KR100740974B1

KR100740974B1 - Ｒｎａ 앱타머 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100740974B1
Application number: KR1020050094404A
Authority: KR
Inventors: 정선주; 이희규; 박민우; 최강현; 이승연
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2007-07-20
Also published as: WO2007043784A1; KR20070039269A; US7999089B1

Abstract

본 발명은 ＲＮＡ 앱타머와 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 베타-카테닌에 특이적으로 결합하여 TCF와의 상호작용을 억제하는 RNA 앱타머, TCF-1의 HMG 도메인에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 RNA 앱타머는 암 발생 및 전이 경로에 관여하는 베타-카테닌과 TCF의 상호작용 및 TCF-1이 암 관련 유전자에 결합하여 전사를 활성화시키는 것을 효과적으로 저해하므로 항암제 개발에 이용될 수 있다.

RNA 앱타머, 베타-카테닌, RNA 앱타머, TCF-1

Description

ＲＮＡ 앱타머 및 그의 용도{RNA aptamers and the uses thereof}

도 1은 RNA 앱타머가 베타-카테닌 단백질에 결합시 친화도와 특이성을 나타낸 것으로,

도 1a는 실시예에서 사용된 다양한 베타-카테닌 단백질을 나타낸 것으로 아르마딜로(Arm) 반복서열 12개와 TCF-1 결합부위를 나타낸 그림이고,

도 1b는 0, 6, 8 주기의 선별주기 후 GST pull-down assay를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 1c는 선별된 RNA 앱타머의 서열을 나타낸 그림이고,

도 1d는 선별된 RNA 앱타머가 베타-카테닌 단백질에 결합하는지 RNA-EMSA로 확인한 결과를 나타낸 그림이고,

도 2는 U6-RNA 인트라머의 발현과 안정성을 나타낸 것으로,

도 2a는 U6 앱타머로 형질전환된 세포의 노던 블럿 분석 결과를 나타낸 그림이고,

도 2b는 U6-RNA 인트라머의 안정성을 나타낸 그림이고,

도 2c는 U6-NC (뉴클레오캡시드), U6-앱타머(U6-Apt) 또는 U6 (벡터)로 형질전환된 세포주에서 RNA 동시-면역침강 어세이를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3은 U6-RNA 인트라머에 의해 표적 유전자가 조절됨을 나타낸 것으로,

도 3a는 RNA 앱타머 발현벡터로 형질도입된 293T 세포에서 LiCl 처리시 내생의 베타-카테닌이 안정화됨을 나타낸 그림이고,

도 3b는 TCF-1 결합(OT) 루시퍼라제 리포터와 U6 벡터 또는 U6-RNA 앱타머 벡터로 형질전환된 293T 세포의 루시퍼라제 어세이 결과를 나타낸 그림이고,

도 3c는 HCT116 세포를 TCF-responsive (OT) 또는 mutant (OF) 루시퍼라제 리포터 유전자와 U6 벡터(-), 뉴클레오캡시드에 대한 RNA 앱타머(U6-NC) 또는 U6-앱타머로 공-형질도입한 후, 루시퍼라제 어세이를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3d는 HCT116 세포를 -1745 cyclin D1 프로모터 루시퍼라제 리포터(WT, 야생형; MT, 돌연변이 TCF 부위) 와 U6 벡터, U6-NC 또는 U6-앱타머로 공-형질전환시킨 후, 루시퍼라제 어세이를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 3e는 목(mock), U6 벡터, U6-앱타머를 발현하는 HCT116 세포에서 다양한 RNA(c-myc, cyclin D1, GAPDH mRNA)에 대해 RT-PCR을 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 4는 pDHFR-앱타머 발현 세포를 동시-면역침강한 결과를 나타낸 그림이고,

도 4a는 TCF와 베타-카테닌를 정온배치한 후, RNA 앱타머의 부재(-) 또는 존재(+)하에 항-TCF 항체로 면역침강한 후, 항-TCF 및 항-베타-카테닌 항체로 웨스턴 블럿을 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 4b는 U6-벡터 또는 U6-앱타머를 과발현하는 HCT116 세포를 항-베타-카테닌 항체로 동시면역침강한 결과를 나타낸 그림이고,

도 5는 RNA 인트라머가 안정적으로 발현되는 세포주(stable cell line)의 면역형광 분석 결과를 나타낸 그림이다.

도 5a는 HCT116 세포주에서 U6-NC, U6-앱타머(클론 #6), 및 U6 벡터로 형질전환된 세포주에서 RNA 인트라머가 안정적으로 발현되는지 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이고,

도 5b는 U6-RNA 인트라머로 형질전환된 HCT116 세포주에서 웨스턴 블럿을 실시한 결과를 나타내는 그림이고,

도 5c는 RNA 인트라머가 안정적으로 발현되는 세포주의 유세포 분석 결과를 나타낸 그래프이고,

도 5d는 RNA 인트라머가 안정적으로 발현되는 세포주의 연성 아가 콜로니 형성 어세이 실시 결과를 나타낸 그림이고,

도 6은 TCF-1 단백질의 DNA 결합부위에 대한 RNA 앱타머 #10의 결합을 나타낸 그림으로,

도 6a는 본 발명에 사용된 재조합 GST TCF-1 단백질의 모식도이고,

도 6b는 방사성 동위원소로 표지된 RNA 앱타머 #10으로 GST pull down assay를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

G: GST 단백질, F: 전체-길이 TCF-1 단백질, C: TCF-1 C200

N: TCF-1 N100, β: β-카테닌, NF: NFAT 단백질

도 7은 RNA 앱타머 #10이 TCF-1 단백질에 특이적으로 결합함을 나타내는 그림으로,

도 7a는 방사성 동위원소 표지된 RNA 앱타머 #10, TCF-1 C200 단백질과 경쟁자로 과량의 표지되지 않은 RNA #10, #9 및 #20으로 RNA-EMSA를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

도 7b는 방사성 동위원소 표지된 RNA 앱타머 #10, 세포내 핵 추출물의 TCF-1단백질과 경쟁자로 과량의 표지되지 않은 RNA 앱타머 #10, #9 및 Ori로 RNA-EMSA를 실시한 결과를 나타낸 그림이고,

레인 1: 핵 추출물(TCF-1) 없음

레인 2: GST-TCF-1 벡터 형질도입된 세포

레인 3: TCF-1 cDNA 형질도입된 세포

도 8은 RNA 앱타머 #10에 의한 TCF-1과 DNA의 결합 억제를 나타낸 그림으로,

도 8a는 RNA 앱타머 #10이 TRE(TCF-1 response element)가 TCF-1 C200에 결합하는 것을 억제하는 것을 나타낸 그림이고,

레인 1: 표지된 TRE 단독, 레인 2: TCF-1 C200 단백질 존재

레인 3-6: 2, 20, 200 및 1000nM의 표지되지 않은 RNA 앱타머 #10

레인 7-9: 20, 200 및 1000nM의 표지되지 않은 tRNA

도 8b는 RNA 앱타머 #10이 TRE가 TCF-1 전체-길이 단백질에 결합하는 것을 억제하는 것을 나타낸 그림이고,

도 9는 본 발명의 베타 카테닌 결합 앱타머와 TCF-1 결합 앱타머의 결합부위를 나타낸 그림이다.

