PL211426B1 - Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen - Google Patents
Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany genInfo
- Publication number
- PL211426B1 PL211426B1 PL370282A PL37028204A PL211426B1 PL 211426 B1 PL211426 B1 PL 211426B1 PL 370282 A PL370282 A PL 370282A PL 37028204 A PL37028204 A PL 37028204A PL 211426 B1 PL211426 B1 PL 211426B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- codon
- gene
- replaced
- protein
- modified gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 26
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 33
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 3
- 108010067396 dornase alfa Proteins 0.000 claims description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 2
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710145796 Staphylokinase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 2
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003773 calcitonin (salmon synthetic) Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 2
- 229950007278 lenercept Drugs 0.000 claims description 2
- 108010068072 salmon calcitonin Proteins 0.000 claims description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 2
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 claims 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 claims 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012215 HSC70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101150105682 HSPA1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043239 HSPA8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040352 Heat shock 70 kDa protein 1A Human genes 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101001037759 Homo sapiens Heat shock 70 kDa protein 1A Proteins 0.000 description 1
- 101001080568 Homo sapiens Heat shock cognate 71 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 208000010191 Osteitis Deformans Diseases 0.000 description 1
- 208000027868 Paget disease Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059594 Secondary hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000027202 mammary Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 208000001685 postmenopausal osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211426 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 370282 (51) Int.Cl.
C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/06 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 23.09.2004 C12N 15/63 (2006.01)
Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, (54) wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen
| (73) Uprawniony z patentu: MIĘDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMÓRKOWEJ W WARSZAWIE, Warszawa, PL | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 03.04.2006 BUP 07/06 | (72) Twórca(y) wynalazku: GRZEGORZ KUDŁA, Zielonka, PL |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2012 WUP 05/12 | (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Witek Rafał WITEK TWARDOWSKA ŚNIEŻKO KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH Spółka Partnerska |
PL 211 426 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, sposób prowadzenia ekspresji białka w komórce ssaczej, zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej oraz wektor i komórka ssacza zawierające ten gen.
Cechą charakterystyczną kodu genetycznego jest kodowanie jednego aminokwasu przez kilka wariantów kodonów (patrz tabela 1).
Zazwyczaj kodony odpowiadające danemu aminokwasowi różnią się dwoma pierwszymi nukleotydami, co wiązane jest z ich wyjątkowym znaczeniem w oddziaływaniach pomiędzy tRNA i mRNA w trakcie translacji. Zaobserwowano również, że pewne kodony są częściej używane przez określone organizmy lub tkanki, a także wpływ pewnych kodonów na wydajność i szybkość procesu translacji. Liczne publikacje opisują korelację obserwowaną w różnych organizmach istniejącą pomiędzy wyborem kodonów, a wydajnością translacji (przykładowo lida K. i Akashi H., Gene 261 (2000) 93-105 i cytowane tam publikacje).
Znane są sposoby podnoszenia poziomu ekspresji genów polegające na zmianie sekwencji kodowanego przez te geny mRNA. Polegają one na dostosowaniu sekwencji poddawanego ekspresji genu do specyficznych warunków translacji cechujących komórkę, w której produkowane ma być dane białko. Znane sposoby opierają się na uwzględnieniu we wprowadzanych modyfikacjach preferencji używania poszczególnych kodonów (ang. codon usage) reprezentowanych w podlegającym translacji mRNA, które to preferencje są obserwowane w danym organizmie. Tego rodzaju podejście opisano między innymi w US 6114148, EP1433853, WO04050872, WO03085114, WO03062374.
