, TMS), δ = 8,00 (d, J = 8,6, 2H), 6,94 (d, J = 8,6, 2H), 5,34 (m, 1H), 5,05 (m, 1H), 4,94 (t, J = 7.0, 1H), 4,76 (d, J = 6,0, 1H), 4,37 (d, J = 5,4, 1H), 4,16 (dd, J1 = 3,9, J2 = 11,5, 1H), 3,94-4,04 (m, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,82 (m, 3H), 3,75 (m, 2H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 2H), 3,43 (m, 1H), 2,22 (t, J =

7,3, 2H), 1,83 (s, 3H), 1,01 (s, 3H), 0,908 (t, J = 7,2, 3H), 0,907 (d, J = 6,7, 3H), 0,84 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3, 25°C. TMS), δ = 173,1 (C), 169,4 (C), 166,1 (C), 164,1 (C), 140,6 (C), 132.1 (2CH), 121,5 (CH), 121,2 (C), 113,9 (2CH), 101,8 (CH), 101,4 (CH), 88,7 (CH), 86,9 (C), 79,7 (CH),

74.3 (CH), 73.6 (CH), 71,7 (CH), 70,4 (CH), 69,7 (CH), 68,4 (CH2), 66,6 (CH), 64,4 (CH2), 55,5 (CH3),

53.4 (CH, CH2), 49.7 (CH), 48,5 (CH), 46,6 (C), 42,3 (CH2), 37.2 (CH2), 36.4 (C), 34,9 (CH2), 34,1 (CH2), 33,7 (CH), 32,4 (CH2), 31,8 (CH), 31,7 (CH2), 31,6 (CH2), 26,9 (CH2), 22,2 (CH2), 20,6 (CH3),

19.4 (CH3), 13,7 (CH3), 12,9 (CH3), 12,2 (CH3) ppm; ESI-MS m/z (%) 911,5 (MNa⁺); dla C47H68O16Na, obliczono: 911,43996; znaleziono: 911,44275.

P r z y k ł a d 5.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1 —3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-21-O-heptanoilo-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (wzór 1; R = heptanoil; związek 5)

Estryfikacja kwasem heptanowym

Estryfikacja 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'--0acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e, 17a,21-triolu kwasem heptanowym została przeprowadzona analogicznie jak w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: heksan - octan etylu (85 :15), otrzymano żądany ester z wydajnością 80%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-heptanoilo-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopre-gnano16e,17a,21-triolu [¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, 25°C, TMS), δ = 7,99 (d, J = 8,8, 2H), 6,90 (d, J = 8,8,

PL 214 648 B1

2H), 5,02 (dd, J1 = 5,6, J2 = 7,5, 1H), 4,93 (dd, J1 = 5,8, J2 = 6,2, 1H), 4,75 (d, J = 5,1, 1H), 4,30 (d, J =

5.3, 1H), 4,12 (m, 2H), 3,99 (m, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,75 (t, J = 6,6, 1H), 3,66 (m, 3H). 3,35 (dd, J1 = 1,2, J2 = 10,1, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,25 (dd, J1 = 7,3, J2 = 11,5, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,36 (t, J = 7,5, 2H), 1,90 (s, 3H), 0,87 - 1,02 (m, 48H), 0,54 - 0,64 (m, 19H), 0,42 (dd, J1 = 5,2, J2 = 7,8, 1H) ppm], który bez dalszej identyfikacji poddano reakcji usunięcia grup zabezpieczających.

