JP6855037B2 - ゲノム編集方法 - Google Patents
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Description
項1. (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法.
項2. 前記ドナーDNAが2本鎖DNAである、項1に記載のゲノム編集方法.
項3. 前記ドナーDNAが環状DNAである、項2に記載のゲノム編集方法.
項4. 前記ガイドRNA 1の標的鎖及び前記ガイドRNA 2の標的鎖が、いずれもセンス鎖である、或いはいずれもアンチセンス鎖である、項2又は3に記載のゲノム編集方法.
項5. 前記ガイドRNA 1の標的部位の近傍領域内に疾患関連変異部位又はそれに対応する非変異部位を含む、項2〜4のいずれかに記載のゲノム編集方法.
項6. 前記近傍領域が、前記ガイドRNA 1の標的部位の標的鎖5´末端の塩基を起点(0)とした場合の−200〜+100の領域である、項5に記載のゲノム編集方法.
項7. 前記相同配列内の前記変異が同義置換である、項2〜6のいずれかに記載のゲノム編集方法.
項8. 前記ガイドRNA 2の標的部位が前記相同配列以外の部位である、項2〜7のいずれかに記載のゲノム編集方法.
項9. 前記ドナーDNAが1本鎖DNAであり、且つ前記ガイドRNA 2の標的部位が前記ゲノムDNA及び前記相同配列の両方に存在する、項1に記載のゲノム編集方法.
項10. (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法.
項11. 項10に記載の製造方法で得られた細胞又は非ヒト生物.
項12. (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用組成物.
項13. (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用キット.
e high−scoringsegments in molecular sequences.”NatlAcad Sci USA.90:5873−7(1993))を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、NationalCenter of BiotechnologyInformation(NCBI)のウェエブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
材料(a)は、ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種である。
材料(b)は、ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種である。
材料(c)は、前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNAである。
材料(d)は、前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種である。
上記材料(a)〜(d)をゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象非ヒト生物に導入する工程を含む方法により、これらの細胞又は生物のゲノムを編集すること、より具体的にはガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列をドナーDNAに含まれる相同配列に置き換えることができる。
上記材料(a)〜(d)は、これらが一体となって含まれるゲノム編集用組成物として利用することもできるし、或いはキットとして利用することもできる。
非蛍光型変異EGFPのコード配列が組み込まれた細胞に、各種Casタンパク質及び各種ガイドRNAの発現ベクターと共に、蛍光型正常EGFPのコード配列が組み込まれたドナーベクターを導入し、EGFP由来の蛍光を発する細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。試験の概要を図1Aに示す。この細胞の割合が高い程、非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列が、ドナーベクターにおける該変異部位の対応配列に組み替えられた細胞(すなわち目的のゲノム編集が起こった細胞)の割合が高いこと、すなわちゲノム編集効率が高いことを示す。具体的には以下のように行った。
EGFPコード配列(配列番号1)において5´末端から321番目のCGに変異(これにより、N末端から107番目のアミノ酸(チロシン)のコドンが終止コドンとなる)させた非蛍光型変異EGFPコード配列を、レンチウイルスベクター(pMX-puro)に組み込んだ。得られたベクターとパッケージングプラスミドを293T細胞に導入し、定法に従ってウイルス粒子を得た。該ウイルス粒子を293T細胞に感染させ、ピューロマイシンを1μg/mLの濃度で含む培地中で一定期間培養した後、pMX-puro内にコードされる蛍光タンパク質(mCherry)由来の蛍光を発する細胞を、セルソーター(Aria II、BD Biosciences社製)を用いて分離した。分離した細胞の1つを培養して増殖させ、目的の細胞を得た。
CMVエンハンサー及びトリβアクチンプロモーターで発現制御されている野生型Cas9又はニッカーゼ型Cas9(D10A)発現カセットを含むベクター(pSpCas9(BB)-2A-Puro又はpSpCas9n(BB)-2A-Puro)を準備した。このベクターにおいては、5´側からU6プロモーター、2つのBbsI認識サイト、及びトレーサーRNA配列が配置された発現カセットがある。これを利用して、ベクターをBbsIで切断し、そこにガイドRNA標的配列からPAM配列が除かれてなる配列を含む2本鎖DNA(2つの1本鎖DNAをアニールさせて作製)を組み込むことにより、ベクター内にガイドRNA発現カセットを作製した。なお、標的配列は、ガイドRNA作製プログラム(CRISPR Design、http://crispr.mit.edu/)を用いて設計した。標的配列の配列番号、及び標的配列の組み込みに用いた1本鎖DNAの配列番号を以下の表1に示す。