T a b e l a 1. Kodony występujące w mRNA i odpowiadające im aminokwasy
| aminokwas | kod on |
| 1 | 2 |
| alanina (Ala) | GCU GCC GCA GCG |
| arginina (Arg) | CGU CGC CGA CGG AGA AGG |
| asparagina (Asn) | AAU AAC |
| kwas asparaginowy (Asp) | GAU GAC |
| leucyna (Leu) | UUA UUG CUU CUC CUA CUG |
| lizyna (Lys) | AAA AAG |
| prolina (Pro) | CCU CCC CCA CCG |
| fenyloalanina (Phe) | UUU UUC |
PL 211 426 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 |
| cysteina (Cys) | UGU UGC |
| glutamina (Gln) | CAA CAG |
| kwas glutaminowy (Glu) | GAA GAG |
| glicyna (Gly) | GGU GGC GGA GGG |
| histydyna (His) | CAU CAC |
| izoleucyna (Ile) | AUU AUC AUA |
| metionina (Met) | AUG |
| seryna (Ser) | UCU UCC UCA UCG AGU AGC |
| treonina (Uhr) | ACU ACC ACA ACG |
| walina (Val) | GUU GUC GUA GUG |
| tryptofan (Urp) | UGG |
| tyrozyna (Uyr) | UAU UAC |
Podsumowując, można stwierdzić, że dotychczasowe sposoby podnoszenia wydajności ekspresji białek dotyczące zmian obojętnych dla sekwencji aminokwasowej produkowanego białka wprowadzanych w sekwencji kodującej pożądany polipeptyd skupiały się głównie na próbie optymalizacji przebiegu procesu translacji, a wprowadzane zmiany polegały na dostosowaniu kodonów obecnych w wykorzystywanym mRNA do preferencji używania poszczególnych kodonów cechującej dany organizm.
Istotnym ograniczeniem opisanych sposobów jest ścisłe powiązanie zakresu ich stosowania z rodzajem wykorzystywanego do ekspresji organizmu/tkanki/komórki wynikające z różnic w preferencjach używania poszczególnych kodonów charakterystycznych dla różnych typów gospodarzy.
Istnieje jednak ciągłe zapotrzebowanie na metody pozwalające na zwiększanie wydajności rekombinowanych białek, zwłaszcza w komórkach ssaczych. Pożądane jest, aby takie metody niewywoływany zmiany właściwości produkowanego białka, a także nadawały się do stosowania w różnych typach komórek ssaczych.
Nieoczekiwanie tak zdefiniowany cel udało się osiągnąć dzięki niniejszemu wynalazkowi.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są: sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, sposób prowadzenia ekspresji białka w komórce ssaczej, zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej oraz wektor i komórka ssacza zawierające ten gen, zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.
PL 211 426 B1
Sposób według wynalazku polega na takiej zmianie sekwencji genu kodującego dane białko, żeby uzyskać wysoką częstość występowania nukleotydów G i C w obszarze kodującym genu, bez zmieniania sekwencji aminokwasowej białka. W praktyce polega to na takiej zamianie większości nukleotydów A i T, najczęściej w trzecich pozycjach kodonów, na nukleotydy C i G, aby nie zmienić sekwencji kodowanego białka.
Stosowane w niniejszym opisie pojęcie „cicha substytucja dotyczy takiej zmiany w sekwencji nukleotydowej, która nie prowadzi do zmiany kodowanej przez nią sekwencji aminokwasowej. Każdorazowo prowadzi ona do osiągnięcia zmiany synonimicznej.
Stosowane w niniejszym opisie pojęcie „częstość występowania nukleotydów G i C” charakteryzujące sekwencję nukleotydową może być utożsamiane z zawartością procentową tych nukleotydów w cał kowitym skł adzie nukleotydowym danej sekwencji.
Zaproponowana metoda może być stosowana wobec różnych znanych genów kodujących pożądane białko, zarówno naturalnych jak i rekombinowanych, które mają być poddane ekspresji w komórkach ssaczych. Sekwencje takich genów są łatwo dostępne dla specjalisty i mogą być przykładowo uzyskane z bazy GeneBank dostępnej w Internecie (www.ncbi.nih.gov).
