CN102695794B - 启动子的增强子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种病毒启动子的增强子，例如可以在免疫活性细胞(例如淋巴细胞)或血细胞中选择性地并且强烈地诱导表达的启动子。意外地发现内含子具有上述的增强子活性。因此，发现包含人类疱疹病毒-6(HHV-6)(特别是HHV-6B)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列或者该内含子序列的片段的启动子的增强子具有强效的启动子活性。

Description

启动子的增强子及其用途
技术领域
本发明涉及一种启动子的增强子及其用途。
背景技术
为了治疗针对淋巴细胞的各种疾病(例如白血病和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染)，一直以来需要建立针对淋巴细胞的基因治疗的技术。本发明人已从人类疱疹病毒-6(HHV-6)(一种疱疹病毒)中发现了作为将期望基因导入淋巴细胞的启动子的HHV-6B MIE启动子，并且提交了其专利申请(专利文件1)。
这种病毒启动子可以单独使用，但理想的是与增强子联合使用以增强其作用。
在这方面，就真核启动子而言，已知各种内含子具有增强子的功能。然而，就病毒(如疱疹病毒)的启动子而言，对内含子的增强子功能尚未有充分了解。
已知巨细胞病毒(CMV)启动子在淋巴细胞中的活性较差。尽管使用了专利文件2的增强子，但该活性在除CHO细胞以外的细胞中是否增加是未知的。
专利文件1：国际公布第2007/029712号
专利文件2：日本PCT国家阶段公开公布第2008-536506号
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于病毒启动子的增强子，例如在免疫活性细胞或血细胞(如淋巴细胞等)中能够选择性地且强烈地诱导表达的启动子。
本发明的发明人意外地发现：用于HHV-6B的主要立即早期基因(MIE)的内含子具有这种增强子活性，由此解决上述问题。
重要的是，甚至所有的内含子不具有增强的表达效果，但新近已发现了具有这种效果的内含子。同样重要的是，即使大部分以往的研究是针对真核生物，但本发明人揭示了HHV-6的内含子(至少对于HHV-6特别是HHV-6B是第一次)并且其效果是显著的。
已知巨细胞病毒(CMV)启动子在淋巴细胞中的活性较低。即使使用了专利文件2的增强子，但在除CHO细胞外的细胞中该活性是否会增加是未知的。尽管在淋巴细胞中活性增加，但是这种增加并非总是有利的，这是因为最初的活性较低。在这方面，6MIE启动子本身显示了比来自于T细胞系(如Molt-3、Jurkat和SupT1)的培养细胞中的巨细胞病毒启动子更高的活性。此6MIE启动子与本发明增强子的联合使用使活性进一步增加。此外，发现这种组合的启动子活性比巨细胞病毒启动子的活性至少高5倍。因此，期望可以以特定方式更有效地将外源基因导入淋巴细胞中。
因此，本发明说明书提供以下项目。
(1)一种启动子的增强子，包含：用于人类疱疹病毒-6(HHV-6，HumanHerpes Virus-6)的主要立即早期基因(MIE，Major Immediate Early gene)的内含子序列(在下文中称为HHV-6B)、或者该内含子序列的片段。
(2)根据第1项所述的启动子的增强子，其中所述内含子序列包含：基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQ IDNo.2)、或者该序列的片段。
(3)根据第1项或第2项所述的启动子的增强子，其中所述序列包含基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的-12至+262的序列(SEQ ID No.3)。
(4)根据第1项至第3项中任一项所述的启动子的增强子，其中所述序列是基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的-12至+262的序列(SEQ IDNo.3)。
(5)根据第1项至第4项中任一项所述的启动子的增强子，其中所述启动子包含基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-382至-983的序列(SEQ ID No.4)、或者该序列的片段。
(6)一种具有改善的活性的启动子，包含：人类疱疹病毒-6(HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列或者该序列的片段、以及启动子。
(7)根据第6项所述的具有改善的活性的启动子，所述启动子还包含：基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQID NO.2)或该序列的片段、以及MIE启动子。
(8)根据第7项所述的具有改善的活性的启动子，其中所述主要立即早期基因启动子包含：基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-382至-983的序列(SEQ ID No.4)、或者该序列的片段。
(9)一种用于增强细胞中的基因表达的构成物，包含：人类疱疹病毒-6(HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列或者该序列的片段；以及启动子。
(10)根据第9项所述的构成物，其中该构成物包含：基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQ ID NO.2)或该序列的片段、以及主要立即早期基因(MIE)启动子。
(11)根据第9项或第10项所述的构成物，其中所述细胞是T淋巴细胞系或粘细胞系(adherent line)的细胞。
(12)根据第9、10或11项所述的构成物，其中所述细胞选自由Molt-3、Jurkat、MRC-5、MeWo、SupT1、和U373组成的组。
(13)一种用于增强细胞中的基因表达的方法，包括以下步骤：
(1)生成包含第1至5项中任一项所述的启动子的增强子以及启动子的构成物，其中将基因设置成可操作地连接到序列；
(2)将所述构成物导入细胞；以及
(3)在用于表达基因的条件下培养细胞。
(14)基于6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQ ID NO.2)或者该序列的片段作为启动子的增强子的用途。
在下文中描述了本发明的优选实施方式。应当理解的是，本领域技术人员可基于本发明的描述以及在本领域众所周知且常规使用的技术来适当地执行本发明的实施例，并且应当容易地理解由本发明所获得的功能和效果。
发明的有利效果
本发明提供了选择性地诱导免疫细胞(如T淋巴细胞)中的蛋白质表达的启动子的增强子。本发明的启动子的增强子的使用，提供了用于有效地预防或治疗免疫性疾病(如先天免疫缺陷综合症)的方法及药剂。而且，本发明还提供一种用于有效地实施基因治疗的技术。
附图说明
[图1]
图1描绘了HHV-6B基因组的基因图谱。三角形代表开放阅读框区。图中示出了在IE1区附近的放大视图，其中利用PCR被放大的主要立即早期基因启动子和主要立即早期基因启动子变异体的区分别由箭头表示。上排分别代表主要立即早期基因启动子和5′-末端-缺失(5′-end-deleted)的变异体。中排分别代表通过将延伸入内含子1所获得的启动子变异体。下排分别代表通过将5′-末端431-bp-缺失(5′-end 431-bp-deleted)主要立即早期基因启动子(6MIEp-d2)从内含子1延伸至内含子4所获得的启动子变异体。箭头上的数字代表相对位置：就在+1处的IE1的转录起始点而言，负数代表上游位置而正值代表下游位置。各个内含子的位置如下：内含子1：+63至+220、内含子2：+361至+1163、内含子3：+1297至+1383、以及内含子4：+1595至+1705。
[图2]
图2描绘了从IE1的内含子1延伸至内含子4的主要立即早期基因启动子变异体的启动子活性的比较。将各主要立即早期基因启动子变异体克隆入pGL3质粒，以制备报告质粒。将报告质粒转染入各种细胞，然后在24小时后收集细胞。接着，测定细胞的萤光素酶发光，以图形形式表示所得出的相对值。将使用的培养细胞描述于各自图的上侧(从左上开始，MRC-5、MeWo和U373；从左下开始，Molt-3、Jurkat、和SupT1)。
[图3]
图3描绘了在内含子1存在或不存在下MIE启动子与5′-末端缺失的MIE启动子变异体的启动子活性比较。将巨细胞病毒启动子和各MIE启动子变异体克隆入pGL3质粒，以制备报告质粒。将报告质粒转染入各种细胞，然后在24小时后收集细胞。接着，测定细胞的萤光素酶发光，以图形形式表示所得出的相对值。将所使用的培养细胞描述于各个图的上侧(从左上开始，MRC-5、MeWo和U373；从左下开始，Molt-3、Jurkat和SupT1)。
[图4]
图4描绘了HHV-6B基因组的基因图谱。图中示出了IE区的放大视图。图中示出了MIE启动子(包含第一内含子)、U90聚腺苷酸加入序列、和U95聚腺苷酸加入序列(poly-A addition sequence)的区。圆括弧内的数字表示在HHV-6B株(strain)HST中的各自区的碱基数<示出了基因序列数据库序列号为AB021506的DNA序列中的碱基数>。
[图5]
图5描绘了包含MIE启动子的DsRed表达盒的示意图。表达盒是通过如下方式制造：将基因编码红色荧光蛋白质DsRed2连接到MIE启动子的下游侧(包含第一内含子)，并将包含U90或U100聚腺苷酸加入序列的区连接到其下游侧，接着插入pBlueScript SK(-)质粒。圆括弧内的数字表示HHV-6B株HST中的各自区的碱基数，其中各区实际上包含插入表达盒中的聚腺苷酸序列<基因序列数据库序列号为AB021506的DNA序列中的碱基数>。
具体实施方式
在下文中对本发明的优选实施方式进行描述。应该理解的是，在本发明中，除非另有说明单数形式的表达也包括其复数形式的概念。因此，应该理解的是，除非另有说明单数形式的物件(例如，英语中的“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the)”等)也包括其复数形式的概念。此外，应该理解的是，除非另有说明本发明说明书中所用术语的含义是采用该术语在本领域中的含义。因此，除非另有规定，所有术语以及本发明说明书中所用的科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解含义相同的含义。在发生矛盾的情况下，以本发明说明书(包括定义)为准。
(定义)
下面对本发明说明书中特别使用的术语的定义进行描述。
本发明说明书中所使用的“HHV”是指人类疱疹病毒，其中存在1、2、3、4、5、6、7、8型等。
除非另有说明，本发明说明书中所使用的术语“疱疹病毒”包括所有的HHV-6A、HHV-6B、和HHV-7以及它们的野生型和重组体类型。除非另有说明，本发明说明书中所使用的术语“HHV-6(人类疱疹病毒-6)”包括HHV-6A和HHV-6B以及它们的野生型和重组体类型。HHV6属于与巨细胞病毒HHV-5相同的亚属β，HHV-6B是幼儿急诊(exanthema subitum)的致病病毒。据说几乎所有日本人在年龄2周岁前都会被其感染。
本发明说明书中所使用的术语“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”、和“肽”的含义与本领域中的含义相同，并且各自是指任意长度的氨基酸的聚合物。
本发明说明书中使用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、和“核酸”的含义与本领域的含义相同，并且分别是指任意长度的核苷酸的聚合物。除非另有说明，特定的核酸序列也暗示包括其经保守修饰的变异体(例如退化密码子替换体)以及互补序列和明确指出的序列。具体地，可通过产生其中1个以上的所选(或所有的)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所取代的序列而产生退化密码子替换体(Batzer等人，Nucleic Acids Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。
