PL202082B1 - Zastosowanie antagonisty integryny - Google Patents
Zastosowanie antagonisty integrynyInfo
- Publication number
- PL202082B1 PL202082B1 PL359602A PL35960200A PL202082B1 PL 202082 B1 PL202082 B1 PL 202082B1 PL 359602 A PL359602 A PL 359602A PL 35960200 A PL35960200 A PL 35960200A PL 202082 B1 PL202082 B1 PL 202082B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antagonist
- use according
- brain
- tumor
- integrin
- Prior art date
Links
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 67
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 27
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 229940123038 Integrin antagonist Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims abstract description 18
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 112
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 78
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 78
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 66
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 66
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 37
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 28
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 claims description 17
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 17
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 14
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 11
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 claims description 10
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 10
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 claims description 8
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 6
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 5
- 229940083963 Peptide antagonist Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 claims description 2
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 claims description 2
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 claims description 2
- 239000000951 adrenergic alpha-1 receptor antagonist Substances 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 24
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 109
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 29
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 20
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 8
- 210000004781 brain capillary Anatomy 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 101100440985 Danio rerio crad gene Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 6
- 101100440987 Mus musculus Cracd gene Proteins 0.000 description 6
- 101100467905 Mus musculus Rdh16 gene Proteins 0.000 description 6
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 4
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 4
- 102000012936 Angiostatins Human genes 0.000 description 3
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 3
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 3
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- AMLYAMJWYAIXIA-VWNVYAMZSA-N cilengitide Chemical compound N1C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H]1CC1=CC=CC=C1 AMLYAMJWYAIXIA-VWNVYAMZSA-N 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 2
- 206010048832 Colon adenoma Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MSHZHSPISPJWHW-UHFFFAOYSA-N O-(chloroacetylcarbamoyl)fumagillol Chemical compound O1C(CC=C(C)C)C1(C)C1C(OC)C(OC(=O)NC(=O)CCl)CCC21CO2 MSHZHSPISPJWHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 2
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229950009003 cilengitide Drugs 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- CTCHDPAJHVDPRN-UHFFFAOYSA-N integrin Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2CC=C(C)C)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C=C1O CTCHDPAJHVDPRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010006143 Brain stem glioma Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 101000803709 Homo sapiens Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000004462 Leydig Cell Tumor Diseases 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009277 Neuroectodermal Tumors Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101000781681 Protobothrops flavoviridis Disintegrin triflavin Proteins 0.000 description 1
- 101100496572 Rattus norvegicus C6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004782 brain capillary endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000004528 endothelial cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- -1 olive oil Chemical compound 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
Obecny wynalazek dotyczy zastosowania antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu nowotworu w mózgu, adhezji komórkowej zale znej od macie- rzy zewn atrzkomórkowej, zale znej od witronektyny migracji komórkowej komórek nowotworu mózgu oraz do indukowania apoptozy komórek nowotworu rozwijaj acego si e w mózgu gospodarza. Kompo- zycje farmaceutyczne wytworzone zgodnie z zastosowaniami wed lug wynalazku s a odpowiednie do zastosowania in vivo w leczeniu nowotworów mózgu. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie antagonisty integryny. Rozwiązania według wynalazku dostarczają środków do hamowania wzrostu guza, a w szczególności do hamowania wzrostu guza mózgu.
W niniejszym zgł oszeniu odniesienia literaturowe został y wskazane w nawiasach. Tym samym ujawnienia zawarte w tych publikacjach są włączone na drodze odniesienia w niniejszym zgłoszeniu, aby pełniej opisać stan techniki, do którego odnosi się wynalazek. Pełne dane bibliograficzne tych odnośników można znaleźć na końcu opisu, przed zastrzeżeniami.
Nowotwory mózgu, podobnie jak inne guzy lite, wymagają nieustannie rosnącej dostawy krwi dla podtrzymania ciągłego wzrostu w zakresie 1-2 mm3 (1,2). Procesem umożliwiającym taką dostawę krwi jest angiogeneza, która następuje w wyniku uwalniania przez komórki nowotworowe czynników wzrostu śródbłonka. Angiogeneza wymaga pobudzenia proliferacji komórek śródbłonka ze spoczynkowych naczyń włosowatych, migracji komórek neoendotelialnych do podstawy guza i ostatecznie dojrzewania ich w postaci nowej siatki naczyń włosowatych (3). Nowotwory mózgu są nowotworami, które najsilniej wywołują angiogenezę spośród wszystkich ludzkich nowotworów. Obecność głównych czynników angiogenicznych wykazano zarówno przez hybrydyzację in situ, jak i przy pomocy specyficznych przeciwciał w skrawkach tkanki pacjentów z glejakiem lub rdzeniakiem, najpowszechniejszymi złośliwymi nowotworami mózgu, a są nimi czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (4-7). W rzeczywistości ekspresja VEGF i gęstość mikronaczyń w nowotworach gleju bezpośrednio koreluje ze złośliwością i ich ogólnymi właściwościami (8-9).
Współczesne dane sugerują, że angiogeneza jest regulowana przez aktywację integryn komórek śródbłonka, rodziny transbłonowych receptorów, które kierują adhezję komórki na białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) przez wiązanie z sekwencją aminokwasową Arg-Gly-Asp (RGD) (10).
W odpowiedzi na bFGF i VEGF komórki śródbłonka zwiększają ekspresję integryn ανβ3 i ανβ5 odpowiednio (11-13). Stwierdzono, że glejaki i związany z nimi śródbłonek naczyń wyraża integryny ανβ3 i ave5 (14, 15). Zależna od integryny adhezja powoduje rozprzestrzenianie się wewnątrzkomórkowych sygnałów powodujących przeżywanie komórki, proliferację, ruchliwość i rozrost włosowaty (16, 17). Niezwiązanie ligandu przez te integryny powoduje apoptozę komórki śródbłonka (18, 19). Glikoproteina macierzy, witronektyna, służy jako ligand dla ave3 i ave5 i jest wytwarzana przez złośliwe glejaki na rozrastającym się końcu (15, 20). Łącznie ujawnienia te sugerują złożone, parakrynne oddziaływania pomiędzy komórkami guza, mózgową ECM i integrynami komórek nabłonka dla zapewnienia ciągłej angiogenezy i wzrostu złośliwych guzów mózgu.
Badania z zastosowaniem przeciwciała przeciw ave3, LM-609, lub cyklicznego peptydu RGD będącego antagonistą ave3 i ave5, który zapobiega oddziaływaniu integryna-ECM, ujawniły odpowiedź przeciw angiogenezie występującą w błonie omoczniowo-kosmówkowej kurczaka (CAM) i w modelu mysiej chimery (21-23). W hamowaniu angiogenezy skuteczne są również inne czynniki działające w alternatywnych miejscach szlaku angiogenezy, takie jak przeciwciała przeciw VEGF lub jego odpowiadającemu receptorowi kinazy tyrozynowej (24, 25).
Wcześniejsze badania pokazały, że przyłączenie komórek raka sutka, czerniaka i komórek HT29-D4 gruczoloraka okrężnicy do witronektyny zależy od odpowiednio av, ave3 i ave5 (51-53). Witronektyna, która jest wytwarzana przez guz i komórki śródbłonka jest rozpoznawana przez ave3 i ave5 i jest białkiem ECM obecnym w miejscach inwazji nowotworu i wytwarzania nowych naczyń krwionośnych (54-55). Tak więc oprócz podtrzymywania przeżycia komórki śródbłonka przez ligację av i co za tym idzie angiogenezę, ekspresja witronektyny może dodatkowo zwiększać adhezję guza i komórek śródbłonka wyrażających integryny ave3 i ave5, a tym samym powodując ich inwazję. W pewnym badaniu wykorzystującym chimerowy model mysz SCID/człowiek dla raka sutka rozprzestrzenianie się nowotworu było znacząco ograniczone po podaniu przeciwciała LM-609 anty-ave3, co sugeruje bezpośredni wpływ na biologię komórki nowotworowej przez blokowanie ave3 (56).
Nowotwory mózgu z uwagi na ich wysoce inwazyjny charakter i stopień angiogenezy stanowią doskonały model dla dalszych badań nad doniosłością integryn dla rozwoju guza. Wielokrotne badania pokazują, że gęstość mikronaczyń koreluje z wynikiem i stopniem złośliwości gwiaździaków (57-59). Inhibitory angiogenezy takie jak TNP-470, trombospondyna-1 i czynnik płytkowy 4 wprowadzone do eksperymentów nad guzami mózgu wykazywały hamowanie wzrostu guza (60-62). Jednakże do chwili obecnej nie były prowadzone żadne badania nad wpływem antagonizmu integryn na inPL 202 082 B1 wazyjność nowotworu mózgu i angiogenezę. Zatem istnieje potrzeba badania tego efektu, a tym samym wprowadzenia nowego sposobu leczenia nowotworów mózgu.
Podsumowanie wynalazku.
Rozwiązania według wynalazku oparto na zaskakującym ujawnieniu, że docelowy antagonizm integryn, szczególnie ανβ3 i ανβ5, może zasadniczo hamować in vivo rozwój nowotworu mózgu. Wynalazek oparto również na stwierdzeniu, że mikrośrodowisko nowotworu mózgu jest istotne dla zachowania się nowotworu i dla określenia jego wrażliwości na takie leczenie, które jest biologicznie adresowane. Ponadto rozwiązania według wynalazku oparto na ujawnieniu, że antagonizm integryny może mieć działanie przeciwnowotworowe niezależnie od działania przeciwko angiogenezie, które to działania mogą hamować wzrost guza synergicznie. Przykładowo, antagonizm integryny może bezpośrednio wywoływać śmierć komórki nowotworu mózgu.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu nowotworu w mózgu gospodarza. Korzystnie, integryna w zastosowaniu według wynalazku jest integryną av, ave3 lub ave5. Również korzystnie antagonistą w zastosowaniu według wynalazku jest antagonista wybrany z grupy obejmującej polipeptydowego antagonistę av, przeciwciała przeciwko ave3, przeciwciała przeciwko ave5 i kombinację przeciwciał odpowiednio przeciwko ave3 i ave5. Ponadto korzystnie antagonista w zastosowaniu według wynalazku jest polipeptydowym antagonistą av, który korzystniej jest polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD), a najkorzystniej cyklicznym pentapeptydem RGD.
Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku antagonistą jest przeciwciało monoklonalne immunospecyficzne wobec ave3, a korzystniej przeciwciało monoklonalne wykazujące reaktywność immunologiczną przeciwciała monoklonalnego oznaczonego LM-609. Ponadto w zastosowaniu według wynalazku kombinacja przeciwciał, odpowiednio przeciwko ave3 i ave5, jest korzystnie kombinacją przeciwciała monoklonalnego specyficznego immunologicznie wobec ave3 i przeciwciała monoklonalnego specyficznego immunologicznie wobec ave5, a korzystniej przeciwciało monoklonalne, specyficzne immunologicznie wobec ave3 ma reaktywność immunologiczną przeciwciała monoklonalnego oznaczonego LM-609, a przeciwciało monoklonalne specyficzne immunologicznie względem ave5 ma reaktywność immunologiczną przeciwciała monoklonalnego oznaczonego P1-F6.
Nowotwór mózgu do hamowania wzrostu którego jest przeznaczona kompozycja farmaceutyczna wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest zlokalizowany wewnątrzmózgowo. Również korzystnie nowotwór taki jest wybrany z grupy obejmującej glejaka, rdzeniaka, gwiaździaka, pierwotnego raka neuroektodermy i będące glejakami nowotwory pnia mózgu.
Kompozycja farmaceutyczna wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest korzystnie przeznaczona do podawania dootrzewnowo, podskórnie, dożylnie, przezskórnie, wewnątrzmaziówkowo, domięśniowo lub doustnie, a także korzystnie obejmuje farmaceutyczny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania angiogenezy w tkance guza umiejscowionej w mózgu gospodarza. Korzystnie, integryna w zastosowaniu według wynalazku jest integryna av, ave3 lub ave5. Również korzystnie antagonistą w zastosowaniu według wynalazku jest antagonista wybrany z grupy obejmującej po li peptyd owego antagonistę av, przeciwciała przeciwko ave3, przeciwciała przeciwko ave5 i kombinację przeciwciał odpowiednio przeciwko ave3 i ave5.
Wynalazek dotyczy także zastosowania antagonisty integryn ave3 i ave5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) adhezji komórkowej komórek nowotworu mózgu rozwijającego się w mózgu gospodarza. Korzystnie antagonistą w zastosowaniu według wynalazku jest antagonista av lub kombinacja przeciwciał odpowiednio przeciwko ave3 i ave5. Korzystniej antagonista av jest polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD), a najkorzystniej cyklicznym pentapeptydem RGD. Ponadto korzystnie ECM w zastosowaniu według wynalazku stanowi witronektyna lub tenascyna.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie antagonisty ave3 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania zależnej od witronektyny migracji komórkowej komórek nowotworu mózgu rozwijającego się w mózgu gospodarza. Korzystnie antagonistą w zastosowaniu według wynalazku jest antagonista av lub przeciwciało przeciwko ave3.
Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania apoptozy komórek nowotworu rozwijającego się w mózgu gospodarza. Korzystnie integryna w zastosowaniu według wynalazku jest integryną av, ave3 i ave5. Również korzystnie antagonistą w zastosowaniu według wynalazku jest polipeptydowy antagonista av będący
PL 202 082 B1 korzystniej polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD), a najkorzystniej cyklicznym pentapeptydowym RGD antagonistą av integryn ανβ3 i ανβ5.
Kompozycje farmaceutyczne wytworzone zgodnie z zastosowaniami według wynalazku są odpowiednie do zastosowania in vivo w leczeniu nowotworów mózgu. Niniejszym opisane zostały również nowe sposoby leczenia nowotworów mózgu.
Opis figur
Rozwiązania według wynalazku staną się bardziej zrozumiałe przez odniesienie do poniższego opisu w połączeniu z odpowiadającymi mu rysunkami. Rysunki te przedstawiają jedynie typowe postacie wykonania wynalazku i nie ograniczają jego zakresu.
Fig. 1a i 1b przedstawiają hamowanie angiogenezy (a) i wzrostu guza na CAM (b) przez antagonistę av.
Fig. 2 przedstawia wielkość guza (A) i przeżywalność myszy (B) po domózgowym wstrzyknięciu komórek DAOY i U87MG.
Fig. 3a i 3b przedstawiają histopatologię ortotopowo wstrzykniętych komórek nowotworu mózgu DAOY (a) i U87MG (b) poddanych codziennie działaniu nieaktywnego (A) lub aktywnego peptydu (B-D). U zwierząt kontrolnych (A) są widoczne duże nowotwory wewnątrzmózgowe (groty strzałek), podczas gdy nie są wykrywane nowotwory (B) lub są wykrywane jedynie mikroskopowe pozostałości nowotworów (groty strzałek) u zwierząt poddanych działaniu antagonisty av (C i D).
Fig. 4 przedstawia przeżywalność myszy po ortotopowym wszczepieniu nowotworu mózgu, otrzymywujących zarówno aktywny jak i nieaktywny peptyd.
Fig. 5 przedstawia działanie antagonisty av na ortotopowo (mózg) i heterotopowo (podskórnie) wszczepione komórki DAOY.
Fig. 6a-6d przedstawiają profil integryny (a) i wpływ antagonisty av na adhezję do witronektyny (b), migrację na witronektynie (c) i żywotność komórki na witronektynie (d) dla komórek nowotworu mózgu i śródbłonka naczyń włosowatych w mózgu.
Fig. 7 przedstawia wpływ cyklicznego pentapeptydu na adhezję komórki nowotworowej do białek ECM.
Fig. 8 przedstawia skutek hamowania adhezji prowadzący do śmierci komórki (apoptoza) zarówno w przypadku komórek nowotworu mózgu i komórek naczyń włosowatych mózgu. Efekt ten jest ograniczony do witronektyny i tenascyny ECM.
Fig. 9 przedstawia analizę immunohistochemiczną ksenogenicznego przeszczepu nowotworu mózgu U87 do przodomózgowia nagiej myszy i leczenia peptydem aktywnym (anty-av) lub kontrolnym.
Szczegółowy opis wynalazku.
Jeden aspekt niniejszego wynalazku dostarcza zastosowania antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu guza w mózgu gospodarza. Kompozycja wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, gdy jest podawana gospodarzowi dostarcza leczniczo skutecznej ilości antagonisty integryny.
Kompozycja farmaceutyczna wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być użyta do leczenia jakichkolwiek guzów, które rosną w mózgu, tak długo, jak długo wzrost guzów wymaga oddziaływania integryny z ligandem. Przykłady takiego guza obejmują, lecz nie są ograniczone do glejaka, rdzeniaka (gwiaździaka, innych pierwotnych nowotworów neuroektodermy i glejaka pnia mózgu). Dla celów obecnego wynalazku, korzystnie wzrost nowotworu jest zlokalizowany w mózgu gospodarza wewnątrzmózgowo. Gospodarz może być jakimkolwiek ssakiem, łącznie z, lecz nie jedynie, szczurem i człowiekiem. Wzrost guza jest zahamowany jeśli wzrost jest osłabiony przez leczenie.
Dla celów obecnego wynalazku integryna jest jakimkolwiek przedstawicielem specyficznej rodziny homologicznych transbłonowych receptorów, będących heterodimerami. Receptory kierują adhezją komórki, przez wiązanie sekwencji aminokwasowej Arg-Gly-Asp (RGD). Receptory mogą być prezentowane zarówno na komórkach prawidłowych, jak również nowotworowych. Właściwości integryn są dobrze znane i dobrze scharakteryzowane w dziedzinie, oraz zostały w szczegółach opisane w cytowanych pracach (1,2), których zawartość jest włączona tu przez odniesienie. Przykłady integryn obejmują, lecz nie są ograniczone do rodziny av, na przykład ave3, ave5, ave1, ave6 ave8 i im podobne.
Antagonistą integryny jest cząsteczka, która blokuje lub hamuje fizjologiczną lub farmakologiczną aktywność integryny, przez hamowanie aktywności wiążącej integryny - receptora, z jego ligandem - różnymi białkami macierzy obejmującymi nieograniczająco witronektynę, tenascynę, fibronektynę i kolagen I. Antagonista integryny może być antagonistą integryny ave3 lub ave5. Korzystnie
PL 202 082 B1 antagoniści integryny mogą być zarówno przeciwciałem, fragmentem przeciwciała monoklonalnego lub peptydem.
Przykładem antagonisty ανβ3 może być jakikolwiek czynnik, który hamuje wiązanie ανβ3 z jednym z wielu jego ligandów, konkretnie witronektyną lub tenascyną. Przykłady antagonistów ave3 są opisane w publikacjach PCT WO 96/37492 i WO 97/45137, których cała zawartość jest włączona niniejszym na drodze odniesienia.
Podobnie antagonistą ave5 może być czynnik, który hamuje wiązanie ave5 z jego ligandem, konkretnie witronektyna. Przykłady antagonistów ave3 są opisane w publikacji PCT WO 97/06791, która w całości jest włączona jako odnośnik literaturowy.
W jednej postaci obecnego wynalazku antagonistą jest polipeptydowy antagonista av, konkretnie polipeptydowy antagonista ave3 i ave5. Korzystnie polipeptyd jest polipeptydem zawierającym ArgGly-Asp (RGD). W jednej postaci polipeptydowym antagonistą jest antagonista av będący cyklicznym pentapeptydem RGD.
Zgodnie z kolejną postacią obecnego wynalazku antagonista może być przeciwciałem monoklonalnym immunospecyficznym wobec ave3 lub ave5. Alternatywnie może on być kombinacją przeciwciał odpowiednio przeciw ave3 i ave5. W pewnej postaci przeciwciało monoklonalne immunospecyficzne wobec ave3 ma charakterystykę reakcji immunologicznej przeciwciała monoklonalnego oznaczonego jako LM-609. W innej postaci obecnego wynalazku przeciwciało monoklonalne immunospecyficzne wobec ave5 ma charakterystykę reakcji immunologicznej przeciwciała monoklonalnego oznaczonego jako P1-F6. Zarówno przeciwciało LM-609 jak i przeciwciało P1-F6 są dobrze znane i dostępne handlowo z Chemicon, Temecula, Kalifornia.
Dla celów obecnego wynalazku antagoniści mogą być zastosowani osobno lub razem w kombinacji do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu guza w mózgu.
Leczniczo skuteczna ilość jest ilością antagonisty wystarczającą do wywołania możliwego do zmierzenia zahamowania wzrostu guza w mózgu poddanego leczeniu gospodarza. Hamowanie wzrostu guza może być określone przez pomiar mikroskopowy po wybarwieniu, przez skanowanie MRI mózgu myszy lub wbudowywanie 3H-tymiyny, które to metody są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Tak długo jak antagonista integryny może przybierać postać peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciw ave3 lub jego fragmentu, przeciwciała monoklonalnego przeciw ave5 lub jego fragmentu, lub kombinacji przeciwciał monoklonalnych wobec ave3 i ave5, powinno być to dostrzeżone, że moc jak i wyrażenie „ilość skuteczna leczniczo mogą się różnić. Jednakowoż, jak pokazano przy pomocy zastosowanych sposobów oznaczania, specjalista w dziedzinie może łatwo określić moc kandydata na antagonistę.
Moc antagonisty może być zmierzony różnymi sposobami obejmującymi, ale nieograniczonymi do hamowania angiogenezy w oznaczeniu CAM, oznaczenia in vivo prowadzonego na nowotworze mózgu i pomiaru hamowania wiązania naturalnych ligandów z integrynami takimi jak ave3 lub ave5, które zostały tu opisane oraz w tym podobnych oznaczeniach.
Zakres dawki podawanego antagonisty zależy od postaci antagonisty i jego mocy względem szczególnej integryny. W świetle niniejszego wynalazku specjalista w dziedzinie może określić, bez nadmiernych prac eksperymentalnych, odpowiednią dawkę szczególnego antagonisty. Dawka powinna być dostatecznie duża, aby wywołać pożądane działanie hamujące wzrost guza w mózgu. Dawka nie powinna być na tyle duża, aby powodować niepożądane efekty uboczne, takie jak obrzęk mózgu lub gwałtowne uwalnianie z guzów mózgu cytokin, włącznie z kachektyną, przykładowo gdy antagonista integryny jest podany w postaci polipeptydu. Dawka na kilogram wagi ciała może różnić się w zakresie od 1 do 20 mg w jednej lub większej liczbie dawek podawanych codziennie przez 1 lub kilka dni lub przez czas nieokreślony. Gdy antagonista integryny jest podawany w postaci przeciwciała monoklonalnego dawka może mieścić się w zakresie od 1 do 20 mg/kg w jednej dawce podawanej raz lub dwa razy w tygodniu przez nieokreślony czas.
Polipeptyd lub przeciwciała monoklonalne, mogą być podane pozajelitowo, przez wstrzyknięcie lub stopniową ciągłą wlewkę. Mimo, że tkanka, która ma być poddawana leczeniu jest najczęściej traktowana przez podawanie dootrzewnowe lub podskórne (przeciwciało), antagonista może również być podawany do oka, dożylnie, domięśniowo, do jamy ciała, przezskórnie i może być dostarczony perystaltycznie.
Kompozycje są podawane w sposób zgodny z formulacją dawki i w leczniczo skutecznej ilości. Ilości, które mają być podane i czas podawania zależy od osobnika, który ma być leczony, zdolności układu tego osobnika do wykorzystania składnika czynnego, oraz poziomu pożądanego działania
PL 202 082 B1 leczniczego. Dokładne ilości aktywnego składnika, który ma być podany zależą od osądu praktyka i są specyficzne dla każdego osobnika. Jednakże, użyteczny zakres dawki do podawania ogólnoustrojowego jest niniejszym ujawniony i zależy od drogi podania. Odpowiednie reżimy podawania są również zmienne, ale są określone przez początkowe podanie, a następnie kolejne dawki podawane w jedno lub kilkugodzinnych odstępach czasu przez kolejne wstrzyknięcie lub inny rodzaj podawania.
Kompozycje farmaceutyczne wytworzone zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawierają antagonistę w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. W użytym tu znaczeniu określenia „dopuszczalny farmaceutycznie, „tolerowany fizjologicznie i ich gramatyczne odmiany, gdy dotyczą kompozycji, nośników, rozcieńczalników i odczynników są używane wymiennie i oznaczają, że odczynniki mogą być podawane ssakowi bez wywoływania niepożądanych skutków fizjologicznych.
Preparaty do podawania pozajelitowo peptydu lub przeciwciała obejmują jałowe roztwory wodne lub niewodne, zawiesinę i emulsję. Przykładami niewodnych rozpuszczalników są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i nadające się do wstrzyknięcia estry organiczne, takie jak oleinian etylu. Wodne nośniki obejmują wodę, roztwory alkoholowo/wodne, emulsje lub zawiesiny łącznie z roztworem soli i buforowanym ośrodkiem. Nośniki do podawania pozajelitowego obejmują roztwór chlorku sodu, dekstrozy Ringera, dekstrozy i chlorku sodu, roztwór Ringera z mleczanem oraz oleje nielotne. Nośniki do podawania dożylnego obejmują preparaty uzupełniające płyny i składniki odżywcze, preparaty uzupełniające elektrolity (takie jak preparaty oparte na dekstrozie Ringera) i im podobne. Występować mogą również środki konserwujące i inne dodatki, takie jak przykładowo, czynniki przeciwbakteryjne, przeciwutleniacze, czynniki chelatujące, obojętne gazy i tym podobne.
Wynalazek w innym aspekcie dostarcza zastosowania antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania angiogenezy w tkance guza umiejscowionej w mózgu gospodarza.