본 발명은 ＲＮＡ 앱타머와 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 베타-카테닌에 특이적으로 결합하여 TCF와의 상호작용을 억제하는 RNA 앱타머, TCF-1의 HMG 도메인에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것이다.

베타-카테닌은 복합 기능을 가진 단백질로 신호전달 뿐 아니라 세포 부착에 있어서도 중요한 역할을 한다(Moon RT et al., Nat Rev Genet. 5(9):691-701, 2004; Nelson WJ and Nusse R. Science. 303(5663):1483-7, 2004). 베타 카테닌은 처음에 막 통과 카드헤린 단백질과 세포골격을 연결하는 세포 부착 복합체의 성분으로 동정되었다. 또한 수정란 발생과 암 발생에서 세포 성장과 분화를 조절하는 중요한 Wnt 경로의 중요 성분이다(Gregorieff A and Clevers H. Genes Dev. 19(8):877-890, 2005). Wnt가 없을 때, 내피세포(endothelial cell)의 대부분의 베타-카테닌은 막 단백질에 결합하여 adherens junction의 E-cadherin과 결합한다. 세포질의 베타-카테닌은 adenomatous polyposis coli(APC) 단백질, axin/conducin 및 글리코겐 합성 키나제-3베타(GSK-3베타)로 이루어진 다중 단백질 복합체에 존재한다. 그러나 APC 또는 베타-카테닌의 돌연변이는 종종 다양한 형태의 암세포에서 발견된다(Polakis P. Genes Dev. 14(15):1837-1851, 2000). 베타-카테닌의 ser/thr-인산화 부위 중 어느 하나의 돌연변이는 베타-카테닌을 안정화시켜 표적 유전자의 전사를 일으키는데 표적 유전자에는 cyclin D1과 c-myc 등이 있다(Morin PJ et al., Science. 275(5307):1787-1790, 1997; Rubinfeld Bet al., Science. 275(5307):1790-1792, 1997; Tetsu O and McCormick F. Nature. 398(6726):422-426, 1999; He et al., Science. 281(5382):1509-1512, 1998). TCF 단백질은 이러한 표적 유전자의 인핸서에 HMG-1(High Mobility Group-1) DNA 결합부위를 통하여 결합하고 베타-카테닌 결합부위도 가지고 있다(Behrens J et al., Nature. 382(6592):638-642, 1996; Morin PJ et al., Science, 275(5307):1787-1790, 1997).

Wint 신호전달이 종양 발생에 있어 중요하기 때문에 베타-카테닌 매개의 신호전달은 치료 목적, 특히 암 치료를 위해 중요하다고 여겨져 왔다(Lustig B and Behrens J. J Cancer Res Clin Oncol. 129(4):199-221, 2003; Lee et al., Biochem Biophys Res Commun. 327(1):294-299, 2005). 이 과정을 조절하는 분자들은 항암 치료에 유용한데(Tolwinski & Wieschaus, PLoS Biol. 2(4):486-493, 2004; Lipinski et al., Mol Ther. 10(1):150-61, 2004). 몇 가지 화학물질은 암세포에서 베타-카테닌/TCF 결합을 방해한다고 보고되었다(Nath et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(22):12584-9, 2003; Lepourcelet et al., Cancer Cell. 5(1):91-102, 2004). 그러나 베타-카테닌이 몇가지 다른 단백질 복합체의 성분이기 때문에 베타-카테닌과 TCF와의 결합을 E-cadherin과의 상호작용없이 선택적으로 방해할 수 있는 보다 특이적인 도구가 필요하다.

한편, T 세포인자-1(T-cell factor-1, TCF-1)은 원래 고이동성 그룹-1(high mobility group-1, HMG-1) DNA 결합 도메인을 통해서 DNA에 결합하는 T 세포 특이적인 전사인자이다(M van de Wetering et al., EMBO J. 10: 123-32, 1991; M. Oosterwegel et al., J. Exp. Med. 173: 1133-1142, 1991; H. C. Clevers et al., Immunol. Today 14: 592-597, 1993) 형질전환 및 녹아웃 실험으로 TCF-1이 T-림프구의 증식에 관여할 것이라 여겨지고 있으나 T 세포 발달에서 맡고 있는 정확한 기능은 확실히 밝혀지지 않았다(M. Oosterwegel et al., Development 118: 439-448; S. Verbeek et al., Nature 374: 70-74, 1990; R.M. Okamura et al., Immunity 8: 11-20, 1998).

TCF 패밀리 단백질은 서열 특이적으로 DNA에 결합하여 다른 전사 인자가 모여 DNA에 결합하는 것을 유도하는 구성 단백질(architectural protein)의 역할을 한다(J. J. Love et al., Nature 376: 791-795, 1995). 베타-카테닌이 TCF 패밀리 단백질의 잠재적인 전사 보조-활성인자로 동정되었고(H. Clevers and M. van de wertering, Trends Genet. 13: 485-489, 1997; J. Behrens et al., Nature 382: 638-642, 1996), TCF-1이 다양한 암세포에서 높게 발현되므로 TCF가 암유발 단백질인 베타-카테닌과 결합하여 복합체를 형성함으로써 암을 진행시키는데 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다(V. Korniek et al., Science 275: 1784-1787, 1997; P. J. Morin et al., Science 275: 1787-1790, 1997; B. Rubinfeld et al., Science 275: 1790-1792, 1997).

TCF/베타-카테닌 단백질 복합체는 또한 개구리(Xenopus) 수정란에서 축(axis) 형성 및 초파리의 Wingless 신호전달과 같이 초기 발달에 있어 중요한 조절 자이다(M. Molenaar et al., Cell 86: 391-399, 1996; M. van de Wetering et al., Cell 88: 789-799, 1997; E. Brunner et al., Nature 385: 829-833, 1997). 이에 덧붙여, Wnt 신호전달을 매개하는 TCF/베타-카테닌 복합체는 미성숙한 흉선세포(thymocyte)가 발달하는데 중요한 경로라는 것이 밝혀졌다(V. Ionnidis et al., Nat. Immunol. 2: 691-697, 2001). 이러한 발견은 TCF 패밀리 단백질이 증식과 세포사멸을 결정하는 유전자의 중요한 조절자 역할을 한다는 것을 시사한다(J. Roose and H. Clevers, Biochem. Biophys. Acta 87456: M23-M37: 1999; J. Roose et al., Nature 395: 608-612, 1998). 예를 들어, TCF/베타-카테닌은 cyclin D1과 c-myc과 같은 암 발달에 관여하는 유전자의 전사가 일어나도록 한다(O. Tetsu and F. McCormick, Nature 395: 608-612, 1998; T. C. He et al., Science 281: 1509-1512, 1998).

앱타머는 짧은 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있다. 이러한 앱타머는 대부분의 경우에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다.