在本发明说明书中的“基因”是指确定遗传特点的因子。基因通常设置在染色体上的给定序列中。确定蛋白质一级结构的基因称为结构基因。调节结构基因的表达的基因称为调节元件。在本发明说明书中，“基因”可指代“多核苷酸”、“寡核苷酸”、以及“核酸”和/或“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”。在本发明说明书中，与基因有关的“开放阅读框(reading frame)”或者“ORF”是指阅读框，该阅读框是将以3个碱基为间隔的基因的碱基序列切成段所获得的3个框中的一个，并且在不出现终止密码子的情况下具有起始密码子以及一定长度，并且具有实际上对蛋白质进行编码的可能性。疱疹病毒基因组的全部碱基序列已经被确定，并鉴定出至少101个基因。已知各基因均具有开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)。
在本发明说明书中“RNAi”是RNA干扰(interference)的缩写且是指如下现象以及利用该现象的技术：导致RNAi的因子(例如双链RNA(也称为dsRNA))被导入细胞并且与其同源的mRNA被特异性地降解从而抑制了基因产物的合成。在本发明说明书中RNAi具有与导致RNAi的因子相同的含义。
在本发明说明书中“导致RNAi的因子”是指能够导致RNAi的任何因子。在本发明说明书中“导致对基因的RNAi的因子”表示导致与基因有关的RNAi并且成功地获得RNAi的效果(例如对基因表达的抑制)的因子。这种导致RNAi的因子的实例包括但不限于：含有具有至少10个核苷酸的长度的双链部分的RNA或者其变异体，其具有与目的基因的核酸序列的部分具有至少大约70％的同源性的序列或者在严格条件下可杂交入其中的序列。这里，优选地此因子包含3′突出末端的DNA，其中更优选地3′突出末端具有2个以上核苷酸的长度(例如，长度为2至4个核苷酸的长度)。
在本发明说明书中，“相应的(corresponding)”氨基酸和核酸是指分别在给定的多肽和核酸分子中具有或者期望具有与作为比较参照的多肽和核酸分子中的预定氨基酸和核酸相类似功能的氨基酸和核酸。例如，在泛素的情况下，相应的氨基酸和核酸是指与负责连接赖氨酸的序列(例如在C-端的甘氨酸)以相似的方式产生催化活性并且存在于相似位置的氨基酸以及对该序列进行编码的核酸。例如，在核酸序列的情况下，相应的氨基酸和核酸可以是核酸序列或者具有与其所编码的特定部分相似功能的相似部分。
在本发明说明书中，“相应的”基因、启动子和内含子是指在给定物种中的基因，其具有或者期望具有与作为比较参照的物种中的预定基因相类似的功能。当存在多个具有这种功能的基因时，它是指具有相同进化起源的基因。因此，与给定基因相对应的基因可以是该给定基因的直系同源物(ortholog)。因此，与这些(如6B型疱疹病毒和肿瘤抗原)相对应的基因可以在其他生物体(例如7型疱疹病毒)中发现。可以利用本领域中众所周知的技术来鉴定这种相应的基因。因此，例如通过利用参照作为查询序列的基因序列(例如，疱疹病毒6A的主要立即早期基因启动子序列、内含子序列等)来查询动物的序列数据库(例如疱疹病毒6B)，由此可以发现给定动物中的相应的基因。作为选择，可利用湿法实验对数据库进行筛选以发现相应的基因。
在本发明中，“分离的”的物质(例如，生物因子(如核酸或蛋白质))是指一种从其他物质(优选生物因子)中基本上分离或纯化的物质，该其他物质存在于上述分离出的物质天然产生的环境中(例如在生物体的细胞中)(例如，“分离的”物质表示在核酸的情况下，除核酸和包含除感兴趣核酸的核酸序列以外的核酸序列的核酸外的因子；并且，在蛋白质的情况下，除蛋白质和包含除感兴趣蛋白质的氨基酸序列以外的氨基酸序列的蛋白质外的因子)。术语“分离的”核酸和蛋白质包括利用标准纯化技术纯化的核酸和蛋白质。因此，分离的核酸和蛋白质包括化学合成的核酸和蛋白质。
在本发明说明书中“纯化”物质(例如，生物因子(如核酸或蛋白质))是指至少一部分的天然伴存的因子已被除去的物质。因此，通常纯化物质的纯度高于正常状态物质的浓度(即，经浓缩)。
在本发明说明书中，“纯化的”和“分离的”表示相同类型的物质以优选至少75重量％、更优选至少85重量％、更优选至少95重量％、最优选至少98重量％的含量存在。
在本发明说明书中，与基因有关的“同源性”是指2个以上的基因序列之间一致性的比。因此，两个给定基因之间的同源性越大，则它们的序列之间的一致性或相似性就越大。两个基因是否具有同源性可通过直接对它们的序列进行比较或者在核酸的情况下在严格条件下实施杂交法而确定。当直接对两个基因序列进行相互比较时，如果这些基因的DNA序列相互之间具有代表性地至少50％的一致性、优选至少70％的一致性、更优选地至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的一致性，则这些基因具有同源性。
在本发明中“严格杂交条件”是指通常所采用且在本领域众所周知的条件。通过实施使用选自本发明多核苷酸的多核苷酸作为探针的菌落杂交法(colonyhybridization method)、菌斑杂交法(plaque hybridization method)、印迹杂交法(Southern blot hybridization method)等，可以获得这种多核苷酸。具体地，在严格条件被杂交的多核苷酸是指通过如下方式鉴定的多核苷酸：在0.7M至1.0M NaCl存在下于65℃使用固定有从菌落或菌斑获得的DNA过滤器实施杂交，并且于65℃用0.1至2倍浓度的SSC(生理盐水-柠檬酸钠)溶液(1倍浓度的SSC溶液是由150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠所组成)清洗过滤器。杂交可以依照实验书中所描述的方法进行，例如“分子克隆(Molecular Cloning)”(第二版)，分子生物学中的实验室指南(Current Protocols in MolecularBiology)，增刊(Supplement)1-38，DNA克隆1(DNA Cloning 1)：核心技术(Core Techniques)，实用方法(APractical Approach)，第二版，牛津大学出版社(Oxford University Press)(1995)。这里，在严格条件下杂交的序列排除，优选地，仅包含A或T的序列。“可杂交多核苷酸”是指在上述杂交条件下可以杂交入其他多核苷酸的多核苷酸。可杂交多核苷酸的具体实例包括：具有与编码多肽(该多肽具有本发明说明书中具体公开的氨基酸序列)的DNA的碱基序列至少60％的同源性的多核苷酸，优选地具有至少为80％同源性的多核苷酸、更优选地具有至少为95％同源性的多核苷酸。
在本发明说明书中，利用具有默认参数的序列分析工具BLAST实施碱基序列的一致性比较和同源性计算。例如可利用NCBI BLAST 2.2.9(于2004年5月12日出版)实施一致性检查。本发明说明书中的一致性的值通常是指利用如上所述的使用默认参数的BLAST校准所获得的值。然而，如果参数的变化导致较高值，则采用最高值作为一致性的值。当对多个区的一致性进行评估时，采用最高值作为一致性的值。
在本说明书中，“检查”表示采用电子学或生物学方法或者采用其他方法利用给定的核酸碱基序列来发现其他具有特定功能和/或性质的核酸碱基序列。电子学检查的实例包括但不限于BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990年))、FASTA(Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85：2444-2448(1988年))，Smith和Waterman法(Smith and Waterman，J.Mol.Biol.147：195-197(1981年))、以及Needleman和Wunsch法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970年))等。生物学检查的实例包括但不限于：严格杂交法、PCR法和原位杂交法，在严格杂交法中，基因组DNA吸附到尼龙膜等或者微阵列(微阵列分析)上且在微阵列中将基因组DNA吸附到玻璃板上。本说明书的意图是，用于本发明的启动子包含与利用这种电子学或生物学检查鉴定的序列相对应的序列。
在本说明书中，基因、多核苷酸、多肽等的“表达(expression)”表示基因等受到预定体内作用影响而转变成另一种形式。优选地，它表示基因、多核苷酸等被转录且被翻译入多肽。在表达的一个方面中，可将基因转录到mRNA中。更优选地，这些多肽可具有翻译后处理修饰。
在本说明书中，氨基酸可用常用三个字母缩写来表示或者用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母缩写来表示。核苷酸也可用被普遍接受的常用的1个字母缩写来表示。
在本说明书中，“片段(fragment)”是指具有相对于多肽或多核苷酸的整个长度(具有为n的长度)从1至n-1的序列长度的多肽或多核苷酸。可以根据目的适当地改变片段的长度，例如在多肽的情况下片段长度的下限包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或更多的氨基酸。由本发明中未说明的整数(例如11)所表示的长度也可适当地作为下限。例如，在多核苷酸的情况下，片段长度的下限包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、600、700、800、900、1000或更多的核苷酸。由本发明中未说明的整数(例如11)所表示的长度也可适当地作为下限。
本发明中所用的多肽在氨基酸序列中可具有至少一个(例如，一个或几个)氨基酸置换、加入和/或缺失，只要它具有与天然存在的多肽大致相同的功能。
在本说明书中，“变异体(variant)”是指一种部分地不同于原来物质的物质，例如多肽、多核苷酸等。这种变异体的实例包括：置换变异体、加入变异体、缺失变异体、截短变异体(truncated variant)、和等位基因变异体。术语“等位基因”是指与相应的基因处于相同位点的遗传变异体，其中这2个基因相互可区分。因此，术语“等位基因变异体”是指与给定基因具有等位基因关系的变异体。术语“物种同系物或者同系物”是指与给定物种中的给定基因具有氨基酸或核苷酸同源性(优选地具有至少60％、更优选至少80％、至少85％、至少90％、和至少95％的同源性)。从本发明说明书的描述中可以清楚地理解用于获得这种物种同系物的方法。术语“直系同源(ortholog)”(也称为直向同源基因)是指从相同祖先获得的不同物种(由于物种形成)中的基因。例如，在具有多基因结构的血红蛋白基因家族的情况下，人和鼠-α血红蛋白基因是直系同源，而人-α血红蛋白基因与人-β血红蛋白基因是间接同源(由基因复制所产生的基因)。直系同源可用于对分子系统树的估计。因此，本发明的直系同源可用于本发明。
在本说明书中，“功能性变异体”是指保留标准的序列所决定的生物活性(特别是启动子活性)的变异体。
在本发明的说明书中，“保守的(或者保守地修饰的(conservativelymodified)的)变异体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守修饰的变异体是指对相同或基本相同的氨基酸序列进行编码的核酸，并且是指基本相同的序列(如果核酸不编码氨基酸序列)。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸对任意给定的蛋白质进行编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均可对氨基酸丙氨酸进行编码。因此，在由密码子确定的丙氨酸的每个位置，可将密码子改变成所述相应的密码子中的任一个密码子而不会改变编码的多肽。这种核酸变异体是“沉默变更体(变异体)”，其代表经保守修饰的变异体中的一种。在核酸中，例如可以通过测定启动子活性来确定保守性取代。
在本发明的说明书中，为了制备对功能上相当的多肽进行编码的基因，除了氨基酸置换外，还可以实施氨基酸加入、缺失或修饰。氨基酸替换是指用不同的氨基酸来替换原来肽中的至少一个氨基酸，例如用不同的氨基酸替换原来肽中的1至10个氨基酸、优选1至5个氨基酸、更优选1至3个氨基酸。氨基酸加入是指将至少一个氨基酸加入到原来的肽链中，例如将1至10个氨基酸、优选1至5个氨基酸、更优选1至3个氨基酸加入到原来的肽链中。氨基酸缺失是指从原来的肽中去除至少一个氨基酸，例如从原来的肽中去除1至10个氨基酸、优选1至5个氨基酸、更优选1至3个氨基酸。氨基酸修饰的实例包括但不限于：酰胺化、羧基化、硫酸化、卤化、烷基化、糖基化、磷酸化、羟基化、和酰化(如乙酰化)。被置换或加入的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸、或者氨基酸类似物。优选天然氨基酸。