Jak zostało to omówione w części opisu poświęconej stanowi techniki, angiogeneza jest tworzeniem się nowej sieci naczyń krwionośnych z wcześniej występujących naczyń gospodarza i jest wymagana, aby rosnący guz przekroczył wielkość 1-2 mm3. Dla celu obecnego wynalazku angiogeneza jest hamowana jeśli angiogeneza i objawy choroby zależne od angiogenezy są złagodzone.
W pewnej postaci niniejszego wynalazku tkanka guza jest umiejscowiona wewną trz mózgu gospodarza. Gospodarz może być jakimkolwiek ssakiem. Przykłady gospodarza obejmują, lecz nie są ograniczone do myszy, szczura i człowieka.
Zakres podawanych dawek antagonisty zależy od postaci antagonisty i jego mocy względem szczególnej integryny. Specjalista w dziedzinie może określić odpowiednią dawkę określonego antagonisty dzięki ujawnieniu obecnego wynalazku bez nadmiernej pracy eksperymentalnej. Dawka powinna być dostatecznie duża, aby wywołać pożądane działanie polegające na zmniejszeniu angiogenezy i objawów choroby zależnych od angiogenezy. Dawka nie powinna być tak duża, aby powodować działania nieporządane, takie jak obrzęk mózgu spowodowany gwałtownym niszczeniem nowotworu, któremu towarzyszy uwalnianie cytokin lub krwawienie.
W pewnej postaci obecnego wynalazku antagonista integryny może być antagonistą integryny ανβ3 lub integryny ανβ5. Korzystnymi antagonistami integryny są zarówno przeciwciało monoklonalne jak i peptyd. W jednej postaci obecnego wynalazku antagonista jest antagonistą polipeptydowym av, a mianowicie antagonistą polipeptydowym ave3 i ave5. Korzystnie, polipeptyd jest polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD). W pewnej postaci wykonania antagonistą av jest polipeptydowy antagonista będący cyklicznym pentapeptydem RGD.
Zgodnie z kolejną postacią wykonania obecnego wynalazku antagonista może być przeciwciałem przeciw ave3 i kombinacją przeciwciał odpowiednio przeciw ave3 i ave5.
Leczniczo skuteczna ilość jest ilością antagonisty wystarczającą do wywołania możliwego do zmierzenia hamowania angiogenezy w poddanej jego działaniu tkance, to jest ilością hamująca angiogenezę. Hamowanie angiogenezy może być mierzone in situ opisanymi tu metodami immunohistochemicznymi, lub innymi sposobami znanymi specjaliście w dziedzinie.
W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania antagonisty integryn ave3 i ave5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) komórkowej adhezji komórek nowotworu mózgu rozwijającego się w mózgu gospodarza. Kompozycja wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, gdy jest podawana gospodarzowi dostarcza leczniczo skutecznej ilości antagonisty integryny.
PL 202 082 B1
Dla celów obecnego wynalazku komórkowa adhezja zależna od ECM obejmuje jakąkolwiek adhezję komórki, która jest zależna od ECM i w której uczestniczą integryny av. Przykłady takiej adhezji obejmują, lecz nie są ograniczone do adhezji komórki zależnej od witronektyny i adhezji komórki zależnej od tenascyny. Nowotwory mózgu człowieka, jak zostało to ujawnione niniejszym, mogą wytwarzać witronektynę i tenascynę i te ECM odgrywają istotną rolę w adhezji komórki nowotworowej i jej migracji przez oddziaływanie z integrynami. Dla celów obecnego wynalazku hamowanie jest uzyskane, gdy ograniczona jest adhezja komórki guza do ECM.
Określenie „ilość skuteczna leczniczo w użytym tu znaczeniu określa ilość antagonisty wystarczającą do ograniczenia zależnej od ECM adhezji komórki guza. Adhezja komórki może być mierzona opisanymi tu sposobami, a także sposobami powszechnie znanymi w dziedzinie.
Zgodnie z jedną postacią wykonania obecnego wynalazku antagonista może być polipeptydowym antagonistą av lub kombinacją przeciwciał odpowiednio przeciw ave3 i ave5. Przykładowo, antagonistą może być antagonista av będący cyklicznym pentapeptydem RGD lub kombinacją przeciwciał monoklonalnych oznaczonych LM-609 i P1-F6.
Kolejny aspekt obecnego wynalazku dostarcza zastosowania antagonisty ave3 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania zależnej od witronektyny migracji komórkowej komórek nowotworu mózgu rozwijającego się w mózgu gospodarza. Kompozycja wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, gdy jest podawana gospodarzowi dostarcza leczniczo skutecznej ilości antagonisty integryny.
Dla celów obecnego wynalazku hamowanie jest osiągnięte jeśli ograniczona jest migracja komórek nowotworu.
Określenie „ilość leczniczo skuteczna, jak użyte niniejszym, definiuje ilość antagonisty, która jest wystarczająca, aby ograniczyć zależną od witronektyny migrację komórek guza. Migracja komórek może być mierzona opisanymi tu sposobami i sposobami powszechnie znanymi w dziedzinie.
Zgodnie z pewną postacią wykonania obecnego wynalazku antagonista może być polipeptydowym antagonistą av lub immunoreaktywnym przeciwciałem monoklonalnym przeciw ave3. Przykładowo, antagonista może być antagonistą av będącym cyklicznym pentapeptydem RGD lub przeciwciałem monoklonalnym oznaczonym LM-609.
Obecny wynalazek dostarcza również zastosowania antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania apoptozy komórek nowotworu rozwijającego się w mózgu gospodarza. Kompozycja wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, gdy jest podawana gospodarzowi dostarcza leczniczo skutecznej ilości antagonisty integryny.
Dla celów obecnego wynalazku apoptoza komórki nowotworu mózgu jest indukowana jeśli w mózgu po podaniu antagonisty obserwuje się zwiększoną ilość ulegających apoptozie komórek nowotworowych. Leczniczo skuteczna ilość jest ilością antagonisty wystarczającą do wytworzenia w mózgu leczonego gospodarza możliwej do zmierzenia ilości ulegających apoptozie komórek guza. W mózgu apoptoza komórki guza może być mierzona opisanymi tu sposobami lub w sposób powszechnie znany w dziedzinie.
Zgodnie z pewną postacią obecnego wynalazku integryną może być av, ave3 lub ave5. Antagonistą może być polipeptydowy antagonista av.
P r z y k ł a d y
Materiały i metody
Materiały: Aktywny cykliczny pentapeptyd RGD EMD 121974, cyklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val) i nieaktywny peptyd kontrolny cRAD (EMD 135981) były dostarczone przez dr A. Jonczyk, Merck KgaA, Darmstadt, Niemcy. Przeciwciała monoklonalne LM609 i P1F6 były uprzednio opisane (13). Linie komórkowe nowotworu mózgu DAOY i U87MG otrzymano z ATCC, Rockville, MD. Pierwotne hodowle komórek śródbłonka naczyń włosowatych z mózgu człowieka były dostarczone przez dr M. Stins, Childrens Hospital, Los Angeles (49). Ludzka witronektyna była dostarczona przez Promega, Madison WI.
Badania FACS: Użyto cytometrię FACScam (Becton-Dickinson, San Jose). Warunki analizy były wcześniej opisane (43). Pierwszorzędowymi przeciwciałami były LM 609 i P1F6 rozcieńczone 1:100, a drugorzędowym przeciwciałem było znakowane FITC kozie przeciwciało przeciw mysim IgG rozcieńczone 1:250. Apoptozę określano zgodnie z zaleceniami producenta (Clontech, Palo Alto, CA, Apo Alert Annexin V FITC Apoptosis Kit).
Adhezja: Warunki oznaczania były takie, jak określono wcześniej (15). Studzienki nieprzeznaczone dla hodowli tkankowych inkubowano przez noc z witronektyną (1-10 μg/ml PBS) w 4°C, płukano i blokowano przez 30 minut denaturowaną termicznie 1% BSA w PBS, a następnie płukano PBS. Kontrolę i ko8
PL 202 082 B1 mórki testowe inkubowane wstępnie przez 30 minut w 37°C z badaną substancją (20 μg/ml) w buforze do adhezji, zaszczepiano (5x104 komórek na studzienkę) i inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Po dokładnym wypłukaniu studzienek buforem do adhezji przywierające komórki utrwalano i barwiono fioletem krystalicznym, który to barwnik rozpuszczono w metanolu, a następnie określano OD przy 600°A.
Migracja: Łączące studzienki filtry poliwęglanowe typu transwell (wielkość porów 8 μm) inkubowano przez 30 min. w 37°C z witronektyną w PBS (1 μg/ml na górną stronę i 10 μg na stronę dolną), blokowano przez 30 min. 1% zdenaturowanym BSA i płukano PBS. Badane komórki (5x105/studzienkę) dodano w buforze do adhezji zawierającym badane substancje (20 μg/ml) i inkubowano przez 4 godz. w 37°C w dolnej komorze zawierającej bufor do adhezji. Komórki w górnej komorze usuwano przy pomocy wacika, a komórki znajdujące się na dolnej części filtra utrwalano, barwiono fioletem krystalicznym. Liczbę migrujących komórek określano przez zliczanie.
Apoptoza: Warunki adhezji były jak powyżej z tym wyjątkiem, że 12-studzienkowe płytki pokrywano witronektyną i opłaszczano 5x105 komórek/studzienkę w buforze do adhezji. Po 30 min. inkubacji w 37°C bufor do adhezji zastępowano buforem zawierającym 20 μg/ml aktywnego cRGD lub nieaktywnego peptydu cRAD i inkubowano dalej przez 4 godz. Przywierające komórki trawiono trypsyną i łączono z komórkami uwolnionymi w nadsączu, a następnie badano pod kątem występowania komórek apoptotycznych z zastosowaniem zestawu do wykrywania apoptozy Apo Alert Annexin V-FITC (Clontech).
Oznaczenie CAM: Dostawca jaj i sposób ich przygotowania były opisane wcześniej (23). Komórki nowotworowe wysiewano w 50 μl PBS w ilości 4x106 komórek/jajko dla DAOY i 3,5x106 komórek/jajko dla U87MG. Komórki hodowano przez 7 dni do postaci nowotworu i zbierano w jałowych warunkach, przycinano do podobnych rozmiarów i ponownie poddawano CAM na 10 dniowych zarodkach. Po upływie tego czasu do naczyń CAM wstrzykiwano aktywny lub nieaktywny peptyd (100 μg/jajko). Po 7 dniach wzrostu guzy fotografowano in situ, następnie zbierano, ważono i utrwalano w 4% zbuforowanej formalinie i zatapiano w parafinie. Po wykonaniu seryjnych przekrojów skrawki barwiono hematoksyliną i eozyną.
Model nowotworu mózgu: Szczegóły modelu były przez nas opisane (31). Komórki guza (106/10 μl PBS) były wstrzyknięte śródmózgowo w określone miejsca. Leczenie dootrzewnowe aktywnym cRGD lub nieaktywnym peptydem cRAD (100 μg/50 ml/mysz) zapoczątkowano 3 dnia po wszczepieniu w przypadku U87MG i 10 dnia dla komórek DOAY i powtarzano codziennie do wystąpienia kacheksji i/lub umierania. Wtedy zwierzęta uśmiercano usypiając je za pomocą CO2, wypreparowywano mózgi i niezwłocznie zamrażano w płynnym azocie lub utrwalano w zbuforowanej formalinie, zatapiano w parafinie i skrawki barwiono hematoksyliną-eozyną.
Podskórny wzrost guza: Dla wzrostu guza pod skórą komórki (106 na mysz) wstrzykiwano s.c. poniżej prawej łopatki bezpośrednio po zastrzyku śródmózgowym.
Badania na zwierzętach: Badania na zwierzętach wykonano zgodnie z zaleceniami NIH i po uzyskaniu zgody miejscowego komitetu opieki nad zwierzętami.
Doświadczenia
Angiogeneza na CAM
Aby ocenić wpływ antagonisty av na angiogenezę towarzyszącą nowotworowi mózgu, komórki ludzkiego nowotworu mózgu DAOY i U87MG hodowano na błonach omoczniowo-kosmówkowych kurczaka (CAM). Nowotworom pozwalano rosnąć przez 7 dni zanim zostały usunięte i ponownie zaszczepione na świeżą CAM. 24 godziny po przeniesieniu 100 μg aktywnego peptydu cRGD lub kontrolnego peptydu (cRAD) wstrzykiwano do żyły CAM. Nowotwory hodowano przez dalsze 6 dni, a następnie ważono i badano pod kątem unaczynienia. Po badaniu w mikroskopie stereoskopowym nowotwory, które otrzymały peptyd kontrolny wykazywały znaczną angiogenezę, podczas gdy nowotwory poddane działaniu antagonisty av ujawniały istotne zahamowanie angiogenezy (Fig. 1a). Wzrost guza był hamowany również przez antagonistę av. W przeciwieństwie do guzów kontrolnych, które zwiększyły swoją wagę o 80%, guzy poddane działaniu antagonisty av zmniejszyły swoją wagę w 30% (Fig. 1b). Dane te sugerują, że hamowanie wzrostu guza przez antagonistę av jest konsekwencją zaburzenia angiogenezy towarzyszącej nowotworowi.
