PL189791B1

PL189791B1 - Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek, wkład zapobiegający krzyżowemu zanieczyszczeniu odczynnikiem oraz kaseta uszczelniona folią

Info

Publication number: PL189791B1
Application number: PL97318258A
Authority: PL
Inventors: Walter Milchanoski; Milan Jorik; Kathleen J. Reis; Diane E. Bechtold; Linda Davis; Thomas M. Setcavage; Donald M. Davies
Original assignee: Ortho Diagnostic Systems Inc
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 2005-09-30
Also published as: PE104298A1; SG78267A1; AR005685A1; ZA97849B; IL120120A; CN1252475C; GR1003213B; CN1487298A; CN1198531A; MY115233A; CN1544948A; IL120120A0; BR9700847A; PL318258A1; RU2191382C2; CO4790148A1; CN1145532C; KR970062693A; MY128785A; CN1908670A

Abstract

1. Naczynie do przeprowadzania te- stów aglutynacyjnych krwinek zawierajace komore z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, zna- mienne tym, ze zawiera dwie komory, ko- more górna (20), z otworem do doprowa- dzania plynnych substratów reakcji i komo- re dolna polaczona z komora górna (20) i zawierajaca matryce do oddzielania aglu- tynatów, przy czym pomiedzy komora górna (20), i komora dolna usytuowany jest element barierowy w postaci spiralnej wkladki (10), posiadajacej elementy utrzy- mujace plyn w górnej komorze (20) w warunkach normalnych w postaci kana- lu wyznaczonego przez zwoje usytuowane na trzonie centralnym. FIG. 11 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek, wkład zapobiegający krzyżowemu zanieczyszczeniu odczynnikiem oraz kaseta uszczelniona folią.

Wynalazek dotyczy testów aglutynacyjnych, a zwłaszcza naczyń do prowadzenia testów aglutynacyjnych i oddzielania czynników powodujących aglutynację.

Badania serologiczne grup krwi wymagają wyznaczenia zgodności krwinek dawcy i biorcy przed przeprowadzeniem transfuzji lub przeszczepieniem organów pacjentowi. Zgodność krwinek określa się brakiem reakcji immunologicznej pomiędzy antyciałami znajdującymi się w surowicy krwi pacjenta a antygenami obecnymi w krwinkach dawcy.

Na powierzchni krwinek każdego osobnika znajduje się wiele różnych antygenów grup krwi. Wyznaczanie grupy krwi jest procesem polegającym na testowaniu krwinek na obecność i nieobecność różnych antygenów. Na ogół robi się to za pomocą antyciał o znanej specyficzności.

W celu wykrycia antyciał w surowicy lub plazmie pacjenta, miesza się z próbką surowicy odczynniki zawierające krwinki ze znanymi antygenami. Odczynniki te inkubuje się przez czas wystarczający do aglutynacji krwinek, która występuje w przypadku obecności antyciał do danych antygenów. Następnie mieszaninę tę wiruje się w wirówce i w razie obecności zaglutynowanych krwinek widać je wyraźnie na dnie naczynia reakcyjnego, co wskazuje na obecność w próbce antyciał przeciwko znanym antygenom na krwinkach. Jeżeli w próbce nie ma antyciał przeciwko znanym antygenom na krwinkach, aglutynacja nie występuje, co sygnalizuje brak zaglutynowanych krwinek po wirowaniu.

Ostatnio opracowano metody, w których reakcja aglutynacji występuje w jednej części naczynia, a oddzielanie zaglutynowanych krwinek odbywa się w innej części tego samego naczynia za pomocą matrycy oddzielającej komórki zaglutynowane od innych składników mieszanki reagenta z próbką. Jedno z takich urządzeń ujawniono i opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 552 064. Naczynia do reakcji aglutynacyjnej i oddzielające, które są także użyteczne w wynalazku ujawnionym we wspomnianym powyżej opisie patentowym, są wytwarzane i sprzedawane przez Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, New Jersey, pod nazwą handlową BIOVUE™. Takie naczynia oddzielające mają postać kolumny z komorą górną i komorą dolną, gdzie średnica komory górnej jest większa niż dolnej. W dolnej komorze znajduje się matryca po oddzielania krwinek zaglutynowanych od niezaglutynowanych. Średnica komory dolnej jest na tyle mała, że po dodaniu do górnej komory odczynników i próbek, zazwyczaj pipetą, odczynniki i próbki pozostają w komorze górnej i nie przepływają do komory dolnej, o ile nie pojawi się dodatkowa siła.