반복된 생체 외 선별과정은 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA 분자, 즉 앱타머의 선별이 가능하도록 하는데(A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346: 818-822, 1990; C. Tuerk and L. Gold, Science 249: 505-510, 1990) RNA 라이브러리의 사이즈가 크고(10¹⁴-10¹⁵) 생체 외 효소 작용에 의해 RNA 분자를 생성하기 쉽기 때문에 RNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리 보다 우수하다(E. N. Brody and L. Gold, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5-13, 2000).

치료제로서 RNA 앱타머의 잠재적인 용도에 대한 흥미가 증가하고 있는데(Nimjee et al., Trends Cardiovasc Med. 15(1):41-45, 2005), 고친화도 RNA 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정에 의해 선별될 수 있다(Ellington et al., Nature. 346(6287):818-822, 1990; Brody & Gold, J Biotechnol. 74(1):5-13, 2000). RNA 앱타머는 작은 화학물질보다 억제제로서 잇점이 있는데 이는 일반적으로 표적 단백질에 넓은 결합부위를 제공하기 때문이다. 병리학적인 단백질-단백질 상호작용은 RNA 앱타머의 훌륭한 표적이 될 수 있는데 이는 고친화도 RNA가 표적 단백질에 결합하여 복합체에서 다른 단백질과의 결합을 방해하기 때문이다. 더욱이 RNA 앱타머는 세포에서 RNA 발현 벡터 시스템을 이용하여 인트라머로 발현될 수 있다(Famulok & Mayer, Chembiochem. 6(1):19-26, 2005).

앱타머에 대한 내용이 기술되어 있는 특허로는 하기와 같은 것이 있는데, 대한민국 특허 10-2003-0054412는 응고 촉진을 위하여 RNA 앱타머(aptamer)를 포함하는 약제에 관해 기술하고 있고 대한민국 특허 10-2002-7009983는 용액 중의 동족 리간드의 존재를 신호화하는데 사용되는 리포터 분자를 함유하는 앱타머(aptamer)에 관해 기재되어 있다. 또한, 국제특허 WO 2003/027319는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 상동성 결합으로 결합된 2개 이상의 핵염기-함유 서열을 포함하는 앱타머에 관한 것이다. 그러나 상기 특허 중 어느 것도 베타-카테닌의 TCF 결합부위와 상호작용하는 앱타머 또는 TCF-1 의 DNA 결합부위와 상호작용하는 앱타머에 대해서는 기술하고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 베타-카테닌에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하고 이를 세포주에 특이적으로 위치하는 RNA 인트라머로 안정적으로 발현시켜 RNA 인트라머가 베타-카테닌의 전사 활성을 억제하고 표적 유전자의 발현을 감소시키며 생체 외에서 선별된 TCF-1에 결합하는 RNA 앱타머(RNA 앱타머 #10)가 실제로 TCF-1 단백질에 결합하여 암 관련 유전자와의 결합을 방해하여 전사를 억제함으로써 항암제 개발에 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 베타-카테닌에 결합하는 RNA 앱타머, TCF-1의 HMG 도메인에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 베타 카테닌에 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 함유하는 유전자 발현 조절제를 제공한다.

또한, 본 발명은 베타-카테닌과 다른 단백질 간의 상호작용 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 항암제를 제공한다.

또한, 본 발명은 TCF-1의 HMG 도메인에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 함유하는, TCF-1과 타 유전자 간 상호작용 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 함유하는 유전자 발현 조절제를 제공한다

또한, 본 발명은 RNA 앱타머를 함유하는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 베타 카테닌에 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.

베타-카테닌에 결합하는 RNA 앱타머를 제작하기 위하여, 본 발명자들은 베타-카테닌 단백질의 아르미딜로 반복부위(armadillo repeat(Arm 1-12)를 시험관 선별을 위한 표적으로 이용하였는데 이는 TCF-4 단백질과 상호작용하는 모티프를 포함하고 있는 부위이다(도 1a 참조). 임의의 50 개짜리 RNA 서열(1x10¹⁵개의 분자)을 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)과정의 시작물질로 사용하여(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004) 방법으로 재조합된 아르마딜로 반복서열에 결합한 RNA만을 선별하였다. 선별된 RNA에 대해 in vitro에서 베타-카테닌에 결합하는지 확인한 결과, RNA-EMSA에서 전체길이 베타-카테닌에 결합하는 반면(도 1d 참조) 베타-카테닌 이외의 다른 단백질에는 결합하지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 RNA 앱타머가 베타 카테닌에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

베타-카테닌은 세포질에서는 세포 부착에 관여하고 핵 내에서는 표적 유전자의 발현을 조절한다. 본 발명자들은 세포질의 세포 부착 복합체가 아닌 핵의 전사 복합체에서 표적 세포의 베타 카테닌에 선택적으로 결합하도록 핵 발현 RNA 벡터를 사용하여 세포내에서 RNA 인트라머를 발현시켰다. 핵 특이적 RNA 발현 벡터시스템은 삽입 서열을 핵에서 발현시키는 모든 벡터가 가능하며 바람직하게는 RNA polymerase Ⅲ의 조절을 받는 U6 프로모터를 이용한 pTZU6+1과 pTZU6+27 벡터 및 Human tRNA^met 프로모터를 이용한 벡터이고 보다 바람직하게는 pTZU6+27 벡터이다.

본 발명자들은 높은 수준으로 베타-카테닌을 발현하는 대장암 세포에서 루시퍼라제 어세이를 실시하여, RNA 인트라머 용량 의존적으로 베타-카테닌 의존적인 TCF 전사 활성을 억제함을 확인하였다(도 3c 참조). 한편, 베타-카테닌이 TCF 단백질의 패밀리와 결합하고 cyclin D1과 c-myc 프로모터의 전사를 활성화시킨다고 알려져 있어(Tetsu & McCormick, 1999; He et al., 1998) RNA 인트라머가 베타-카테닌의 표적 유전자인 cyclin D1의 전사를 억제할 수 있는지 알아본 결과, cyclin D1 mRNA의 발현을 감소시키고 유사한 결과가 c-myc 발현에 대해서도 수득됨을 확인하였다(도 3d 참조).

이로써, in vitro에서 베타-카테닌에 결합하는 것으로 선별된 RNA 앱타머를 세포주에서 핵내에 특이적으로 위치하는 RNA 인트라머로 안정적으로 발현시켜, RNA 인트라머는 베타-카테닌의 전사 활성을 억제하고 표적 유전자의 발현을 감소시켰으나 세포 부착에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

본 발명의 RNA 앱타머는 베타-카테닌과 TCF 단백질 간의 결합과 핵내 단백질 복합체의 형성도 억제하므로(도 4a 및 4b) 병리학적 단백질-단백질 상호작용의 특이적인 억제제를 제작하는데 이용될 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 항암제를 제공한다. 본 발명자들은 RNA 인트라머를 발현하는 세포주에서는 cyclin D1 발현이 낮았기 때문에 이러한 세포주가 세포주기의 G1/S 전이단계에 머물러 있는 것으로 가정한 후, 이를 확인하기 위하여 유세포 분석 실험을 실시한 결과, 실제로 세포주는 G1에 머물러 있는 비율이 높았다(도 5c 참조).

