PL212696B1

PL212696B1 - Inhibitor rybonukleazy Dicer

Info

Publication number: PL212696B1
Application number: PL384455A
Authority: PL
Inventors: Marek Figlerowicz; Agata Tyczewska; Tomasz Twardowski; Aleksandra Szopa; Anna Kietrys
Original assignee: Inst Chemii Bioorg Pan
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2012-11-30
Also published as: PL384455A1; WO2009102225A2; WO2009102225A3; EP2255002A2; EP2255002B1; US20110207197A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są sposób inhibowania rybonukleazy Dicer, inhibitor rybonukleazy Dicer oraz zastosowanie aptamerow RNA do inhibowania rybonukleazy Dicer. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy zastosowania aptamerow RNA jako inhibitorów rybonukleazy Dicer działających na zasadzie kompetycji (aptamery jako inhibitory kompetycyjne), zastosowania aptamerow RNA jako allosterycznych inhibitorów rybonukleazy Dicer oraz zastosowania aptamerow RNA jako selektywnych inhibitorów powstawania wybranych miRNA.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem rozwiązania jest inhibitor rybonukleazy Dicer.

Aptamery to stosunkowo krótkie cząsteczki RNA lub DNA, które z wysokim powinowactwem i specyficznością wiążą się ze ściśle określoną molekułą. Określenie aptamer pochodzi od łacińskiego słowa „aptus” - „pasować” [1, 2]. Można powiedzieć, że aptamery są ligandami wiążącymi molekuły, takie jak białka, cukry, aminokwasy, nukleotydy, antybiotyki, czy witaminy. Do tej pory uzyskano bardzo wiele aptamerów wobec całego szeregu indywiduów, począwszy od małych nieorganicznych cząsteczek, a skończywszy na organizmach jednokomórkowych [3-6]. Specyficzność i siła rozpoznawania (stała dysocjacji rzędu nano- lub pikomoli) powoduje, że aptamery często porównuje się do przeciwciał. Masa molekularna aptameru to średnio 10-15 kDa, czyli około 10 razy mniej niż masa pojedynczego przeciwciała [7], co ułatwia ich rozprzestrzenianie w organizmie oraz szybkie usuwanie z krwiobiegu.

Aptamery zwykle uzyskiwane są na drodze selekcji in vitro, zwanej metodą SELEX (ang. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Pozwala ona wyłonić z wyjściowej puli wielu cząsteczek RNA lub DNA (cząsteczki o nieznanej, przypadkowej sekwencji, czyli sekwencji losowej) te, które posiadają pożądaną właściwość np.: silnie wiążą się z wybraną cząsteczką (cząsteczka docelowa - CD). Wyjściowa pula cząsteczek RNA lub DNA zwana jest biblioteką kombinatoryczną. Jest ona zbiorem wszystkich możliwych do zsyntetyzowania oligonukleotydów o określonej długości n. W praktyce poddawane selekcji oligonukleotydy obok centralnie usytuowanej sekwencji losowej (ang. random sequence) zawierają także tzw. odcinki flankujące o znanej sekwencji. Są one wykorzystywane do amplifikacji i klonowania zidentyfikowanych cząsteczek. Liczba oligonukleotydów tworzących pełną bibliotekę kombinatoryczną (pełną pulę wyjściową) zależy od długości sekwencji losowej. W każdej jej pozycji może występować jeden z czterech nukleotydów: A, G, C lub T/U, stąd w przypadku n-nukleotydowej sekwencji losowej zsyntetyzować można 4ⁿ różnych ologonukleotydów.

Typowa selekcja aptamerów RNA przebiega według następującego schematu. Na wstępie otrzymywana jest drogą syntezy chemicznej możliwie duża liczba jednoniciowych cząsteczek DNA zawierających n-nukleotydową sekwencję losową. Cząsteczki te są przepisywane na dwuniciowy DNA, który służy jako matryca do syntezy biblioteki kombinatorycznej jednoniciowych cząsteczek RNA metodą transkrypcji in vitro. Otrzymany RNA jest inkubowany z wybraną cząsteczką docelową (CD). Następnie, usuwa się wszystkie niezwiązane cząsteczki RNA. W kolejnym etapie izoluje się cząsteczki związane z CD. Uzyskane RNA przepisywane są na dwuniciowy DNA metodą RT-PCR, przy zastosowaniu starterów komplementarnych do sekwencji flankujących. Uzyskany produkt służy jako matryca do syntezy zawężonej puli RNA metodą transkrypcji in vitro. Otrzymane cząsteczki ponownie poddawane są selekcji. Po przeprowadzeniu zaplanowanej liczby cykli selekcyjnych dsDNA wklonowywany jest do wektora, namnażany w komórkach bakteryjnych, po czym pojedyncze klony poddawane są sekwencjonowaniu. W ten sposób zidentyfikowane zostają sekwencje cząsteczek RNA najsilniej wiążących się z CD.

Odczytanie informacji zapisanej w genomach organizmów żywych to jedno z najważniejszych zadań stawianych współczesnej biologii molekularnej i bioinformatyce. Wykazano, że pojedynczy gen może być źródłem więcej niż jednego transkryptu. Co więcej, z pojedynczego transkryptu może powstać wiele różnych mRNA. Nie stwierdzono, by istniała prosta korelacja pomiędzy wielkością genomu a złożonością organizmu. Jedynie u bakterii i prostych organizmów zwierzęcych lub roślinnych większość genomu koduje białka. U organizmów wyższych sekwencje kodujące białka stanowią jedynie niewielką część materiału genetycznego (u człowieka mniej niż 5%). W wyniku poznania pełnej sekwencji genomu ludzkiego stwierdzono, iż wbrew wcześniejszym oczekiwaniom nie zawiera on 150 tysięcy, a jedynie około 25 tysięcy genów, a więc mniej więcej tyle samo, co prosta roślina modelowa Arabidopsis thaliana. Jednak prawdziwy przełom w nauce w odniesieniu do mechanizmów rządzących procesem ekspresji informacji genetycznej dokonał się dopiero w ostatnich latach, głównie za sprawą nieoczekiwanego odkrycia zjawiska interferencji RNA (RNAi, ang. RNA interference) oraz krótkich regulatorowych RNA, w tym mikro RNA (miRNA) [8]. Okazało się, iż w genomach organizmów eukariotycznych, w tym i w genomie człowieka, obecne są sekwencje kodujące regulatorowe cząsteczki RNA, tzw. miRNA. Sekwencje takie mogą występować w obrębie genów kodujących białka (często w intronach), jak i tworzyć niezależne geny nie kodujące białek a jedynie RNA. Transkrypty kodujące miRNA zwane są pri-miRNA. W ich strukturze występują zazwyczaj około 50-80 nukleotydowe, nie w pełni komplementarne rejony dwuniciowe, które ze względu na swój kształt określane są mianem