Pośredni test antyglobulinowy, znany jako test Coombsa, jest testem krwi, stosowanym do określenia czy w surowicy pacjenta znajdują się antyciała IgG na określone antygeny znajdujące się na powierzchni krwinek. W teście Coombsa inkubuje się surowicę w obecności krwinek odczynnika, co umożliwia antyciałom związanie antygenów na powierzchni krwinek.

189 791

Te antyciała IgG najczęściej same nie aglutynują krwinek, lub aglutynują je tylko w stopniu nie wystarczającym do ich wzrokowego wykrycia technikami konwencjonalnymi. Dla ułatwienia aglutynacji, którą można zobaczyć, zazwyczaj trzeba dodać drugie antyciało skierowane na IgG człowieka.

W procesie wyznaczania grupy krwi, teście krwi stosowanym do wyznaczania obecności pewnych antygenów na powierzchni krwinek, analizowane krwinki wprowadza się do górnej komory, po czym działa się na nie siłą, na przykład siłą odśrodkową, która przemieszcza je do komory dolnej z antyciałami do konkretnych antygenów krwinek i matrycą oddzielającą. Jeżeli na powierzchni krwinek znajduje(ą) się antygen(y) reagujące ze specyficznym(i) antygenem(ami) w komorze dolnej, to powstają aglutynaty, które można oddzielić za pomocą matrycy.

W innych typach testów krwi, takich jak klasyfikacja rewersyjna, gdzie testuje się bezpośrednio aglutynujące antyciała do antygenów krwinek w surowicy pacjenta, do górnej komory wprowadza się surowicę pacjenta i krwinki reagenta ze znanymi antygenami na swoich powierzchniach, po czym działa się na nie siłą na przykład siłą odśrodkową celu przemieszczenia odczynników do dolnej komory, w której znajduje się ciecz i matryca oddzielająca, ale nie ma antyciała. W teście tego typu, skutkiem obecności w surowicy pacjenta antyciała aglutynującego bezpośrednio jest powstawanie aglutynatów, które można oddzielić za pomocą matrycy^.

W innym typie testu krwi, w górnej komorze osadza się antyciało reagujące o znanej specyficzności do antygenu krwinek oraz krwinki pacjenta. Jeżeli antyciało reagujące jest antyciałem aglutynujacym bezpośrednio, to działa się siłą, na przykład siłą odśrodkową, bez uprzedniej inkubacji, w wyniku czego zawartość jest przetłaczana do komory dolnej z matrycą oddzielającą w roztworze wodnym. Następnie za pomocą matrycy oddziela się aglutynaty. Alternatywnie, krwinki pacjenta osadza się w komorze górnej, po czym dodaje się antyciało reagujące IgG o znanej specyficzności, a następnie inkubuje się mieszankę dla umożliwienia antyciału przyłączenie się do przypuszczalnych antygenów znajdujących się na powierzchni krwinek. Po inkubacji działa się na mieszankę siłą, na przykład siłą odśrodkową, w celu przemieszczenia odczynników do komory dolnej, w której znajduje się matryca oddzielająca i antyciała anty-IgG specyficzne dla antyciała reagującego IgG stosowanego do inkubowania krwinek w komorze górnej. Jeżeli na powierzchni krwinek pacjenta znajduje się antyciało reagujące, antyciało anty-IgG w komorze dolnej ułatwi tworzenie aglutynatów, które można oddzielić za pomocą matrycy.

Po inkubowaniu próbki i odczynników przez okres czasu wystarczający do zajścia albo aglutynacji bezpośredniej, jak w przypadku testu klasyfikacji krwinek, albo reakcji antyciałoantygen, jak w przypadku testu Coombsa, w naczyniu reakcyjnym podnosi się ciśnienie, na przykład wirując, tak, że odczynniki są przetłaczane do dolnej części kolumny i na matrycę oddzielającą. Wskutek wirowania materiały niezaglutynowane migrują w dół przez matrycę oddzielającą, natomiast komórki zaglutynowane zostają na górnej powierzchni matrycy oddzielającej lub rozkładają się wewnątrz matrycy w zależności od stopnia aglutynacji.