1〜3番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列78as(配列番号14)、標的配列285as、及び標的配列332sのPAM配列及びその近傍配列をCasタンパク質が認識できないように同義置換させた配列を、ドナーベクター用プラスミド(pUC57)のマルチクローニングサイトに組み込んだ。これと同様にして、1〜3番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列41s、標的配列260s、及び標的配列360as(配列番号15)のPAM配列及びその近傍配列をCasタンパク質が認識できないように同義置換させた配列を、ドナーベクター用プラスミド(pUC57)のマルチクローニングサイトに組み込んだ。
293T細胞を24ウェルプレート(BD Bioscience社製)の1ウェル当り4×104個/培地700μL播種した。24時間後、Casタンパク質及びガイドRNAの発現ベクター2種(それぞれ40 ng)、及びドナーベクター(400 ng)を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後に、細胞を培地に植え継いだ。トランスフェクションから4日後、細胞をトリプシン処理によりウェルから剥がし、フローサイトメトリー(FACS Calibur、BD Bioscience社製)によりEGFP由来の蛍光を発する細胞の割合を測定した。
結果を図1に示す。図1に示されるように、ニッカーゼ型Cas9を利用し、且つガイドRNA標的配列をタンデムに2つ設計した場合(「Cas9(D10A)」における「41s/332s」及び「260s/332s」)に、ゲノム編集効率(非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列が、ドナーベクターにおける該変異部位の対応配列に組み替えられた細胞の割合)が顕著に高かった。
Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を発現させ、且つドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1と同様にしてゲノム編集効率を評価した。
Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を発現させ、且つドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1と同様にしてゲノム編集効率を評価した。本実施例で新たに用いるガイドRNA標的配列の配列番号、及び標的配列の組み込み(実施例1-2)に用いた1本鎖DNAの配列番号を以下の表2に示す。
ドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1及び3と同様にしてゲノム編集効率を評価した。なお、本実施例では、新たにドナーベクターとして、1〜3番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列332sのPAM配列のみをCasタンパク質が認識できないように同義置換したものを用いた。
Casタンパク質としてニッカーゼ型Cas9を発現させ、且つドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1及び4と同様にしてゲノム編集効率を評価した。なお、本実施例では、新たにドナーベクターとして、1〜128番目、1〜231番目、又は1〜3及び471〜720番目の塩基が欠失したEGFPのコード配列において標的配列332sのPAM配列のみをCasタンパク質が認識できないように同義置換したものを用いた。
ドナーベクターのEGFPコード配列における同義置換部位とガイドRNA標的配列との組合せを変える以外は、実施例1及び3と同様にしてゲノム編集を行った。また、一部のサンプルについては、ゲノム編集を行って得られたEGFP陽性細胞に対して再度ゲノム編集を繰り返して、計3回のゲノム編集を行った。得られたEGFP細胞のゲノムDNAシーケンスを行い、非蛍光型変異EGFPの変異部位のコード配列のゲノム編集が両アリールで起こった細胞の割合、及び該ゲノム編集が起こっていないアリールにおいて、塩基の挿入又は欠失が起こった細胞の割合を算出した。
Claims (12)
- (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法。 - 前記ドナーDNAが2本鎖DNAである、請求項1に記載のゲノム編集方法。
- 前記ドナーDNAが環状DNAである、請求項2に記載のゲノム編集方法。
- 前記ガイドRNA 1の標的鎖及び前記ガイドRNA 2の標的鎖が、いずれもセンス鎖である、或いはいずれもアンチセンス鎖である、請求項2又は3に記載のゲノム編集方法。
- 前記ガイドRNA 1の標的部位の近傍領域内に疾患関連変異部位又はそれに対応する非変異部位を含む、請求項2〜4のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記近傍領域が、前記ガイドRNA 1の標的部位の標的鎖5´末端の塩基を起点(0)とした場合の−200〜+100の領域である、請求項5に記載のゲノム編集方法。
- 前記相同配列内の前記変異が同義置換である、請求項2〜6のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記ガイドRNA 2の標的部位が前記相同配列以外の部位である、請求項2〜7のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記ドナーDNAが1本鎖DNAであり、且つ前記ガイドRNA 2の標的部位が前記ゲノムDNA及び前記相同配列の両方に存在する、請求項1に記載のゲノム編集方法。
- (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法。 - (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用組成物。 - (a)ゲノムDNAの任意部位を標的とするガイドRNA 1及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(b)ニッカーゼ型Casタンパク質及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種、
(c)前記ガイドRNA 1の標的部位を含む任意配列の相同配列であって、前記ガイドRNA 1標的部位に変異を有する配列を含む、ドナーDNA、並びに
(d)前記ドナーDNA内の任意部位を標的とするガイドRNA 2及びその発現カセットからなる群より選択される少なくとも1種
を含む、ゲノム編集用キット。
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