本发明说明书中所述的核酸形式表达的多肽是指允许多肽以蛋白质形式表达的核酸分子。如上所述，只要被表达的多肽具有与天然多肽大致相同的活性，这种核酸分子可以是其中部分核酸序列被删除或者被其他碱基代替或者可以是其中插入其他核酸序列的一部分的核酸分子。作为选择，可将其他核酸连接到该核酸的5′末端和/或3′末端。核酸分子可以是在严格条件下可杂交入编码多肽的基因并且对具有与该多肽大致相同功能的多肽进行编码的基因。这种基因在本领域是已知的并且可以用于本发明。
可以利用众所周知的PCR法获得这种核酸，也可以利用化学合成获得这种核酸。此方法可与例如定点突变法、杂交法等结合使用。
在本说明书中，多肽或多核苷酸的“置换、加入或缺失(deletion)”是指相对于原来的多肽或多核苷酸，氨基酸或其替代物、或者核苷酸或其替代物的置换、加入或缺失。用于这种置换、加入、或缺失的技术在本领域是众所周知的，该技术的实例包括定点突变技术。只要是一个以上，则置换、加入、或缺失的数量可任意确定。只要具有这种置换、加入或缺失的变异体可以维持预期的功能，那么该数量可以较大。例如，这种数量可以是一个或几个，优选地在全长序列的20％或10％内，或者不大于100、不大于50、不大于25等。
(启动子)
在本说明书中，“启动子(或者启动子序列)”是指决定基因转录的起始位点并且直接调节转录频率的DNA区，并且是RNA聚合酶通常结合以启动转录的碱基序列。因此，在本发明的说明书中，具有基因启动子的功能的部分指“启动子部分”。可以通过采用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区而推导出启动子区。尽管根据结构基因而变化，推导的启动子区通常位于结构基因的上游，但不局限于此，也可以位于结构基因的下游。
在本发明的说明书中，“MIE(基因)是指主要立即早期基因，该基因是利用从病毒感染后的受体或病毒粒体中获得的转录因子立即进行转录的基因。
在本发明的说明书中，“MIE启动子”或“MIEp”是指主要立即早期启动子，其是利用从病毒感染后的受体或病毒粒体中获得的转录因子立即进行转录的基因的启动子。可通过使用从经环己酰亚胺(CHX)处理的感染细胞中提取的RNA的RT-PCR法来鉴定主要立即早期基因。
在本发明的说明书中，“6MIE”(基因)是指人类疱疹病毒6(HHV-6)(特别是HHV-6B)的主要立即早期基因。在本发明的说明书中，“6MIE的IE1”是指对由HHV-6的主要立即早期基因所编码的蛋白质中的IE1蛋白质进行编码的基因。在图1中将6MIE的IE1(SEQ ID NO.41)的转录起始点示为+1。
在本发明的说明书中，“6MIE启动子”或者“6MIEp”是指人类疱疹病毒6(特别是HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的启动子。
在本发明的说明书中，启动子的识别方法如下：即，对在结构基因附近的一些序列进行筛选(例如，使用在实施例中所述的表达盒)，并且描绘出具有基因表达促进活性的序列。因此，可以确定具有显著促进活性的序列。通常，在许多情况下它位于结构基因的上游，但不局限于此。
在本发明的说明书中，“HHV-6B的主要立即早期基因启动子”是指任何具有SEQ ID NO：1中启动子活性的序列。优选地，该启动子具有从SEQ ID NO：1中的转录起始点开始的位置-770至位置-1。该序列的实例包括但不限于：SEQ IDNO：1或者与其相对应的序列。在HHV-6B基因的表达控制中，优选的是位于从上游区开始的-530至-383的区，优选地位于从转录起始点开始的-1007至-383的区，并且其碱基序列包含SEQ ID NO：5、6等中所示的序列。其中，已阐明NF-κB和AP-1基序(从作为起始的转录起始点开始的-541至-534，对应于NF-κB基序序列，并且-426至-416以及-196至-186对应于AP-1基序序列)可以是来自碱基序列置换实验的基序。因此，优选地，本发明的HHV-6B的主要立即早期基因启动子包括：(a)具有SEQ ID NO：1中所示的碱基序列，或者与其相对应的碱基序列或者其片段序列的多核苷酸；(b)SEQ ID NO：1中所示的碱基序列的等位基因变异体或者与其相对应的碱基序列或者其片段序列的多核苷酸；(c)在严格条件下使(a)和(b)中任一项的多核苷酸杂交且具有生物活性的多核苷酸；或者(d)(a)至(c)中任一项的多核苷酸或包含与(a)至(c)中任一项的多核苷酸的互补序列具有至少70％的一致性的碱基序列且具有生物活性的多核苷酸。
在本发明的说明书中，启动子的“组成性(constructive)”表达是指在生物体的任一发育阶段在生物体的任何组织中以大致预定量表达的特征。具体地，当在与本发明说明书中所述实施例中的条件相似的条件下进行北方墨点法分析(northern blot analysis)时，如果在任意时间点(例如，2个以上的时间点，例如第5天和第15天)在其相同或相应的位点上观察到大致相同的表达，则根据本发明中的定义该表达被认为是组成性的。一般认为组成性启动子在正常生长环境中的生物体的稳态中发挥作用。这些特征可以通过从生物体的任何部分中提取RNA并且对RNA进行北方墨点法分析以分析表达量或者对表达的蛋白质进行西方墨点法分析以测定蛋白质的数量而确定。
在本发明的说明书中，可使用“增强子”或者“增强子的启动子”来增强感兴趣的基因的表达效率。可以使用多个增强子或者单个增强子，或者可以不使用增强子。内含子或启动子中增强启动子的活性的区也被称为增强子，只要其具有增强基因的表达效率的活性。
在本发明的说明书中，“内含子”是存在于DNA并且包含于初级转录物中作为插入序列而提供的基因区，但是并不包含于最后的功能成熟RNA中，并且通过剪接而去除。
在本发明的说明书中，“可操作地连接”或者“操作性连接”是指期望序列的表达(操作)在转录调节序列(例如启动子或增强子)或者翻译调节序列的控制下定位。为了将启动子可操作地连接到基因，启动子通常位于该基因的上游，但是不必以位于侧面的方式定位。
(核酸构成物)
在本发明说明书中，“核酸构成物”和“基因盒”可互换地使用来指代核酸序列，包括：对基因进行编码的核酸分子(例如DNA、RNA)，和根据需要可操作地与其连接(使得它可以控制核酸的表达)的控制序列(例如启动子)，并且也指代核酸分子，包括：控制序列(例如启动子)；以及根据需要可操作地与其连接(即，在框中)的异源基因。目的是将该盒或者可选地与其他调节元件结合的构成物的使用包含于本发明中。优选的表达盒或者核酸构成物是被特定的限制酶切断的且易于回收的。
当本发明说明书中提及基因时，“载体(vector)”能够将感兴趣的多核苷酸序列转移入靶细胞。这种载体的实例包括能够在宿主细胞中自我复制或者并入染色体的载体，并且在适于本发明多核苷酸的转录的位点包含启动子，例如原核细胞、酵母细胞、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、单个的动物、和单个的植物。在本发明的说明书中，可使用例如BAC载体。BAC载体是指基于大肠杆菌(E.coli)的F质粒而产生的质粒，并且在细菌(例如大肠杆菌等)中能够繁殖且稳定地维持尺寸大约300kb以上的DNA片段。BAC载体至少包含对于BAC载体的复制必不可少的区。对复制必不可少的这种区的实例包括oriS，F质粒的复制起始点，或者其变异体。
本发明说明书中所使用的“选择性标记物”是指作为用于选择包含核酸构成物或者载体的宿主细胞的指示物的基因。该选择性标记物的实例包括但不限于荧光标记物、发光标记物和药物选择性标记物。“荧光标记物”的实例包括但不限于：编码荧光蛋白质例如绿色荧光蛋白质(GFP)、青色荧光蛋白质(CFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、和红色荧光蛋白质(dsRed)的基因。“发光标记物”的实例包括但不限于编码发光蛋白质例如萤光素酶的基因。“药物选择性标记物”的实例包括但不限于次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)、二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬氨酸氨基移转酶、金属硫蛋白(MT)、腺苷脱氨酶(ADA)、AMP脱氨酶(AMPD1，2)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、UMP合成酶、P-糖蛋白、天冬酰胺合成酶(asparagine synthase)、和鸟氨酸脱羧酶。这些药物选择性标记物与所使用药物的组合的实例包括，但并不局限于：编码蛋白质的基因，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因与甲氨蝶呤(MTX)的组合；谷氨酰胺合成酶(GS)基因与蛋氨酸磺酸盐(Msx)的组合；天冬氨酸氨基转移酶(AST)基因与N-膦乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)的组合；MT基因与镉(Cd2+)的组合；腺苷脱氨酶(ADA)基因与腺苷、丙氨菌素、2′-脱氧助间型霉素的组合；AMP脱氨酶(AMPD1，2)基因与腺嘌呤、重氮丝氨酸和助间型霉素的组合；黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因与霉酚酸的组合；UMP合成酶基因与6-氮尿苷、吡唑呋喃(pyrazofuran)的组合；P-糖蛋白(P-gp，MDR)基因与多个药物的组合；天冬氨酸合成酶(AS)基因与β-天冬氨酰基羟肟酸(β-aspartyl hydroxamic acid)或合欢氨酸；鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因与α-二氟甲基-鸟氨酸(DFMO)的组合。
本发明说明书中所使用的“表达载体”是指包含用于调节其表达的结构基因和启动子的核酸序列，此外还指允许在宿主细胞内操作的状态下的各种调节元件。调节元件可包括，优选终止子，选择性标记物例如耐药基因(例如卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因)和增强子。在本领域众所周知的是，生物体(例如动物)的表达载体的类型以及被使用的调节元件的类型可根据宿主细胞而变化。本发明说明书中所使用的“重组载体”是指能够将感兴趣的多核苷酸序列转移入靶细胞的载体。这种载体的实例包括能够在宿主细胞中自我复制或者并入染色体的载体，并且包括在适于本发明多核苷酸的转录的位点包含启动子的载体，例如原核细胞，酵母细胞、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、单个动物、和单个植物。
在本发明说明书中，“终止子”是指如下序列：其位于基因蛋白质编码区的下游，并且参与当DNA被转录到mRNA中时转录的终止以及聚腺苷酸(poly-A)序列的加入。已知终止子有助于mRNA的稳定性，并且影响基因表达的量。终止子的实例包括但不限于包含AATAAA的序列。
在本发明说明书中，“外源基因”是指在给定的生物体中不是在给定的生物体中天然产生的基因。这种外源基因可以是对给定生物体中天然的基因修饰后的基因、或者在不同于给定生物体的生物体中的天然基因(例如ADA基因)、或者人工合成的基因、或者其复合体(例如融合)。包含这种外源基因的生物体可表达在自然界不被表达的遗传产物。例如，被删除的隐性基因(例如ADA基因、PNP基因、γc链基因、TAP基因、MHC II基因、X-连锁WASP(X-linkedWASP)、CD40配体、PI3K样基因、DNA解旋酶)可用作外源基因。
在本发明说明书中，外源基因可以属于细胞因子。本发明说明书中所使用的“细胞因子”采用本领域最广泛的含义定义，指由细胞产生并作用于相同细胞或不同细胞的生理活性物质。细胞因子通常是蛋白质或多肽，并且具有对免疫应答的控制作用、对内分泌系统的调节作用、对神经系统的调节作用、抗肿瘤活性、抗病毒活性、对细胞增殖的调节作用、对细胞分化的调节作用等。在本发明说明书中，细胞因子可以蛋白质形式或核酸形式存在、或者以任何其他形式存在，并且在实际作用时间内，细胞因子通常表示为蛋白质形式。本发明说明书中所使用的“生长因子”是指促进或控制细胞生长的物质。生长因子也称为生长或发育刺激物质。通过添加到细胞培养或组织培养中的培养基中，生长因子可代替血清大分子物质的作用。已发现，许多生长因子除了作为细胞生长的控制因子外还可可作为细胞分化状态的控制因子。细胞因子通常包括白细胞介素、趋化因子、成血因子例如集落刺激因子、肿瘤坏死因子、和干扰素。生长因子的实例通常包括显示生长活性的血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、和血管内皮生长因子(VEGF)。