본 발명자들은 상기와 같은 세포주가 종양 형성 능력을 감소시켰는지 테스트하기 위하여 연성 아가 콜로니 형성(soft agar colony formation)을 어세이하였다. 그 결과, RNA 인트라머 안정 세포주에서는 콜로니가 생성되지 않은 반면 대조 세포주에서는 많은 수의 콜로니가 생성되었다. 이러한 결과는 베타-카테닌 RNA 인트라머가 세포분열 주기를 멈추게 하는데 효과가 있고 궁극적으로는 종양 발생을 감소시킨다는 것을 의미한다(도 5d 참조).

본 발명자들은 이전에 생체 외(in vitro)에서 TCF-1 단백질의 HMG 도메인에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하였으며 본 발명에서는 상기 RNA 앱타머가 세포 내에서 실제로 TCF-1 단백질과 결합하는지 확인하였다. 그 결과, RNA 앱타머 #10은 DNA 결합부위를 포함하는 HMG 도메인(C200, C)에는 결합했지만 N-말단의 베타 카테닌 결합 도메인(N100, N)에는 결합하지 않았고 베타-카테닌이나 NFAT(NF)와 같은 다른 단백질의 DNA 결합 도메인에도 결합하지 않았다(도 6 참조).

본 발명자들은 RNA 앱타머 #10의 TCF-1 단백질에 대한 결합 특이성을 시험하기 위해 RNA 앱타머 #10과 비특이적인 RNA 간의 경쟁실험을 수행하였다. 그 결과, RNA #10의 양이 증가함에 따라 TCF-1과 결합한 RNA 앱타머 #10의 세기가 점차 약해지나 TCF-1에 결합하지 않는 RNA #9나 원래 RNA 풀(Ori)에 의해서는 결합이 약해지지 않았으므로(도 7 참조) RNA 앱타머 #10은 TCF-1에 특이적으로 결합함을 확인하 였다.

본 발명자들은 TCF-1 결합서열을 포함하는 DNA 올리고뉴클레오타이드(TRE, TCF responsive element), TCF-1, RNA 앱타머 #10 및 tRNA를 반응시켰다. 그 결과, TRE와 TCF-1 단백질 간의 결합은 RNA 앱타머 #10의 농도를 증가시킴에 따라 점차 억제되었지만, 비-특이적인 tRNA와에 의해서는 억제되지 않았다(도 8a 참조).

이로써, RNA 앱타머 #10은 TCF-1과 이에 특이적인 DNA 결합을 억제함을 확인하였다.

TCF 단백질은 DNA 결합 전사인자로 다른 전사 활성인자에 강하게 결합하여 각종 표적 유전자를 활성화시킨다. 본 발명의 RNA 앱타머는 TCF-1의 HMG 도메인에 강력하게 결합하여 다른 전사인자와의 상호작용을 저해하므로 TCF-1이 결합하는 유전자, 즉, cyclin D1, c-myc과 같은 표적 유전자의 발현을 조절하는데 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 RNA 앱타머를 함유하는 항암제를 제공한다.

cyclin D1과 c-myc 등의 표적 유전자는 암 발생에 관여하는 것으로 알려져 있으므로, 전사인자 TCF-1에 특이적으로 결합하여 다른 전사 활성인자와의 결합을 저해할 수 있는 RNA 앱타머는 표적 유전자의 발현 활성화로 일어나는 암과 같은 질환의 치료제로 유용하다. 베타 카테닌이 TCF-1과 결합하지 못할 경우 여러 종류의 암을 발생시키지만 특히 대장암과 직장암의 발생 빈도가 높아 본 발명의 항암제는 대장암과 직장암 치료에 이용될 수 있을 것이다(Lustig B and Behrens J. J, Cancer Res Clin Oncol. 129(4): 199-221, 2003; Gregorieff A & Clavers H. Genes Dev. 19(8): 87-90, 2005).

본 발명의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 항암제는 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제는 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내, 국소 또는 시각 경로에 적용)가 바람직하며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 치료제는 RNA 앱타머를 10 내지 95 중량 %, 바람직하게는 25 내지 75 중량 %로 포함할 수 있으며 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다. RNA 앱타머의 유효량은 세포내 농도가 약 1nM 내지 1000nM, 바람직하게는 100nM 내지 500nM이 되도록 하는 양을 포함한다. 보다 적거나 많은 양의 앱타머를 투여하는 것도 고려할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되지는 않는다.

베타-카테닌에 결합하는 앱타머

<실시예 1> 플라스미드와 시약

pCAN-베타-카테닌은 Dr. McCrea(University of Texas M.d. Anderson Cancer Center)로부터, pTZU6+27은 Dr. David Engelke(University of Michigan) 그리고 루시퍼라제 리포터 플라스미드, pGL3-OT(TOPFLASH의 개선된 버전)와 pGL3-OF(돌연변이)는 Dr.Shivdasani과 Volestein(Johns Hopkins University)으로부터 수득하였다. 야생형과 세 가지 TCF 부위 돌연변이 -1745 cyclin D1 프로모터 리포터는 Dr. Pestell(Albert Eistein College of Medicine)으로부터 수득하였다. 대조군 벡터, Renilla 루시퍼라제 pRL-TK는 형질전환 횟수를 표준화하기 위해 이중 루시퍼라제 키트(Promega)를 이용하였고 pCMV-β는 Clonetech에서 구입하였다. 항-케타-카테닌 폴리클론(C-18), 항-TCF-4 폴리클론(H-125) 및 항-cyclin D1 모노클론(HD11) 항체는 Santa Cruz 로부터 구입하였고 항-감마-카테닌과 E-cadherin 모노클론 항체는 Transduction Laboratories로부터 구입하였다.

<실시예 2> In vitro RNA 결합 어세이

<2-1> GST-베타-카테닌 단백질의 클로닝과 발현

재조합 베타-카테닌 단백질의 세균 발현 벡터는 pCAN-베타-카테닌 플라스미드의 베타-카테닌 부위(Arm 1-12, 아미노산 129-695)는 BamHⅠ(서열번호 3) 및 EcoRⅠ(서열번호 4) 제한효소부위를 포함하는 프라이머로 증폭하였다. PCR 증폭 조건은 DNA (10 μM), 10 × Mg²⁺ free buffer, 2.5 mMMgCl_2,250 nM 5′ Primer, 250 nM 3′ Primer, 100 μM, Taq polymerase lu (Promega)을 첨가하고 총 부피가 100 ㎕ 되도록 제작한 뒤 95℃에서 5분 동안 변성시키고, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분의 조건으로 30 cycle을 반복하여 72℃에서 10분간 연장(extension)시켜 반응을 종결하였다. PCR 증폭산물은 상기 제한효소부위를 사용하여 pBluescriptⅡ-SK 벡터로 클로닝하였다. 상기 삽입부위를 BamHⅠ과 XhoⅠ으로 절단하여 GST-5X-1 벡터(Amersham Biosciences)로 융합하여 GST-베타-카테닌 발현벡터를 제작하였다. 재조합 GST-융합 단백질은 대장균에서 발현시킨 후, 기존에 알려진 방법으로 정제 하였다(Lee et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 327: 294-299, 2005).