Skutkiem silniejszych reakcji aglutynacji jest pozostawanie komórek na górnej części matrycy oddzielającej, natomiast rezultatem słabszych reakcji aglutynacji jest rozłożenie się aglutynatów w różnych odległościach od górnej powierzchni matrycy.

Zatrzymywanie próbki i odczynników w górnej części kolumny podczas fazy inkubacji wynika z napięcia powierzchniowego na górnym obrzeżu dolnej części kolumny, gdzie średnica jest mniejsza niż w części górnej. Stwierdzono, że w testach prowadzonych za pomocą takiej kolumny istnieją dwa potencjalne źródła błędów. Po pierwsze, jeżeli odczynniki i próbkę wprowadza się pipetą bezpośrednio w dół do środka komory reakcyjnej, używając zbyt dużej siły, odczynniki mogą osadzać się bezpośrednio na górnej powierzchni matrycy oddzielającej w dolnej komorze i podczas fazy inkubacji nie utrzymują się w komorze górnej.

Zatem odczynniki zaczynają wnikać w matrycę oddzielającą przed zakończeniem aglutynacji. Po drugie, zachodzi potencjalna możliwość przepływu rozcieńczalnika lub roztworu zawierającego matrycę oddzielającą do komory górnej. Może to nastąpić wskutek rozchlapywania lub innych zakłóceń, na przykład podczas przenoszenia i manipulowania naczyniami.

W pewnych przypadkach, w których roztwór lub rozcieńczalnik zawierający matrycę oddzielającą zawiera również antyciała lub inne odczynniki, które bezpośrednio wpływają na

189 791 wynik testu, takie rozchlapywanie może doprowadzić do wzajemnego zanieczyszczenia zawartości kolumn pewnymi odczynnikami pochodzącymi z innych kolumn. Może to również wystąpić kiedy użytkownik wkłada końcówkę pipety do komory reakcyjnej, zanieczyszczając ją rozchlapanym odczynnikiem, który może następnie przenieść pipetą do innego naczynia.

Może to doprowadzić do uzyskania błędnych wyników testu aglutynowego.

A zatem celem wynalazku jest opracowanie naczynia z usprawnionym mechanizmem oddzielającym próbkę od odczynników podczas fazy inkubacji w teście aglutynacyjnym. Kolejnym celem wynalazku jest opracowanie konstrukcji środków zapobiegających przemieszczaniu materiałów znajdujących się w dolnej części kolumny.

Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek zawierające komorę z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, odznacza się według wynalazku tym, że zawiera dwie komory, komorę górną z otworem do doprowadzania płynnych substratów reakcji i komorę dolną połączoną z komorą górną i zawierającą matrycę do oddzielania aglutynatów, przy czym pomiędzy komorą górną i komorą dolną usytuowany jest element barierowy w postaci spiralnej wkładki, posiadającej elementy utrzymujące płyn w górnej komorze w warunkach normalnych w postaci kanału wyznaczonego przez zwoje usytuowane na trzonie centralnym.

Korzystnie spiralna wkładka jest z polipropylenu lub reksolitu.

Korzystnie średnica spiralnej wkładki jest w przedziale od około 2,794 mm do 3,556 mm.

Korzystnie średnica trzonu spiralnej wkładki wynosi od około 0,762 do 2,286 mm.

Korzystnie spiralna wkładka ma około 2,36 do 11,81 zwojów na cm.

Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek zawierające komorę z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, charakteryzuje się według wynalazku tym, że zawiera dwie komory, komorę górną z otworem do doprowadzania płynnych substratów reakcji i komorę dolną połączoną z komorą górną i zawierającą matrycę do oddzielania aglutynatów, przy czym pomiędzy komorą górną i komorą dolną usytuowany jest element barierowy w postaci przepony posiadającej elementy utrzymujące płyn w górnej komorze w warunkach normalnych w postaci centralnego otworu.