在本发明中，与上述天然方式的外源基因具有具有同源性的基因可用作被表达的外源基因。具有这种同源性的外源基因的实例包括但不限于，使用Blast的默认参数进行比较时核酸分子与比较性外源基因具有核酸序列的一致性或相似性为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％，或者使用Blast的默认参数进行比较时多肽分子与比较性外源基因具有氨基酸序列的一致性或相似性为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％。
在发明本说明书中，基因产物的“表达”，例如基因、多核苷酸、多肽等，表示基因等受预定的体内作用的影响而变成另一种形式。优选地，它表示基因、多核苷酸等被转录并翻译入多肽。在表达的一个方面中，基因可被转录到mRNA中。更优选地，这些多肽可具有翻译后处理修饰。
因此，在本发明说明书中，基因、多核苷酸、多肽等的“表达”的“减少”是指当本发明的因子被允许作用时，与不允许该因子发挥作用时相比较，表达量显著较小。优选地，表达的减小包括多肽表达的数量上的减少。在本发明说明书中，基因、多核苷酸、多肽等的“表达”的“增加”是指允许本发明的因子发挥作用时，与不允许该因子发挥作用时相比，表达量显著增加。优选地，表达的增加包括多肽表达的数量上的增加。在本发明说明书中，基因的“表达”的“诱导”是指通过使因子作用于细胞来使基因表达量增加。因此，表达的诱导包括当根本未观察到基因表达时基因的表达，并且当已观察到基因表达时基因的表达的增加。
在本发明说明书中，基因的“特异性表达”是指与在其他位点或时段相比植物中特定的位点或时段具有不同水平(优选较高水平)的表达。术语“特异性表达”可以是指在某个位点(特异性位点)的表达，或者也可以是指除某个位点外的表达。优选地，术语“特异性表达”是指仅在某个位点的表达。
本发明说明书中所使用的任何导入重组载体的方法(只要是导入DNA的方法)都可以被采用，其实例包括氯化钙法、电穿孔法[方法(Methods).Enzymol.，194，182(1990年)]、脂质体转染法、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1929(1978年)]、醋酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983年)]、和在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978年)中描述的方法。
用于本发明说明书中所使用的用于除去基因组、基因组位点等的Cre酶的转移表达、染色体的DNA图谱等的方法在本领域是众所周知的，正如在“由Kenichi Matsubara，Hiroshi Yoshikawa，SHUJUNSHA有限公司(东京)等监督，实验方案系列，特刊，细胞工程中的“FISH实验方案：从人类/基因组分析到染色体/遗传诊断”(FISH Experimental Protocol：from human/genomic analysis tochromosomal/genetic diagnosis″in Cell Engineering，special issue，ExperimentalProtocol Series，supervised by Kenichi Matsubara，Hiroshi Yoshikawa，SHUJUNSHA Co.，Ltd.(Tokyo)，and the like)”中所描述的。
在本发明说明书中，基因表达(例如，mRNA表达、多肽表达)的“检测”或“定量化”可利用合适的方法实现，包括mRNA测定法和免疫测定法。分子生物学测定方法的实例包括：北方墨点法、斑点印迹法、和PCR法。免疫测定法的实例包括ELISA法(其中可使用微量滴定板)、RIA法、荧光抗体法、西方墨点法(Western blotting method)、和免疫组织化学染色法(immunohistologicalstaining method)。定量方法的实例包括ELISA法、和RIA法。也可采用使用阵列(例如DNA阵列、蛋白质阵列)的基因分析方法。DNA阵列的内容综述于由SHUJUNSHA有限公司编写的细胞工程，特刊，“DNA微阵列和更新PCR法”(Cell Engineering，special issue，″DNA Microarray and Up-to-date PCRMethod″，edited by SHUJUNSHA Co.，Ltd.)中。蛋白质阵列详细描述于NatGenet.2002年12月；32增刊：526-32(Nat Genet.2002 Dec；32S uppl：526-32)中。对基因表达进行分析的方法的实例包括但不限于：RT-PCR法、RACE法、SSCP法、免疫沉淀法、双杂交系统、和除上述技术以外的体外翻译法。其他分析方法描述于例如由Yusuke Nakamura，YODOSHA有限公司(2002)等编著的Yusuke Nakamura的实验室手册中的“基因组分析实验方法”(″GenomeAnalysis Experimental Method，Yusuke Nakamura′s Lab-Manual，edited by YusukeNakamura，YODOSHA Co.，Ltd.(2002)，and the like)。所有以上描述的参考文献通过引用并入本文中。
在本发明说明书中，“表达量”是指受试者细胞中所表达的多肽或mRNA的量。这种表达量的实例包括通过使用本发明抗体的任何适当方法评估的本发明多肽的蛋白质水平的表达量(包括免疫测定法例如ELISA法、RIA法、荧光抗体法、西方墨点法、免疫组织化学染色法等)，或者通过任何适当方法评估的本发明的多肽的mRNA水平的表达量，包括分子生物学测定方法例如北方墨点法、斑点印迹法、PCR法等。术语“表达量的变化”表示采用任何合适的方法(包括上述免疫测定法或者分子生物学测定方法)评估的本发明多肽的蛋白质水平或mRNA水平的表达量的增加或减少。
除非另有说明，本发明说明书中所使用的术语“转化(transformation)”、“转导(transduction)”和“转染(transfection)”可互换使用，并且是指将核酸导入宿主细胞。作为转化方法，可以采用将DNA导入宿主细胞的任何技术，其实例包括各种众所周知的技术，例如电穿孔法、使用粒子枪(基因枪)的方法、和磷酸钙法。
术语“转化体”是指通过转化而得到的活生物体(例如细胞)的全部或者一部分。转化体的实例包括原核细胞、酵母细胞、动物细胞、植物细胞、和昆虫细胞。根据受试者，转化体可以被称为转化细胞、转化组织、转化受体等，并且在本发明的说明书中包含所有这些形式；然而，在具体上下文中具体限定了特定形式。
原核细胞的实例包括：埃希氏菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属、和假单胞菌属的细菌；包括大肠肝菌XL1-Blue、大肠肝菌XL2-Blue、大肠肝菌DH1、大肠肝菌MC1000、大肠肝菌KY3276、大肠肝菌W1485、大肠肝菌JM109、大肠肝菌HB101、大肠肝菌No.49、大肠肝菌W3110、大肠肝菌NY49、大肠肝菌BL21(DE3)、大肠肝菌BL21(DE3)pLysS、大肠肝菌HMS174(DE3)、大肠肝菌HMS174(DE3)pLysS、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、枯草杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨短杆菌(Brevibacterium ammmoniagene)、短杆菌(Brevibacterium)immariophilum ATCC 14068、解糖短杆菌ATCC 14066、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、嗜氨小杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、假单胞菌D-0110等。
动物细胞的实例包括脐带血单核细胞、外周血单核细胞、和Sup-T1细胞。
在本发明说明书中，“动物”是采用在本领域中的最广泛的含义并且是指脊椎动物和无脊椎动物。动物的实例包括但不限于：哺乳纲、鸟纲、爬行纲、两栖纲、鱼纲、昆虫纲、和蠕虫纲。
在本发明说明书中，与生物体有关的“组织”是指具有某个相似功能的细胞的聚集体。因此，组织可以是器官(体器官(body organ))的一部分。在许多情况下器官(体器官)通常含有具有相同功能的细胞，但是也可含有具有略微不同功能的共存细胞。因此，在本发明的说明书中，组织可具有各种共存方式的细胞，只要细胞共同具有某个性质。
在本发明说明书中，“体器官(器官)”是指具有单一独立形式的结构并且其中将1个以上组织组合以执行特定功能。在动物中，其实例包括但不限于：胃、肝、小肠、胰腺、肺、呼吸道、鼻、心脏、动脉、静脉、淋巴结(淋巴系统)、胸腺、卵巢、眼、耳、舌、和皮肤。
在本说明书中，“转基因”是指将特定基因并入生物体或者包含这种基因的生物体(例如植物或者动物(小鼠等))。在转基因生物体中，除去或抑制的基因的生物体指基因剔除生物体(knockout organism)。
当本发明的生物体是动物时，可以利用采用微注射法(微量注射法)、病毒载体法、ES细胞法(胚胎干细胞法)、精子载体法、染色体片段导入法(transsomic法)、附加体法等的转基因生物体生产技术来生产转基因生物体。这些转基因动物的生产技术在本领域是众所周知的。
本发明说明书中所使用的，“筛选(screening)”是指利用特定的操作/评估方法从一些候选物中选择出具有给定的感兴趣的特定性质的物质、宿主细胞、病毒等。应当理解的是，本发明也包括通过筛选获得的具有期望活性的病毒。
在本发明说明书中，“芯片”和“微芯片”可互换指代，指具有多重功能并且构成该系统的一部分的微集成电路。芯片的实例包括但不限于：DNA芯片、蛋白质芯片、和细胞芯片。
本发明的疱疹病毒启动子可以用作用于处理、预防和/或治疗淋巴或血液疾病、免疫疾病和感染疾病的药物组合物的成分。
在本发明说明书中，与药物有关的“有效量”是指使药物显示其预期疗效的量。在本发明说明书中，在这种有效量中，对应于最小浓度的有效量可称为最小有效量。这种最小有效量在本领域是众所周知的。通常，药物的最低有效量已由本领域技术人员确定或者可以适当地被确定。除了实际给药外，可以通过使用动物模型等来确定这种有效量。本发明也可用于这种有效量的确认。
在本发明说明书中，“药学上可接受的载体”是指用于制造药剂或农用化学品(例如动物药)并且对有效成分无不利影响的物质。这种药学上可接受的载体的实例包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂(filler)、膨胀剂、缓冲剂、传送载体、赋形剂、和/或农用或药物佐剂。
用于本发明治疗方法的药物的类型和用量，可以由本领域技术人员在考虑使用目的、目标疾病(类型、严重程度等)、患者的年龄、体重、性别和既往史，以及受试者给药部位的形式和类型等的情况下，并基于利用本发明方法所获得的信息(例如，与疾病有关的信息)而容易地确定。对受试者(患者)实施本发明的监测方法的频率，也可以由本领域技术人员在考虑使用目的、目标疾病(类型、严重程度)、患者的年龄、体型大小、体重和既往史，治疗的进程等的情况下而容易地确定。疾病状态的监测频率的实例包括每日1次到每几个月1次(例如，每周1次到每月1次)。优选地，检测优选的是参照治疗的进程按每周1次到每月1次的方式进行。