PL 212 696 B1 struktur typu spinki do włosów (ang. hairpin). Stwierdzono, iż miRNA powstają zarówno w organizmach roślinnych, jak i zwierzęcych, jednak proces ich dojrzewania w obu typach komórek jest wyraźnie różny. W przypadku komórek ludzkich wyróżniamy trzy podstawowe etapy tworzenia miRNA [9]. W pierwszym enzym Drosha wycina z pri-miRNA dwuniciowy fragment przyjmujący strukturę typu spinki do włosów. W drugim etapie nowopowstała 50-80 nukleotydowa cząsteczka - pre-miRNA transportowana jest z jądra komórkowego do cytoplazmy przez eksportynę 5. W trzecim etapie pre-miRNA rozpoznawany jest przez rybonukleazę Dicer, która wycina z niego 20-23 nukleotydowy dupleks. Następnie, dupleks ten jest przenoszony do innego kompleksu białkowego - RISC (ang. RNA- induced silencing complex). W kolejnym etapie RISC zostaje zaktywowany. Proces ten polega na usunięciu jednej z nici dupleksu, podczas gdy druga zwana miRNA pozostaje w kompleksie i służy jako sonda umożliwiająca specyficzne rozpoznawanie w pełni lub częściowo komplementarnych cząsteczek RNA [10, 11]. Aktywny kompleks RISC może wiązać się z mRNA. Jeżeli mRNA jest w pełni komplementarny do znajdującego się w RISC miRNA, wówczas zostaje on przecięty (mniej więcej w środku dupleksu mRNA/siRNA) [12]. W konsekwencji w stosunkowo krótkim czasie cala pula mRNA zostaje zdegradowana, ma miejsce tzw. potranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS; ang. posttranscriptional gene silencing). Jeśli jednak mRNA jest tylko częściowo komplementarny do występującego w RISC miRNA wówczas nie ulega on degradacji, a pozostaje związany z kompleksem białkowym, przez co nie może służyć jako matryca do syntezy białka. Dochodzi zatem do wyciszenia genu na poziomie translacji (TR ang. translational repression).

Wykazano, że miRNA pełnią bardzo istotne role zarówno w procesach fizjologicznych (np. procesach: rozwojowych, różnicowania komórek, apoptozy, utrzymywania linii komórek macierzystych czy morfogenezie mózgu), jak i patologicznych (transformacja nowotworowa, procesy neurodegeneracyjne itp.) [13-15]. Wyniki ostatnich badań wskazują, iż około 30-40% ludzkich genów znajduje się pod kontrolą miRNA. Rybonukleaza Dicer należy do rodziny RNaz III, tj. do endorybonukleaz, które specyficznie tną dwuniciowe cząsteczki RNA. Wszystkie enzymy należące do tej rodziny charakteryzuje obecność jednej lub dwóch domen rybonukleazowych, zwyczajowo zwanych domeną RNazy III. Na skutek trawienia dsRNA przez RNazy III powstają specyficzne produkty posiadające grupę fosforanową na końcu 5' i dwa niesparowane nukleotydy na końcu 3'. RNazy III różnią się wielkością, mają od 200-2000 aminokwasów. Zebrane dotychczas dane sugerują, iż w genomie człowieka zakodowana jest tylko jedna nukleaza Dicer. W przypadku biogenezy miRNA, rybonukleaza Dicer odpowiedzialna jest za wycinanie z prekursorowych pre-miRNA krótkich około 20-23 nukleotydowych dupleksów zawierających miRNA. W oparciu o dane biochemiczne stwierdzono, że ludzka rybonukleaza Dicer i bakteryjna RNaza III zawierają tylko jedno centrum aktywne, w którym dochodzi do cięcia obu nici RNA [16, 17]. Wykazano jednak, że w przypadku ludzkiej Dicer, wchodzące w jej skład dwie domeny RNazy III działają niezależnie (każda tnie tylko jedną z nici) [17].

Istnieje wiele przykładów pokazujących, iż aptamery RNA mogą być z sukcesem zastosowane jako regulatory procesów zachodzących w organizmach żywych. Niektóre z nich zostały już wprowadzone jako leki, na przykład w terapii choroby zwanej AMD (zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem). Głównym czynnikiem powodującym przerost naczyń krwionośnych i wysięki w chorobie AMD jest jedna z izoform czynnika wzrostu komórek śródbłonka (VEGF, ang. vascular endothelial growthfactor) - VEGF165 [18]. Przeprowadzono selekcję aptamerów RNA wobec VEGF165 i uzyskano 3 cząsteczki, które specyficznie wiązały się z VEGF165 (Kd+49-130 pM) [19]. Jeden z tych aptamerów, nukleotydowy NX-1838, jest silnym inhibitorem angiogenezy i wykorzystano go do produkcji leku _® o nazwie Macugen^® [20-23]. Zapobiega on wiązaniu VEGF przez receptory VEGFR1 i VEGFR2. Na podstawie badań klinicznych stwierdzono poprawę widzenia u 80% pacjentów, w 3 miesiące po poda_® niu aptameru. W 2004 roku Macugen^® został zatwierdzony przez FDA jako lek u pacjentów ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanej z wiekiem [http://www.centerwatch.com/patient/drugs/areal3.html].

Przetestowano również wpływ NX-1838 na rozwój nowotworu Wilmsa w układzie mysim [24]. Stwierdzono 84% redukcję masy nowotworu w porównaniu z kontrolą. Zaobserwowano ponadto zmniejszenie ilości przerzutów do płuc (20%) w porównaniu z kontrolą (60%) [24] oraz 53% inhibicję wzrostu neuroblastomy [25]. Opisano także próby zastosowania aptamerów w leczeniu trombozy. Tromboza jest chorobą związaną z zaburzeniami procesu krzepnięcia krwi. Może ona prowadzić do poważnych uszkodzeń serca oraz innych narządów. Jednym z czynników indukujących proces krzepnięcia krwi jest trombina. Uzyskano więc aptamery DNA o wysokim powinowactwie wobec trombiny (Kd między 2 a 200 nM). Jeden z nich przedłuża czas krzepnięcia z 25 do 169 sekund. Stwierdzono

PL 212 696 B1 ponadto, że aptamer ten hamuje zarówno wolną trombinę, jak i tę tworzącą skrzep. Przestaje on być aktywny krótko po podaniu do organizmu, co zapobiega konieczności stosowania antidotum [26].