Korzystnie przepona jest z kauczuku silikonowego. Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek zawierające komorę z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, odznacza się według wynalazku tym, że zawiera dwie komory, komorę górną z otworem do doprowadzania płynnych substratów reakcji i komorę dolną połączoną z komorą górną i zawierającą matryce do oddzielania aglutynatów, przy czym pomiędzy komorą górną i komorą dolną usytuowany jest element barierowy w postaci porowatej zatyczki posiadającej elementy utrzymujące płyn w górnej komorze w warunkach normalnych w postaci przelotowych kanałów.

Korzystnie porowata zatyczka jest z polipropylenu.

Wkład zapobiegający krzyżowemu zanieczyszczaniu odczynnikiem lub roztworem z jednej kolumny kasety do testów aglutynacyjnych innej kolumny tej kasety, zawierający korpus oraz co najmniej jeden element wystający z korpusu charakteryzuje się według wynalazku tym, że element wystający z korpusu stanowi element stożkowy, mający otwór w swoim zwężonym wierzchołku, przy czym element stożkowy jest otoczony pierścieniem samouszczelniającym o przekroju okrągłym.

Korzystnie element stożkowy zawiera pierwszy koniec, w którym znajduje się zwężony wierzchołek, oraz drugi koniec, znajdujący się w pewnej odległości od niego w sąsiedztwie korpusu, przy czym pierścień samouszczelniający o przekroju okrągłym znajduje się w drugim końcu lub w jego pobliżu.

Korzystnie pierścień samouszczelniający o przekroju okrągłym stanowi integralną część elementu stożkowego.

Korzystnie w jego skład wchodzi sześć wystających z korpusu elementów stożkowych o wierzchołkach usytuowanych w jednej linii.

Korzystnie ma wymiary dobrane do naczyń reakcyjnych kasety.

Korzystnie wkład jest z akrylu.

Kaseta uszczelniona folią, zawierająca więcej niż jedno naczynie reakcyjne oraz wkład zawierający korpus z co najmniej jednym wystającym z niego elementem odznacza się we6

189 791 dług wynalazku tym, że zawiera sześć naczyń reakcyjnych rozmieszczonych w niej liniowo, zaś wkład, zawiera korpus z sześcioma wystającymi z niego elementami stożkowymi o wierzchołkach usytuowanych w jednej linii, przy czym elementy stożkowe mają zwężony wierzchołek do przebijania uszczelnienia foliowego, i włożony wkład jest sprzężony ciernie w kasecie, zaś uszczelnienie stanowią pierścienie samouszczelniające o przekroju okrągłym otaczające każdy z elementów stożkowych i stanowiące ich integralną część.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano usprawnione naczynie do realizacji reakcji aglutynacji i rozdzielania aglutynatów. W skład tego naczynia wchodzi komora górna z otworem wlotowym, w której znajdują się odczynniki, komora dolna, w której rozdziela się aglutynaty, oraz element barierowy oddzielający te komory, będący w stanie utrzymywać substraty reakcji w komorze górnej przed wprowadzeniem zawartości komory górnej do matrycy oddzielającej, oraz pozwalający na przepływanie zawartości komory górnej do komory dolnej po przyłożeniu do elementu barierowego siły (tj. większej niż ciśnienie atmosferyczne).

W zalecanym przykładzie wykonania, w elemencie barierowym znajduje się zwężający się kanał biegnący pomiędzy komorą górną a dolną. Taki zwężający się kanał można za pomocą wkładki ze zwężonym za pomocą obciskania otworem, albo za pomocą wkładki o geometrii spiralnej lub innej podobnej, którą można albo uformować z komorą górną i dolną, albo włożyć pomiędzy te komory podczas produkcji. Taka wkładka zapewnia fizyczną barierę zmniejszającą wielkość otworu pomiędzy komorą dolną a górną, lepiej zapobiegając zanieczyszczaniu górnej komory zawartością komory dolnej.