在本发明说明书中，“说明书(instruction)”是指用于实施给药的人(例如医生和患者)的对本发明治疗方法的描述。该说明书说明了本发明药剂的给药的，例如，在放射治疗前后不久(例如24小时内)。说明书是依照本发明所实施的国家的管理机构(例如，在日本是厚生劳动省(Ministry ofHealth，Labour andWelfare)，在美国是食品药品管理局(FDA)(Food and Drug Administration))，所规定的版式来制作，该版式明确地指示说明书经管理机构批准。说明书是所谓的“包装插入物”并且通常是以纸质媒体的形式而提供；然而，说明书并不局限于此，也可以以电子媒体的形式而提供(例如，互联网中的网站和电子邮件)。
在本发明的治疗中，当需要时可使用2种以上药剂。当使用2种以上药剂时，这些药剂可具有相似的特性或者可从相似的来源中获得，或者可具有不同性质或可从不同的来源中获得。对于施用这样2种以上药剂的方法，本发明的方法可以用于获得关于疾病程度的信息。
用于本发明的培养方法描述于例如“动物培养细胞手册(Animal CultureCell Manual)，Eeno等人编著，KYORITSU SHUPPAN有限公司，1993年”，其全部内容通过引用并入本文中。
(基因治疗)
在某些实施例中，将包含对抗体或其功能性衍生物进行编码的序列的核酸给药，以用于治疗、抑制或预防与本发明的多肽的异常表达和/或活性有关的疾病或病症的基因治疗。基因治疗是指通过给受试者施用已被表达或者能够被表达的核酸而实施的治疗。在本发明的实施例中，核酸产生被编码的蛋白质，因此蛋白质介导治疗效果。
本领域可获得的用于基因治疗的任何方法均可用于本发明。下面对示例性的方法加以描述。
参见以下针对基因治疗的方法的综述：Goldspiel等人，临床药理学(ClinicalPharmacy)12：488-505(1993年)；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991年)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993年)；Mulligan，Science260：926-932(1993年)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993年)；以及May，TIBTECH，11(5)：155-215(1993)。用于基因治疗的常用重组DNA技术，描述于Ausubel等人(编著)的《分子生物学中的实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》，John Wiley&Sons，NY(1993)；以及Kriegler编著的，《实验手册》中的“基因转移和表达”，Stockton出版社，NY(1990年)(Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990))。
(治疗活性或预防活性的证明)
优选地在体外对本发明的复合物或药物组合物进行测试，然后在用于人之前在体内对期望的治疗或预防活性进行测试。例如，用于证明复合物或药物组合物的治疗或预防效果的体外检测包括复合物对细胞系或患者组织样本的影响。该复合物或组合物对细胞系和/或组织样本的影响，可以利用本领域技术人员所了解的技术(包括但不限于细胞裂解检测)来确定。根据本发明，可以用来确定是否施用特定复合物的体外检测的实例包括体外细胞培养检测。在此检测中，使患者组织样本在培养物中生长，并且接触复合物，或者将复合物施用给患者组织样本，并且观察这种复合物对组织样本的作用。
(治疗/预防和组合物的给药)
本发明提供一种通过将有效量的成分或者包含本发明的启动子的增强子的药物组合物对受试者给药而实现治疗、抑制和预防的方法。在一个优选方面中，该成分包括基本上被纯化的(例如，包括作用被限制的状态，或者基本上没有导致不希望的不良反应的物质)启动子的增强子。优选地受试者可以是动物，包括但不限于：牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选的是哺乳动物，最优选的是人。
当把本发明的核酸分子或多肽用作药剂时，这种组合物还可包含药学上可接受的载体等。本发明药剂中所包含的药学上可接受的载体的实例包括本领域已知的任何物质。
这种合适的制剂材料或者药学上可接受的载体的实例包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、传送载体、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂。通常，本发明的药剂是以包含分离的多能干细胞或其变异体或其衍生物以及至少一种生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物的形式给药。例如，合适的媒质可以是注射溶液、生理溶液、或者人工脑脊液。可以在这种媒质中补充通常用于肠胃外给药组合物的其他物质。
用于本发明说明书的可接受的载体、赋形剂或稳定剂对受者是无毒的，并且优选在所采用剂量和浓度下是惰性的，其实例包括但不限于：磷酸、柠檬酸、或其他有机酸；抗坏血酸、(α-生育酚；低分子量多肽；蛋白质类(例如，血清白蛋白、明胶、和免疫球蛋白)；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸类(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；单糖、二糖、及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖、和糊精)；螯合剂(例如EDTA)；糖醇(例如甘露醇和山梨糖醇)；形成盐的反离子(例如钠)；和/或非离子表面活性剂(例如，吐温(Tween)、普朗罗尼(pluronic)和聚乙二醇(PEG))。
合适载体的实例包括中性缓冲生理盐水或者与血清白蛋白混合的生理盐水。优选地，将该产品配制成使用合适赋形剂(例如蔗糖)的冷冻干产物。需要时，可包括其他的标准载体、稀释剂、和赋形剂。其他示例性组合物包括pH为7.0至8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、或者pH为4.0至5.5的醋酸盐缓冲液，还可包含山梨糖醇或其合适的替代物。
本发明的药剂可口服给药或者肠胃外给药。作为选择，本发明的药剂可静脉给药或者皮下给药。当进行系统给药时，用于本发明的药剂可采用无热原的药学上可接受的水溶液的形式。这种药学上可接受的组合物的制备，可以由本领域技术人员在考虑pH值、等渗性、稳定性等的情况下容易地实施。在本发明的说明书中，给药方法可以是口服给药、以及肠胃外给药(例如，静脉给药、肌肉注射、皮下给药、皮内给药、黏膜给药、直肠内给药、阴道给药、对受影响部位的局部给药、皮肤给药)。这种给药的剂型可以是任何剂型。剂型的实例包括液体制剂、注射剂、和缓释制剂。
本发明的药剂可以如下的冻干饼或水溶液的形式制备和储存：根据需要将具有期望纯度的糖链组合物与生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂相混合(参见见日本药局方(Pharmacopoeia)第14版或者其增补版或者其最新版，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编著，Mack出版公司，1990年等)。
用于本发明治疗方法的糖链组合物的量，可以由本领域技术人员在考虑使用目的、目标疾病(类型、严重程度等)、患者的年龄、体重、性别、和既往史，细胞的形式和类型等的情况下容易地决定。受试者(患者)接受本发明治疗方法的频率，也可以由本领域技术人员在考虑使用目的、目标疾病(类型、严重程度等)、患者的年龄、体型大小、体重和既往史、治疗的进程等的情况下而容易地确定。给药频率的实例包括每日1次到每几个月1次(例如每周1次到每月1次)。优选地，优选地参照治疗的进程以每周1次到每月1次的方式给药。
(用于本发明说明书的一般技术)
用于本发明说明书的技术采用糖链科学、微流体、微加工、有机化学、生物化学、基因工程、分子生物学、微生物学、遗传学的领域、以及它们的相关领域中的众所周知且通常使用的技术，除非另有说明这些技术均是在本发明的技术范围内。该技术充分地描述于下述文件和本发明说明书的其他地方所引用的其他文件中。
微加工描述于例如Campbell，S.A.(1996年)，微电子学加工科学与工程(TheScience and Engineering of Microelectronic Fabrication)，牛津大学出版社；Zaut，P.V.(1996年)，微微阵列加工：半导体工艺、半导体服务的实用指导(Micromicroarray Fabrication：a Practical Guide to Semiconductor Processing，Semiconductor Services)；Madou，M.J.(1997年)，微加工基础(Fundamentals ofMicrofabrication)，CRC15出版社(CRC15Press)；Rai-Choudhury，P.(1997年)，显微光刻法、显微机械加工和微加工的手册：显微光刻法(Handbook ofMicrolithography，Micromachining&Microfabrication：Microlithography)等，其相关的部分通过引用的方式并入本文中。
本发明说明书中所采用的分子生物学步骤、生物化学步骤、微生物学步骤和糖链科学步骤是众所周知的并且在本领域是惯用的，这些技术描述于例如Maniatis，T.等人(1989)的《分子克隆》：实验手册，冷泉港及其第三版(2001)(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor and its 3rd Ed.(2001))；Ausubel，F.M.等人编著，分子生物学中的实验室指南(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley&Sons Inc.，NY，10158(2000年)；Innis，M.A.(1990).PCR方案：方法和应用指南，学术出版社(PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Academic Press)；Innis，M.A.等人(1995)，PCR策略，学术出版社(PCR Strategies，Academic Press)；Sninsky，J.J.等人(1999)，PCR应用：功能基因组的研究方案，学术出版社(PCR Applications：Protocols forFunctional Genomics，Academic Press)；Gait，M.J.(1985年)，寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach)，IRL出版社；Gait，M.J.(1990年)，寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis：APracticalApproach)，IRL出版社；Eckstein，F.(1991年)，寡核苷酸及类似物：实用方法(Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach)，IRL出版社；Adams，R.L.等人(1992年)，核酸的生物化学(The Biochemistry of the NucleicAcids)，Chapman&Hall；Shabarova，Z.等人(1994年)，核酸的高等有机化学(Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids)，Weinheim；Blackburn，G.M.等人(1996年)，化学和生物学中的核酸(Nucleic Acids in Chemistry and Biology)，牛津大学出版社；Hermanson，G.T.(1996年)，生物交联技术(BioconjugateTechniques)，学术出版社(Academic Press)；酶学中的方法(Method inEnzymology)230，242，247，学术出版社，1994年；特刊，实验医学“基因导入和表达分析的实验方法)”YODOSHA有限公司，1997年(Special issue，Experimental Medicine″Experimental methodfor Gene Introduction&ExpressionAnalysis)″，YODOSHA Co.，Ltd.，1997)等，以及相关的部分(或者可能是整体)以引用的方式并入本文中。