Zmodyfikowany gen według wynalazku może być łatwo otrzymany znanymi technikami, przykładowo techniką wprowadzania poszczególnych mutacji punktowych do polinukleotydu genu poddawanego modyfikacji albo poprzez zautomatyzowaną syntezę de novo całego genu lub jego fragmentów.
Pojęcie „znane odmiany i rekombinowane pochodne stosowane w niniejszym opisie wobec białek kodowanych przez gen modyfikowany metodą według wynalazku obejmuje wszelkie znane warianty, mutanty i pochodne takich białek. Mogą to być białka naturalne albo rekombinowane, posiadające np. ulepszone właściwości funkcjonalne. Przykładowymi pochodnymi białek są białka fuzyjne, białka humanizowane lub białka posiadające dodatkowe sekwencje ułatwiające ich oczyszczanie. Specjalista, w oparciu o powszechnie dostępną wiedzę, będzie w stanie wskazać odpowiednie sekwencje aminokwasowe jak również zaproponować ich pożądane modyfikacje. Szczególnym przykładem białek nadających się do produkowania metodą według wynalazku są białka terapeutyczne wymienione w Tabeli 2. Są to białka, których ekspresja jest szczególnie pożądana, ze względu na ich oczekiwane właściwości terapeutyczne.
T a b e l a 2. Wybrane białka terapeutyczne
| Klasa | Białko | Wskazanie |
| 1 | 2 | 3 |
| Hormony | Insulina zwierzęca | cukrzyca |
| Rekombinowana insulina ludzka | cukrzyca | |
| Rekombinowany ludzki hormon wzrostu | Niedobór hormonu wzrostu, Zespół Turnera | |
| Hormon uwalniający gonadotropinę | Męska niepłodność | |
| Ludzka kosmówkowa gonadotropina | Hipogonadyzm hipogonadotropowy | |
| Kalcytonina z łososia | Choroba Pageta, hiperkalcemia w chorobie nowotworowej osteoporoza postmenopauzalna | |
| Rekombinowana ludzka erytropoetyna (epoetyna) | anemia | |
| Enzymy | Czynnik VIII | Hemofilia |
| rhDNaza | Mukowiscydoza | |
| Rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu | Thromboliza w ostrym zawale mięśnia sercowego | |
| Rekombinowana streptokinaza | Thromboliza w ostrym zawale mięśnia sercowego | |
| Rekombinowana stafylokinaza | Thromboliza w ostrym zawale mięśnia sercowego |
PL 211 426 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 |
| Cytokiny | IFN-alfa2a | Hepatitis C, Niektóre nowotwory |
| IFN-alfa2b | Leukemia, guz nowotworowy | |
| IFN-beta 1a, 1b | Stwardnienie rozsiane, niektóre nowotwory | |
| IL-2 | niektóre nowotwory | |
| IL-3 | niektóre nowotwory | |
| Czynniki wzrostu | białko fuzyjne IL-3 GM-CSF (ΡΙΧΥ321) | niektóre nowotwory |
| GM-CSF | niektóre nowotwory | |
| Ludzki G-CSF | Neutropenia | |
| Receptory i antagoniści | CD4 | HIV |
| Lenercept (TNF białko rozpuszczalnej formy receptora) | Stwardnienie rozsiane | |
| Etanercept (TNF białko rozpuszczalnej formy receptora) | Reumatoidalne zapalenie stawów |
G-CSF = czynnik stymulujący wzrost granulocytarnych kolonii; GM-CSF = czynnik stymulujący wzrost granulocytarnychmakrofagowych kolonii; HIV = ludzki wirus upośledzenia odporności, IFN = interferon; IL = interleukina; rhDNase = rekombinowana ludzka deoksyrybonukleaza; TNF = czynnik martwicy nowotworu
Geny pozyskane metodą według wynalazku zgodnie z jednym z jego aspektów mogą być wykorzystywane w przemysłowej produkcji białek w odpowiednich kulturach hodowlanych. Zarówno warunki hodowli jak i dobór odpowiedniego gospodarza i zaprojektowanie wektora właściwego do jego transfekcji leżą w możliwościach specjalisty dysponującego dostępną wiedzą z tej dziedziny.