Uzyskano także aptamer RNA (nazwany 9.3t), który specyficznie wiąże czynnik IX (Kd poniżej 3 nM) będący proteazą serynową uczestniczącą w tworzeniu trombiny z protrombiny [27]. Wykazano, że 9.3t znacząco przedłuża czas krzepnięcia krwi in vitro oraz in vivo. Bazując na sekwencji 9.3t zaprojektowano oligonukleotyd antysensowy (5-2C) tak, aby wiązał się z 9.3t i blokował jego aktywność. Wykazano, że po dodaniu 5-2C, aktywność antykoagulacyjna aptameru jest szybko hamowana [27, 28]. Przetestowano, czy para aptamer 9.3t - antidotum 5-2C może być wykorzystywana podczas operacji serca (z krążeniem pozaustrojowym) jako zamiennik heparyny i protoaminy [29]. W tym celu podano świniom heparynę (300 IU/kg) oraz aptamer 9.3tC (0,5 mg/kg) i po przywróceniu krążenia ustrojowego (po 60 minutach), aby zahamować antykoagulacyjne działanie heparyny bądź aptameru, zaaplikowano odpowiednio protaminę (1 mg/l 00 IU heparyny) lub 5-2C (5 mg/kg). Wykazano, że aptamer skutecznie zastępuje heparynę, nie zauważono powstawania skrzepów; podawane antidotum 5-2C było dobrze tolerowane przez organizm, ponadto szybko i efektywnie odwracało efekt antykoagulacyjny wywołany przez aptamer [29].

Zidentyfikowano też aptamery wiążące tenascynę-C (TN-C). TN-C jest dużym białkiem występującym w macierzy zewnątrzkomórkowej. Kodujący ją gen ulega ekspresji podczas rozwoju płodowego, gojenia ran, regeneracji narządów oraz w stanach patologicznych [30, 31]. Wysoki poziom ekspresji genu TN-C zaobserwowano w nowotworach złośliwych. Przeprowadzono selekcję in vitro wobec całych komórek glejaka (glioblastomy) U251 z ekspresją TN-C oraz wobec oczyszczonego białka TN-C [32]. W efekcie uzyskano aptamer o długości 39 nt nazwany TTA1, o stałej dysocjacji 5 nM [32]. Stwierdzono, że TTA1 wiąże się do domeny fibrynogenopodobnej TN-C. Przetestowano również możliwości dostarczania radioizotopów oraz leków cytotoksycznych do komórek rakowych z wykorzystaniem TTA1. Przebadano w tym celu kilka różnych nowotworów - piersi, płuc, okrężnicy, glejaka (wyznakowany TTA1 podawano dożylnie). Stwierdzono, że szybkie pobieranie i usuwanie TTA1 z krwi oraz tkanek pozwala na wyraźne obrazowanie nowotworów [33].

W nowotworach prostaty obserwuje się podwyższoną akumulację antygenu błonowego gruczołu krokowego (PSMA). Wykazano, że jego stężenie wzrasta wraz z postępem choroby (raka gruczołu krokowego), przy czym najwyższy poziom PSMA występuje w przypadku nowotworów opornych na leczenie hormonalne i przerzutowych [34-38]. Powstawanie PSMA obserwowano także poza gruczołem krokowym, podczas tworzenia naczyń krwionośnych różnych guzów litych [35-38]. Przeprowadzono selekcję in vitro wobec pozakomórkowego komponentu PSMA-xPSM. Po sześciu rundach selekcji uzyskano dwa aptamery nie wykazujące wspólnych motywów sekwencyjnych, nazwane xPSM-A9 oraz xPSM-A10 o Kd = 11,9 nM [39]. Przeprowadzono również selekcję aptamerów wiążących priony (PrP). PrP jest to białko, które może występować w dwóch alternatywnych formach przestrzenC Sc nych: normalnej PrP (zawiera około 40% α-helis i niewiele β-harmonijek) oraz chorobotwórczej PrP

Sc (zbudowanej z ok. 30% α-helis i 45% β-harmonijek) [40]. PrP mają zdolność do agregacji i odkładania się w mózgu, co w efekcie prowadzi do zaburzeń funkcjonowania komórek i ich śmierci [41, 42].

W wyniku selekcji aptamerów uzyskano cząsteczki RNA rozpoznające specyficznie białka prionowe

Sc C

PrP^Sc oraz PrP^C w homogenatach mózgu myszy, chomików i bydła [43].

Już na początku lat 90-tych XX wieku wykorzystano metodę SELEX do uzyskania aptamerów wobec odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 [44]. Stwierdzono, że jeden z nich (nazwany 1.1) znacznie obniża aktywność polimerazową HIV-1 RT, nie wpływa natomiast na pozostałe aktywności RT ani na odwrotne transkryptazy innych retrowirusów [44]. Wyselekcjonowano także aptamery wobec białka nsP10 wirusa SARS (ang. Severe Acute Respiratory Syndrome). Uzyskane cząsteczki wydajnie inhibowały aktywność helikazową nsP10 [45].

W zgłoszeniu patentowym WO 2007 043 784 (opubl. 2007 04 19) opisano aptamery RNA i ich zastosowanie, dokładniej aptamery zaburzające interakcję TCF z innymi białkami poprzez specyficzne wiązanie do ss-kateniny oraz aptamery specyficznie wiążące się z domeną HMG białka TCF-1 i ich zastosowanie. Aptamery RNA przedstawione w tym rozwiązaniu mogą być wykorzystane przy tworzeniu czynników antynowotworowych, ze względu na ich specyficzne wiązanie do TCF-1, powodujące zaburzenie interakcji TCF z ss-kateniną biorącą udział w tworzeniu się guzów oraz przerzutów, a także wpływającą na aktywność transkrypcyjną TCF-1 w odniesieniu do onkogenezy.

W zgłoszeniu patentowym US 6 995 249 (opubl. 2006 02 07) przedstawiono kwas nukleinowy (aptamer) zdolny do specyficznego wiązania się z docelowym białkiem Ras, dokładniej z Raf-1; opisano także sposób screeningu RNA zdolnego do specyficznego wiązania się z docelowym białkiem Ras,

PL 212 696 B1 który obejmuje selekcję RNA zdolnego do wiązania do docelowego białka Ras z puli RNA obejmującej różne sekwencje podstawowe. W zgłoszeniu przedstawiono także sposób regulowania sygnału transdukcji powodującego proliferację lub różnicowanie komórek poprzez wykorzystanie opisanego kwasu nukleinowego, a także jego wykorzystanie w kompozycji farmaceutycznej.