<2-2> In vitro RNA 선별과 RNA 결합 어세이

<2-2-1> 앱타머 선별과 동정

베타-카테닌에 결합하는 RNA 앱타머를 제작하기 위하여, 본 발명자들은 베타-카테닌 단백질의 아르미딜로 반복부위(armadillo repeat(Arm 1-12))를 시험관 선별을 위한 표적으로 이용했는데 이는 TCF-4 단백질과 상호작용하는 모티프를 포함하고 있는 부위이다(도 1a).

SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 방법을 이용한 RNA 앱타머 선별을 실시하였다. 구체적으로 임의의 50 개짜리 RNA 서열(1x10¹⁵개의 분자)을 시작물질로 사용하여 이를 베타-카테닌에 노출시키고 일정시간 정온배치한 후, GST-결합된 RNA는 제외시키고 GST-아르마딜로 반복서열에 결합한 RNA만을 글루타치온-세파로즈 4B 비드로 선별하였다. 선별한 RNA를 증폭시키고 증폭된 앱타머들로만 구성된 라이브러리를 다음 단계의 시작물질로 하여 다시 선별반응을 8회 반복하여 결합한 RNA 앱타머를 분리하였다. 선별된 RNA는 6 번의 선별 과정을 거친 후에 단백질에 결합하였고(selection 6, SE6, 도 1b) 유사한 수준의 결합은 8 주기의 선별 후에 관찰되었다(SE8). 각각의 RNA 분자를 SE8 RNA 풀(pool)로부터 분리하여 40개의 독립적인 클론을 시퀀싱하였다. 시퀀싱 결과, 모든 클론이 동일한 서열을 가지고 있었다(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004; Lee SK et al., Biochem Biophys Res Commun. 327:294-299, 2005)(도 1c).

<2-2-2> In vitro RNA 결합 어세이

SELEX 선별과정 8주기 후에 선별된 서열은 EcoRⅠ과 BamHⅠ으로 처리한 후, pUC19로 클로닝하여 pUC19-aptamer를 제작하였다. RNA 결합을 테스트하기 위해, RNA는 방사성 동위원소로 기존의 방법(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004)대로 표지하였고 GST-베타 카테닌과 정온배치한 후, GST pull-down(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004) 또는 RNA-EMSA 방법(RNA-Electrophoretic Mobility-Shift Assay)(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004)으로 어세이하였다. 그 결과, 상기 RNA 앱타머는 RNA-EMSA에서 전체길이 베타-카테닌에 결합함을 확인하였고 결합 친화도(Kd)는 약 5nM(도 1d)였다. 그러나 RNA 앱타머는 베타-카테닌 이외의 다른 단백질, 예를 들어 RNA 결합 단백질 HuR, 베타-카테닌과 결합하는 TCF1 또는 전혀 관련이 없는 GST 단백질 모두에 결합하지 않았다. 따라서 본 발명의 RNA 앱타머가 베타 카테닌에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

<실시예 3> RNA 앱타머의 세포내 발현과 세포질 베타-카테닌과의 특이적 결합

RNA 앱타머가 시험관내에서 베타-카테닌에 대한 높은 친화도와 특이성을 나타내었기 때문에, 본 발명자들은 포유류 세포에서도 RNA 앱타머와 베타-카테닌이 특이적으로 결합하는지 시험하였다.

<3-1> RNA 인트라머의 제작과 발현

본 발명자들은 작은 RNA 인트라머 전사체가 핵에서만 발현되도록 U6 프로모터를 포함하는 pTZU6+27 벡터에 RNA 앱타머 서열을 삽입한 발현벡터 pU6-aptamer를 제작하였다(Paul CP et al., Nature Biotechnol 20: 505-50, 2002).

구체적으로, 앱타머 서열을 pTZU6+27로 클로닝하기 위해서, 프라이머 U6-F1(서열번호 5)와 U6-R1(서열번호 6)를 사용하여 pUC19-aptamer로부터 앱타머 부분을 증폭하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 5분 동안 변성시키고, DNA (10 μM), 10 × Mg²⁺ free buffer, 2.5 mMMgCl_2,250 nM 5′ Primer, 250 nM 3′ Primer, 100 μM, Taq polymerase lu (Takara사)을 첨가하고 총 부피가 100 ㎕ 되도록 제작한 뒤 95℃에서 5분 동안 변성시키고, 95℃ 1 분, 55℃ 1분, 72℃ 1분의 조건으로 30 cycle을 반복하여 72℃에서 10분간 연장(extension)시켜 반응을 종결하였다. PCR 산물은 SalⅠ과 XbaⅠ으로 절단하여 pTZU6+27의 동일한 제한효소부위로 클로닝함으로써 pU6-aptamer를 제작하였다. 플라스미드 U6-NC(뉴클레오캡시드)(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004)는 모든 실험에서 음성대조군으로 사용되었다. pDHFR-앱타머는 이전에 기술된 내용(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004)대로 만들어졌다.

RNA 인트라머의 높은 수준의 발현은 U6-앱타머로 형질전환된 293 세포의 노 던 블럿과(도 2a) 실-시간 RT-PCR 분석으로 확인하였다. 본 발명자들은 또한 형질전환 5일 후에 RNA 인트라머가 안정적으로 지속 발현됨을 확인하였다.

<3-2> 세포 배양, 형질전환 및 루시퍼라제 어세이

Humane Embryonic Kidney 293T 세포, 인간 대장암(colorectal carcinoma) HCT116 세포 및 선암(adenocarcinoma) SW480 세포(상기 모든 세포는 American Type Culture Collection로 부터 수득)를 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 상기 실시예 <3-1>에서 제작한 pU6-aptamer를 lipofectAMINE(invitrogen)을 사용하여 HCT116 세포 및 SW480 세포에 형질전환시켰다. 루시퍼라제 어세이를 위해서 상기 세포는 루시퍼라제 리포터, pU6-aptamer 및 pCMV-β-catenin으로 공-형질전환시켰다. 루시퍼라제 활성은 Turner Luminometer TD-20/20를 이용하여 Luciferase assay system(Promega)로 검출하였다.

<3-3> RNA 인트라머와 베타-카테닌의 결합 확인

본 발명자 들은 RNA 앱타머가 세포내에서도 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여 하기의 실험을 실시하였다.

<3-3-1> RNA 동시-면역침강 어세이

HCT116 세포를 RNA 발현벡터, pU6-aptamer 또는 대조군 벡터인 pU6-NC로 형질전환시켰다. 핵 추출물은 단백질-G-세파로즈 비드로 미리 정제한 후 정상 래빗 IgG, 항-감마-카테닌 항체 또는 항-베타-카테닌 항체로 4℃에서 밤새 면역침강시켰다. 펠렛과 상등액은 페놀로 추출되어 결합된 RNA는 순수분리되어 역전사된 후 상기와 같이 서열번호 5와 6으로 기재되는 앱타머의 프라이머 및 서열번호 22와 23으로 기재되는 GAPDH 프라이머 서열로 PCR 증폭되었다.