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Otrzymany w poprzednim etapie ester poddano reakcji z kwasem p-toluenosulfonowym, zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: chlorek metylenu - metanol (96 : 4), żądaną saponinę uzyskano z wydajnością 92%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1--3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-heptanoilo-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (związek 5)

IR (film) v = 3446, 1734, 1717, 1699, 1653, 1606, 1512, 1259, 1180 cm^-1; ¹HNMR (400 MHz, CDCl3/MeOD, 25°C, TMS), δ = 7,97 (d, J = 8,9, 2H), 6,91 (d, J = 8.9, 2H), 5,29 (m, 1H), 5,02 (dd, J1 =

6.4, J2 = 8,4, 1H), 4,91 (dd, J = 6,7, J₂ = 7.7, 1H), 4,65 (d, J = 6,5, 1H), 4,29 (d, J = 6.4. 1H), 4,01 4,08 (m, 2H), 3,91 - 3,97 (m, 2H), 3,86 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,60 - 3,71 (m, 5H), 3,42 (m, 2H), 3,34 (dd, J1 = 8,6, J2 = 11,7, 1H), 1,72 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 0,90 (d, J = 7,0, 3H), 0,86 (m, 3H), 0,80 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3/MeOD, 25°C, TMS), δ = 174 (C), 169,5 (C), 165,7 (C), 163,8 (C), 140,6 (C), 132,0 (2CH), 121,6 (C), 121,4 (CH), 113,7 (2CH), 102,3 (CH), 101,7 (CH), 88,5 (CH), 86,7 (C), 79,7 (CH), 74,0 (CH), 73,2 (CH), 71,5 (CH), 70,5 (CH), 69,4 (CH), 68,3 (CH2), 67,2 (CH), 64,5 (CH2), 64,3 (CH2), 55,4 (CH3), 49,7 (CH), 48,5 (CH), 46,5 (C), 42,0 (CH2), 37,2 (CH2), 36,4 (C), 35,0 (CH2), 34,3 (CH2), 33,7 (CH), 32,4 (CH2), 31,73 (CH2), 31,68 (CH), 31,4 (CH2), 28,7 (CH2), 26,0 (CH2), 24,8 (CH2), 22,4 (CH2), 20,5 (CH2), 20,4 (CH3), 19,3 (CH3), 13,9 (CH3), 12,8 (CH3), 12,0 (CH3) ppm; ESI-MS m/z (%) 939,5 (MNa⁺); dla C49H72O16Na, obliczono: 939,47126; znaleziono: 939,47337.

P r z y k ł a d 6.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-(21-0-(undec-10-enoilo)-pregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (wzór 1; R = undec10-enoil; związek 6)

Estryfikacja kwasem undec-10-enowym

Estryfikacja 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17^a,21-triolu kwasem undec-10-enowym przeprowadzono analogicznie jak w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej za żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: heksan - octan etylu (87,5 : 12,5)) otrzymano żądany ester z wydajnością 63%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo-4-0trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-21-0-(undec-10-enoilo)-3a,5acyklopregnano-16e,17a,21-triolu [¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, 25°C, TMS), δ = 7,99 (d, J = 8,7, 2H), 6,90 (d, J = 8,7, 2H), 5,82 (m, 1H), 4,93 - 5,02 (m, 4H), 4,75 (m, 1H), 4,31 (t, 1H), 4,12 (m, 2H), 4,01 (m, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,62 - 3,87 (m, 4H), 3,36 (m, 2H), 3,31 (s, 3H), 3,25 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,23 (m, 2H), 1,91 (s, 3H), 0,89 - 1,02 (m, 40H), 0,56 - 0,64 (m, 19H), 0,42 (m, 1H) ppm], który bez dalszej identyfikacji poddano reakcji usunięcia grup zabezpieczających.

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Otrzymany w poprzednim etapie ester poddano reakcji z kwasem p-toluenosulfonowym, zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: chlorek metylenu - metanol (95 : 5), żądaną saponinę uzyskano z wydajnością 95%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-20-metylo-21-0-(undec-10-enoilo)-pregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (związek 6)