Zgodnie z innym aspektem wynalazku, geny modyfikowane mogą być wykorzystywane w terapii genowej. Również w tym przypadku należy zwrócić uwagę na odpowiedni wybór wektora stosowanego do wprowadzania genu modyfikowanego dostosowany do leczonego organizmu lub tkanki, czy też pożądanego efektu terapeutycznego lub planowanej metody leczenia. Specjalista w oparciu o dostępną wiedzę z tej dziedziny będzie w stanie dokonać koniecznego doboru pozostałych elementów i warunków terapii.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nieoczekiwanie ustalono, że geny o wysokiej zawartości nukleotydów G i C w sekwencji kodującej są poddawane ekspresji skuteczniej niż geny o niskiej zawartości G i C. Zwiększenie zawartości nukleotydów G i C w genie wpływa na zwiększenie ilości mRNA produkowanego przez ten gen. Natomiast nie stwierdzono wpływu zawartości nukleotydów G i C na prę dkość translacji. Moż na postulować co najmniej dwa mechanizmy zaobserwowanego efektu, mianowicie wydajniejsza produkcja mRNA przez geny o wysokiej zawartości G i C może być wynikiem większej stabilności mRNA albo też wydajniejszej transkrypcji.
Celem lepszego zilustrowania wynalazku opisano poniżej przykłady jego realizacji dla pewnych genów ssaczych. Zilustrowano również obserwowany efekt wzrostu poziomu ekspresji dla genów modyfikowanych. Nie należy jednak ograniczać zakresu przedmiotowego wynalazku jedynie do wskazanych przykładowych genów, komórek ssaczych, wektorów i warunków ekspresji. W szczególności należy oczekiwać, że wzrost poziomu ekspresji będzie obserwowany również dla innych genów i ssaczych układów ekspresyjnych.
P r z y k ł a d 1. Porównanie wydajności ekspresji w komórkach ssaczych genów o wysokiej i niskiej zawartoś ci nukleotydów G i C.
W celu porównania wydajności ekspresji genów o wysokiej i niskiej zawartości nukleotydów G i C użyto wektora pEGFP-N2 (BD Clontech) oraz wektora pGFP-N2, stworzonego przez nas. Wektory te zawierają promotor CMV do ekspresji w komórkach ludzkich i są identyczne na całej długości, z wyjątkiem sekwencji genów kodujących białka EGFP i GFP. Gen kodujący białko EGFP zawiera 97% nukleotydów G i C w trzeciej pozycji kodonów, a gen kodujący białko GFP - 33% nukleotydów G i C w trzeciej pozycji kodonów. Sekwencje aminokwasowe biał ek EGFP i GFP są identyczne; identyczne są również 3' i 5' UTRy genów GFP i EGFP oraz sekwencje Kozak w tych genach.
PL 211 426 B1
Wektor pGFP-N2 uzyskano przez podstawienie sekwencji kodującej białko GFP w wektorze pEGFP-N2 przez sekwencje kodującą GFP z wektora pS65T-C1 (BD Clontech), oraz 3 mutagenezy prowadzące do uzyskania jednakowej sekwencji aminokwasowej białek GFP kodowanych przez wektory pEGFP-N2 i pGFP-N2. Sekwencje wektorów przedstawiono na figurach 1 i 2. Sekwencję części kodującej GFP wektora pGFP-N2 sprawdzono przez sekwencjonowanie.