Ponadto, wkładka taka lepiej oddziela próbkę i odczynniki podczas inkubacji. W przypadku wkładki spiralnej, kanał ograniczony zwojem, trzonem centralnym i ściankami kolumny spirali jest na tyle mały, że przy normalnej grawitacji i ciśnieniu atmosferycznym zatrzymuje ciecz w komorze górnej. Korzystnie średnica spiralnej wkładki jest w zakresie od około 2,794 mm do około 3,556 mm. Średnica trzonu spiralnej wkładki wynosi około 0,762 do 2,286 mm. Spiralna wkładka ma około 2,36 do 11,81 zwojów na cm.

Zwężający się kanał można również wykonać zgrzewając ultradźwiękami kolumnę, co robi się po niej odczynników. Ponadto w kanale tym może znajdować się element barierowy w postaci przepony. W tym ukształtowaniu wynalazku w przeponie znajduje się centralny otwór na tyle mały, że zatrzymuje ciecz w komorze górnej przy normalnej grawitacji i ciśnieniu atmosferycznym. Korzystnie, przepona ta jest wykonana z kauczuku silikonowego. W kanale może ponadto znajdować się element barierowy w postaci porowatej zatyczki. W porowatej zatyczce znajdują się przelotowe kanały na tyle małe, że zatrzymują ciecz w górnej komorze przy normalnej grawitacji ciśnieniu atmosferycznym. Korzystnie, porowata zatyczka jest z polipropylenu.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku, naczynie według wynalazku zawiera wkład zawierający korpus oraz co najmniej jeden element wystający z korpusu, ma element wystający w postaci stożkowego elementu z przelotowym otworem w zwężającym się wierzchołku. Po umieszczeniu na górze i włożeniu do kolumnowego naczynia reakcyjnego przed wprowadzeniem próbki pipetą do naczynia, wkład ten zapobiega wzajemnemu zanieczyszczeniu rozcieńczalnikiem lub roztworem z jednego naczynia do drugiego naczynia, co w razie jego braku może nastąpić podczas takiego pipetowania.

Korzystnie, użytkownik umieszcza wspomniany wkład na szczycie kolumny przed pipetowaniem odczynników;. Wkład może zwierać korpus z sześcioma stożkowymi elementami lub komórkami umieszczonymi obok siebie; całkowite pole powierzchni i kształt wkładki są takie same jak górna strona kasety BIOVUE™.

W skład wkładu wchodzi korpus i co najmniej jeden, wychodzący z niego stożkowy człon, w którego zwężającym się wierzchołku znajduje się otwór, i w którym są elementy uszczelniające usytuowane w miejscu leżącym w pewnej odległości od wspomnianego zwężającego się wierzchołka. Stożkowy element ma pierwszy koniec ze zwężającym się wierzchołkiem oraz drugi koniec, usytuowany w pewnej odległości od niego w sąsiedztwie korpusu, przy czym elementy środki uszczelniające znajdują się na drugim końcu lub w jego sąsiedztwie. Elementy uszczelniające stanowi pierścień samouszczelniający o przekroju okrągłym (typu O-ring) otaczający element stożkowy, przy czym pierścień ten może być integralną częścią elementu stożkowego. W zalecanym przykładzie wykonania w skład wkładu wchodzi

189 791 sześć wystających z korpusu stożkowych elementów o wierzchołkach usytuowanych w jednej linii, a wymiary wkładu pasują do naczyń reakcyjnych kasety. Korzystnie, wkład jest wykonany z tworzywa akrylowego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto uszczelniona folią kaseta z sześcioma naczyniami reakcyjnymi, usytuowanymi w niej liniowo, oraz wkład z korpusem i sześcioma, wystającymi z niego elementami stożkowymi o wierzchołkach usytuowanych w jednej linii, które to elementy mają zwężony wierzchołek przystosowany do przebijania uszczelnienia foliowego, przy czym wkład ten jest sprzężony ciernie, po włożeniu, ze wspomnianą kasetą tak, że połączenie pomiędzy kasetą a wkładem jest szczelne. Elementami uszczelniającymi połączenie są pierścienie uszczelniające typu O-ring, otaczające każdy ze stożkowych elementów i, korzystnie, stanowiące integralne elementy każdego ze stożkowych członów.