<3-3-2> 바이오틴 RNA Pull-down 어세이

RNA 앱타머는 시험관 내에서 4-thio UTP(USB)의 존재하에 전사되었고 Biotin(Pierce)로 말단표지되었다. RNA pull-down 어세이를 위해서 4.4㎍의 표지된 앱타머를 20㎍의 SW480 핵 추출물과 상온에서 30분 동안 정온배치한 후 UV로 15분 동안 조사하였다. 복합체들은 streptavidin-conjugated Dynabead(New England BioLabs)로 분리하였고 비드와 상등액의 단백질은 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

그 결과, 바이오틴-RNA 침강된 레인에서 베타-카테닌을 검출하였으나 대조 레인에서는 검출하지 못했다. 베타-카테닌 항체로 면역침강하였을 때도 U6-RNA 인트라머만이 공-면역침강(co-immunoprecipitation)되었고 대조군인 NC 단백질(HIV의 뉴클레오캡시드) 또는 벡터 RNA와는 면역침강되지 않았다(도 2c).

또한, 세포내 단백질 결합의 특이성을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 베타-카테닌과 86% 서열 상동성을 갖고 세포막에서 베타-카테닌과 세포 부착 복합체를 형성하는 감마-카테닌에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과, RNA 인트라머는 세포내에서 감마-카테닌과 결합하지 않았는데 이로써 RNA 인트라머가 베타-카테닌과 특이적인 결합을 함을 확인하였다.

<실시예 4> 베타-카테닌의 전사 기능 억제

<4-1> 베타-카테닌 발현 유도 확인

RNA 인트라머가 베타-카테닌 의존적인 TCF 전사 활성을 억제하는지 알아보기 위한 준비단계로 먼저, 염화리튬(LiCl)을 293T 세포에 처리하고 항-베타-카테닌 항체로 면역블로팅하여 내생의 베타-카테닌 단백질이 염화리튬 처리에 의해 활성화됨을 확인하였다(도 3a).

또한, 야생형 TCF 결합부위 또는 야생형(OT)과 돌연변이(OF) TCF 결합 부위를 갖는 루시퍼라제 리포터를 U6 벡터 또는 RNA 앱타머(U6-Aptamer)와 함께 293T 세포에 공-형질도입하였다. 염화리튬 또는 염화칼륨 처리 후 루시퍼라제 활성을 측정한 결과, 야생형(OT) TCF 결합부위를 갖는 루시퍼라제 리포터에서만 RNA 인트라머 용량에 따른(dose-dependent) 루시퍼라제 활성 억제가 나타났다(도 3b). 매우 높은 수준으로 베타-카테닌을 발현하는 HCT116 대장암 세포에 동일한 실험을 실시한 결과, 역시 야생형(OT)에서만 RNA 인트라머 용량에 따른 루시퍼라제 활성 억제가 나타났다(도 3c).

한편, 뉴클레오캡시드 단백질(U6-NC)은 루시퍼라제 수준에 영향을 미치지 못했기 때문에 RNA 인트라머의 억제 효과가 서열 특이적임을 확인하였다.

<4-2> 베타 카테닌의 전사기능 억제 확인

<4-2-1> RT-PCR과 노던 블럿 분석 방법

전체 세포내 RNA는 세포로부터 TRisol(Invitrogen)로 분리되어 M-MuLV Reverse Transcriptase(Roche)로 역전사된 후 PCR 반응에 주형으로 이용되었다. PCR을 실시한 결과, 서열번호 7 및 8으로 기재되는 프라이머로 cyclin D1의 483bp PCR 산물, 서열번호 9 및 10로 기재되는 프라이머를 이용하여 베타-카테닌의 334bp PCR 산물 및 서열번호 11 및 13으로 기재되는 프라이머로 c-myc의 308 bp PCR 산물을 생성하였다.

노던 블럿 분석에서 전체 세포내 RNA는 상기 방법으로 추출하였고 RNA 시료는(5㎍/레인) 폴리아크릴아마이드 젤에서 분리하고 나일론 막에 블롯팅하였다. 블롯은 UV에 의해 크로스 링크되었고 DIG-표지된 RNA 프로브(Roche)와 혼성화되었다. DIG Luminescent Detection kit(Roche)가 검출을 위해 사용되었다.

<4-2-2> 베타 카테닌의 전사기능 억제 확인

염화리튬에 의해 베타-카테닌이 발현 유도되고 루시퍼라제 어세이에 의해 RNA 인트라머가 정상적으로 작용함을 확인하였으므로, 본 발명자들은 실시예 <4-2-1>의 방법을 이용하여, 본 발명의 RNA 인트라머가 DNA 결합 TCF 단백질의 패밀리와 결합하고 cyclin D1과 c-myc 프로모터의 전사를 활성화시킨다고 알려져 있는 베타-카테닌(Tetsu & McCormick, 1999; He et al., 1998)의 작용을 억제할 수 있는지 확인하였다.

또한, RNA 인트라머가 내생의 표적 유전자의 발현을 억제하는지 알아보기 위해서, 염화리튬 처리한 293T 세포, HCT116 및 SW480 대장암 세포주를 U6-RNA 인트 라머로 형질전환시키고 c-myc과 cyclin D1 mRNA의 발현을 측정하였다(도 3d 및 도 3e).

그 결과, RNA 인트라머의 발현은 세포주 모두에서 cyclin D1과 c-myc mRNA의 발현을 감소시킴을 확인하였다.

<실시예 5> 베타-카테닌/TCF 복합체의 특이적인 저해

U6-RNA 인트라머가 특이적으로 핵의 베타-카테닌과 결합하기 때문에, 본 발명자들은 베타-카테닌과 TCF 간의 상호작용도 저해할 수 있을 것이라 가정하였다. 본 발명자들은 먼저 시험관 내에서 재조합 베타-카테닌과 TCF간의 상호작용에 대해 시험해 보았다. 구체적으로 재조합된 베타-카테닌과 TCF 단백질들을 앱타머의 존재(실험군) 또는 부재(대조군)하에서 반응시킨 뒤, 항-베타-카테닌 항체를 이용한 면역침강 및 웨스턴 블럿으로 베타-카테닌과 TCF 단백질간의 단백질-단백질 상호결합을 측정하였다.

그 결과, 베타-카테닌과 TCF 단백질 간의 결합은 U6-RNA 인트라머에 의해 억제되었는데 이는 고친화도 RNA 앱타머가 TCF와 베타-카테닌과의 결합을 위해 경쟁한다는 것을 의미한다(도 4a).

다음으로 본 발명자들은 핵내 단백질 복합체의 형성이 RNA 앱타머에 의해 억제되는지 확인하여 보았다(도 4b). 동시-면역침강 어세이 결과, 베타-카테닌/TCF-4 상호작용은 RNA 인트라머에 의해 저해되지만 베타-카테닌과 E-cadherin 간의 결합은 억제되지 않음을 확인하였다.