Poziom ekspresji genów GFP i EGFP monitorowano przy użyciu cytofluorymetru przepływowego. Komórki HeLa wysiewano na płytce 6-dołkowej w ilości 250 000 komórek na dołek, a następnego dnia transfekowano 1.5 μg wektorów pGFP-N2 albo pEGFP-N2, przy użyciu 5 μg odczynnika Lipofectamine2000. Podobnie komórki HEK293 wysiewano na płytce 6-dołkowej w ilości 400 000 na dołek, a następnego dnia transfekowano 2 μg wektorów pGFP-N2 albo pEGFP-N2, przy użyciu 4 μg odczynnika PEI. Po 24 godzinach komórki trypsynizowano, zawieszano w buforze PBS i mierzono fluorescencję na cytofluorymetrze. Poziom białka EGFP był kilkudziesięciokrotnie wyższy niż białka GFP. Wyniki zaprezentowano na fig. 3 i fig. 4.
W celu porównania ilości mRNA genów EGFP i GFP, 24 godziny po transfekcji komórek wykonano izolację całkowitego RNA komórkowego za pomocą zestawu NucleoSpin firmy Macherey-Nagel. Po określeniu ilości RNA we wszystkich próbkach wykonano odwrotną transkrypcję za pomocą zestawu firmy Fermentas, a następnie ilościowe oznaczenie cDNA za pomocą urządzenia Light-Cycler (Roche) przy użyciu odczynnika Sybr-Green. Sekwencje starterów przyłączały się do cDNA EGFP i GFP w obszarze 3'UTR, co gwarantowało identyczną wydajność PCR w obu przypadkach, ponieważ obszary 3'UTR tych genów są identyczne. Jako kontroli jednakowej wydajności transfekcji wektorami pEGFP-N2 i pGFP-N2 użyto sekwencji cDNA genu oporności na neomycynę, znajdującego się na tych plazmidach. Ilości produktów genu oporności na neomycynę były podobne w przypadku transfekcji wektorami pEGFP-N2 i pGFP-N2. Przeciwnie, poziom mRNA genu EGFP był kilkudziesięciokrotnie wyższy niż poziom mRNA genu GFP, zarówno w komórkach HeLa jak i HEK293. W świetle wcześniejszej wiedzy uzyskany efekt należy uznać za nieoczekiwany. Wyniki zaprezentowano na figurze 5.
P r z y k ł a d 2. Porównanie wydajności ekspresji w komórkach ssaczych podobnych genów ssaczych o wysokiej i niskiej zawartości nukleotydów G i C.
Przykładem ludzkich genów o podobnej sekwencji, ale różnej zawartości nukleotydów G i C są geny HSPA1A i HSPA8, kodujące odpowiednio białka Hsp70 i Hsc70. Gen HSPA1A zawiera 92% nukleotydów G i C w trzeciej pozycji kodonów, a gen HSPA8 - 46% nukleotydów G i C w tej pozycji. W celu porównania wydajności ekspresji tych genów stworzono wektory pET-Hsc70 i pET-Hsp70 zawierające promotor dla polimerazy T7, pozwalający na syntezę mRNA w warunkach in vitro. Zsyntetyzowane mRNA wykorzystano następnie do pokazania, że mimo różnicy w zawartości nukleotydów G i C, prędkość translacji obu genów jest identyczna (szczegółowo eksperyment opisano w publikacji Grzegorz Kudła, Aleksandra Helwak, i Leszek Lipiński, „Gene Conversion and GC-Content Evolution in Mammalian Hsp70, Molecular Biology and Evolution 2004 21: 1438-1444).
Stworzono następnie wektory pcDNA3.1-Hsc70-HA oraz pcDNA3.1-Hsp70-HA, których sekwencje zaprezentowano na figurach 6 i 7. Są to wektory pozwalające na ekspresję genów Hsc70 i Hsp70 w komórkach ludzkich, zawierające promotor CMV oraz tag HA umożliwiający skuteczne wykrywanie białek w lizatach komórkowych metodą Westernbloting.