Przedmiot wynalazku uwidoczniono w przykładzie wykonania na rysunku, na którym, fig. 1 przedstawia naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek z wkładką z wąskim otworem umieszczonym w górnej komorze reakcyjnej; fig. 2 - kasetę z sześcioma naczyniami reakcyjnymi, w rzucie z góry, na którym widać cztery naczynia bez wkładek i jedno naczynie drugie od lewej) z wkładką pokazanym, na fig. 1, oraz jedno naczynie (trzecie od lewej) z odczynnikami; fig. 3 - kasetę z naczyniami reakcyjnymi, w przekroju płaszczyzną 3-3 na fig. 2; fig. 4 - kasetę z naczyniami reakcyjnymi, w rzucie z boku; fig. 5 - wkładkę z wąskim otworem wewnątrz górnej komory naczynia reakcyjnego, w przekroju poprzecznym płaszczyzną 5-5 na fig. 2; fig. 6 - górną komorę naczynia reakcyjnego z wąskim otworem; fig. 7 - wkładkę z wydłużoną częścią z otworem znajdującym się w komorze dolnej; fig. 8 - kasetę z fig. 3 w przekroju poprzecznym płaszczyzną 8-8; fig. 9 - naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych po obciśnięciu bezpośrednio pod komorą górną; fig. 10 - naczynie z fig. 9 w przekroju poprzecznym płaszczyzną 10-10; fig. 11 - naczynie reakcyjne i oddzielające według wynalazku ze spiralną wkładką 10 umieszczoną w komorze górnej 20, której część dolną 30 zmodyfikowano dla wpasowania tej wkładki; fig. 12 - wkładkę w różnych konfiguracjach, w rzutach bocznych; (A) wkładkę o średnicy całkowitej 1 równej 3,048 mm i trzon wewnętrzny o średnicy 2 równej 1,524 mm; (B) wkładkę o średnicy całkowitej równej 3,048 mm i trzon wewnętrzny o średnicy 2 równej 2,032 mm; fig. 13 - wkładkę spiralną o średnicy całkowitej 1 równej 3,048 mm i trzon wewnętrzny o średnicy równej 2,032 mm, w rzutach z boku, i fig. 14 - jeden element wkładu dopasowany do górnej komory kolumny zbiornika reakcyjnego, w każdym stożkowym elemencie lub komórce znajduje się pierścień samouszczelniający O-ring usytuowany wokół elementu lub komórki poniżej korpusu wkładu, i fig. 15 - wkład z sześcioma stożkowymi elementami lub komórkami z ostrymi wierzchołkami dopasowanymi do wewnętrznych komór w kasecie z sześcioma kolumnami naczyń reakcyjnych. Każdy element ma pierścień uszczelniający O-ring otaczający go pod korpusem wkładu.

Każdy człon ma ponadto wierzchołek 50 przystosowany do przebijania foliowego uszczelnienia pokrywającego kolumny naczyń reakcyjnych kasety.

Zgodnie z wynalazkiem, naczynia do przeprowadzania testów aglutynacyjnych i oddzielania aglutynatów zostaną opisane na przykładach wykonania. Niektóre z tych przykładów można lepiej zrozumieć dzięki opisowi aglutynacyjnych naczyń reakcyjnych i oddzielających wytwarzanych i sprzedawanych w postaci kaset przez firmę Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, New Jersey, pod nazwą handlową BIOVUE™.

Naczynia według wynalazku można wytwarzać z dowolnego, nadającego się do tego materiału, który nie przeszkadza w wizualizacji wyników reakcji aglutynacji ani oddzielania, takiego jak szkło lub różne tworzywa sztuczne. W zalecanym przykładzie wykonania naczynia są wykonane z polipropylenu.