대조군으로 베타-카테닌 결합 RNA 인트라머를 잘못된 스플라이싱이 일어난 DHFR 전사체와 융합 전사체를 이루도록 제작하고(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004) 단백질-단백질 결합을 시험하였다(도 4). 그 결과, DHFR-인트라머는 TCF-4와의 베타 카테닌 단백질 상호작용 뿐만 아니라 E-cadherin과의 상호작용도 억제하였다. 이는 포유류 세포 내에서 인트라머가 전체적으로 발현되었기 때문인데(Kim & Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun 320:1181-1186, 2004), 이는 U6-RNA 인트라머가 특이적으로 핵내 전사 복합체만 저해하고 세포질의 세포 부착 복합체는 저해하지 않음을 의미한다. 이는 U6-RNA 인트라머가 핵에서만 발현되기 때문에 발생하는 현상이다.

<실시예 6> RNA 앱타머에 의한 종양 생성 억제

<6-1> 안정적인 앱타머 형질전환체의 선별

본 발명자들은 상기 실시예에서, RNA 인트라머가 형질도입에 의해 일시적으로 발현되는 세포에서 베타-카테닌의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것을 확인하였기 때문에, RNA가 안정적으로 발현되는 세포주에서 RNA 인트라머가 나타내는 효과를 시험해보았다.

먼저, HCT116 세포는 pU6-aptamer, pU6-NC 또는 pU6 벡터로 pTK-Hyg(Clontech)의 존재하에 공-형질도입한 후, 안정적으로 형질도입된 클론은 hygromycin B(Invitrogen)으로 선별하였다. 2 주 후에 hygromycin에 저항성이 있는 클론이 RNA 앱타머를 발현함을 RT-PCR로 확인한 후, RT-PCR로 cyclin D1과 c- myc의 발현 수준도 확인하였다. 그 결과, 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이, mRNA의 수준(cyclin D1과 c-myc)과 cyclin D1 단백질의 수준은 원래의 종과 비교했을 때, 안정적으로 앱타머가 발현되는 세포주에서는 감소됨을 확인하였다. 안정적으로 앱타머가 발현되는 HCT116 세포주의 형태는 U6 RNA(벡터)나 뉴클레오캡시드(NC)-결합 RNA 인트라머를 포함하는 세포주와 다르지 않았다(도 5).

<6-2> 세포주기 분석과 연성 아가 콜로니 형성(Soft Agar Colony Formation)

본 발명자들은 안정적으로 RNA 인트라머를 발현하는 세포주에서는 cyclin D1 발현이 낮았기 때문에 이러한 세포주가 세포주기의 G1/S 전이단계에 머물러 있는 것으로 가정한 후, 이를 확인하기 위하여 유세포 분석 실험을 실시하였다.

유세포 분석을 위해, 안정적으로 앱타머가 발현되는 HCT116 세포주(10,000 세포/시료)는 트립신 처리한 후 70% 에탄올로 고정하고 프로피디움 요오드(10㎍/ml)로 염색하고 37℃에서 301ns 동안 정온배치하였다. 세포주기 프로파일은 Cellquest Software(Becton Dickinson)을 장착한 FACScaliber로 분석하였다.

그 결과, 세포주 #6 중 G1에 머물러 있는 비율이 높았다(도 5c).

본 발명자들은 상기와 같은 세포주가 종양 형성 능력을 감소시켰는지 테스트하기 위하여 연성 아가 콜로니 형성(soft agar colony formation)을 어세이하였다. 5000 세포를 6-웰 플레이트에 0.7% 아가와 함께 접종하여 10일 후에, 콜로니가 형성되었고 이를 70% 에탄올로 고정한 후 물로 세척하고 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 20분 동안 염색하였다. 그 결과, RNA 인트라머 안정 세포주에서는 콜로니가 생 성되지 않은 반면 대조 세포주에서는 많은 수의 콜로니가 생성되었다(도 5d). 이러한 결과는 베타-카테닌 RNA 인트라머가 세포분열 주기를 멈추게 하는데 효과가 있고 궁극적으로는 종양 발생을 감소시킨다는 것을 의미한다.

TCF-1에 결합하는 앱타머

<실시예 7> 플라스미드 단백질 및 시약

본 발명자들은 pcDNA3.1 벡터의 EcoRⅠ 부위로 마우스 TCF-1의 완전한 코딩 부위를 삽입하였다(S. Jeong et al., Kor. J. Biol. Sci. 4:389-394, 2000). 먼저, EcoRⅠ(5' 프라이머, N100 및 전체길이 TCF-1:서열번호 16, C200: 서열번호 19 )과 SalⅠ(3' 프라이머, N100: 서열번호 17, 전체길이 TCF-1 및 C200: 서열번호 20) 제한효소 부위를 포함하는 프라이머로 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Taq polymerase, Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장 (extension)시켜 반응을 종결하였다. 상기 PCR에 의하여 수득한 산물(C200: 아미노산 188-388, N100: 아미노산 5-100, 전체길이 TCF-1 단백질: 아미노산 5-388)은 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 절단하여 pGEX 4T-1 플라스미드로 클로닝하여 재조합 TCF-1 단백질에 대한 발현벡터를 제작하였다. 상기 발현벡터로부터 각각의 재조합 단백질을 발현시켜 GST-TFP-1 단백질 및 (His)₆-NFAT-1을 순수분리하는 과정은 이미 기술되어 있다(S. Y. Lee and S. Jeong, Mol. Cell 17: 174-179, 2004; M.Y. Kim and S. Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 320: 1181-1186, 2004).

<실시예 8> RNA 앱타머 #10과 TCF-1 단백질 DNA 결합 도메인의 특이적 결합

먼저, 서열번호 13로 기재되는 RNA 앱타머 #10은 방사성 동위원소로 표지하고(α-³²P UTP) GST-융합된 TCF-1 단백질과 정온배치하여 후 GST pull-down에 의해 어세이하였다. RNA-단백질 복합체는 글루타치온-세파로즈(GST) 4B 비드로 침강시킨 후 결합된 RNA 앱타머는 5mM EDTA로 용리시켰다. 이를 6% 폴리아크릴아마이트/7M 우레아 젤에서 전기영동한 후 자동 방사선 사진법(autoradiography)로 확인하였다.

그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, RNA 앱타머 #10은 DNA 결합부위를 포함하는 HMG 도메인(C200, C)에는 결합했지만 N-말단의 베타 카테닌 결합 도메인(N100, N)에는 결합하지 않았고 베타-카테닌이나 NFAT(NF)와 같은 다른 단백질의 DNA 결합 도메인에도 결합하지 않았다. 즉, 본 발명의 RNA 앱타머 #10은 TCF-1의 HMG 도메인에만 특이적으로 결합함을 확인하였다.