W zgłoszeniu patentowym US 2005 202 423 (publ. 2005 09 15) opisano sposób identyfikacji związków (głównych struktur), które a) wiążą się specyficznie z pożądanym docelowym motywem RNA i mogą inhibować bądź eliminować jego funkcję lub b) wpływają na związek połączony z pożądanym docelowym motywem RNA i mogą tym samym inhibować bądź eliminować jego funkcję. Rozwiązanie opiera się na dołączeniu liganda (= związek, który zostanie zidentyfikowany) do docelowego motywu RNA, który jest sprzężony ze zmodyfikowanym rybozymem tak, że rybozym jest transformowany do aktywnej lub nieaktywnej konformacji, powodując odłączenie dającego sygnał substratu rybozymu. Zidentyfikowane związki pozwalają modyfikować funkcje komórkowych motywów docelowych RNA przez co umożliwiają wytwarzanie specyficznych leków.

Wynalazek dotyczy także polinukleotydu zawierającego rybozymu „hammerhead” i aptameru dla cząsteczki docelowej. Podstawowy model parowania polinukleotydu, gdy cząsteczka docelowa wiąże się do aptameru, jest różny od podstawowego modelu parowania polinukleotydu, gdy cząsteczka docelowa nie wiąże się do aptameru.

W zgłoszeniu patentowym US 2005 239 061 (publ. 2005 10 27) przedstawiono sposób identyfikacji i zastosowanie efektorów i cząsteczek allosterycznych do zmienienia ekspresji genu. Wynalazek obejmuje konstrukcję allosterycznej cząsteczki kontrolnej, w której katalityczny RNA tworzy część lub jest związany z domeną RNA wiążącą efektor lub aptamerem. Konstrukty te umożliwiają efektorowi kontrolować aktywność kataliczną RNA, czyli uzależniają aktywację bądź inaktywację katalitycznego RNA od obecności efektora.

Jak już wcześniej wspomniano, miRNA odgrywają niezwykle istotną rolę w regulacji ekspresji genów, szczególnie w takich procesach jak: różnicowanie i proliferacja komórek, dojrzewanie, apoptoza czy transformacja nowotworowa. Chociaż ogólne zasady funkcjonowania miRNA zostały już poznane nadal brakuje sposobów pozwalających aktywnie wpływać na ich powstawanie czy działanie. Opracowanie narzędzi molekularnych pozwalających np. kontrolować enzymy uczestniczące w biogenezie miRNA może więc mieć kluczowe znaczenie dla takich dziedzin jak medycyna (szczególnie leczenie chorób nowotworowych) czy biotechnologia.

Celem niniejszego wynalazku była selekcja aptamerów RNA specyficznie wiążących ludzką rybonukleazę Dicer, będącą jednym z głównych enzymów uczestniczących w biogenezie miRNA oraz innych krótkich regulatorowych RNA, a następnie określenie czy wyselekcjonowane cząsteczki wpływają na aktywność enzymu. Celem tego rozwiązania jest także:

(i) zastosowanie aptamerów RNA jako inhibitorów rybonukleazy Dicer działających na zasadzie kompetycji (aptamery jako inhibitory kompetycyjne);

(ii) zastosowanie aptamerów RNA będących allosterycznymi inhibitorami rybonukleazy Dicer;

(iii) identyfikacja aptamerów RNA będących selektywnymi inhibitorami powstawania wybranych miRNA.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie problemów związanych z tym, by aptamery RNA można było zastosować jako inhibitory rybonukleazy Dicer działających na zasadzie kompetycji (aptamery jako inhibitory kompetycyjne) oraz jako allosteryczne inhibitory rybonukleazy Dicer, a także jako selektywne inhibitory powstawania wybranych miRNA zostały osiągnięte w tym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest inhibitor rybonukleazy Dicer, charakteryzujący się tym, że inhibitor stanowi, uzyskany na drodze selekcji in vitro, aptamer RNA, wiążący rybonukleazę Dicer, przy czym aptamer zawiera dwie sekwencje flankujące i sekwencję losową centralnie usytuowaną, przy czym sekwencje flankujące stanowią odpowiednio SEQ. ID. 1 oraz SEQ. ID. 2, sekwencja centralna zaś zawiera 20 nukleotydów.

Korzystnie, gdy inhibitor działa na zasadzie kompetycji.

Korzystnie, gdy inhibitor jest inhibitorem allosterycznym.

Korzystnie, gdy inhibitor selektywnie lub nieselektywnie hamuje powstawanie wybranych miRNA.

Rysunki załączone na końcu niniejszego opracowania umożliwiają lepsze zrozumienie omawianych zagadnień i ilustrują istotę wynalazku.

Figura 1 przedstawia bibliotekę kombinatoryczną ssDNA i sekwencje starterowe wykorzystywane do selekcji in vitro. Startery ATD2 i ATD3 wykorzystywane były do otrzymywania dsDNA stanowiącego matrycę w reakcji transkrypcji in vitro. Starter ATD2 dodatkowo zawierał promotor polimerazy

PL 212 696 B1

RNA T7. Startery ATD2e i ATD3p stosowane były do uzyskania dsDNA, który był klonowany do plazmidu, stąd oba startery zawierały sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, odpowiednio EcoRI i PstI.

Figura 2 przedstawia wpływ ATD15.52 na aktywność Dicer:

A. Wpływ ATDl5.52 na cięcie hsa-miR33a.

B. Wpływ ATD 15.52 na cięcie hsa-miR210.

W reakcjach oznaczonych numerem 1 stosunku molowym aptamer : Dicer wynosił 1:1, w reakcjach oznaczonych numerem 2-10:1, a w reakcjach oznaczonych numerem 3-100:1. Dodatkowo zawsze przeprowadzano dwie reakcje kontrolne- K+ - standardowa reakcja bez dodatku aptameru oraz K- standardowa reakcja bez enzymu.

C. Wyznaczona wydajność cięcia obu substratów przez Dicer (średnia z trzech niezależnych eksperymentów).

Figura 3 przedstawia wpływ ATD13.6 na aktywność Dicer.

A. Wpływ ATDl3.6 na cięcie hsa-miR33a.

B. Wpływ ATD 13.6 na cięcie hsa-miR210.

W reakcjach oznaczonych numerem 1 stosunku molowym aptamer : Dicer wynosił 1:1, w reakcjach oznaczonych numerem 2-10:1, a w reakcjach oznaczonych numerem 3-100:1. Dodatkowo, zawsze przeprowadzano dwie reakcje kontrolne- K+ - standardowa reakcja bez dodatku aptameru oraz K- - standardowa reakcja bez enzymu.

Figura 4 przedstawia trawienie aptamerów ATD15.52 (A), ATD13.6 (B) przy użyciu rybonukleazy Dicer.

Jako 1, 2, 3, 4 i 5 oznaczono ścieżki, dla których mieszaniny reakcyjne inkubowano odpowiednio 10', 1 h, 2 h, 5 h i 16 h.