Górna komora naczynia może mieć dowolny kształt i wymiary umożliwiające trzymanie w niej odczynników i próbki podczas procesu inkubacji. Typowo, najwyższa część górnej komory jest cylindryczna. Element barierowy usytuowany pomiędzy komorą górną i dolną wyznacza zazwyczaj dolną granicę komory górnej i górną granicę komory dolnej. W przykładzie wykonania pokazanym na fig. 1, 5, 6, 7 element barierowy, który tworzy dolną część komory górnej, jest stożkowy. Część tego elementu barierowego jest zbudowana w taki sposób, żeby podczas inkubacji w warunkach normalnej grawitacji i ciśnienia atmosferycznego utrzymywała odczynniki i próbkę w górnej komorze, ale jednocześnie pozwalała na przepływ

189 791 cieczy z pierwszej komory do drugiej po pojawieniu się siły, takiej jak zwiększone ciśnienie lub siła odśrodkowa. Można to zrealizować za pomocą różnych środków, takich jak mały otwór, membrana, zatyczka, zwężka, wkładka o dowolnej geometrii, lub siatka, oraz ich kombinacje.

W zalecanym przykładzie wykonania, w elemencie barierowym znajduje się otwór o średnicy na tyle małej, żeby zapobiegał przepływowi cieczy z komory pierwszej do drugiej w warunkach normalnej grawitacji i ciśnienia atmosferycznego, natomiast pozwalał na przepływ cieczy po wzroście ciśnienia. Otwór 1 znajduje się w wierzchołku stożkowej części górnej komory, albo we wkładce 2, jak pokazano na fig. 1, 5 lub 7, albo stanowi integralny element komory górnej, jak pokazano na fig. 6.

Średnica otworu może być dowolna, ale na tyle mała, żeby napięcie powierzchniowe cieczy w komorze górnej uniemożliwiało przepływ z komory górnej do dolnej przy normalnej grawitacji lub ciśnieniu atmosferycznym, ale jednocześnie umożliwiała przezwyciężenie napięcia powierzchniowego, a zatem umożliwiała przepływ zawartości z komory górnej do dolnej po wzroście ciśnienia lub sił grawitacyjnych. Średnicę otworu można zmieniać w zależności od wielkości stosowanej siły, tj. zmniejszać ją w przypadku działania większą siłą i zwiększać przy sile mniejszej. Średnicę tę można również zmieniać dostosowując ją do różnej wielkości cząstek w odczynnikach. W zalecanym przykładzie wykonania średnica otworu jest w przedziale wartości od około 0,254 mm do 1,27 mm. W specjalnie zalecanym przykładzie wykonania, średnica tego otworu wynosi 0,508 mm.

W przykładzie wykonania wynalazku pokazanym na fig. 11, element barierowy oddzielający komorę górną od dolnej ma postać spiralnej wkładki 10, taka spiralna wkładka może mieć postać śruby. Korzystnie, przekrój spiralnej wkładki 10 jest okrągły lub cylindryczny, ale dopuszcza się również kształt owalny. Podobnie jak w opisanym powyżej otworze, średnica kanału wyznaczonego przez trzon, zwoje spiralnej wkładki oraz ścianki komory jest na tyle mała, że uniemożliwia cieczy przepływ z komory górnej do dolnej przy normalnej grawitacji lub ciśnieniu atmosferycznym, natomiast pozwala jej na przepływ przy zwiększonej sile lub ciśnieniu. Następnym zadaniem wkładki jest zmniejszanie możliwości rozchlapywania rozcieńczalnika lub roztworu z komory dolnej do komory górnej, a tym samym zanieczyszczania komory górnej. Takie rozchlapywanie może pojawić się, na przykład, podczas transportu i manipulowania. Sj^ii^i^llę umieszcza si^ w komorze górnej 20prrzy jej podssawie, jalk widać na fig. 11, albo też może ona stanowić integralny element uformowany w takim położeniu podczas formowania naczynia reakcyjnego.

Spiralną wkładkę 10 wkładaną oddzielnie do komory górnej można wykonać z dowolnego, nadającego się do tego celu materiału, który nie koliduje z reakcją aglutynacyjną ani oddzielaniem, a także nie zakłóca wizualizacji wyników, takiego jak, na przykład, szkło lub tworzywa sztuczne. Korzystnie, materiałem tym jest tworzywo sztuczne, na przykład polipropylen, poliamidy takie jak nylon, żywice acetalowe takie jak Delrin™ lub Derlin P™, usieciowany kopolimer styrenu z dwuwinylobenzenem, taki jak Rexolite™, poliwęglany lub polietyleny.