Fig. 1a i 1b ilustrują hamowanie angiogenezy (a) i wzrostu guza na CAM (b) przez antagonistę av. Nowotwory mózgu hodowane na CAM zbierano i cięto na fragmenty podobnej wielkości i umieszczano na świeżej CAM 10 dniowych jajek kurzych. Następnego dnia do żył kurczaków wstrzyknięto 100 μg aktywnego inhibitora av lub peptyd kontrolny i hodowano przez 6 kolejnych dni. Jajka, które otrzymały peptyd kontrolny wykazywały znaczącą angiogenezę (a) (DAOY=A i U87MG=C), podczas gdy istotne zahamowanie powstawania nowych naczyń obserwowano w jajach, które otrzymały aktywny peptyd (DAOY=B i U87MG=D). Nowotwory umieszczone na CAM ważono na początku i na końcu doświadczePL 202 082 B1 nia (b). Waga nowotworów poddanych działaniu peptydu kontrolnego wzrosła o 80%) dla obu rodzajów guzów (lewy, n=8), podczas gdy przy podawaniu aktywnego peptydu zmalała o około 30% (prawy, n=8).
Ortotopowy model nowotworu.
Komórki DAOY i U87MG (106 komórek/mysz) wstrzyknięto stereotaktycznie do prawej, przedniej części kory myszy nu/nu celem ustalenia systemu, który oddawałby mikrośrodowisko mózgu. Sposób ten pozwolił na otrzymanie wysoce powtarzalnego modelu rozwoju ludzkiego nowotworu mózgu oraz pomiar wzrostu nowotworu i przeżywalności myszy przez okres do wprowadzenia antagonizmu av (Fig. 2a i 2b). Fig. 2 przedstawia wielkość guza (A) i przeżywalność myszy (B) po śródmózgowym wstrzyknięciu komórek DAOY i U87MG. Komórki U87MG ujawniają gwałtowny wzrost i osiągają wymiar około 6 mm w szóstym tygodniu, podczas gdy komórki DAOY rosną wolniej i osiągają średnicę 5,5 mm w dziewięć tygodni (A). Wszystkie zwierzęta zmarły w ciągu 9 tygodni (B). Dla każdego punktu czasowego n=5 lub 6.
Celem sprawdzenia działania peptydu cRGD w tym modelu, nowotwory były najpierw hodowane przez 7 dni (DAOY) lub 3 dni (U87MG), a następnie antagonistę av lub jego nieaktywną kontrolę podawano i.p. codziennie (100 μg/mysz) przez dodatkowe 3 tygodnie. W momencie uśmiercania (łączny czas wzrostu guza 4 tygodnie) myszy kontrolne posiadały bardzo widoczne nowotwory mózgu średnio 3 mm (DAOY) i 5,5 mm (U87MG) wielkości. U leczonych myszy nie znaleziono guza lub znaleziono jedynie pozostałości komórek guza w mikroskopijnych grudkach wzdłuż powierzchni naczyń i opony twardej (Fig. 3a i 3b). Fig. 3a i 3b przedstawiają histopatologię ortotopowo wstrzykniętych do mózgu komórek DAOY (a) i U87MG (b) codziennie poddawanych działaniu nieaktywnego (A) lub aktywnego peptydu (B-D). U zwierząt kontrolnych (A) widoczne są duże, wewnątrzmózgowe nowotwory (groty strzałek), podczas gdy nie zaobserwowano nowotworów (B) lub zaobserwowano jedynie mikroskopowe resztki nowotworów (groty strzałek) u zwierząt poddanych działaniu antagonisty av (C i D).
Leczone myszy zachowywały również swoją wyjściową wagę 21 g, podczas gdy myszy kontrolne DAOY i U87MG ważyły odpowiednio 16 g i 15 g, co stanowi utratę 5-6 g względem wartości podstawowej (patrz Tabela 1). Średni czas pojawienia się objawów neurologicznych w grupie kontrolnej wynosił 2,5 tygodnia dla U87MG i 4,5 tygodnia dla myszy DAOY, podczas gdy leczone zwierzęta nie ujawniały po jakimkolwiek czasie jakichkolwiek objawów neurologicznych.
T a b e l a 1
| Linia komórkowa | Wielkość nowotworu (mm) | Waga myszy (g) | |
| Mózg | Podskórnie | ||
| DAOY Peptyd kontrolny | 3,010,71 | 18±1,41 | 16±1,3 |
| Peptyd aktywny | NM | 17±0,84 | 21±0,89 |
| U87MG Peptyd kontrolny | 5,5±0,55 | 20±1,0 | 15±0,45 |
| Peptyd aktywny | NM | 19±0,77 | 20± 0,71 |
NM = niemierzalny
Dodatkowe zwierzęta badano pod kątem przeżywalności. Przeżywalność mierzono jako punkty czasowe, w których myszy wymagały uśmiercenia z uwagi na ich konający stan. Wszystkie myszy kontrolne uśmiercano przed upływem 6-tygodniowego wzrostu guza i większość z nich (>50%) w obu grupach kontrolnych została uśmiercona w ciągu 3-4 tygodni (Fig. 4). Fig. 4 pokazuje, że przeżywanie myszy po ortotopowym wszczepieniu nowotworu mózgu, które otrzymywały aktywny lub nieaktywny peptyd; leczenie i.p. (100 μg/mysz/dzień) rozpoczęte w dniu 3 w przypadku U87MG i w dniu 7 dla komórek DAOY. N dla każdej z kontroli DAOY i U87MG wynosi 16 myszy, a 32 i 24 myszy dla leczonych grup DAOY i U87MG odpowiednio. Fig. 4 pokazuje, że żadne z leczonych zwierząt nie wymagało uśmiercenia i poddane działaniu DAOY myszy przeżywały do 24 tygodni, a myszy U87MG do 15 tygodni od wstrzyknięcia komórek nowotworu. Żadne z leczonych zwierząt nie wykształciło jakichkolwiek objawów neurologicznych i wszystkie rosły prawidłowo.
Heterotopowy model guza
W celu określenia wpływu mikrośrodowiska na wzrost guza poddanego działaniu antagonisty av wstrzyknęliśmy podskórnie te same komórki guza mózgu (106 komórek/nagą mysz) przed rozpoczę10
PL 202 082 B1 ciem leczenia aktywnym i kontrolnym peptydem (100 μg/mysz dziennie podane i.p.) w trzecim (U87MG) i siódmym (DOAY) dniu po wstrzyknięciu komórek nowotworu. W tych warunkach nie było hamowania wzrostu guza przez aktywny peptyd i po 6 tygodniach guzy pochodzące z grup leczonych i nieleczonych wyglądały identycznie zarówno na poziomie makroskopowym jak i mikroskopowym; w każdym przypadku ujawniło się występowanie intensywnej angiogenezy (dane nieprzedstawione). Wskazuje to, że wrodzone właściwości badanych komórek nowotworu mózgu nie są wystarczające, aby uczynić je wrażliwymi na aktywność antagonisty będącego peptydem cRGD, lecz raczej wymagają warunków charakterystycznych dla mikrośrodowiska mózgu.
Dla dalszego badania tego ujawnienia równocześnie wstrzyknęliśmy śródczaszkowo i podskórnie komórki DAOY i U87MG przed rozpoczęciem leczenia peptydami jak to przedstawiono w modelu ortotopowym. Fig. 5 przedstawia efekt antagonisty av na ortotopowe (mózg) i heterotopowe (podskórne) wszczepienie komórek DAOY. Komórki nowotworu (106) wstrzyknięto do mózgu i podskórnie, a leczenie nieaktywnym (a) lub aktywnym peptydem rozpoczęto od dnia 7 (b). Zdjęcia wykonano w 4 tygodniu. Zwierzęta otrzymujące nieaktywny (a) lub aktywny (b) peptyd ujawniają podobną wielkość podskórnych guzów (A) i unaczynienie (B). W obydwu warunkach nowotwory s.c. wrastały w podściełającą warstwę mięśni (groty strzałek) (C). Przeciwnie, zwierzęta kontrolne rozwinęły duże guzy mózgu (groty strzałek), podczas gdy myszy otrzymujące aktywny peptyd nie ujawniały lub ujawniały mikroskopijne pozostałości choroby (D). Tak więc Fig. 5 pokazuje, że nowotwory podskórne w kontroli i grupach leczonych w obu przypadkach rosną do średniej wielkości 18 mm3 z widocznym intensywnym unaczynieniem (Fig. 5). Myszy kontrolne również wykształcały duże guzy wielkością podobne do wcześniej obserwowanych w ortotopowym modelu guza, jak również kliniczne objawy upośledzenia neurologicznego (Tabela 1). Przeciwnie, myszy otrzymujące aktywny peptyd przeżywały bez objawów neurologicznych i nekropsja ujawniła brak nowotworów wewnątrz mózgowych lub jedynie szczątkowe mikroskopijne zgrupowania komórek nowotworowych (Fig. 5). Jednakże, w grupie tej występował postępujący wzrost podskórnych nowotworów czyniąc koniecznym uśmiercenie myszy po 10 tygodniach. Potwierdziło to, że nowotwory rosnące wewnątrz mózgowo są podatne na leczenie cyklicznym peptydem RGD, podczas gdy te same nowotwory nie są hamowane gdy się znajdują pod skórą.
Ekspresja integryny
Witronektyna jest białkiem macierzy, które może wpływać na różne, obserwowane w mózgu i pod skórą, reakcje biologiczne. Występuje powszechnie w miejscach poza neuronami, lecz nie jest prawidłowo wytwarzane przez tkankę glejową i nerwową (15, 20). Jednakże, złośliwe komórki glejaka syntetyzują witronektynę, która z kolei może być kluczowa, aby umożliwić przyłączenie i rozprzestrzenienie (15). Alternatywnie, witronektyna może powodować adhezję komórek śródbłonka i migrację w kierunku podstawy guza, a co za tym idzie wzmocnienie angiogenezy. Ponieważ osadzanie się komórki na witronektynie odbywa się za pośrednictwem integryn ave3 i ave5, w celu określenia czy ludzki rdzeniak DAOY, glejak U87MG i pierwotne hodowle komórek śródbłonka z mózgu człowieka (HBEC) wyrażają integryny ave3 i ave5 przeprowadzono analizę FACS (Fig. 6a).
Fig. 6a-6d przedstawiają profile integryny (a), wpływ antagonisty av na adhezję (b), migrację (c) i żywotność komórki na witronektynie (d) dla nowotworu mózgu i komórek śródbłonka naczyń włosowych mózgu. Zarówno komórki nowotworowe DAOY jak i U87MG oraz komórki naczyń włosowych mózgu wyrażają integryny ave3 i ave5 (a).
Adhezja na witronektynie była znacząco hamowana przez aktywny peptyd, jak również przez kombinację przeciwciał przeciw ave3 i ave5, podczas gdy ani sam peptyd kontrolny, ani specyficzne przeciwciało przeciw ave3, ani przeciw ave5 nie powodowało znaczącego efektu. Migracja komórek na gradiencie witronektyny była zniesiona przez przeciwciała ave3 i antagonistę av, podczas gdy ani peptyd kontrolny, ani przeciwciała na ave5 nie powodowały żadnego efektu hamującego. Żywotność komórek sprawdzano przez pozostawienie komórek osadzonych na witronektynie przez 1 godz., a następnie eksponowanie ich przez 4 godziny na peptyd kontrolny lub antagonistę av (20 μg/ml) (d). Komórki przylegające i znajdujące się w zawiesinie były połączone i badane przez FACS pod kątem apoptozy z zastosowaniem wyznakowanych FITC przeciwciał przeciw anneksynie V i jodkiem propidyny. Podczas gdy w hodowli poddanej działaniu peptydu kontrolnego obserwowano niewielką apoptozę (d, lewy), zarówno komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, jak i komórki DAOY wykazywały znaczącą liczbę komórek ulegających apoptozie (d, prawy).
Fig. 6a-6d pokazują, że komórki U87MG wyrażają ave3 na wysokim poziomie w odniesieniu do komórek DAOY, lecz te ostatnie wyrażają wyższy poziom ave5. Komórki HBEC hodowane w pożywce zawierającej VEGF wyrażają dużą ilość ave5, podczas gdy 50% komórek wyraża integrynę ave3
PL 202 082 B1 w krótkotrwałych hodowlach. Komórki były również sprawdzane przez analizę FACS po dwóch dniach wzrostu w hodowli na płytkach opłaszczonych witronektyną. W tych warunkach ekspresja ave5 i ave3 nie uległa zmianie (dane nieprzedstawione).