IR (KBr) v = 3448, 1735, 1719, 1606, 1512, 1257, 1047 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3/MeOD, 25°C, TMS), δ = 7,95 (d, J = 8,9, 2H), 6,89 (d, J = 8,9, 2H), 5,77 (m, 1H), 5,27 (d, J = 4,6, 1H), 5,01 (dd, J1 = 6,7, J2 = 8,6, 1H), 4,95 (dd, J1 = 1,9. J2 = 17,1, 1H), 4,88 (m, 2H), 4,61 (d, J = 6,6, 1H), 4,25 (d, J = 6,6, 1H), 4,02 (m, 2H), 3,93 (m, 2H), 3,83 (s, 4H), 3,59 - 3,67 (m, 4H), 3,42 (m, 2H), 3,30 (m, 1H), 2,00 (m, 2H), 1,68 (s, 3H). 0,95 (s, 3H), 0,89 (d, J = 7,0, 3H), 0,77 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3/MeOD, 25°C, TMS), δ = 174,0 (C), 169,4 (C), 165,6 (C), 163,7 (C), 140,5 (C), 139,0 (CH), 131,9 (2CH), 121,6 (C), 121,3 (CH), 114,0 (CH2), 113,6 (2CH), 102,3 (CH), 101,7 (CH), 88,3 (CH), 86,6 (C), 79,6 (CH), 73,9 (CH), 73,1 (CH), 71,3 (CH), 70,4 (CH), 69,3 (CH), 68,3 (CH2), 67,3 (CH), 64,6 (CH2), 64,4 (CH2), 55,3 (CH3), 49.6

PL 214 648 B1 (CH), 48,4 (CH), 46,5 (C), 41,9 (CH2), 37,1 (CH2), 36,3 (C), 35,0 (CH2), 34,2 (CH2), 33,6 (CH2, CH), 32,3 (CH2), 31,64 (CH), 31,60 (CH2), 31,2 (CH2), 29,2 (CH2), 29,1, (CH2), 29,0 (CH2), 28,9 (CH2), 28,8 (CH2), 24,8 (CH2), 20,4 (CH2), 20,3 (CH3), 19,2 (CH3), 12,7 (CH3), 11,9 (CH3) ppm; ESI-MS m/z (%) 993,5 (MNa⁺); dla C53H78O16Na, obliczono: 993,5188; znaleziono: 993,5186.

P r z y k ł a d 7.

Synteza 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1 -3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-21-O-[(£)-but-2-enoilo]-20-metylopregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (wzór 1; R = (E)-but-2-enoil; związek 7)

Estryfikacja kwasem E-but-2-enowym

Reakcja estryfikacji 16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo(1 -3)-2'-0-acetylo-4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozydu} (20R)-20-metylo-6e-metoksy-3a,5a-cyklopregnano-16e,17a,21-triolu kwasem (E)-but-2-enowym przeprowadzono analogicznie jak w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: heksan - octan etylu (82 : 18)) otrzymano żądany ester z wydajnością 95%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-3,4-di-0-trietylosililo-e-D-ksylopiranozylo-(1--3)-2'-0-acetylo4-0-trietylosililo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-[(£)-but-2-enoilo]-20-metylo-6e-metoksy-3a,5acyklopregn-16e,17a,21-triolu [¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, 25°C, TMS), δ = 7,98 (d, J = 8,7, 2H), 7,08 (dd, J1 = 6,9. J2 = 15,5, 1H), 6,90 (d, J = 8,7, 2H), 5,77 (dk, J1 = 1,7, J2 = 15,5, 1H), 5,03 (m, 1H), 4,94 (t, 1H), 4,77 (m, 1H), 4,31 (t, 1H), 4,00 - 4,18 (m, 4H), 3,87 (s, 3H), 3,63 - 3,74 (m, 4H), 3,36 (m, 2H), 3,31 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 1,89 (s, 3H), 1,84 (d, J = 1,7, 3H), 0,87 - 1,02 (m, 34H), 0,52 0,66 (m, 19H), 0,42 (m, 1H) ppm], który bez dalszej identyfikacji poddano reakcji usunięcia grup zabezpieczających.

Odbezpieczenie grup funkcyjnych w glikozydzie

Otrzymany w poprzednim etapie ester poddano reakcji z kwasem p-toluenosulfonowym, zgodnie z procedurą podaną w przykładzie 2. Po oczyszczeniu za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina eluująca: chlorek metylenu - metanol (94 : 6)) żądaną saponinę uzyskano z wydajnością 94%.