<실시예 9> RNA 앱타머 #10과 비특이적인 RNA와의 경쟁

<9-1> 핵 추출물의 준비

인간 태아 신장 293T 세포와 뮤린(murine)의 미성숙한 흉선세포주 S49.1(American Type Culture Collection)를 Dulbecco's modified Eagle's 배지(10% 우태아 혈청과 항체를 포함하는)에서 배양하였다. 인간 태아 신장 293T세포는 GST-TCF-1 발현벡터로 형질전환되었고 S49.1 세포주는 cd4/cd8 이중 음성 미성숙 흉선세포를 가지고 있고 높은 수치의 TCF-1을 나타내며 TCF 신호전달에 의해 조절된다(S. H. Jeon et al., J. Exp. Med. 185: 1827-1836, 1997) 293T 세포(1X10⁷ 세포)와 S49.1 세포(1X10⁸ 세포)는 회수하여 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠렛은 단백질 분해효소 억제제 칵테일과 포스파타제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich)이 첨가된 200μl의 차가운 완충용액 A(20mM Tris-Cl (pH 8.0), 10mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail)에 재현탁하였다. 이를 얼음에 15분 동안 정온배치한 후, 세포는 0.5% NP40로 용해시키고 부드럽게 흔들었다. 세포 파쇄물은 4℃에서 30분 동안 4000rpm으로 원심분리하였다. 펠렛은 50ml의 차가운 완충용액 C(20mM Tris-Cl (pH8.0), 400mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM EDTA, 0.5mM PMSF, 25% glycerol, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail)에 재현탁하였다. 얼음에 30분 동안 정온배치한 후, 파편은 원심분리로 침전시키고 상등액만 수득하였다. 여과된 세포 추출물의 단백질 농도는 Bradford assay(Bio-Rad)에 의해 측정되었다.

<9-2> Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA)

본 발명자들은 RNA 앱타머 #10의 TCF-1 단백질에 대한 결합 특이성을 시험하기 위해 RNA 앱타머 #10과 비특이적인 RNA 간의 경쟁 실험을 수행하였다.

실시예 <9-1>에서 준비한 핵 추출물(5.25μg의 S49.1)에 0.2μg poly(dI-dC), 방사성 표지된 RNA 앱타머 #10와 방사성 표지되지 않은 RNA 앱타머 #10, 비특이적인 RNA 앱타머 #9(서열번호 14) 및 #20(서열번호 15)를 첨가하여 상온에서 30분 동안 정온배치하였다. 정온배치 후 상기 반응물을 5% 네이티브 폴리아크릴아마이드젤에서 1xTBE 150V로 4 시간 동안 전기영동하는 EMSA를 실시하여 단백질 RNA-단백질 복합체를 분리한 후 자동 방사선 사진법(autpradiography)으로 시각화하였다.

그 결과, 표지되지 않은 RNA(#10, #9, #20)의 양이 증가함에 따라 결합 밴드, 즉 TCF-1과 결합한 방사성 표지된 RNA 앱타머 #10의 세기가 점차 약해지는 것을 관찰하였다. 그러나 TCF-1에 결합하지 않는 RNA #9나 원래 RNA 풀(Ori)에 의해서는 결합이 약해지지 않았다. 이로써 비-결합 RNA 분자(#9와 #20)는 TCF-1 결합에 있어, RNA 앱타머 #10과 경쟁하지 않음을 확인하였다.

<실시예 10> RNA 앱타머 #10에 의한 TCF-1과 DNA의 결합 억제

본 발명자들은 TCF-1 결합서열(A/T A/T CAAAG)을 포함하는 DNA 올리고뉴클레오타이드(TRE, TCF responsive element, 서열번호 21)로 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다.

<10-1> TRE 올리고뉴클레오타이드 제작

서열번호 12로 기재되는 이중가닥 TRE 올리고뉴클레오타이드는 Bioneer에 의해 합성되었다. TRE 올리고뉴클레오타이드는 20U의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 50μCi[γ-³²P]ATP로 말단-표지된 후, G-50 Sephadex spin column(Sigma)으로 분리되고 페놀 추출되고 에탄올 침전되었다.

<10-2> EMSA

본 발명자들은 상기 실시예 <10-1>에서 준비한 TRE 올리고뉴클레오타이드를 핵 추출물(5.25μg의 S49.1)에 0.2μg poly(dI-dC)(Roche)에 첨가하고 , 방사성 표지되지 않은 RNA 앱타머 #10과 tRNA를 첨가하여 정온배치 한 후, 상기 실시예 <9-2>과 같이 EMSA를 수행하였다.

그 결과, TRE와 TCF-1 C200 단백질 간의 결합은 표지되지 않은 앱타머 #10의 농도를 증가시킴에 따라 점차 억제되었지만, 비-특이적인 tRNA와에 의해서는 억제되지 않았다(도 8a).

본 발명자들은 또한 RNA 앱타머 #10에 의해 TCF-1 전체길이 단백질과 TRE 결합이 특이적으로 억제되는지 관찰하였다.

그 결과, RNA 앱타머 #10에 의해 TCF-1 전체길이 단백질과 TRE 결합역시 억제되었지만 TCF-1에 비특이적인 HIV-1 뉴클레오캡시드(NC) 단백질 결합 RNA 앱타머(M. Y. Kim and S. Jeong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 320: 1181-1186, 2004) 또는 원래의 RNA 라이브러리는 TCF-1과의 결합을 위해 TRE와 경쟁하지 않았다(도 8b).

이로써, RNA 앱타머 #10은 생체 외와 세포내 모두에서 TCF-1와 이에 특이적인 DNA 결합을 억제함을 확인하였다.

<제제예> 주사액제의 제조방법

본 발명의 RNA 앱타머 100 nM을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘ㆍ염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

RNA 앱타머 ---------------------- 5 ㎍(100nM)

5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘ㆍ염산염 --------------------- 1 g

염화나트륨 --------------------- 0.6 g

아스코르브산 --------------------- 0.1 g

증류수 --------------------- 정량

본 발명의 베타-카테닌에 결합하는 RNA 앱타머는 베타-카테닌의 전사 활성을 억제하고 표적 유전자의 발현을 감소시키므로 베타-카테닌/TCF 전사 복합체의 특이적인 억제제로 병리학적 단백질-단백질 상호작용의 특이적인 억제제 및 암 유전자인 베타-카테닌의 기능을 억제하는 항암제를 개발하는데 이용될 것이다. 또한, TCF-1의 DNA 결합부위에 대한 RNA 앱타머는 TCF-1과 표적 유전자의 결합을 억제하여 표적 유전자의 발현을 저해함으로써 TCF-1의 기능을 밝히는데 이용될 수 있고, 대부분의 표적 유전자가 cyclin D나 c-myc과 같은 암 관련 유전자이므로 TCF-1의 DNA 결합을 저해하는 RNA 앱타머는 항암제 개발 및 항암제 후보물질 스크리닝에 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1로 기재되는 베타 카테닌에 결합하는 RNA 앱타머.
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제 1항의 RNA 앱타머를 함유하는 유전자 발현 조절제.
제 3항에 있어서, 유전자가 cyclin D1 또는 c-myc 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절제.
제 1항의 RNA 앱타머를 함유하는 베타-카테닌과 타 단백질 간 상호작용 저해제.
베타 카테닌에 결합하고, 서열번호 2로 기재되는 DNA로부터 전사되는 RNA 인트라머 발현용 재조합벡터.
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제 1항의 RNA 앱타머 또는 제 6항의 인트라머가 발현되는 재조합벡터를 유효성분으로 함유하는 항암제.
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