T1 - aptamer cięty przez rybonukleazę T1, F - aptamer poddany hydrolizie formamidowej.

KO - reakcja kontrolna bez enzymu, K16 - reakcja kontrolna bez enzymu po 16 h inkubacji.

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d

Jednym z kluczowych enzymów uczestniczących w biogenezie miRNA, jak i innych krótkich regulatorowych RNA jest rybonukleaza Dicer. Wycina ona funkcjonalne Bk cząsteczki miRNA z dwuniciowych prekursorów pre-miRNA. Postawiono zatem pytanie, czy aktywność enzymu odpowiedzialnego za generowanie krótkich regulatorowych RNA, w tym miRNA, może być kontrolowana poprzez inne cząsteczki RNA. Aby rozwiązać ten problem postanowiliśmy przeprowadzić selekcję aptamerów RNA specyficznie wiążących ludzką rybonukleazę Dicer, a następnie sprawdzić, czy wyselekcjonowane cząsteczki wpływają na aktywność enzymu.

Selekcja in vitro

Otrzymanie biblioteki kombinatorycznej jednoniciowych RNA

Na wstępie uzyskana została biblioteka kombinatoryczna jednoniciowych DNA (ssDNA) (przedstawiona na fig. 1). Otrzymano ją na drodze syntezy chemicznej. Następnie, tworzące bibliotekę ssDNA przepisano na dwuniciowy DNA (dsDNA) metodą PCR. W reakcji wykorzystano starter ATD2 _® i ATD3. Reakcję PCR przeprowadzano w aparacie firmy Biometra^®.

T a b e l a 1

Reakcja PCR w dużej skali - skład mieszaniny reakcyjnej

Składnik	Stężenie początkowe	Stężenie końcowe
1	2	3
Matryca	0,01 μβ/μί	25 pg/μί
Starter homologiczny do końca 5' powielanego fragmentu	25 pmoli/μί	2,0 ρΜ/μΙ
Starter homologiczny do końca 3' powielanego fragmentu	25 pmoli/μί	2,0 ρΜ/μΙ
Bufor reakcyjny¹	10 x	1 x
Mieszanina dNTP	Cp = 2,5 mM	Ck = 0,2 mM
MgCl2	Cd = 25 mM	Ck = 1,5 mM

PL 212 696 B1 cd tabeli 1

1	2	3
Polimeraza DNA Taq	5U/\|1	5U
H2O	dopełniano² do 400 \|l

¹ Skład buforu reakcyjnego 1 x: 75 mM Tris-HCl (pH 8,8 at 25°C), 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% (v/v) Tween 20 ² Aby zapewnić właściwe warunki PCR mieszaninę reakcyjną dzielono co najmniej na osiem części tak, by w pojedynczej probówce znajdowało się co najwyżej 50 μΐ mieszaniny

T a b e l a 2

Warunki reakcji PCR w dużej skali

Etap	Temperatura	Czas	Ilość powtórzeń
Denaturacja wstępna	93°C	30 sek	1
Denaturacja	93°C	30 sek
Hybrydyzacja	52°C	30 sek	30
Elongacja	72°C	1 min
Elongacja końcowa	72°C	5 min	1

Uzyskane dsDNA posłużyły jako matryca do syntezy biblioteki kombinatorycznej jednoniciowych

RNA (ssRNA) metodą transkrypcji in vitro. Transkrypcję przeprowadzano w objętości 50 μ|, mieszaninę reakcyjną, o składzie podanym w tabeli 3, inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Po tym czasie dodawano do mieszaniny reakcyjnej wolną od RNaz DNazę w celu usunięcia matrycowego DNA.

T a b e | a 3

Transkrypcja in vitro - skład mieszaniny reakcyjnej

Składnik	Stężenie początkowe	Stężenie końcowe
Bufor¹	5 x	1 x
Mieszanina NTP	25 mM	2 mM
Guanozyna	15 mM	4 mM
Matryca	5 pmoli/\|l	0,5 pM/μΙ
H2O	Dopełniano do 50 \|l

¹ Skład buforu reakcyjnego 1 x: 75 mM Tris-HC| (pH 8,8 at 25°C), 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% (v/v) Tween 20

RNA po transkrypcji oczyszczano w 12% denaturującym że|u po|iakry|oamidowym zgodnie z przedstawionym poniżej protokołem:

- produkty reakcji transkrypcji in vitro denaturowano poprzez ogrzanie do 95°C na 2-5 min. i gwałtowne schłodzenie na lodzie, następnie rozdzielano w denaturującym żelu poliakryloamidowym,

- fragmenty żelu zawierające produkty o pożądanej długości wycinano i umieszczano w osobnych probówkach,

- do każdej probówki dodawano 150 μl buforu elucyjnego (10% roztwór wodny 3M octanu sodu pH 5) i wytrząsano 1,5 h w temperaturze pokojowej (ten etap powtarzano dwukrotnie),

- zebrane frakcje łączono, RNA wytrącano 3 obj. 96% etanolu przez noc w temperaturze -20°C,

- wirowano 20 min. z prędkością 14000 rpm,

- roztwór dekantowano, a osad przemywano 500 μl 70% etanolu,

- ponownie wirowano 20 min. z prędkością 14000 rpm,

- roztwór dekantowano, a osad suszono i rozpuszczano w 20 μl H₂O,

- stężenie oczyszczonego RNA określano mierząc absorpcję promieniowania UV dla λ = 260.

W kolejnym etapie tworzące bibliotekę cząsteczki RNA znakowano radioizotopowo zgodnie z następującą procedurą:

- ssRNA denaturowano przez ogrzanie do 95 0C przez 2 min. i gwałtowne schłodzenie na lodzie (10 min). Reakcję prowadzono w objętości 30μ1 w mieszaninie o składzie podanym w tabeli 4.

PL 212 696 B1

T a b e l a 4

Skład mieszaniny do reakcji radioizotopowego znakowania ssRNA

Składnik	Stężenie początkowe	Stężenie końcowe
Bufor do kinazowania¹	10 x	1 x
ATP	[γ 32P] 4000-5000 Ci/mmol	50 μ^
ssRNA	100 pmoli/pl	0,3 pM^l
Kinazy polinukleotydowej T4	10 U/μΙ	0,5 U/μΙ
H2O	uzupełniano do objętości 30 μ!