16-0-{2-0-(4-metoksybenzoilo)-e-D-ksylopiranozylo-(1—3)-2'-0-acetylo-a-L-arabinopiranozyd} (20R)-21-0-[(E)-but-2-enoilo]-20-metylo-pregn-5-eno-3e,16e,17a,21-tetraolu (związek 7)

IR (KBr) v = 3445, 1748, 1715, 1606, 1513, 1259 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃/MeOD, 25°C, TMS), δ = 7,94 (d, J = 8,9, 2H), 6,88 (d, J = 8,9, 2H), 6,86 (dd, J1 = 6,9, J2 = 15,5, 1H), 5,70, (dk, J1 = 1,7, J2 = 15.5, 1H), 5,26 (m, 1H), 5,01 (dd, J1 = 6,8, J2 = 8,8, 1H), 4,87 (dd, J1 = 6,98, J2 = 8,1, 1H), 4,59 (d, J = 6,8, 1H), 4,25 (d, J = 6,8 1H), 4.07 (dd, J1 = 6,4, J2 = 11,0. 1H), 4.00 (dd. J1 = 4,6, J2 =11,7, 1H), 3,86 - 3,95 (m, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,57 - 3,67 (m, 4H), 3,41 (m, 2H), 3,33 (t, d, J = 1,6, 1H), 3,28 (dd, J1 = 8,8, J2 = 11,7, 1H), 1,81 (dd, J1 = 1,7, J2 = 6.9, 1H), 1,63 (s, 3H), 0,94 (s, 3H), 0,90 (d. J = 7,0, 3H), 0.77 (s. 3H) ppm; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3, 25°C. TMS), δ = 169,4 (C). 166,7 (C), 165,6 (C), 163,7 (C), 145,1 (CH), 140,5 (C), 131,9 (2CH), 122,2 (CH), 121,7 (C), 121,3 (CH), 113,6 (2CH). 102,4 (CH), 101,8 (CH), 88,1 (CH), 86,5 (C), 79,6 (CH), 74,0 (CH), 73,1 (CH), 71,3 (CH), 70,5 (CH), 69,3 (CH), 68,0 (CH2), 67,5 (CH), 64,8 (CH2), 64,5 (CH2), 55,3 (CH3), 49,6 (CH), 48,4 (CH), 46,5 (C), 41,8 (CH2), 37,1 (CH2), 36,3 (C), 35,1 (CH2), 33,8 (CH), 32,3 (CH2), 31,63 (CH), 31,59 (CH2), 31,1 (CH2), 20,4 (CH2), 20,3 (CH3), 19,1 (CH3), 17,8 (CH3), 12,7 (CH3), 11,8 (CH3) ppm; ESI-MS m/z (%)

895,4 (MNa⁺); dla C46H64O16Na. obliczono: 895,4092; znaleziono: 895,4117.

P r z y k ł a d 8.

Badanie aktywności biologicznej analogów saponiny OSW-1 (związki 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) w stosunku do wybranych komórek nowotworowych

Ogólna procedura testu in vitro na aktywność cytotoksyczną

Aktywność cytotoksyczną analogów OSW-1 (związki 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), według niniejszego wynalazku, zbadano in vitro na następujących liniach komórek nowotworowych: białaczki T- limfoblastycznej (CEM), raka sutka (MCF-7), szpiczaka mnogiego (RPMI 8226), raka płuc (A- 549), przewlekłej białaczki szpikowej (K562), raka szyjki macicy (HeLa), czerniaka złośliwego (G361), czerniaka (ARN 8), kostniakomięsaka (HOS) oraz prawidłowych ludzkich fibroblastów (BJ). Do hodowli linii komórek nowotworowych zastosowano medium hodowlane DMEM (Gibco BRL) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej, 4 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Hodowlę przeprowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze o maksymalnej wilgotności, zawierającej 5% CO2. Do zawiesiny komórek nowotworowych ₅ (ok. 1,25 x 10⁵ komórek/ml) umieszczonych w 96-studzienkowych mikropłytkach hodowlanych, po 3 godzinach stabilizacji, dodano 20 μl roztworu badanego związku w DMSO. Do kultury kontrolnej dodano tylko