Adhezja do witronektyny
Aby określić czy ave3 i ave5 regulują adhezję DAOY, U87MG i HBEC do witronektyny komórki zaszczepiono do studzienek opłaszczonych witronektyną i pozwolono im osadzać się w obecności lub w nieobecności przeciwciał blokujących ave3 (LM-609) i ave5 (P1-F6) lub peptydu cRGD. P1-F6 minimalnie hamuje osadzanie się komórek DAOY, podczas gdy LM-609 nie ma wpływu na osadzanie się jakichkolwiek komórek. Znaczące hamowanie adhezji wszystkich komórek obserwowano przy równoczesnej inkubacji z P1-F6 i LM-609 lub z samym cRGD (Fig. 6b). Dane te wykazują, że niezależne blokowanie jednej z integryn jest niewystarczające i, że dla znaczącego zaburzenia wykazywanej przez badane komórki adhezji zależnej od witronektyny wymagane jest równoczesne blokowanie ave3 i ave5.
Migracja na witronektynie
Dla stwierdzenia czy ave3 i ave5 modulują migrację na witronektynie niezależnie od adhezji badaliśmy te same komórki na błonach opłaszczonych witronektyną w komorach Boydena w obecności blokujących przeciwciał lub cRGD. P1-F6 nie zaburzają migracji; jednakże LM-609 i cRGD znacząco hamują migrację wszystkich trzech typów komórek (Fig. 6c). Ponieważ LM-609 w nieobecności P1-F6 było niezdolne do blokowania adhezji, to efekt zapobiegający migracji musi być związany z innym szlakiem, który jest niezależny od sił odpowiedzialnych za adhezję. Ponadto, LM-609 blokują migrację równie dobrze jak cRGD, co sugeruje, że sygnalizacja komórkowa zależna od ave3 jest krytycznym składnikiem w określaniu migracji badanych komórek nowotworu mózgu i śródbłonka błonka mózgu.
Apoptoza
Wysoko aktywne gwiaździaki wytwarzają witronektynę na wiodącym, inwazyjnym końcu co sugeruje, że białko to odgrywa ważną rolę w osadzaniu się komórek nowotworu mózgu, migracji i prawdopodobnie przeżywalności komórek (15). Wcześniej pokazaliśmy, że wstępna inkubacja komórek nowotworu mózgu lub naczyń włosowatych z peptydem cRGD lub kombinacją przeciwciał przeciw ave3 i ave5 zapobiega adhezji komórki na witronektynie. Apoptoza komórek śródbłonka i czerniaka po podobnym zahamowaniu zależnej od integryny adhezji do białek macierzy była wcześniej ujawniona (26-28). Co za tym idzie przedmiotem zainteresowania było, czy antagoniści av mogą indukować apoptozę tych komórek po ich oderwaniu od witronektyny. Komórki DAOY i pierwotne HBEC zaszczepiano w buforze do adhezji do studzienek pokrytych witronektyną (1 μg/ml) i pozwolono im osadzać się przez 30 minut w 37°C. Następnie bufor zastąpiono buforem zawierającym peptyd cRGD lub cRAD (kontrola) w ilości 20 μg/ml i inkubowano dalej przez 4 godz. Osadzone komórki łączono po trawieniu trypsyną z komórkami w zawiesinie i przy użyciu FACS, stosując przeciwciało przeciw anneksynie V-FITC i jodek propidyny (Clontech Apo Alert Annexin V-FITC detection apoptosis kit) określano liczbę komórek ulegających apoptozie. Komórki poddane działaniu kontrolnego peptydu cRAD wykazywały niewielką apoptozę, podczas gdy komórki DAOY i HBEC poddane działaniu cRGD wykazywały znaczącą apoptozę (Fig. 6d). Dane te wskazują, że peptyd cRGD nie tylko powoduje odłączenie się tych komórek od witronektyny, lecz również indukuje ich apoptozę.
Wpływ pentapeptydu na adhezję komórki nowotworu mózgu na różnych substratach ECM
Fig. 7 przedstawia wpływ cyklicznego pentapeptydu na adhezję komórki guza na białkach ECM. Szalki nieprzeznaczone do hodowli tkankowych inkubowano 1 godz. w 37°C z witronektyną, tenascyną, fibronektyną lub kolagenem I (10 μg/ml), a następnie płukano PBS. Po płukaniu 5x105 komórek na studzienkę zaszczepiano i inkubowano przez 16 godz. w 37°C. Hodowle następnie płukano, dodawano bufor do adhezji zawierający 20 μg/ml pentapeptydu lub peptydu kontrolnego i inkubowano przez dodatkowe 2-24 godz. Następnie hodowle dwukrotnie płukano buforem do adhezji i barwiono fioletem krystalicznym i określono OD 600. Im więcej występuje przylegających komórek tym wyższe OD. Dane odpowiadają przylegającym komórkom po 8 godz. inkubacji. U87=glejak i DAOY=rdzeniak.
Jak przedstawiono na Fig. 7 komórki nowotworowe odłączone od witronektyny i tenascyny, w których osadzaniu biorą udział av integryny, lecz nie z kolagenu i fibronektyny, które oddziałują z integrynami innymi niż av. Podobne dane uzyskano dla komórek naczyń włosowatych mózgu (nieprzedstawione).
Wpływ odłączenia komórki na przeżycie komórkowe
Fig. 8 przedstawia apoptozę komórek nowotworu mózgu i naczyń włosowatych hodowanych na ECM i wystawionych na działanie pentapeptydu. Warunki testu były takie jak na Fig. 7 z tym wyjątkiem, że odłączone komórki i komórki przylegające były połączone po trawieniu trypsyną. Następnie
PL 202 082 B1 komórki przemywano, zawieszano w 50 μl PBS i wirowano na szkiełkach nakrywkowych (cytospin). Po utrwaleniu 4% paraformaldehydem komórki barwiono w celu wykrycia apoptozy stosując Boehringer Apoptosis Kit. Wyniki są wyrażone w procentach ulegających apoptozie komórek względem całkowitej liczby komórek. Doświadczenie wykonano po 24 godzinnej inkubacji z peptydami.
Wpływ odłączenia komórki na przeżywalność komórkową przedstawiono na Fig. 8. Jak pokazano komórki wystawione na działanie aktywnego peptydu przez 24 godziny i hodowane na witronektynie lub tenascynie wykazują rosnącą liczbę martwych komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Przeciwnie, pentapeptyd nie zmienia przeżywalności komórek hodowanych na kolagenie I lub fibronektynie. Zmniejszoną przeżywalność komórkową obserwowano w przypadku obu rodzajów komórek nowotworowych i komórek naczyń włosowatych mózgu. Podobne dane uzyskano gdy komórki barwiono pod kątem wczesnych znaczników śmierci komórki, prezentowanych na powierzchni komórki (Annexin-V, dane niepokazane). Tak więc aktywny pentapeptyd indukuje odłączenie komórki i śmierć zarówno komórek nowotworu mózgu jak i naczyń włosowatych przywierających do witronektyny i tenascyny.
Wytwarzanie białek ECM w ludzkim nowotworze mózgu
Jak podano wyżej u ludzi nowotwory mózgu wytwarzają witronektynę i tenascynę i uważa się, że substraty te poprawiają przeżywalność komórek nowotworu oraz zwiększają ich inwazyjność. W naszym modelu nowotworu mózgu badaliśmy wytwarzanie tych białek.
Fig. 9 przedstawia immunohistochemię nowotworu mózgu U87 przeszczepionego ksenogenicznie do przodomózgowia nagich myszy poddanych działaniu peptydu aktywnego (anty- av) lub kontrolnego. Myszy nastrzyknięto komórkami nowotworowymi (106/komórki/mysz) i traktowano aktywnym lub nieaktywnym peptydem (100 μg/mysz/dzień) począwszy od 7 dnia po wstrzyknięciu. Nowotwory usunięto po dwóch tygodniach leczenia, utrwalono w zbuforowanej formalinie, zatopiono w parafinie i otrzymano 5 μm skrawki. Skrawki badano pod kątem ekspresji CD31 (znacznik dla komórek naczyń włosowatych) stosując szczurze przeciwciała monoklonalne przeciw myszy (Pharmingen), monoklonalne przeciwciało mysie przeciw ludzkiej witronektynie (Sigma), mysie przeciwciało przeciw ludzkiej tenascynie (Neo-Marker) i zestaw Boehringer Apoptosis Kit do wykrywania martwych komórek. CD 31=znacznik dla naczyń włosowatych, VE=witronektyna, TN=tenascyna i APO=apoptoza.
Jak przedstawiono na Fig. 9 nowotwory mózgu rzeczywiście wytwarzają witronektynę i tenascynę, a ich pochodzenie z komórek nowotworowych zostało potwierdzone za pomocą przeciwciał specyficznych wobec ludzkich białek. Podanie aktywnego pentapeptydu nie miało wpływu na syntezę tych białek. Ponadto wykazano, że komórki guza wytwarzają te białka w hodowlach tkankowych (wyniki nieprezentowane). Tak więc nasz model mysi naśladuje sytuację ludzkich nowotworów mózgu.
W górnej części Fig. 9 przedstawiono antyangiogeniczne działanie pentapeptydu, gdzie skrawki tkanki barwiono z uwagi na specyficzne markery dla komórek naczynia włosowatego, a mianowicie CD 31. Podczas gdy guzy poddane działaniu kontrolnego peptydu miały wiele naczyń barwiących się pozytywnie z uwagi na ten marker, bardzo niewiele takich naczyń było w guzach poddawanych działaniu aktywnego pentapeptydu (p<0,005), co wskazuje na zahamowanie wzrostu naczynia włosowatego. Dół Fig. 9 przedstawia wybarwienie komórek pod kątem apoptozy (martwych komórek). Sposób jest podobny do opisanego dla Fig. 8. Nowotwory leczone aktywnym pentapeptydem wykazywały znacząco więcej martwych komórek, niż te poddane działaniu peptydu kontrolnego (p<0,02). Zdjęcia zrobiono dla glejaka U87, lecz podobne wyniki otrzymano dla rdzeniaka DAOY (niepokazane).
Zależność śmierci komórkowej i apoptozy komórki nowotworowej
W celu pokazania, że zwiększona śmierć komórki zależy od bezpośredniej apoptozy komórki nowotworowej i nie jest konsekwencją zahamowania wzrostu naczynia włosowatego zaszczepiliśmy myszy komórkami czerniaka mózgu, który albo wyraża (M21 L av pos) albo nie wyraża (M12 L av neg) av integryny. Jeśli myszom przeszczepiono komórki av pozytywne i leczono aktywnym pentapeptydem przeżywały one dłużej niż myszy leczone peptydem kontrolnym; tak więc bezpośrednio odpowiedzialna musi być apoptoza komórki.
Tabela 2 przedstawia przeżycie myszy z ave3 ujemnymi i dodatnimi nowotworami leczonych RGDfV. Komórki nowotworowe (106) były wstrzyknięte do przodomózgowia 6-tygodniowych nagich myszy i leczone aktywnym lub kontrolnym peptydem (100 μg/mysz/dzień), które to leczenie rozpoczęto dnia 3. Myszy uśmiercono w momencie wystąpienia kacheksji, a obecność nowotworu potwierdzono przez autopsję.
PL 202 082 B1
T a b e l a 2
| Linia komórkowa | Przeżywalność (dni) | |
| RGDfV (aktywne) | RGDfV (kontrolne) | |
| M21Lav neg | 15,7±3,8 | 15,3±3,3 |
| M21L4av pos | 36,5±2,9 | 17,3±1,9 |
Jak pokazano w Tabeli 2 myszy, którym przeszczepiono av-negatywne komórki czerniaka przeżyły 15 dni niezależnie od zastosowanego leczenia. Przeciwnie, zakres życia z nowotworami av-pozytywnymi zwiększył się do 36 dni gdy myszy leczono aktywnym pentapeptydem, w porównaniu do 17 dni gdy leczono je peptydem kontrolnym. Wykazuje to, że bezpośrednia apoptoza komórki nowotworowej musi być odpowiedzialna za śmierć komórki guza.
Podsumowując, wyżej omawiane wyniki wspierają hipotezę, że cykliczny pentapeptyd bezpośrednio indukuje śmierć komórki.
Omówienie
Nowotwory mózgu są wysoce angiogeniczne i ciągłość ich wzrostu zależy od wytworzenia nowych naczyń włosowatych. Hamowanie angiogenezy jest zatem potencjalnie ważną strategią terapeutyczną skierowaną przeciwko temu rodzajowi złośliwych nowotworów. Integryny ave3 i ave5 są kandydatami na czynniki docelowe w hamowaniu angiogenezy, bowiem ich ekspresja w śródbłonku jest pobudzana podczas angiogenezy (12, 13). Ich rola w tworzeniu nowych naczyń krwionośnych była wcześniej potwierdzona przez badania, które pokazały indukcję angiogenezy w CAM przez bFGF i TNF-α, która może być zaburzona obecnością zarówno przeciwciała LM-609 blokującego ave3 lub cyklicznego peptydu RGD będącego antagonistą ave3 i ave5 (21, 23). Uważa się, że w każdym przypadku antyangiogeniczne działanie następuje przez indukcję apoptozy komórki śródbłonka w wyniku zapobiegania istotnym oddziaływaniom związanym z wiązaniem av i białek macierzy (28-30). W niniejszych badaniach zastosowano cykliczne peptydy RGD będące antagonistami ave3 i ave5 o podobnej specyficzności (EMD 121974) i wykazano ich zdolność do hamowania angiogenezy CAM indukowanej przez dwie linie komórkowe nowotwory mózgu, DAOY i U87MG. Leczenie cRGD nie tylko hamuje angiogenezę CAM, lecz w konsekwencji prowadzi do nekrozy mózgu i inwolucji nowotworu.