¹Skład buforu do kinazowania 1 x: 70 mM Tris-HCl ph 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT

- mieszaninę inkubowano 45 min. w temperaturze 37°C,

- mieszaninę reakcyjną rozcieńczano do objętości 200 μΐ i dodawano 100 μΐ fenolu oraz 100 μΐ chloroformu,

- wytrząsano i wirowano 1 min. z prędkością 14000 rpm,

- zawierającą kwas nukleinowy fazę wodną przenoszono do nowej probówki i dodawano 200 μl chloroformu, wytrząsano i wirowano 1 min. z prędkością 14000 rpm (dwukrotnie),

- do otrzymanej po ekstrakcji fazy wodnej dodawano 10 μΐ 3 M CH3COONa i 3 obj. 96% etanolu,

- roztwór inkubowano przez noc w (-20°C),

- wirowano 20 min. z prędkością 14000 rpm,

- roztwór dekantowano, a osad przemywano 500 μΐ 70% etanolu,

- wirowano 20 min. z prędkością 14000 rpm,

- roztwór dekantowano, a osad suszono i rozpuszczano w 20 μΐ H2O,

- przy użyciu aparatu Beckman określano ilość materiału radioaktywnego wprowadzonego do wyjściowej puli RNA.

Selekcja RNA wiążących Dicer Wiązanie RNA z białkiem

Reakcję przeprowadzano w objętości 100 μl w mieszaninie o składzie podanym w tabeli 5; używano 10-krotny molowy nadmiar RNA w stosunku do białka.

T a b e l a 5

Skład mieszaniny do reakcji wiązania RNA z białkami

Składnik	Ilość
RNA	250 pM
Dicer	25 pM
Bufor 2 x	50 μ!
H2O	Uzupełniano do 100 μ!

- wyznakowany RNA denaturowano 2 min. w 95°C, następnie wolno schładzano w temperaturze pokojowej,

- przygotowywano mieszaninę reakcyjną o składzie podanym w tabeli 5,

- mieszaninę inkubowano 5 min. w 37°C, _®

- niezwiązane RNA odmywano na sitach molekularnych 30 kDa Amicon^® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices firmy Millipore (objętość 4 ml) przy prędkości 4000 rpm, w 4°C, przemywając 5 ml buforu wiążącego 1 x,

- pozostały na sitach kompleks RNA-Dicer przenoszono do probówki i denaturowano poprzez dodanie 200 μl 7 M mocznika i 400 μl fenolu, całość wytrząsano przy prędkości 1400 obr/min, 20 min. w temperaturze pokojowej,

- następnie wirowano 10 min. w temperaturze pokojowej przy prędkości 12000 rpm,

- do otrzymanej po ekstrakcji fazy wodnej dodawano 0,1 obj. 3M CH3COONa i 3 obj. 96% etanolu,

- roztwór inkubowano przez noc w (-20°C),

- wirowano 20 min. z prędkością 14000 rpm,

PL 212 696 B1

- roztwór dekantowano, a osad przemywano 500 μΙ 70% etanolu,

- wirowano 20 min. z prędkością 14000 rpm,

- roztwór dekantowano, a osad suszono i rozpuszczano w 20 μΙ H₂O,

- mierzono ilość materiału radioaktywnego włączonego do RNA, który został wyekstrahowany z kompleksu z białkiem, na tej podstawie określano ile procent wyjściowej puli RNA wiązała się z Dicer.

W celu przeprowadzenia kolejnego cyklu selekcji otrzymany ssRNA przepisywano na jedno-, a następnie dwuniciowy DNA metodą RT-PCR. W tym celu do RNA rozpuszczonego w 20 μΙ wody dodawano 6 μΙ wodnego roztworu startera AT3 (25 pmoli/μΙ), inkubowano 3 min. w 65°C i schładzano 10 min. w 4°C. Następnie, przygotowywano mieszaninę reakcyjną o składzie przedstawionym w tabeli 6. 35 μΙ mieszaniny przenoszono do roztworu RNA ze starterem AT3. Całość inkubowano 1,5 h w 42°C.

T a b e l a 6

Skład mieszaniny do reakcji odwrotnej transkrypcji

Składnik	Ilość
TrispH 8,0 (1M)	4 μΙ
KCl (1M)	4 μΙ
MgCl2 (200 mM)	4 μΙ
DTT (80 mM)	4 μΙ
dNTP (2,5 mM)	16 μΙ
M-MuLV-RT (200U/pl)	0,5 μΙ
H2O	7,5 μΙ

Uzyskany produkt reakcji odwrotnej transkrypcji ampNfikowano metodą PCR przy wykorzystaniu starterów ATD2 i ATD3. Reakcję PCR przeprowadzano w aparacie firmy Biometra^®. Produkty reakcji anaNzowano metodą elektroforezy w 12% że^ poliakryloamidowym w warunkach denaturujących. Stężenie uzyskanego DNA okreśtono za pomocą pomiaru absorpcji promieniowania UV dla λ = 260 nm. Otrzymany dsDNA stanowił matrycę do syntezy zawężonej puN RNA (metodą transkrypcji in vitro), która poddana została setokcji w kotojnym cyklu.

Po zakończeniu 15 cyklu selekcyjnego otrzymany produkt RT-PCR nie został przepisany na RNA tocz był wktonowany do ptozmidu, zgodnie ze standardowo stosowanymi metodami. Następnie, pojedyncze klony poddano sekwencjonowaniu. W rezultacie zidentyfikowano 50 sekwencji odpowiadających cząsteczkom RNA, które wiązały się z Dicer.

Po dokładnej anaNzie bioinformatycznej struktury pierwszo- i drugorzędowej wysetokcjonowanych RNA do datezych badań wybrano następujące 4 aptamery:

aptamer ATD15.14

5'GGGAGAAUCAUAAGUAGCCGGGCCUCCCCAUCCCUGCCCCAUGUUAACAGUUAGCC3' aptamer ATDl5.26

5'GGGAGAAUCAUAAGUAGCACAUUGAGUGUUGCCCUUCCCCAUGUUAACAGUUAGCC3' aptamer ATD15.52

5'GGGAGAAUCAUAAGUAGCGCAGUGAGUCGUUGUGCUGCCCAUGUUAACAGUUAGCC3' aptamer ATD13.6

5'GGGAGAAUCAUAAGUAGCGGUGUGUGAGUCGUGGUGCCCCAUGUUAACAGUUAGCC3'

Badanie aktywności wyselekcjonowanych aptamerów

Wpływ uzyskanych aptamerów na aktywność Dicer testowano in vitro. W tym celu przeprowadzano standardowe reakcje trawienia ludzkich pre-miRNA przez Dicer.

W pojedynczym eksperymencie, wykonanym co najmniej trzykrotnie d^ każdego aptameru, przeprowadzano 4 reakcje: jedną kontrotoą (bez dodatku aptameru) oraz trzy reakcje z dodatkiem różnych Mości aptameru (w reakcjach tych stosunek motowy Dicer:aptamer wynosił 1:1, 1:10 i 1:100).