(优选实施方式的描述)
在下文中将对优选实施例加以描述；然而，这些实施例仅用于说明本发明的目的。因此，应当理解的是本发明的范围并不局限于这些优选实施例。本领域技术人员应当理解，参考以下优选实施例可在本发明的范围内容易地做出各种改变和修改。
(启动子的增强子)
在一个方面中，本发明提供一种启动子的增强子，其包含人类疱疹病毒-6(HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列、或者该内含子序列的片段。特别是，意外地发现该增强子增强了病毒启动子(例如HHV-6B MIE启动子等)的能力。
已意外地发现，与HCMV IE启动子相比，HHV-6B主要立即早期基因启动子与HHV7主要立即早期基因启动子和HHV7 U95启动子对淋巴细胞的选择性增强。当然本发明的增强子可以进一步增强这种选择性。此外，已发现在粘细胞(293细胞、Vero细胞等)中，主要立即早期基因启动子仅仅显示HCMVIE启动子活性的百分之一活性，而在淋巴细胞例如SupT1和U937中表达效率增加了几倍。这种高水平的选择性或特异性使其能够应用于DNA疫苗，特别是对于针对淋巴细胞的药剂作为基因治疗的开发。在这方面，可理解的是，本发明的增强子可以进一步增强这种效果。而且，在体内表达系统中，由于甲基化酶的作用而使活性减小，甚至在具有强力活性的巨细胞病毒启动子存在下，当然本发明的启动子的增强子可用来确保血细胞或淋巴细胞中的体内表达量。在遗传性疾病、癌症的基因治疗等中，通常使用逆转录病毒载体；然而，由于作为启动子，LTR活性不太强，所以将本发明的启动子的增强子导入被表达的基因的上游以使血细胞中的强力表达成为可能。本发明可用于针对血细胞的疾病(例如白血病)的基因治疗。此外，RNAi也用作剔除基因表达的方法，并且本发明的启动子的增强子可用作发夹型(hair-pin type)RNA表达载体的启动子的增强子，由此能够更有效地抑制血细胞中的表达。利用流式细胞术(flowcytometry)从天然的外周血中纯化巨噬细胞、树状细胞等，并且利用构造的质粒使这些细胞转染从而在控制本发明的启动子的增强子的情况下表达癌特异性抗原、肿瘤坏死因子(TNF)基因等，并且在确认癌抗原的表达后将这些细胞再次导入原来的身体，由此作为通过I类-HLA(Class I-HLA)有效激活癌抗原特异性CTL的结果而实施癌症的基因治疗。
在一个实施例中，用于本发明的启动子包含在SEQ ID NO：1中所示序列的至少8个连续核苷酸序列的长度，优选地，本发明的启动子包含在SEQ ID NO：1中所示的序列的至少R3区或者其功能性变异体。更优选地，本发明的启动子包含在SEQ ID NO：1中所示的序列的基于转录起始点的至少-574至-427的序列，更优选地，基于转录起始点的至少-1051至-427的序列。
在一个实施例中，本发明的内含子序列包含基于上述6MIE序列中所包含的IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQ ID NO.2)、或者该内含子序列的片段。已知，本发明的内含子序列具有增强子效果，本发明的内含子序列已不再是通常所谓的病毒启动子，因此这是完全出乎意料的。
在一个优选实施例中，本发明的内含子序列包含基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的-12至+262的序列(SEQ ID NO.3)。更优选地，本发明的内含子序列由基于6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的-12至+262的序列(SEQ ID NO.3)组成。应当理解，只要具有增强子效果，这种序列可具有1个以上、或者至少1个核苷酸的置换、加入和/或缺失。
在一个实施例中，本发明的作为增强子的目标的启动子包含：(a)具有SEQID NO：1中所示碱基序列、或者与其相对应的碱基序列或者其片段序列的多核苷酸；(b)SEQ ID NO：1中所示的碱基序列的等位基因变异体或者与其对应的碱基序列或者其片段序列的多核苷酸；(c)在严格条件下对(a)和(b)中的任一个多核苷酸进行杂交且具有生物活性的多核苷酸；或者(d)如(a)至(c)中任一项所述的多核苷酸，或者包含与(a)至(c)中任一项所述的多核苷酸的互补序列具有至少70％一致性的碱基序列并且具有生物活性的多核苷酸。这里，生物活性可以是启动子活性和/或增强子活性，但并不局限于此。可以利用本领域中众所周知的技术来确定启动子活性和增强子活性。这种技术也描述于本发明说明书中并且在实施例中加以说明。
在一个优选实施例中，本发明的作为增强子的目标的启动子可包括上述(a)至(d)中的置换、加入或缺失。这种置换、加入和缺失的数量可以优选地限于例如50以下、40以下、30以下、20以下、15以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、或者2以下。优选的是置换、加入和缺失的数量较小。然而，只要启动子能保持其生物活性(优选地，启动子具有与HHV-6B主要立即早期基因启动子相似的或大致相同的活性)，则较大的置换、加入和缺失的数量也是允许的。
在一个优选实施例中，与上述(a)至(d)中任一项的多核苷酸或者其互补序列的一致性可为至少约80％、更优选至少约90％、更优选至少约98％、最优选至少约99％。
在另一个优选实施例中，作为本发明目标的启动子包含：基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-382至-983的序列、或者该序列的片段。不希望受理论的约束，这是因为在该区可以发现本发明的具有显著的增强子效果的序列。而且，应当理解的是，可以发现具有这种增强子效果的区并不局限于上述区。
(启动子)
在另一个方面中，本发明提供一种具有改善的活性的启动子，其包含人类疱疹病毒-6(HHV-6)(特别是HHV-6B)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列或者该序列的片段、以及启动子。
在本发明的说明书中，本发明的“具有改善的活性的启动子”可以理解成任何具有高于单独使用启动子的活性的具有改善的活性的启动子。
在一个实施例中，应当理解，用于本发明的具有改善的活性的启动子中的人类疱疹病毒6(HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列、或者该序列的片段可以采用上面“启动子的增强子”部分中所述的任何实施例。
此外，在一个实施例中，应当理解，用于本发明的具有改善的活性的启动子的启动子，可以采用上面“启动子的增强子”部分中所述的任何实施例。
在一个优选实施例中，本发明的具有改善的活性的启动子包含6MIE序列中所包含IE1的至少-12至+1292的序列(SEQ ID NO.2)或者该序列的片段、以及主要立即早期基因启动子。不希望受到理论的约束，这是因为与常规主要立即早期基因启动子相比，这种组合的使用使启动子具有显著改善的启动子效果。
这里，优选地，用于本发明的主要立即早期基因启动子包含基于上述6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-382至-983的序列(SEQ ID No.4)、或者该序列的片段。
(基因构建)
在另一个方面中，本发明提供一种用于增强细胞中的基因表达的构成物，其包含人类疱疹病毒-6(HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列或该序列的片段、以及启动子。
在一个实施例中，应当理解，人类疱疹病毒6(HHV-6)的主要立即早期基因(MIE)的内含子序列或者该序列的片段可以采用上面的“启动子的增强子”部分中所述的任何实施例。
此外，在一个实施例中，应当理解，用于本发明的构成物的启动子也可以采用上面“启动子的增强子”部分中所述的任何实施例。
在一个优选实施例中，本发明的构成物是用于增强细胞中的基因表达的构成物，并且包括基于上述6MIE序列中所包含的IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQ ID NO.2)或者该序列的片段、以及主要立即早期基因启动子。不希望受到理论的约束，这是因为与常规主要立即早期基因启动子相比，这种组合的使用使构成物具有显著改善的启动子效果。
在一个实施例中，作为本发明构成物的目标的细胞是血细胞，特别是T淋巴细胞或者粘细胞系细胞。T淋巴细胞系的细胞的实例包括Molt-3、Jurkat和SupT1。粘细胞系细胞的实例包括：MRC-5、MeWo和U373。
在一个实施例中，本发明的核酸构成物包含对从不同于用于本发明的启动子及其增强子的源中获得的外源基因进行编码的序列，其中该序列可操作地连接到用于本发明的启动子的序列。
这种外源基因的例子包括但不限于，一个对RNAi分子进行编码的外缘基因、药剂、被删除的隐性基因、或者选择性标记物。
优选地，用于本发明的选择性标记物可以是允许对导入本发明核酸构成物的受体的培养基进行选择的标记物。例如，该选择性标记物可以是允许对导入核酸构成物的受体进行视觉选择的选择性标记物，并且其实例包括次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)和绿色荧光蛋白质(GFP)、青色荧光蛋白质(CFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、和红色荧光蛋白质(dsRed)。
优选地，有利的是本发明核酸构成物中所包含的选择性标记物对导入本发明的核酸构成物的受体基本上不显示毒性。这是因为，当本发明用于治疗或预防目的时，优选无不良反应。
包含于本发明核酸构成物中的实例包括待去除的隐性基因。这里，待去除的隐性基因是指被去除时显示疾病状态的任何隐性基因。这种隐性基因的实例包括ADA基因(其与重症联合免疫缺陷病(SCID)有关)、PNP基因(其与重症联合免疫缺陷病(SCID)有关)、γc链基因(其与重症联合免疫缺陷病(SCID)有关)、TAP基因(其与MHC I缺陷有关)、MHC II基因(其与MHC II缺陷有关)、X-连锁WASP(其与维斯科特-奥尔德里奇(Wiskott-Aldrich)综合征有关)、CD40配体(其与X性联高IgM综合征(X-linked high IgM syndrome)有关)、PI3K样基因(其与毛细血管扩张共济失调有关)、和DNA解旋酶(其与布卢姆氏综合征(Bloom′s syndrome)有关)。
在一个优选实施例中，本发明的核酸构成物中所包含的药剂可以是蛋白质药剂例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质激素、和肽激素例如IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12、G-CSF、和GM-CSF。
在另一个方面中，本发明提供一种包含本发明核酸构成物的表达载体。该表达载体包含对表达必不可少的元件，这种元件可不存在于本发明的核酸构成物中，例如除了本发明中以可操作连接方式连接的序列以外的终止子和增强子序列，从而允许在受体中的表达。在另一个优选实施例中，该选择性标记物可以是无限增殖基因(例如bcl-2)。作为选择，该选择性标记物可以是次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HPRT)、编码有毒产物的基因、根据与自杀底物结合的状态而显示活性的有毒基因产物(例如与更昔洛韦(ganciclovir)联合使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK))。
在另一个方面中，本发明提供一种包含本发明的构成物的细胞。在淋巴细胞的情况下，这种细胞促进由外源基因编码的蛋白质的表达。
优选地，有利的是本发明的细胞对于用于本发明的启动子序列是异源性的。令人惊讶的效果是即使细胞是异源性的也具有启动子活性。将本发明的核酸分子导入细胞的方法在本领域是众所周知的，并且详细描述于上述部分中。作为选择，这种细胞可通过在包含细胞的样品中对包含核酸分子的细胞进行筛选而鉴定。含有本发明的核酸分子的细胞可优选地处于未分化状态。表达本发明的核酸分子的细胞通常处于未分化状态。因此，已导入这种核酸分子从而以可控方式表达的的细胞可以控制未分化状态。作为选择，这种细胞可用于大量地生产本发明的核酸分子。这种生产方法在本领域是众所周知的并且描述于本发明说明书所述的文件中。