Aby odpowiedzieć na pytanie, czy podobna odpowiedź może być uzyskana w modelu, który odtwarza mikrośrodowisko mózgu komórki nowotworu mózgu były stereotaktycznie wstrzyknięte do przodomózgowia nagiej myszy. Komórki glejaka U87MG i rdzeniaka DAOY były wybrane do badania ze względu na ich wrażliwość na peptyd w oznaczeniu CAM i ich znaczącą inwazyjność i zdolność indukowania angiogenezy, które wcześniej wykazano in vivo (31, 32). Również w tym ortotopowym modelu cRGD hamuje znacząco wzrost nowotworów mózgu U87MG i DAOY. Kontrolne myszy ulegały postępowi nowotworu i wykazywały obecność wysoce inwazyjnych nowotworów większych średnio niż 3 mm3. Poddane działaniu cRGD myszy przeżyły bez oznak śmiertelności i nie wykryto u nich żywotnych nowotworów z wyjątkiem resztek komórek w miejscu wszczepienia lub w postaci małych zgrupowań wzdłuż powierzchni komory i błony twardej. Wszystkie resztkowe ogniska nowotworowe w leczonej grupie były mniejsze niż 1 mm3 i co za tym idzie nie nabyły odpowiedzi gospodarza przez angiogenezę. Alternatywnie inhibitory angiogenezy, takie jak trombospondyna-1, TNP-470 i czynnik płytkowy 4 również ujawniły hamowanie wzrostu doświadczalnego guza mózgu, choć większość tych wyników była ograniczona do podskórnych przeszczepów ksenograficznych lub wymagała bezpośredniego dostarczenia leku do podstawy nowotworu przez wstrzyknięcie stereotaktyczne (32-34). Peptydowy antagonista ave3 w modelu mysz SCID/szczur podskórnego guza komórki Leydig'a wykazał hamowanie wzrostu guza w 80% po podaniu dootrzewnowym (35). Angiostatyna i czynnik przeciw angiogenezie o jak dotąd niejasnym mechanizmie działania, wykazał również znaczące zahamowanie wzrostu ksenograficznego wszczepionego śródczaszkowo glejaka C6 i 9L szczura (36). W przeciwieństwie do naszych badań leczenie angiostatyną (1 mg/mysz/dzień) lub antagonistą peptydowego mimetyka (2 mg/mysz/dzień) było zapoczątkowane bezpośrednio po wszczepieniu komórki nowotworu. Nasze badania pokazały bliską ablację ksenograficznego przeszczepu guza i jest to pierwsze wykazanie zahamowania wewnątrzczaszkowego wzrostu mózgu i angiogenezy poprzez antagonizm integryny.
Co interesujące, nowotwory DAOY i U87MG rosnące równocześnie pod skórą wykazywały w naszych badaniach niewielką lub brak reakcji na leczenie cRGD. Podkreśla to znaczenie środowiska zewnątrzkomórkowego w regulacji odpowiedzi gospodarz-nowotwór-komórka przez integrynę.
PL 202 082 B1
Stwierdzono, że angiostatyna w równym stopniu hamuje wzrost wszczepionych s.c. i i.c. komórek nowotworu mózgu wykazując, że związek ten hamuje angiogenezę za pośrednictwem innego mechanizmu niż peptyd RGD (36). Jednym możliwym wytłumaczeniem dla różnic w zahamowaniu wzrostu przez cRGD jest to, że komórki śródbłonka warstwy podskórnej mogą być w sposób wrodzony inne od tych z naczyń włosowatych CNS, czyniąc angiogenezę mniej wrażliwą na antagonizm integryny. Jest to potwierdzone przez niedawne ujawnienie, że u myszy z nokautem av anormalne są jedynie naczynia włosowate w mózgu i jelitach, podczas gdy pozostała część układu krążenia jest niezmieniona (37). Alternatywnie białka macierzy służące jako ligandy integryn komórek śródbłonka mogą być preferencyjnie wyrażane przez komórki nowotworu zależnie od lokalizacji ortotopowej lub heterotopowej. Przykładowo, nie stwierdzono, aby wszczepione podskórnie komórki glejaka człowieka wytwarzały witronektynę, jakkolwiek ich umieszczenie w mikrośrodowisku mózgu indukuje wyrażanie przez nie genu witronektyny (15). Prawidłowa tkanka mózgu może przypuszczalnie zmienić ekspresję białek ECM w odpowiedzi na inwazję komórek glejaka (38). W odróżnieniu od lokalizacji poza neuronalnej, witronektyna normalnie nie występuje w mózgu i co za tym idzie małe zmiany w stężeniu tego białka w CNS mogą znacząco modyfikować odpowiedzi komórki. Badania wykazały, że ruchliwość komórek śródbłonka zależy od stężenia witronektyny i odległości pomiędzy punktami kontaktów komórkamacierz pozwalających na rozprzestrzenianie się komórki (39-40).
Antynowotworowe działania peptydu w naszych badaniach są ogólnie większe niż te obserwowane dla innych czynników antyangiogenicznych. Ponieważ wiele guzów wyraża również integryny ave3 i ave5 (włącznie z U87MG i DAOY) efekt antagonistów integryny może nie być ograniczony do śródbłonka gospodarza, choć znaczenie specyficznych integryn w odpowiedziach komórek nowotworowych jest mniej jasne (41). Wcześniejsze badania pokazały, że przywiązanie glejaka, raka sutka, czerniaka i komórek gruczoloraka okrężnicy HT29-D4 do witronektyny zależy od integryn av (42-45). Witronektyna jest wytwarzana przez komórki guza i podścieliny i jest najbardziej powszechna w miejscu inwazji nowotworu i tworzenia nowych naczyń krwionośnych, włącznie ze złośliwymi nowotworami mózgu (46, 47). Tak więc witronektyna poza zapewnianiem komórce śródbłonka przeżycia może być również krytyczna dla zwiększania adhezji i inwazyjności komórek guza, które wyrażają ave3 i ave5. W chimerowym modelu mysz SCID /człowiek raka sutka przerzuty były znacząco ograniczone po podaniu przeciwciała LM-609 przeciw ave3 sugerując bezpośredni efekt blokowania ave3 w przypadku niezależności nowotworu od angiogenezy (48).
Aby uzyskać odpowiedź na to pytanie badaliśmy adhezję komórkową i migrację na witronektynie w obecności antagonistów av, stosując DAOY, U87MG i wyizolowane pierwotne komórki sródbłonkowe z mózgu człowieka (HBEC) (49). Przeciwciało LM-609 przeciw ave3 hamowało migrację U87MG, DAOY i HBEC na witronektynie i w połączeniu z przeciwciałem P1-F6 przeciw ave5 hamowało adhezję tych komórek do witronektyny. Sam cRGD znacząco hamuje osadzanie się i migrację na witronektynie przez wszystkie trzy typy komórek. W podobnych badaniach inwazyjność komórki czerniaka była zwiększona przez witronektynę i blokowana przez peptyd RGD (50). Ostatecznie, leczenie cRGD powodowało zwiększoną apoptozę nie tylko w przypadku komórek HBEC, lecz również w przypadku komórek nowotworów DAOY i U87MG. Wyniki te sugerują, że cRGD może działać hamując bezpośrednio inwazyjność nowotworu i proliferację, dodatkowo do jego funkcji przeciw angiogenicznej. Ponadto, nasze wyniki pokazują, ze cykliczny pentapeptyd może hamować osadzanie się komórek nowotworu mózgu na różnych substratach ECM, takich jak witronektyna i tenascyna. Skutek takiego hamowania i adhezji prowadzi do śmierci komórki (apoptoza) zarówno w przypadku komórek nowotworu mózgu i komórek naczyń włosowatych mózgu. Efekt ten jest ograniczony do witronektyny i tenascyny ECM. Pokazaliśmy również, że zwiększona śmiertelność komórki zależy bezpośrednio od apoptozy komórki guza i nie jest konsekwencją zahamowania wzrostu naczyń włosowatych. Innymi słowy, niniejszym ujawniono, że cykliczny pentapeptyd bezpośrednio indukuje śmierć komórki nowotworowej.
Podsumowując, badania te dostarczają potwierdzenia, że antagonizm adresowany przeciw integrynom, szczególnie ave3 i ave5, może zasadniczo hamować in vivo onkogenezę nowotworu mózgu, i co za tym idzie może stanowić nowy sposób leczenia nowotworów mózgu. Nasze wyniki sugerują również, że mikrośrodowisko jest krytyczne dla zachowania się nowotworu i określenia jego wrażliwości na tego rodzaju biologicznie adresowane sposoby leczenia. Ostatecznie wykazano, że antagonizm integryny może mieć skutek przeciwnowotworowy niezależnie od działania przeciwko angiogenezie, które to działanie może synergicznie hamować wzrost nowotworu.
PL 202 082 B1
Powyższy opis ma na celu zilustrowanie wynalazku, lecz nie ograniczenie jego zakresu. Specjalista w dziedzinie opierając się na zawartym tu ujawnieniu może, faktycznie, opracować i otrzymać dalsze postaci wykonania bez nadmiernej pracy eksperymentalnej.
Literatura
1. Folkman, J., The role of angiogenesis in tumor growth, Sem. Cancer Biol., 3:65-71, 1992.
2. Plate, K.H., Risau, W., Angiogenesis in malignant gliomas, Glia., 15:339-347, 1995.
3. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia, Nature, 339:58-61, 1989.
4. Chan, A.S., Leunng, S.Y., Wong, M.P., Yuen, S.T., Cheung, N., Fan, Y.W., Chung, L.P., Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in the anaplastic progression of astrocytoma, oligodendroglioma, and ependymoma, Am. J. Surg. Pathol., 22:816-826,1998.
5. Takano, S., Yoshii, Y., Kondo, S., Suzuki, H., Maruno, T., Shirai, S., Nose, T., Concentration of vascular endothelial growth factor in the serum and tumor tissue of brain tumor patients, Cancer Res., 56:2185-2190, 1996.
6. Brem, S., Tsanaclis, A.M., Gately, S., Gross, J.L., Herblin, W.F., Immunolocalization of basic fibroblast growth factor to the microvascuiature of human brain tumors, Cancer, 70:2673-2680, 1992.
7. Li,V.W., Folkerth, R.D., Watanabe, H., Yu, C, Rupnick, M., Barnes, P., Scott, R.M., Black, P.M., Sallan, S., Follcman, J., Microvessel count and cerebrospinal fluid basic fibroblast growth factor in children with brain tumors, Lacet, 344:82-86, 1994.
8. Abulrauf, 5.1., Edvardsen, K., Ho K.L., Yang, X.Y., Rock, J.P., Rosenblum, M.L., Vascular endothelial growth factor expression and vascular density as prognostic markers of survival in patients with low-grade astrocytoma, J. Neurosurg., 88:513-520, 1998.
9. Leon, S.P., Folkerth, R.D., Black, P.M., Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial brain tumors, Cancer, 77:362-372, 1996.
10. Hynes, R.O., Integrins: a family of cell surface receptor, Cell, 48:455-459, 1987.
11. Rusnati, M., Tanghetti, E., Dell'Era, P., Gualandris, A., Presta, M., Alphavbeta3 integrin mediates the cell-adhesive capacity and biological activity of basic fibroblast growth factor (FGF-2) in cultured endothelial cells, Mol. Biol. Cell, 8:2449-2461, 1997.
12. Varner, J.A., The role of vascular Cell integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 in angiogennesis, EXS, 79:361-390, 1997.
13. Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A.,Cheresh, D.A., Definition of two angiogenic pathways by distinct alphav integrins, Science, 270:1500-1502, 1995.
14. Gladson, G.L., Expression of integrin alpha v beta 3 in small blood vessels of glioblastoma tumors, JJ Neuropathol. Exp. Neurol, 55:1143-1149, 1996.
15. Gladson, C.L., Wilcox, J.N., Sanders, L., Gillespie, G.Y., Cheresh, D.A., Cerebral microenvironment influences expression of the vitronectin gene in astrocytic tumors, . 1 Cell Sd., 108:947-956, 1995.
16. Longhurst, C.M., Jemiings, L.K., Integrin-mediated signal transduction, Cell Molljfe Sd., 54:514-526, 1998.
17. Howe, A., Aplin, A.E., Alahari, S.K., Juliano, R.L., Integrin signaling and Cell growth control, Curr. Opin. Cell Biol., 10:220-231, 1998.