Jako substraty wybrano dwa wcześniej scharakteryzowane pre-miRNA - hsa-miR-33a i hsa-miR-210 (http://microma.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences).

PL 212 696 B1 hsa-miR-33a

5'gugcauuguaguugcauugcauguucuggugguacccaugcaauguuuccacagugcauca3' hsa-miR-210

5'gccccugcccaccgcacacugcgcugccccagacccacugugcgugugacagcggcug3'

Reakcje prowadzono w objętości 10 μΐ w komercyjnym buforze dla rybonukleazy Dicer. Do reakcji wykorzystywano pre-miRNA wyznakowane na końcu 5' radioaktywnym fosforem (znakowanie przeprowadzano zgodnie z wcześniej opisaną procedurą). Na wstępie oddzielnie przeprowadzano renaturację aptamerów i wyznakowanych substratów (podgrzanie do 95°C, a następnie powolne schłodzenie do temperatury pokojowej).

W kolejnym etapie przeprowadzano 10 minutową wstępną inkubację różnej ilości aptamerów z Dicer (w stosunku molowym Dicer:aptamer 1:1, 1:10 i 1:100) w buforze reakcyjnym w temperaturze 37°C. Następnie, dodawano pre-miRNA. Reakcję trawienia prowadzono 10 minut w temperaturze 37°C. Dla każdego aptameru wykonywano po trzy powtórzenia każdej reakcji. W przypadku aptameru ATD15.52 dodatkowo przeprowadzano analogiczną serię reakcji z pominięciem wstępnej inkubacji.

T a b e l a 7

Badanie wpływu aptamerów na aktywność Dicer - skład mieszaniny reakcyjnej

	Kontrola (+)	Kontrola (-)	1	2	3
Aptamer			1 pi (1 pmol/ pi)	1 pi (10 pmol/pi)	1 pi (100 pmol/pi)
Dicer	IU		IU	IU	IU
Matryca	5000 cpm	5000 cpm	5000 cpm	5000 cpm	5000 cpm
Bufor 5 x	2 pi	2 pi	2 pi	2 pi	2 pi
H2O	do 10 pi	do 10 pi	do 10 pi	do 10 pi	do 10 pi

* skład buforu - 300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 20 mM HEPES, 5mM MgCl2, (pH 9)

Po zakończeniu reakcji uzyskane produkty denaturowano poprzez podgrzanie do 95°C przez 5 minut i gwałtownie schładzano na lodzie, a następnie analizowano metodą elektroforezy w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Rozdział i elektroforetyczny prowadzono w następujących warunkach:

- preelektroforeza - 1200 V, 50 W, 10 mA przez 10-15 min,

- elektroforeza właściwa - 1200 V, 50 W, 40 mA przez 4 h.

Po rozdziale elektroforetycznym skład mieszaniny analizowano wykorzystując skaner materiałów znakowanych radioizotopowo (Phosphorimager, Typhoon 8600).

Wyniki

Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że aptamery ATD15.14 i ATD15.26 jedynie w niewielkim stopniu hamowały aktywność Dicer (odpowiednio o około 30 i 40%, gdy zastosowano 100-krotny molowy nadmiar aptameru wobec Dicer).

Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów stwierdzono, że ATD15.52 wyraźnie hamuje cięcie hsa-miR-210 (gdy zastosowano 100-krotny nadmiar aptameru wobec Dicer tylko 16% substratu ulegało strawieniu) oraz jedynie w niewielkim stopniu cięcie hsa-miR33a (przy 100-krotnym nadmiarze aptameru 70% substratu ulegało strawieniu) (figura 2).

Zaobserwowano, że wraz ze wzrostem stężenia aptameru maleje wydajność cięcia hsa-miR-210. Wpływ inhibitorowy zaobserwowano już przy stosunku molowym aptamer:enzym 1:1, dochodziło do obniżenia ilości produktów cięcia o 19%. Przy dziesięciokrotnym molowym nadmiarze aptameru w stosunku do enzymu zaobserwowano około 50% inhibicję, a dla stukrotnego nadmiaru 84%. Dla substratu pre-miR-33a efekt inhibitorowy był znacznie niższy osiągając 30% inhibicji dla 100-krotnego nadmiaru ATD15.52.

Zbliżone wyniki uzyskano testując wpływ aptameru ATD13.6 na aktywność Dicer (figura 3). Aptamer ten słabo hamował trawienie hsa-miR33a (maksymalnie do 24%) oraz wyraźnie trawienie hsamiR210 (maksymalnie do 89%).

W kolejnych eksperymentach wykazano, że ATD15.52 jest cięty przez Dicer, podczas gdy ATD13.6 nie jest substratem dla tej rybonukleazy [por. fig. 4 i dane]. Uzyskane wyniki pozwalają sądzić, że zidentyfikowane aptamery hamują powstawanie miRNA według dwóch różnych mechaniPL 212 696 B1 zmów. Aptamer ATD15.52 działa na zasadzie kompetycji - efektywniej od hsa-miR210 wiąże się z Dicer, stąd to on jest trawiony, a nie pre-miRNA. Natomiast aptamer ATD13.6 działa jako inhibitor allosteryczny, tzn. nie jest substratem dla nukleazy Dicer ale wiąże się z nią i hamuje jej aktywność. Co ciekawe, oba aptamery hamowały powstawanie miR210, ale nie miR33a. Świadczy to, iż poprzez zastosowanie różnych aptamerów można selektywnie hamować powstawanie wybranych miRNA.

Literatura

1. Tuerk, C. and L. Gold. Systematic evolution of ligands by exponentiaI enrichment: RNA Iigands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 1990 249 (4968): p. 505-10.

2. Ellington, A. D. and J. W. Szostak, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature, 1990 346 (6287): p. 818-22.

3. Blank, M. and M. Blind, Aptamers as toolsfor target validation. Curr. Opin. Chem. Biol. 2005 9 (4): p. 336-42.

4. Nimjee, S. M., C. P. Ruscom and B. A. Sullenger, Aptamers: an emerging class of therapeutics. Annu. Rev. Med., 2005 56: p. 555-83.

5. Yan, A. C., et al., Aptamers: prospects in therapeutics and biomedicine. Front Biosci. 2005 10 p. 1802-27.

6. Pioske, D., et al., Aptamers - basie research, drug development and clinical applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005 69 (4): p. 367-74.

7. White, R. R., B.A. Sullenger and C. P. Rusconi, Developing aptamers into therapeutics.

J. Clin. Invest., 2000. 106 (8): p. 929-34.

8. Fire, A. et al, Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998 391 (6669): p. 806-11.

9. Bartel, D. P., MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, andfunction. Cell 2004 116 (2)· p 281-97.

10. Nykanen, A., B. Haley and P. D. Zamore, ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell, 2001 107 (3): p. 309-21.