Uzyskane wyniki ekspresji powinny potwierdzić wpływ zawartości nukleotydów G i C na poziom ekspresji - w tym przypadku podobnych genów.
Claims (40)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, znamienny tym, że w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej genu wprowadza się ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Ala zastępuje się kodonem wybranym spośród GCC i GCG.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Cys zastępuje się kodonem TGC.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Asp zastępuje się kodonem GAC.PL 211 426 B1
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Glu zastę puje się kodonem GAG.
- 6. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e kodon odpowiadający Phe zastę puje się kodonem TTC.
- 7. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e kodon odpowiadają cy Gly zastę puje się kodonem wybranym spośród GGC i GGG.
- 8. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e kodon odpowiadają cy His zastę puje się kodonem CAC.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e kodon odpowiadający Ile zastę puje się kodonem ATC.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Lys zastępuje się kodonem AAG.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Leu zastępuje się kodonem wybranym spośród TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, korzystnie kodonem CTG albo CTC.
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Asn zastępuje się kodonem AAC.
- 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Pro zastępuje się kodonem wybranym spośród CCG albo CCC.
- 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Gln zastępuje się kodonem CAG.
- 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Arg zastępuje się kodonem wybranym spośród CGT, CGC, CGA, CGG, AGG, korzystnie kodonem CGC albo CGG.
- 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Ser zastępuje się kodonem wybranym spośród TCC, TCG albo AGC.
- 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Thr zastępuje się kodonem ACC albo ACG.
- 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Val zastępuje się kodonem GTC albo GTG.
- 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kodon odpowiadający Trp stosuje się TGG, a jako kodon odpowiadający Met stosuje się ATG.
- 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Thr zastępuje się kodonem ACC albo ACG.
- 21. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 20, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen kodujący białko wybrane spośród: czynników transkrypcyjnych, chaperonów (białek opiekuńczych), hormonów białkowych, enzymów, cytokin, czynników wzrostu lub receptorów i antagonistów lub ich znanych odmian i rekombinowanych pochodnych.
- 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że hormon białkowy jest wybrany z grupy obejmującej: insulinę zwierzęcą, insulinę ludzką, ludzki hormon wzrostu, hormon uwalniający gonadotropinę, ludzką kosmówkową gonadotropinę, kalcytoninę z łososia, ludzką erytropoetynę lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne.
- 23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że enzym jest wybrany z grupy obejmującej: Czynnik VIII krzepnięcia krwi, rhDNazę, tkankowy aktywator plazminogenu, streptokinazę, stafylokinazę lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne.
- 24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że cytokina jest wybrana z grupy obejmującej: IFN-alfa2a, IFN-alfa2b, IFN-beta 1a, 1b, IL-2, IL-3 lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne.
- 25. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że czynnik wzrostu jest wybrany z grupy obejmującej: białko fuzyjne IL-3 GM-CSF (PIXY321), GM-CSF, ludzki G-CSF lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne.
- 26. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że receptor lub antagonista jest wybrany z grupy obejmującej: CD4, lenercept, etanercept lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne.
- 27. Sposób prowadzenia ekspresji białka w komórce ssaczej, znamienny tym, że identyfikuje się sekwencję nukleotydową genu kodującego rzeczone białko, w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej genu wprowadza się ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C, syntetyzuje się wektor ekspresyjny zawierający gen o zmodyfikowanej sekwencji połączony operacyjnie z sekwencjami umożliwiającymi ekspresję w komórek ssaczej, a następnie (znanymiPL 211 426 B1 metodami) wprowadza się otrzymany wektor ekspresyjny do komórki ssaczej i uzyskuje się ekspresję zmodyfikowanego genu.
- 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wprowadzając substytucje dokonuje się zmiany kodonów według zastrz. od 2 do 20.
- 29. Sposób według zastrz. 27 albo 28, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen według zastrz. od 21 do 26.