18. Malik, R.K., Regulation of apoptosis by integrin receptors, J. Pediatr. Hematol. Oncol., 19:541-545, 1997.
19. Scatena, M., Almeida, M., Chisson, M.L., Fausto, N., Nicosia, R.F., Giachelli, C.M., NF-kappaB mediates alphavbeta3 integrin-induced endothelial cell survival, J. Cell Biol., 141-1083-1093, 1998.
20. Gladson, C.L., Cheresh, D.A., Glioblastoma expression of vitronectin and the avb3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells, J. Clin. Invest., 88:1924-1932, 1991.
21. Brooks, P.C., Clark, R.A., Cheresh, D.A., Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis, Science, 264:569-571, 1994.
22. Christofidou-Solomidou, M., Bridges, M., Murphy, G.F., Abelda, S.M., DeLisser, HM., Expression and function of endothelial cell av integrin receptors in wound-induced human angiogenesis in human skin/SCID mice chimeras, Am. .1. Pathol., 151:975-983, 1997.
23. Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeld, M., Reisfeld, R.A., Hu, I., Klier, G., Cheresh, D.A., Integrin avb3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels, Cell, 79:1157-1164, 1994.
24. Molema, G., Griffioen, A.W., Rocking the foundations of solid tumor growth by attacking the tumor's blood supply, Immunol. Today, 19:392-394, 1998.
PL 202 082 B1
25. Kim, K.J., Li, B., Winer, J., Armanini, M., Gillett, N., Phillips, H.S., Ferrara, N., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo, Nature, 362-841-844, 1993.
26. Re, F., Zanetti, A., Sironi, M., Polentarutti, N., Lanfrancone, L., Dejana, E., Colotta, F., Inhibition of anchorage-dependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells, J. Cell Biol., 127:537-546, 1994.
27. Montgomery, A.M., Reisffeld, R.A., Cheresh, D.A., Integrin avb3 rescues melanoma cells .from apoptosis in three-dimensional dermal collagen, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:8856-8860, 1994.
28. Isik, F.F., Gibran, N.S., Jang, Y., Sandeil, L., Schwartz, S.M., Vitronectin decreases microvascular endothelial cell apoptosis, J. Cell Physiol., 173:149-155, 1998.
29. Germer, M., Kanse, S.M., Kirkegaard, T., Kioler, L., Feldirmg-Habermann, B., Goodman, S., Preissner, T., Kinetic analysis of integrin-dependent cell adhesion on vitronectin. The inhibitory potential of plasminogen activator inhibitor-1 and RGD peptides, Eur. J. Biochem., 253:669-674, 1998.
30. Ruoslahti, E., Reed, J.C., Anchorage dependence, integrins, and apoptosis, Cell, 77:477478, 1994.
31. MacDonald, T.J., Tabrizi, P., Shimada, H., Zlokovic, B.V., Laug, W.E., Detection of brain tumor invasion and micrometastasis in vivo by expression of enhanced green fluorescent protein, Neurosurgery, 43:1437-1443, 1998.
32. Hsu, S.C., Volpert, O.V., Steck, P.A., Mikkelsen, T., Polverini, P.J., Rao, S., Chou Bouck, N.P., Inhibition of angiogenesis in human glioblastomas by chromosome 10 induction of throbospondin-1, Cancer Res., 56:5684-5691, 1996.
33. Taki, T., Ohnishi, T., Arita, N., Hiraga, S., Saitoh, Y., Izumoto, S., Mori, K.,Hayakawa, T., Anti-proliferative effects of TNnP-470 on human malignant glioma in vivo: potent inhibition of tumor angiogenesis, J. Neurooncol., 19:251 -258, 1994.
34. Tanaka, T., Manome, Y., Wen, P., Kufe, D.W., Fine, H.A., Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 cDNA inhibits angiogenesis and tumor growth, Nat. Med., 3:437442, 1997.
35. Carron, C.P., Meyer, D.M., Pegg, J.A., Engleman, V.W., Nickols, M.A., Settlel, S.L., Westlin, W.F., Ruminski, P.G., Nickols, G.A., A peptidomimetic antagonist of the integrin avb3 inhibits Leydig cell tumor growth and the development of hypercalcemia of malignancy, Cancer Res., 58:1930-1935, 1998.
36. Kirsch, M., Strasser, J., Allende, R., Bello, L., Zhang, J., Black, P.M., Angiostatin suppresses malignant glioma growth in vivo, Cancer Res., 58:4654- 4659, 1998.
37. Bader, B.L., Raybuxn, H., Crowley, D., Hynes, R.O., Extensive vasculogenesis, angiogenesis, and organogenesis precede lethality in mice lacking all av integrins, Cell, 95:507-519, 1998.
38. Knott, J.C., Mahesparan, R., Garcia-Cabrera, I., Bolge, T.B., Edvardsen, K., Ness, G.O., Mark, S., Lund-Johansen, M., Bjerkvig, R., Stimulation of extracellular manic components in the normal brain by invading glioma cells, Int. J. Cancer, 75:864-872, 1998.
39. Seger, D., Gechtman, Z., Shaltiel, S., Phosphorylation of vitronectin by casein kinase II. Identification of the sites and their promotion of cell adhesion and spreading, J. Biol. Chem., 273:24805-24813, 1998.
40. Woodard, A., Garcia-Cardera, G., Leong, M., Madri, J., Sessa, W., Languino, L., The synergistic activity of alphavb3 integrin and PDGF receptor inereases cell migration, J. Cell Sci., 111:469478, 1998.
41. Sanders, R.J., Mainiero, F., Giancotti, F.G., The role of integrins in tumorigenesis and metastasis, Cancer Invest., 16:329-344, 1998.
42. Treasurywala, S., Berens, M.E., Migration arrest in glioma cells is dependent on the alpha-v integrin subunit, Glia., 24:236-243, 1998.
43. Won, N.C., Mueller, B.M., Barbas, C.F., Ruminski, P., Quaranta, V., Lin, E.C., Smith, J.W.. Alpha-v integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma cell lines, Clin. Exp. Metastasis, 16:50-61, 1998.
44. Van Leeuwen, R.L., Yoshinaga, I.G., Akasaka, T., Dekker, S.K., Vermeer, B.J., Byers, H,R., Attachment, spreading and migration of melanoma cells on vitronectin. The role of alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrins, Exp. DermatoL, 5:308-315, 1996.
45. Lehmann, M., El Battari, A., Abadie, B., Martin, J.M., Marvalldi, J., Role of alpha v beta 5 and alpha v beta 6 integrin glycosylation in the adhesion of a colonic adenocarcinoma cell line (HT29D4), J. Cell Biochem., 61:266-277, 1996.
PL 202 082 B1
46. Kost, C, Benner, K., Stockmann, A., Linder, D., Preissner, K.T., Limited plasmin proteolysis of vitronectin. Characterization of the adhesion protein as morpho-regulatory and angiostatin binding factor, Eur. J. Biochem., 236:682-688, 1996.
47. Maenpaa, A., Kovanen, P.E., Paetau, A., Jaaskelainen, J., Timonen, T., Lymphocyte adhesion molecule ligands and extracellular matrix proteins in gliomas and normal brain: expression of VCAM-1 in gliomas, Acta. Neuropathol., 94:216-225, 1997.
48. Brooks, P.C., Stromblad, S., Klemke, R., Visscher, D., Sarkar, F.H., Cheresh, D.A., Antiintegrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin, J. Clin. Invest., 96:1815-1822, 1995.
49. Stins, M.F., Gillesl, F., Kim, K.S., Selective expression of adhesion molecules on human brain microvascular endothelial cells, .1. Neuroimmunol., 76:81-90, 1997.
50. Bafetti, L.M., Young, T.N., Itoh, Y., Stack, M.S., Intact vitronectin induces matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression and enhanced cellular invasion by melanoma cells, J. Biol. Chem., 273:143-149, 1998.
51. Wong, N.C., Mueller, B.M., Barbas, C.F., Ruminski, P., Quaranta, V., Lin, E.C., Smith, J.W., Alphav integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma cell lines, Clin. Exp. Metastasis, 16:50-61, 1998.
52. Van Leeuwen, R.L., Yoshinaga, I.G., Akasaka, I., Dekker, S.K., Vermeer, B.J., Byers, H.R. Attachment, spreading and migration of melanoma cells on vitronectin. The role of alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrins, Exp. Dermatol., 5:308-315, 1996.
53. Lebmann, M., El Battari, A., Abadie, B., Martin, J.M., Marvaldi, J., Role of alpha v beta 5 and alpha v beta 6 integrin glycosylation in the adhesion of a colonic adenocarcinoma cell line (HT29-D4), J. Cell Biochem., 61:266-277, 1996.
54. Gladson, C.L., Cheresh, D.A., Glioblastoma expression of vitronectin and the integrin J. Clin. Invest., 88:1924-1932, 1991.
55. Jaskiewicz, K., Chasen, M.R., Robson, S.C., Differential expression of extracellulax matrix proteins and integrins in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease, Anticancer Res., 13:2229-2237, 1993.
56. Brooks, P.C., Stromblad, S., Klemke, R., Visseher, D., Sarkar, F.H., Cheresh, D.A., Antiintegrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin, J. Clin. Invest., 96:1815-1822, 1995.
57. Leon, S.P., Folkerth, R.D., Black, P.M., Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial brain tumors, Cancer, 77:362-372, 1996.
58. Wesseling, P., Van Der Laak, J.A., Link, M., Teepen, H.L., Ruiter, D.J., Quantitative analysis of microvascular changes in diffuse astrocytic neoplasms with inereasing grade of malignancy, Hum. Pathol., 29:352-358, 1998.
59. Li, V.W., Folkerth, R.D., Watanabe, H., Yu, C, Rupnick, M., Barnes, P., Scott, M., Black, P.M., Sallan, S., Folkman, J., Microvessel count and cerebrospinal fluid basic fibroblast growth factor in children with brain tumors, Lancet, 344:82-86, 1994.
60. Taki, T., Ohnishi, T., Arita, N., Hiraga, S., Saitoh, Y., Izumoto, S., Mori, K., Hayakawa, T., Anti-proliferative effects of TNP-470 on human malignant glioma in vivo: potent inhibition of tumor angiogenesis, J. Neurooncol., 19:25 1-258, 1994.
61. Hsu, S.C., Volpert, O.V., Steck, P.A., Mikkelsen, T., Polverini, P.J., Rao, S., Chou Bouck, N.P., Inhibition of angiogenesis in human glioblastomas by chromosome 10 induction of thrombospondin-1, Cancer Res., 56:5684-5691, 1996.
62. Tanaka, T., Manome, Y., Wen, P., Kufe, D.W., Fine, H.A., Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 CDNA inhibits angiogenesis and tumor growth, Nat. Med., 3:437442, 1997.
Claims (29)
1. Zastosowanie antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania wzrostu nowotworu w mózgu gospodarza.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że integryna jest integryną av, ave3 lub ave5.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antagonista jest wybrany z grupy obejmującej po li peptyd owego antagonistę av, przeciwciała przeciwko ave3, przeciwciała przeciwko ave5 i kombinację przeciwciał odpowiednio przeciwko ave3 i ave5.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że antagonista jest polipeptydowym antagonistą av.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że antagonista av jest polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD).
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że antagonistą jest antagonista av będący cyklicznym pentapeptydem RGD.
7. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że antagonistą jest przeciwciało monoklonalne immunospecyficzne wobec ave3.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne ma reaktywność immunologiczną przeciwciała monoklonalnego oznaczonego LM-609.
9. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że kombinacja przeciwciał, odpowiednio przeciwko ave3 i ave5, jest kombinacją przeciwciała monoklonalnego specyficznego immunologicznie wobec ave3 i przeciwciała monoklonalnego specyficznego immunologicznie wobec ave5.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne, specyficzne immunologicznie wobec ave3 ma reaktywność immunologiczną przeciwciała monoklonalnego oznaczonego LM-609 i przeciwciało monoklonalne specyficzne immunologicznie względem ave5 ma reaktywność immunologiczną przeciwciała monoklonalnego oznaczonego P1-F6.
11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotwór w mózgu gospodarza jest zlokalizowany wewnątrzmózgowo.
12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotwór jest wybrany z grupy obejmującej glejaka, rdzeniaka, gwiaździaka, pierwotnego raka neuroektodermy i będące glejakami nowotwory pnia mózgu.
13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania dootrzewnowo, podskórnie, donaczyniowo, śródskórnie, wewnątrzmaziówkowo, domięśniowo lub doustnie.
14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna obejmuje farmaceutyczny nośnik.
15. Zastosowanie antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania angiogenezy w tkance guza umiejscowionej w mózgu gospodarza.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że integryną jest integryna ave3 lub ave5.
17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że antagonista jest wybrany z grupy obejmującej po li peptyd owego antagonistę av, przeciwciało przeciwko ave3, przeciwciało przeciwko ave5 i kombinację przeciwciał odpowiednio przeciwko ave3 i ave5.
18. Zastosowanie antagonisty integryn ave3 i ave5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania adhezji komórkowej zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) komórek nowotworu mózgu rozwijającego się w mózgu gospodarza.