在另一个方面中，本发明提供一种包含本发明的构成物的组织。这种核酸序列优选地可操作地连接到控制序列。这种组织可以是动物组织，或者不同生物体(例如植物)的组织。作为选择，这种组织可用来大量地生产本发明的核酸分子。这种生产方法在本领域是众所周知的并且描述于本发明说明书所述的文件中。
在另一个方面中，本发明提供一种包含本发明构成物的器官。这种核酸序列优选地可操作地连接到控制序列。这种器官或体器官可以是动物器官或体器官、或者不同生物体(例如植物)的器官或体器官。作为选择，这种器官或体器官可用来大量地生产本发明的核酸分子。这种生产方法在本领域是众所周知的并且描述于本发明说明书所述的文件中。
在另一个方面中，本发明提供一种包含本发明的构成物的生物体。这种生物体可以是动物或者不同的生物体例如植物。作为选择，这种生物体可用来大量地生产本发明的核酸分子。这种生产方法在本领域是众所周知的并且描述于本发明说明书所述的文件中。
(增强细胞中的基因表达的方法)
在另一个方面中，本发明提供一种用于增强细胞中的基因表达的方法，其包括下列步骤：
(1)生成包含本发明的启动子的增强子和启动子的构成物，其中将基因设置成可操作地连接到序列；
(2)将所述构成物导入细胞；以及
(3)在用于表达基因的条件下培养所述细胞。
作为选择，本发明提供一种用于增强细胞中的基因表达的试剂盒，包括：
(1)构成物，其包含本发明的启动子的增强子以及启动子，其中将基因设置成可操作地连接到序列；
(2)用于将构成物导入细胞的试剂；以及
(3)在用于表达基因的条件下培养细胞的构件。应当理解，此方法中所使用的启动子的增强子、启动子、构成物、细胞等可以采用在“启动子的增强子”、“启动子”、和“构成物”部分中所述的任何形式。用于将构成物导入细胞的试剂在本领域是已知的，可以采用其中的任意方式。培养构件在本领域也是已知的，可采用其中的任意方式。
(用途)
在另一个方面中，本发明提供基于6MIE序列中所包含IE1的转录起始点的至少-12至+1292的序列(SEQ ID NO.2)或者该序列的片段作为启动子的增强子的用途。这里，应当理解，启动子的增强子可以采用“启动子的增强子”部分中所述的任何形式。
在一个方面中，这种应用形式可以是药剂。
因此，在另一个方面中，本发明提供一种包含本发明的启动子的增强子、启动子、和抗原-编码序列的药物组合物。这里，抗原可以是期望提高受体中的免疫应答的任何蛋白质。这种抗原的例子包括但不限于癌抗原。因此，优选地本发明的药物组合物可以是DNA疫苗。
在另一个方面中，本发明的启动子的增强子提供一种用于治疗需要获得淋巴细胞特异性治疗的疾病、病症或病情的药物组合物，该组合物包括本发明的启动子的增强子、启动子、和用于治疗的核酸序列。这里，该药物组合物的目标可适当地为需要获得淋巴细胞特异性治疗的疾病、病症、病情等中的任何疾病，并且其实例包括获得性免疫缺陷综合征。获得性免疫缺陷综合征的实例包括但不限于：重症联合免疫缺陷病(SCID)、MHC I缺陷、MHC II缺陷、维斯科特-奥尔德里奇综合征、X性联高IgM综合征、毛细血管扩张共济失调、和布卢姆氏综合征。不希望受到理论的约束，获得性免疫缺陷综合征是由隐性基因中的缺陷(在本文中也被称为待去除隐性基因)所引起的。可以实施体细胞基因治疗，其中该待去除基因被导入从患者中获得的骨髓细胞，然后将该细胞重新导入患者体内。在此情况下，本发明的启动子的增强子所指向的HHV-6B主要立即早期基因启动子被用来增加在分化成T细胞、巨噬细胞等的细胞中的基因表达的效率。这种基因构成物的导入，可以例如通过使用逆转录病毒(retrovirus)等进行。
在一个优选实施例中，用于本发明的用于治疗的核酸序列包括：编码细胞因子的核酸序列、编码趋化因子的核酸序列、编码生长因子的核酸序列、编码蛋白质激素的核酸序列、编码肽激素、核酶和RNAi的核酸序列。
在另一个方面中，本发明提供本发明的启动子的增强子在生产用于治疗疾病、病症或病情的药物组合物中的用途。
本发明说明书中所引用的参考文件(例如科学参考文献、专利和专利申请)的全部内容通过引用并入本发明说明书中，如同各自在本发明说明书中被具体地描述。
如上所述，为便于理解已通过揭示优选实施例描述了本发明。以下基于实施例来描述本发明，但是前面的描述和下面的实施例仅仅用于说明，而非限制本发明。因此，本发明的范围不局限于在本发明说明书中具体描述的实施方式和实施例，而仅受限于权利要求。
实施例
用于以下实施例的动物的处理按照由大阪大学所提出的规定进行。
(实施例1)
经确认，人类疱疹病毒6(HHV-6)(6MIEp)的主要立即早期基因(MIE)启动子的活性高于T细胞中的巨细胞病毒(CMV)的IE启动子(SEQ ID NO.35)的活性。在此实施例中，制备了具有HHV-6B MIE启动子的延长的3′末端的启动子，并且研究判断利用IE1的内含子是否可以获得相似的效果。
(材料及方法)
利用以下所述的各种引物将HHV-B株(strain)HST的主要立即早期基因的上游区放大(图1)。
全Fw引物：5’-TCTCTCGAGAGTTAAAGATCAGCGGGTAC-3′(SEQ IDNO.7)；
-d1Fw引物：5’-AGTCGGTACCGGCGAATGAGAACTCTAAAAGCTC-3′(SEQ ID NO.8)；
-d2Fw  引物：5′-AGTCGGTACCTACTGTGGTTGGGGTCTTTCCTAC-3′(SEQ ID NO.9)；
-d3Fw引物：5′-AGTCGGTACCACATTCCTGTTTCATGATGTGTAGC-3′(SEQ ID NO.10)；
-d4Fw  引物：5′-AGTCGGTACCTCCTGTTTTTGAGTAAGATATGAC-3′(SEQ ID NO.11)；
-d5Fw  引物：5’-AGTCGGTACCAGCTAATTTCCATTCCATATTTGTC-3′(SEQ ID NO.12)；
-d6Fw引物：5’-AGTCGGTACCTACAGCGATTGGCTCCTTCATCCTC-3′(SEQ ID NO.13)；
6MIEp Rv引物：5’-AGTCCTCGAGCACTGAACTGGCTGTAACTTCTGC-3′(SEQ ID NO.14)；
6MIEp-in 1Rv引物：5’-TCTAAGCTTCAGCAATCCAATAATTGATG-3′(SEQID NO.15)；
6MIEp-in2Rv引物：5’-CATAAGCTTGCATACGTTCCTCATTGGAT-3′(SEQID NO.16)；
6MIEp-in3Rv  引物：5’-CATAAGCTTCCAAAGTTTTGAATTCTTCA-3′(SEQ ID NO.17)；
6MIEp-in4Rv引物：5’-CATAAGCTTTTTGGATGCAAGTGCCAACG-3′(SEQ ID NO.18)。
将所得各种启动子的变异体分别插入pGL3basic从而构建报告质粒。利用所构建的报告质粒使各种培养细胞(Molt-3、MRC-5、Jurkat、MeWo、SupT1、和U373)转染，然后测定它们的萤光素酶活性。
具体地，在转染的前一天，以1×105个细胞/孔将粘细胞系细胞种植入24孔培养板，然后在5％CO2中于37℃培养一夜。在即将进行转染前，以4×105个细胞/孔将浮动细胞系细胞种植入24孔培养板。使用脂质体(Lipofectamine2000)(Invitrogen公司)，用1μg各种构建的报告质粒或者空载体及0.25μg的海肾萤光素酶表达质粒(pRL-TK)使各种培养细胞(Melt-3、MRC-5、Jurkat、MeWo、SuPT1、和U373)转染，海肾萤光素酶表达质粒(pRL-TK)用于纠正转染效率。在转染24小时后，收集细胞。利用双萤光素酶报告基因检测系统(Promega)将细胞溶解。分别测定细胞溶解产物中由萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶所产生的发光量。这里，使用多功能酶标仪LB941(Berthold)进行测定。将通过测定所获得的由萤火虫萤光素酶所产生的发光量除以由海肾萤光素酶产生的发光量以纠正转染效率。此外，将所得值除以空载体的发光量，而获得启动子活性对于空载体的相对值。
(结果)
利用萤光素酶进行报告检测的结果，任何延伸入内含子1的启动子在任何细胞中均显示活性增强。然而，作为对比，延伸到内含子2至4的启动子显示活性降低(图2)。在任何启动子缺陷突变体中也发现通过加入内含子1使启动子活性增强(图3)。
(考虑)
启动子的报告检测的结果显示内含子1的加入导致活性增加。T-细胞系显示比巨细胞病毒IE启动子更高的活性。此外，部分粘细胞系细胞(例如MeWo细胞和MRC-5细胞)显示活性增加至与巨细胞病毒IE启动子的活性相同的程度。推测这种活性的增加可用于外源基因表达。
(实施例2)
(从疱疹病毒中获得的聚腺苷酸的加入反应的检查)
将聚腺苷酸尾巴(tail)加到mRNA的3′-末端。一般认为聚腺苷酸尾巴可使mRNA稳定化并促进蛋白质表达。聚腺苷酸尾巴以在mRNA的3′区的AAUAAA的序列为目标，并通过聚腺苷酸聚合酶被加入其中。将从疱疹病毒中获得的包含聚腺苷酸加入序列的区插入对感兴趣蛋白质进行编码的基因的下游，以试图进行蛋白质表达。
(材料及方法)
利用PCR分别将以下所示的包含被认为是从HHV-6B、U90、和U100获得的聚腺苷酸加入序列的部分的区放大。将这些插入pBlueScriptSK(-)-DsRed2载体(Clontech)的DsRed2基因的下游。然后，将6MIE用作启动子来构建质粒pBleuScriptSK(-)-6MIE-DsRed2-U90pA(SEQ ID NO.39)和pBlueScriptSK(-)-6MIE-DsRed2-U100pA(SEQ ID NO.40)。
克隆的U90pA序列(HHV-6B HST基因组的134474至134679的互补链，下划线部分被认为是聚腺苷酸加入序列)如下：
5’-TTAGAAATTACATAAGCAAATGTAACTTTTTCTATTATGTAAAACCTCAGCAAACATGTGATTTCTCAAAGGAATTTATTTTCAATATCACCTTACAAATAATAAAAAGTCATACAGACATTGCTTTCTCTTTTTAATTCCAAGTCATGTACATAAACTGACTTATAAGTCATCATACAATATTTCCATAAGTTAATTCCAGCTTT-3’(SEQ ID NO.37)
克隆的100pA序列(HHV-6B HST基因组的148150至148301的互补链，下划线部分被认为是聚腺苷酸加入序列)如下：
5’-CCCTCAGACCCTACGTTGCCCTCACCTTATGGCAACGGACATTATTAAAATAAAAAAATTACTGAAAGAGAGTCAGAAATTGTGTCACATGTTATTTTATTAAATCTTACTGAACTTTGTCCTTTGTCCTTACAAACCTTCCCTATCACAATAC-3’(SEQ ID NO.38)
利用所得质粒使各种培养细胞(293T、MeWo、MRC5、和HeLa)转染，然后在荧光显微镜下确认DeRed的表达。
具体地，在转染的前一天，以2×105细胞/孔将各种培养细胞(293T、MeWo、MRC5、和HeLa)种植入6孔培养板中，然后在5％CO2中于37℃培养一夜。使用脂质体(Lipofectamine 2000)(Invitrogen)将已插入上述表达盒的1μgpBlueScript质粒进行转染。在5％CO2中于37℃培养一夜后，利用荧光显微镜确认DsRed表达。
(实施例3：特异性缺失系统的构建)
利用IE启动子以及RNAi法连同本发明的启动子的增强子来实施血细胞中的基因表达的剔除。由于IE启动子在血细胞中被大量地表达，因此IE启动子对分析是有利的。
(1)细胞的制备(在巨噬细胞的情况下)
收集健康人的外周血，利用使用聚蔗糖/泛影葡胺(Ficoll/Hypaque)的密度梯度法对其进行分离和纯化。将PBMC在补充了M-CSF(R&D系统(R&Dsystems)公司，100U/ml)的AIM V血清培养基(生命科技(Life Technologie)s公司)中进行培养。每3天更换一次培养基，将培养后的第6或第7天的巨噬细胞用于实验。
(2)siRNA表达逆转录病毒载体的生产
为了表达发夹型RNA，生产包含“义链靶序列(sense strand targetsequence)”、“环序列”、“反义链靶序列(antisense strand target sequence)”和“终止子序列”的合成寡聚DNA(oligo-DNA)。这种义链靶序列、环序列、反义链靶序列、终止子序列可利用本领域众所周知的技术而制作。本领域技术人员可以理解，实际使用这些序列时，可根据实际情况使用合适的序列。