- 30. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że komórka ssacza jest komórką ludzką lub jej pochodną.
- 31. Sposobi według zastrz. 27, znamienny tym, że ekspresję zmodyfikowanego genu uzyskuje się in vitro albo w organizmie ssaka.
- 32. Zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, znamienny tym, że w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej zawiera ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C.
- 33. Zmodyfikowany gen według zastrz. 32, znamienny tym, że zawiera zmiany kodonów według zastrz. od 2 do 20.
- 34. Zmodyfikowany gen według zastrz. 32 albo 33, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen według zastrz. od 21 do 26.
- 35. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, przy czym rzeczony gen w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej zawiera ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C.
- 36. Wektor ekspresyjny według zastrz. 35, znamienny tym, że zmodyfikowany gen zawiera zmiany kodonów według zastrz. od 2 do 20.
- 37. Wektor ekspresyjny według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen według zastrz. od 21 do 26.
- 38. Wektor ekspresyjny według zastrz. 35 albo 36 albo 37, znamienny tym, że jest wektorem do przemysłowej produkcji białka albo wektorem to terapii genowej.
- 39. Komórka ssacza, znamienna tym, że jest transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, przy czym rzeczony gen w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej zawiera ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C.
- 40. Komórka według zastrz. 39, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny według zastrz. od 35 do 38.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL370282A PL211426B1 (pl) | 2004-09-23 | 2004-09-23 | Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL370282A PL211426B1 (pl) | 2004-09-23 | 2004-09-23 | Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL370282A1 PL370282A1 (pl) | 2006-04-03 |
| PL211426B1 true PL211426B1 (pl) | 2012-05-31 |
Family
ID=38317545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL370282A PL211426B1 (pl) | 2004-09-23 | 2004-09-23 | Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL211426B1 (pl) |
-
2004
- 2004-09-23 PL PL370282A patent/PL211426B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL370282A1 (pl) | 2006-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113631708B (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
| EP2681327B1 (en) | Vectors conditionally expressing protein | |
| JP5873511B2 (ja) | ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメントに関する組成物および方法 | |
| US6410314B1 (en) | Episomally replicating vector, its preparation and use | |
| JP2025508861A (ja) | センス・レスポンス・アプリケーションのためのａｄａｒ編集を利用した生細胞内ｒｎａセンサー | |
| WO2024240138A1 (zh) | 基于perv逆转录酶的先导编辑系统 | |
| JP6855037B2 (ja) | ゲノム編集方法 | |
| PL211426B1 (pl) | Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen | |
| CN102016025B (zh) | 用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用 | |
| JPWO2018066492A1 (ja) | Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーター | |
| TW202020160A (zh) | Hspa8 基因之啟動子 | |
| AU618394B2 (en) | Factor regulating gene expression | |
| Upreti et al. | Expression and DNA binding activity of the recombinant interferon regulatory factor-1 (IRF-1) of mouse | |
| US20080077999A1 (en) | Using Nonhuman Animal Model, Method of Measuring Transcription Activity Method of Measuring Cell Quantity and Method of Measuring Tumor Volume | |
| JP2005312304A (ja) | 新規インターフェロン制御因子活性化ポリペプチド及びそれをコードする核酸 | |
| KR100512018B1 (ko) | 상동 재조합에 의해 인간 세포에서 인간 변이 단백질을 생성시키는 방법 | |
| KR20250007570A (ko) | Eno1 유전자의 프로모터 | |
| CN102695794B (zh) | 启动子的增强子及其用途 | |
| EP2382319B1 (en) | A method for increasing protein expression in cells | |
| CN116355100A (zh) | 一种碱基编辑器及其构建方法与应用 | |
| HK1192590B (en) | Vectors conditionally expressing protein | |
| HK1192590A (en) | Vectors conditionally expressing protein | |
| JPS63263083A (ja) | 新しい塩基配列のヒトプロテインｃ遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130923 |