19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że antagonista jest antagonistą av lub kombinacją przeciwciał odpowiednio przeciwko ave3 i ave5.
20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że antagonista av jest polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD).
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że antagonistą jest antagonista av będący cyklicznym pentapeptydem RGD.
22. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że ECM stanowi witronektyna lub tenascyna.
23. Zastosowanie antagonisty ave3 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania zależnej od witronektyny migracji komórkowej komórek nowotworu mózgu rozwijającego się w mózgu gospodarza.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że antagonista jest antagonistą av lub przeciwciałem przeciwko ave3.
PL 202 082 B1
25. Zastosowanie antagonisty integryny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania apoptozy komórek nowotworu rozwijającego się w mózgu gospodarza.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że integryną jest integryna av, avP3 i avP5.
27. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że antagonistą jest polipeptydowy antagonista av.
28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że antagonista av jest polipeptydem zawierającym Arg-Gly-Asp (RGD).
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że antagonistą jest cykliczny pentapeptydowy RGD antagonista av integryn avP3 i avP5.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11812699P | 1999-02-01 | 1999-02-01 | |
| US09/489,391 US6521593B1 (en) | 1999-02-01 | 2000-01-21 | Methods for inhibiting brain tumor growth |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL359602A1 PL359602A1 (pl) | 2004-08-23 |
| PL202082B1 true PL202082B1 (pl) | 2009-05-29 |
Family
ID=26815994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL359602A PL202082B1 (pl) | 1999-02-01 | 2000-01-26 | Zastosowanie antagonisty integryny |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6521593B1 (pl) |
| EP (1) | EP1150714B1 (pl) |
| JP (1) | JP4708568B2 (pl) |
| KR (1) | KR100704139B1 (pl) |
| CN (2) | CN1191858C (pl) |
| AT (1) | ATE395934T1 (pl) |
| AU (2) | AU775064B2 (pl) |
| BR (1) | BR0007875A (pl) |
| CA (1) | CA2360146C (pl) |
| CZ (1) | CZ301480B6 (pl) |
| DE (1) | DE60038951D1 (pl) |
| DK (1) | DK1150714T3 (pl) |
| ES (1) | ES2304942T3 (pl) |
| HU (1) | HU230025B1 (pl) |
| MX (1) | MXPA01007765A (pl) |
| NO (1) | NO329695B1 (pl) |
| PL (1) | PL202082B1 (pl) |
| PT (1) | PT1150714E (pl) |
| RU (1) | RU2377017C2 (pl) |
| SK (1) | SK287326B6 (pl) |
| WO (1) | WO2000044404A2 (pl) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1345331A (zh) * | 1999-01-06 | 2002-04-17 | 南加利福尼亚大学 | 抑制血管发生的组合物和方法 |
| US7163681B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-01-16 | Centocor, Inc. | Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses |
| US7288390B2 (en) | 2000-08-07 | 2007-10-30 | Centocor, Inc. | Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses |
| JP4351043B2 (ja) * | 2001-07-09 | 2009-10-28 | エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | アミロイド毒性の阻害方法 |
| US7829087B2 (en) | 2001-07-09 | 2010-11-09 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating cognitive impairment |
| US7138370B2 (en) | 2001-10-11 | 2006-11-21 | Amgen Inc. | Specific binding agents of human angiopoietin-2 |
| US7390885B2 (en) * | 2001-11-26 | 2008-06-24 | Cell Matrix, Inc. | Humanized collagen antibodies and related methods |
| US7365167B2 (en) * | 2001-11-26 | 2008-04-29 | Cell Matrix, Inc. | Humanized collagen antibodies and related methods |
| WO2005044978A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-05-19 | Washington University | Methods of treating, preventing and inhibiting cancer metastasis and tumor formation |
| US9198887B2 (en) | 2003-09-15 | 2015-12-01 | Nanopharmaceuticals Llc | Thyroid hormone analogs and methods of use |
| CA2539288C (en) | 2003-09-15 | 2015-05-12 | Shaker A. Mousa | Thyroid hormone analogs and methods of use |
| US8668926B1 (en) | 2003-09-15 | 2014-03-11 | Shaker A. Mousa | Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations thereof |
| US8071134B2 (en) * | 2003-09-15 | 2011-12-06 | Ordway Research Institute, Inc. | Thyroid hormone analogs and methods of use |
| ITRM20040105A1 (it) * | 2004-02-27 | 2004-05-27 | Tecnogen Scpa | Anticorpo monoclonale antitenascina umana. |
| US20090022806A1 (en) * | 2006-12-22 | 2009-01-22 | Mousa Shaker A | Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists and formulations and uses thereof |
| US10130686B2 (en) | 2005-09-15 | 2018-11-20 | Nanopharmaceuticals Llc | Method and composition of thyroid hormone analogues and nanoformulations thereof for treating inflammatory disorders |
| US9498536B2 (en) | 2005-09-15 | 2016-11-22 | Nanopharmaceuticals Llc | Method and composition of thyroid hormone analogues and nanoformulations thereof for treating anti-inflammatory disorders |
| US20100209382A1 (en) | 2005-09-16 | 2010-08-19 | Ordway Research Institute, Inc. | Polyphenol Conjugates as RGD-Binding Compounds and Methods of Use |
| CA2622852A1 (en) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Universiteit Maastricht | Tumor angiogenesis associated genes and a method for their identification |
| EP2054442A2 (en) * | 2006-06-14 | 2009-05-06 | Cell-Matrix, Inc. | Denatured collagen peptides and uses thereof |
| TW200815474A (en) | 2006-08-03 | 2008-04-01 | Astrazeneca Ab | Antibodies alphaVbeta6 and uses thereof |
| EP2120913B1 (en) * | 2006-12-22 | 2015-01-21 | NanoPharmaceuticals LLC | Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations and uses thereof |
| US20110243927A1 (en) * | 2007-08-24 | 2011-10-06 | University Health Network | Methods of inhibiting tumor growth using beta 5 integrin antagonists |
| US20100159021A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-06-24 | Paul Davis | Small Molecule Ligands of the Integrin RGD Recognition Site and Methods of Use |
| WO2010072348A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Merck Patent Gmbh | Biomarkers for inhibitors with anti-angiogenic activity |
| WO2010120506A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Ordway Research Institute, Inc. | Combination treatment of cancer with cetuximab and tetrac |
| CN101659694B (zh) * | 2009-05-06 | 2012-12-12 | 河北科技大学 | 抗肿瘤环五肽化合物及其制备方法 |
| WO2010148007A2 (en) | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Ordway Research Institute, Inc. | Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone, analogs, antagonists, and formulations and uses thereof |
| CN103209690A (zh) | 2010-06-30 | 2013-07-17 | 盖尔德马研究及发展公司 | α肾上腺素能受体激动剂用于预防或治疗皮肤肿瘤的用途 |
| US8802240B2 (en) | 2011-01-06 | 2014-08-12 | Nanopharmaceuticals Llc | Uses of formulations of thyroid hormone analogs and nanoparticulate forms thereof to increase chemosensitivity and radiosensitivity in tumor or cancer cells |
| CN102145161A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-08-10 | 中国药科大学 | 整合素阻断剂在制备治疗肿瘤药物中的应用 |
| EP2780363B1 (en) | 2011-11-17 | 2019-07-03 | Glia SP Z.O.O. | Compositions and methods for treating glioma |
| CN102417540A (zh) * | 2011-11-21 | 2012-04-18 | 中国药科大学 | 一种聚乙二醇修饰的整合素阻断剂hm-3及其应用 |
| US20170000905A1 (en) * | 2015-06-30 | 2017-01-05 | Mousera, Inc | Device and method of personalized medicine |
| JP7074749B2 (ja) | 2016-06-07 | 2022-05-24 | ナノファーマシューティカルズ エルエルシー | αｖβ３インテグリン甲状腺アンタゴニストにコンジュゲートした非開裂性ポリマー |
| US10328043B1 (en) | 2018-04-11 | 2019-06-25 | Nanopharmaceuticals, Llc. | Composition and method for dual targeting in treatment of neuroendocrine tumors |
| US11351137B2 (en) | 2018-04-11 | 2022-06-07 | Nanopharmaceuticals Llc | Composition and method for dual targeting in treatment of neuroendocrine tumors |
| WO2020030954A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-13 | Integrative Medicine Clinic, Sia | Theranostics-like protein sanps conjugated to integrin and pmsa targeting peptides and therapy of prostate cancer |
| RU2709215C1 (ru) * | 2019-09-12 | 2019-12-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр "Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук" (ИК СО РАН) | Способ подавления роста опухолей глиального происхождения |
| US10961204B1 (en) | 2020-04-29 | 2021-03-30 | Nanopharmaceuticals Llc | Composition of scalable thyrointegrin antagonists with improved blood brain barrier penetration and retention into brain tumors |
| US11723888B2 (en) | 2021-12-09 | 2023-08-15 | Nanopharmaceuticals Llc | Polymer conjugated thyrointegrin antagonists |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2123338C1 (ru) * | 1990-06-15 | 1998-12-20 | Сайтел Корпорейшн | Фармацевтическая композиция на основе медиатора межклеточной адгезии (варианты), способ ингибирования межклеточной адгезии, способ лечения воспалительного заболевания, способ анализа тестируемого соединения на способность ингибировать клеточную адгезию, способ получения соединения |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| PT719859E (pt) * | 1994-12-20 | 2003-11-28 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo monoclonal anti-alfa v-integrina |
| DE19534177A1 (de) * | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
| DE19613933A1 (de) * | 1996-04-06 | 1997-10-09 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Adhäsionsinhibitoren |
| CA2256588A1 (en) * | 1996-05-31 | 1997-12-04 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of .alpha.v.beta.5 mediated angiogenesis |
| EP1007026A4 (en) * | 1997-01-17 | 2002-08-07 | Merck & Co Inc | Integrin antagonists |
| US6590079B2 (en) * | 1997-01-30 | 2003-07-08 | Ixsys, Incorporated | Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same |
| US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
| CZ20002269A3 (cs) * | 1998-12-14 | 2001-01-17 | Merck & Co., Inc. | Látky antagonizující receptor íntegrinu |
-
2000
- 2000-01-21 US US09/489,391 patent/US6521593B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-26 KR KR1020017009487A patent/KR100704139B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-26 DK DK00905742T patent/DK1150714T3/da active
- 2000-01-26 AU AU27379/00A patent/AU775064B2/en not_active Ceased
- 2000-01-26 MX MXPA01007765A patent/MXPA01007765A/es not_active IP Right Cessation
- 2000-01-26 WO PCT/US2000/001949 patent/WO2000044404A2/en not_active Ceased
- 2000-01-26 EP EP00905742A patent/EP1150714B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-26 CN CNB008059977A patent/CN1191858C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-26 CN CNB2005100041591A patent/CN1332713C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-26 ES ES00905742T patent/ES2304942T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-26 PL PL359602A patent/PL202082B1/pl unknown
- 2000-01-26 AT AT00905742T patent/ATE395934T1/de active
- 2000-01-26 JP JP2000595706A patent/JP4708568B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-26 DE DE60038951T patent/DE60038951D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-26 SK SK1062-2001A patent/SK287326B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-26 HU HU0105155A patent/HU230025B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-01-26 CA CA2360146A patent/CA2360146C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-26 PT PT00905742T patent/PT1150714E/pt unknown
- 2000-01-26 BR BR0007875-1A patent/BR0007875A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-01-26 CZ CZ20012793A patent/CZ301480B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-07-31 NO NO20013750A patent/NO329695B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-18 US US10/369,369 patent/US20030157098A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-10-15 AU AU2004220756A patent/AU2004220756B2/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-03-18 RU RU2005107614/14A patent/RU2377017C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL202082B1 (pl) | Zastosowanie antagonisty integryny | |
| MacDonald et al. | Preferential susceptibility of brain tumors to the antiangiogenic effects of an αv integrin antagonist | |
| US6475488B1 (en) | Methods of inhibiting angiogenesis and ameliorating cancer by using superfibronectin | |
| WO1998012226A9 (en) | Methods of ameliorating cancer and of inhibiting angiogenesis by using fibronectin | |
| AU2003226349B2 (en) | Methods for inhibiting vascular hyperpermeability | |
| US8465738B2 (en) | Use of vascular endothelial growth factor receptor 1+ cells in treating and monitoring cancer and in screening for chemotherapeutics | |
| PT1468695E (pt) | Métodos e composições úteis para inibição da angiogénese | |
| EP2327451B1 (en) | Method for detecting and inhibiting angiogenesis | |
| RU2255765C2 (ru) | Способ ингибирования роста опухолей головного мозга с помощью отобранных антагонистов интегринов | |
| AU2004317548A1 (en) | Use of EMMPRIN antagonists for the treatment of diseases associated with excessive angiogenesis | |
| ZA200106069B (en) | Methods for inhibiting brain tumor growth by using selected integrin antagonists. | |
| US20050214302A1 (en) | Use of emmprin antagonists for the treatment of diseases associated with excessive angiogenesis |