11. Hammond, S. M., et al., An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature, 2000 404 (6775): p. 293-6.

12. Haley, B. and P .D. Zamore. Kinetic aiudysis of the RNAi enzyme complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 2004 11 (7): p. 599-606.

13. Mattick, J. S. and I. V. Makunin, Small regulatory RNAs in mammals. Hum. Mol. Genet.

2005 14 Spec No 1: p. R121-32.

14. Croce, C. M. and G. A. Calin, miRNAs, cancer and stem cell division. Cell, 2005 122 (1):

p. 6-7.

15. Giraldez, A. J., et al., MicroRNAs regulate brain morphogenesis in zebrafish. Science 2005 308 (5723): p. 833-8.

16. Zhang, K. and A. W. Nicholson, Regulation of ribonuclease IIl proeessing by double-helical sequence antideterminants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997 94 (25): p. 13437-41.

17. Macrae, I. J. et al., Structural basis for double-stranded RNA proeessing by Dicer, Science

2006 311 (5758): p. 195-8.

18. Ferrara, N., H. P. Gerber and J. LeCouter, The biology of VEGF and its receptors. Nat. Med. 2003 9 (6): p. 669-76.

19. Ruckman. J. et al., 2'-FIuoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF - induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-eneoded domain. J. Biol. Chem., 1998 273 (32): p. 20556-67.

20. Siddiqui, M. A. and G. M. Keating, Pegaptanib: in exudative age-related macular degeneration. Drugs, 2005 65 (11): p. 1571-7; discussion 1578-9.

21. Cunningham, E. T., Jr., et al., A phase II randomized double-masked trial of pegaptanib, an antivascular endothelial growth factor aptamer, for diabetic macular edema. Ophthalmology 2005 112 (10): p. 1747-57.

22. Ng, E. W. and A. P. Adamis. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular agerelated macular degeneration. Can. J. Ophthalmol., 2005 40 (3): p. 352-68.

23. Bell, C. et al., Oligonucleotide NX 1838 inhibits VEGFI65-mediated cellular responses in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 1999 35 (9): p. 533-42.

PL 212 696 B1

24. Huang, J., et al., Highly specific antiangiogenic therapy is effective in suppressing growth of experimental Wilms tumors. J. Pediatr. Surg., 2001 36 (2): p. 357-61.

25. Kim, E. S., et al., Potent VEGF blockade causes regression of coopted vessels in a model of neuroblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002 99 (17): p. 11399-404.

26. Bock, L. C., et al., Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, 1992 355 (6360): p. 564-6.

27. Rusconi, C. P., et al., RNA aptainers as reversible antagonists of coagulation factor IXa. Nature, 2002 419 (6902): p. 90-4.

28. Rusconi, C. P., et al., Antidote-mediated control of an anticoagulant aptamer in vivo. Nat. Biotechnol. 2004 22 (11): p. 1423-8.

29. Nimjee. S. M., et al., A novel antidote-controlled anticoagulant reduces thrombin generation and inflammation and improves cardiac function in cardiopulmonary bypass surgery. Mol. Ther. 2006 14 (3): p. 408-15.

30. Erickson. H. P. and M. A. Bourdon, Tenascin: an extraeellidar matrix protein prominent in speeialized embryonic tissues and tumors. Annu. Rev. Cell. Biol., 1989 5: p. 71-92.

31. Drętkiewicz K, W. E., Rolle K. Nowak S. Żukiel L., Barciszewski J., Rola tenascyny-C w patogenezie. Neuroskop. 2005 7: p. 19-26.

32. Hicke, B.J . et al., Tenasein-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein. J. Biol. Chem., 2001 276 (52): p. 48644-54.

33. Hicke, B. J. et al., Tumor targeting by an aptamer. J. Nucl. Med., 2006 47 (4): p. 668-78.

34. Bostwick, D. G. et al., Prostate specific membrane antigen expression in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma: a study of 184 cases. Cancer, 1998 82 (11): p. 2256-61.

35. Gregorakis, A. Κ., E. H. Holmes and G. P. Murphy, Prostate-specific membrane antigen: current and future utility. Semin. Urol. Oncol., 1998 16 (1): p. 2-12.

36. Chang, S. S. et al., Five different anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) antibodies confirm PSMA expression in tumor-associated neovasculature. Cancer Res., 1999 59 (13) p 3192-8.

37. Silvei. D. A. et al., Prostate-specifie membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clin. Cancer Res., 1997 3 (1): p. 81-5.

38. Nielsen G. K., S. K. Trumbull K., Spaulding B., Welcher R., Immunohistochemical characterization of prostate specific membrane antigen expression in the vasculature of normal and neoplastic tissues. Modern Path., 2004 17: p. 326A.

39. Lupold, S. E. et al., Identification and characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen. Cancer Res. 2002 62 (14): p. 4029-33.

40. Pan, K. M. et al., Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993 90 (23): p. 10962-6.

41. Prusiner, S. B. et al., Prion protein biology. Cell, 1998 93 (3): p. 337-48.

42. Prusiner, S. B., Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 (23): p. 13363-83.

43. Rhie, A. et al., Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to discase - associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem., 2003 278 (41) p. 39697-705.

44. Tuerk, C. S., MacDougal, and L. Gold, RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992 89 (15): p. 6988-92.

45. Jang. K. J., Lee, N. R., Yeo, W. S., Jeong. Y. J., Kim, D. E., Isolation of inhibitory RNA aptamers against severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus NTPase/Helicase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007 Dec 17.

Wykaz sekwencji

GGGAGAAUCAUAAGUAGC

Sekwencja flankująca 1 - SEQ ID NO: 1

CCAUGUUAACAGUUAGCC

Sekwencja flankująca 2 - SEQ ID NO: 2

PL 212 696 B1

Claims

1. Inhibitor rybonukleazy Dicer, znamienny tym, że inhibitor stanowi, uzyskany na drodze selekcji in vitro, aptamer RNA, wiążący rybonukleazę Dicer, przy czym aptamer zawiera dwie sekwencje flankujące i sekwencję losową centralnie usytuowaną, przy czym sekwencje flankujące stanowią odpowiednio SEQ. ID. 1 oraz SEQ. ID. 2, zaś sekwencja centralna losowa zawiera 20 nukleotydów.

2. Inhibitor według zastrz. 1, znamienny tym, że działa na zasadzie kompetycji.

3. Inhibitor według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitor jest inhibitorem allosterycznym.

4. Inhibitor według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitor selektywnie lub nieselektywnie hamuje powstawanie wybranych miRNA.