通过使用限制酶序列等，将上述DNA并入寡聚DNA连接到IE序列的下游的质粒载体，对于逆转录病毒的复制必不可少的gag、pol、和env被去除，并且包括NeoR基因。将所制作质粒载体(10μl)加入到100μl的感受态细胞中，并且进行转化，并且在置于LBAmp培养板后将得到的产物于37℃培养16小时。通过在LBApm液体培养基中于37℃下培养16小时而获得经转化的菌落，并且利用常规方法从该培养溶液中提取并纯化质粒。
将表达gag、pol和env的逆转录病毒包装细胞置于直径为10厘米的碟上，并且打开转染试剂来转染质粒(10μg)。在24至48小时后，将细胞系列稀释入含有G418的培养基(500μg/ml)中并进行传代。
每3至4天，更换G418培养基并且总共培养约2周。当发现在6孔培养板中的生长达到融合程度的时间回收菌落，将培养基换成无G418的培养基，并且在24小时后回收上清液。随后，将细胞贮存。
对上清液中包含的逆转录病毒载体进行系列稀释，并感染入NIH/3T3细胞，对生长的菌落计数以计算感染值。
(3)使用逆转录病毒载体的基因导入实验
用血细胞(例如1中制备的巨噬细胞)感染逆转录病毒载体。在清洗后立即将细胞加入平板使得平板中为0.5至2.5×104细胞/cm2。在感染后24小时，用含G418的培养基更换培养基，并且每3到4天更换一次培养基。在大约2周后，获得导入基因的细胞。该细胞用于确定剔除感兴趣基因的表达量
通过进行这些实验来实际地确认在基因导入后外源基因的淋巴细胞特异性表达被用于本发明的启动子所剔除。
(实施例4：特异性表达)
代替实施例3的RNAi，而将对(例如细胞因子，如TGFβ)期望表达的基因进行编码的核酸分子导入。
结果，通过实施与实施例3相同的实验，在基因导入后，经确认本发明的启动子的增强子实际上以增强启动子活性的方式诱导外源基因的特异性表达。
如上所述，已利用本发明的优选实施例对本发明进行了举例说明；然而，应当理解，本发明的范围应当仅由权利要求来限定。当然，本发明说明书中所引用的专利、专利申请和引用的参考文献应当以引用的方式并入本发明说明书中，如同其内容具体描述于本发明说明书中。
工业实用性
本发明提供了一种病毒启动子的增强子。本发明的启动子的增强子可用于有效预防或治疗免疫疾病(例如获得性免疫缺陷综合征)的方法和药剂。本发明也可用于有效实施基因治疗的技术。
序列表的描述
SEQ ID NO.1是HHV-6B MIE启动子的序列。
SEQ ID NO.2是基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-12至+1292的序列。
SEQ ID NO.3是基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-12至+262的序列。
SEQ ID NO.4是基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-382至-983的序列。
SEQ ID NO.5是基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-530至+383的序列。
SEQ ID NO.6是基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-1007至+383的序列。
SEQ ID NO.7是用于实施例1的全Fw引物的序列。
SEQ ID NO.8是用于实施例1的-d1Fw引物的序列。
SEQ ID NO.9是用于实施例1的-d2Fw引物的序列。
SEQ ID NO.10是用于实施例1的-d3Fw引物的序列。
SEQ ID NO.11是用于实施例1的-d4Fw引物的序列。
SEQ ID NO.12是用于实施例1的-d5Fw引物的序列。
SEQ ID NO.13是用于实施例1的-d6Fw引物的序列。
SEQ ID NO.14是用于实施例1的6MIEp Rv引物的序列。
SEQ ID NO.15是用于实施例1的6MIEp-in1Rv引物的序列。
SEQ ID NO.16是用于实施例1的6MIEp-in2Rv引物的序列。
SEQ ID NO.17是用于实施例1的6MIEp-in3Rv引物的序列。
SEQ ID NO.18是用于实施例1的6MIEp-in4Rv引物的序列。
SEQ ID NO.19是用于实施例1的6MIEp(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-983；971bp)的序列。
SEQ ID NO.20是用于实施例1的6MIEp-d1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-732；720bp)的序列。
SEQ ID NO.21是用于实施例1的6MIEp-d2(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-552；540bp)的序列。
SEQ ID NO.22是用于实施例1的6MIEp-d3(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-381；369bp)的序列。
SEQ ID NO.23是用于实施例1的6MIEp-d4(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-214；202bp)的序列。
SEQ ID NO.24是用于实施例1的6MIEp-d5(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-165；153bp)的序列。
SEQ ID NO.25是用于实施例1的6MIEp-d6(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的-13至-102；90bp)的序列。
SEQ ID NO.26是用于实施例1的6MIEp-in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-983；1245bp)的序列。
SEQ ID NO.27是用于实施例1的6MIEp-d1in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-732；994bp)的序列。
SEQ ID NO.28是用于实施例1的6MIEp-d2in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-552；814bp)的序列。
SEQ ID NO.29是用于实施例1的6MIEp-d3in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-381；643bp)的序列。
SEQ ID NO.30是用于实施例1的6MIEp-d4in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-214；476bp)的序列。
SEQ ID NO.31是用于实施例1的6MIEp-d5in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-165；427bp)的序列。
SEQ ID NO.32是用于实施例1的6MIEp-d6in1(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+262至-102；364bp)的序列。
SEQ ID NO.33是用于实施例1的6MIEp-d2in2(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+1292至-552；1844bp)的序列。
SEQ ID NO.34是用于实施例1的6MIEp-d2in3(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+1592至-552；2144bp)的序列。
SEQ ID NO.35是用于实施例1的6MIEp-d2in4(基于HHV-6B的MIE中所包含IE1的转录起始点的+1732至-552；2284bp)的序列。
SEQ ID NO.36是用于实施例1的巨细胞病毒IE启动子的序列。
SEQ ID NO.37是在实施例2中克隆的U90pA序列的序列。
SEQ ID NO.38是在实施例2中克隆的U100pA序列的序列。
SEQ ID NO.39是在实施例2中构建的的质粒pBleuScriptSK(-)-6MIE-DsRed2-U90pA的序列。
SEQ ID NO.40是在实施例2中构建的的质粒pBleuScriptSK(-)-6MIE-DsRed2-U 100pA的序列。
SEQ ID NO.41是HHV-6的IE1的序列。

Claims (10)

1.一种用于增强细胞中基因表达的启动子的增强子，其特征在于，由人类疱疹病毒-6的主要立即早期基因的内含子序列组成；
其中，所述内含子序列是SEQ ID No.3的序列；且
其中，所述细胞是T淋巴细胞系或者粘细胞系的细胞。
2.一种具有改善的活性的用于增强细胞中基因表达的启动子，其特征在于，由人类疱疹病毒-6的主要立即早期基因的如SEQ ID No.3所示的内含子序列，以及启动子组成；
其中，所述启动子包括SEQ ID No.21的序列；
其中，所述启动子的序列具有由SEQ ID No.21所示的最小长度和由SEQ IDNo.19所示的最大长度；且
其中，所述细胞是T淋巴细胞系或者粘细胞系的细胞。
3.根据权利要求2所述的具有改善的活性的用于增强细胞中基因表达的启动子，其中，所述启动子是选自由SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所组成的组中的序列。
4.一种用于增强细胞中的基因表达的构成物，其特征在于，由人类疱疹病毒-6的主要立即早期基因的内含子序列以及启动子组成；
其中，所述内含子序列是SEQ ID No.3的序列；
其中，所述细胞是T淋巴细胞系或者粘细胞系的细胞；
其中，所述启动子包括SEQ ID No.21的序列；且
其中，所述启动子的序列具有由SEQ ID No.21所示的最小长度和由SEQ IDNo.19所示的最大长度。
5.根据权利要求4所述的用于增强细胞中的基因表达的构成物，其中，所述启动子是选自由SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所组成的组中的序列。
6.根据权利要求4所述的用于增强细胞中的基因表达的构成物，其特征在于，所述细胞选自由Molt-3、Jurkat、MRC-5、MeWo、U373和SupT1组成的组。
7.一种用于增强细胞中的基因表达的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)生成构成物，所述构成物由如权利要求1中所述的启动子的增强子以及启动子组成，其中将所述基因设置为可操作地连接到所述构成物上；
(2)将连接有所述基因的所述构成物导入细胞；以及
(3)在用于表达基因的条件下培养所述细胞，
其中，所述细胞是T淋巴细胞系或者粘细胞系的细胞；
其中，所述启动子包括SEQ ID No.21的序列；且
其中，所述启动子的序列具有由SEQ ID No.21所示的最小长度和由SEQ IDNo.19所示的最大长度。
8.根据权利要求7所述的用于增强细胞中的基因表达的方法，其中，所述启动子是选自由SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所组成的组中的序列。
9.SEQ ID NO.3的序列作为用于增强细胞中基因表达的启动子的增强子的用途；
其中，所述细胞是T淋巴细胞系或者粘细胞系的细胞；且
其中，所述启动子包括SEQ ID No.21的序列；且
其中，所述启动子的序列具有由SEQ ID No.21所示的最小长度和由SEQ IDNo.19所示的最大长度。
10.根据权利要求9所述的SEQ ID NO.3的序列作为用于增强细胞中基因表达的启动子的增强子的用途，其中，所述启动子是选自由SEQ ID No.19、SEQID No.20和SEQ ID No.21所组成的组中的序列。
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