PL 214 648 B1

DMSO. Końcowe stężenie DMSO w mieszaninie, w żadnym z przeprowadzonych testów, nie przekroczyło 0.6%. Roztwory testowanych związków przygotowano bezpośrednio przed wykonaniem doświadczenia. W tym celu analogi saponiny OSW-1 rozpuszczono w DMSO, z roztworu podstawowego sporządzono roztwory robocze metodą 4-krotnych rozcieńczeń, najwyższe badane stężenie wynosiło 50 μΜ. Po 72 godzinach hodowli, komórki inkubowano z roztworem Kalceiny AM (Molecular Probes) przez 1 godzinę. Fluorescencję zdolnych do życia komórek mierzono za pomocą przyrządu Fluoroscan Ascent (Microsystems). Procent komórek, które przeżyły w każdej studzience płytki (TCS) obliczano z równania:

TCS = (OD w studzienkach z badanym związkiem/ Średnia OD w studzienkach kontrolnych) x 100%. Wartość IC50 (stężenie badanego związku letalne dla 50% komórek guza) wyznaczano z wykresu zależności TCS od stężenia badanej substancji. Otrzymane wyniki dla związków 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 zestawiono w tabeli poniżej.

T a b e l a 3. Wartości IC50 (μΜ) analogów saponiny OSW-1 otrzymane w testach cytotoksyczności w porównaniu do daunorubicyny

związek	Linie komórek nowotworowych; IC50 (μΜ)
CEM	MCF7	RPMI8226	G361	HeLa	A549	BJ
1	0.02±0.001	0.6±0.1	0.009±0.002	0.75±0.8	0.2±0.01	0.1 ±-.05	3.1 ± 1.5
2	0.07±0.01	0.7±0.1	0.022±0.006	1.66±0.9	0.24±0.06	0.17±0.04	1.3±0.2
3	0.057±0.019	0.41 ±0.12	-	-	-	-	0.053±0.035
4	0.06±0.01	0.5±0.07	0.022±0.004	0.39±0.06	0.17±0.01	0.16±0.04	1.58±0.7
5	0.01 ±0.002	0.4±0.04	0.003±0.0005	1.28±0.2	0.03±0.002	0.02±0.005	1.1±0.3
6	0.0061 ±0.0012	0.029±0.012	-	-	-	-	0.02±0.01
7	0.34±0.04	0.84±0.51	-	-	-	-	0.32±0.20
daunorubicyna	0.62±0.01	0.14±0.012	-	0.67±0.002	670±31	-	-

(±OS, średnią wartość odchylenia standardowego wyznaczono z trzech niezależnych eksperymentów).

W opisie zostały użyte następujące skróty:

Ac - acetyl

DCC - dicykloheksylokarbodiimid

DMAP - 4-N,N-dimetyloaminopirydyna

DMSO - dimetylosulfotlenek

MBz -p-metoksybenzoil pGI50 - ujemny logarytm dziesiętny ze stężenia badanego związku, przy którym wzrost komórek guza został zahamowany o 50%. Wartość GI50 liczona ze wzoru GI50 = (T0 - Tx / NT0 - NTx) x 100% [gdzie, Tx - liczba komórek poddanych działaniu związku badanego po czasie x, T0 - w czasie początkowym, NTx - liczba komórek w serii kontrolnej (nie poddanych działaniu związku badanego) po czasie x, NT0 - w czasie początkowym]

OD - gęstość optyczna p-TsOH - kwas p-toluenosulfonowy

TES - trietylosilil

THF - tetrahydrofuran

TMS - trimetylosilil

Tf - trifluorometanosulfonyl

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Zastosowanie analogów saponiny OSW-1 o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza benzyl lub podstawiony benzyl, C1-18 alkanoil, C3-18 alkenoil, benzoil lub podstawiony benzoil, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych.

PL 214 648 B1

R = benzyl podstawiony benzyl C^ie alkanoil C₃_iq alkenoil benzoil podstawiony benzoil

Rysunki

Departament Wydawnictw UP RP

Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)