W zalecanym przykładzie wykonania materiałem tym jest polipropylen.

Spiralna wkładka 10 może mieć dowolną geometrię, taką, żeby napięcie powierzchniowe cieczy w górnej komorze zapobiegało przepływowi z komory górnej do dolnej przy normalnej grawitacji lub ciśnieniu atmosferycznym, ale żeby pozwalała ona na przezwyciężenie napięcia powierzchniowego, a zatem umożliwiała przepływ zawartości z komory górnej do dolnej po wzroście ciśnienia lub sił grawitacyjnych.

Przykładowo, spiralne zwoje mogą być pochylone pod dowolnym kątem umożliwiającym przepływ cieczy (np. z krwinkami) pod większym ciśnieniem z komory górnej do dolnej, ale uniemożliwiającym zanieczyszczanie komory górnej cieczą lub matrycą z komory dolnej. Pochylenie to można zmieniać w zależności od wielkości stosowanej siły, tj. stosować mniejsze pole opisywane przez trzon spirali i zwoje oraz ścianki komory przy działaniu większą siłą, oraz większe pole przy działaniu mniejszą siłą. Geometrię spirali można również zmieniać w zależności od wymiarów cząstek odczynników. Ponadto, wkładka bardziej zapobiega rozchlapywaniu zawartości kolumny (rozcieńczalnika lub roztworu z matrycą oddzielającą) do komory górnej.

189 791

W przykładzie wykonania naczynia według wynalazku do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek z elementem barierowym w postaci spiralnej wkładki, liczbę zwojów na cm i głębokość gwintu ogranicza tylko skuteczność zapobiegania przez spiralną wkładkę zanieczyszczaniu komory górnej cieczą znajdującą się w komorze dolnej (przy dolnej granicy zakresu), oraz zdolność próbki, na przykład krwinek, do przepływu w dół wzdłuż spiralnej wkładki pod zwiększonym ciśnieniem (przy górnej granicy zakresu). Z powyższych przyczyn oraz ze względu na łatwość przepływu krwinek i innych aglutynatów przechodzących przez element barierowy, zwoje, trzon i ścianki kolumny wyznaczającej kanał powinny mieć stosunkowo gładką teksturę i wykończenie. Ścianki części zwojowej spiralnej wkładki dochodzące do ścianki kolumny mogą być ostre lub płaskie.

W zalecanym przykładzie wykonania, oraz do stosowania w kasecie BIOVUE™ w aktualnej konfiguracji, zawierającej sześć naczyń reakcyjnych, spiralna wkładka ma około 2,4 do 11,8 zwojów na cm, bardziej korzystnie od około 4,7 do około 7,9 zwojów na cm, a pochylenie mierzone w mm od szczytu jednego zwoju do szczytu następnego dolnego zwoju jest w granicach od około 0,838 do około 4,22 mm, a bardziej korzystnie od około 1,27 do około 2,11 mm.

Całkowita średnica spiralnej wkładki jest w granicach od około 2,794 mm do około 3,556 mm, a bardziej korzystnie od około 3,048 mm do około 3,302 mm.

Trzon spiralnej wkładki jest w zakresie od około 0,762 mm do około 2,286 mm, a bardziej korzystnie, od około 1,524 mm do około 2,032 mm. Odpowiednie przykłady zamieszczono na fig. 11, 12 i 13, na których widać porównawcze geometrie elementów składowych wkładki. Wymiary geometryczne podane na fig. 13 mogą mieć następujące wartości (w mm):

Zwojów/cm	DIM 3	DIM 6
4,72	2,108	0,508
5,51	1,778	0,508
6,30	1,524	0,381

Zamiast wkładki spiralnej o średnicy kołowej, umieszczanej w zmodyfikowanej dolnej części 30 górnej komory 20 z fig. 11, zgodnie z wynalazkiem są również spiralne wkładki o kształcie owalnym o podobnej geometrii i pochyleniu. Jak już wspomniano w odniesieniu do spiralnej wkładki o średnicy kołowej, owalne elementy barierowe mogą mieć postać wkładki lub spiralnej zwężki uformowanej w jednym zespole z komorami.

Kolejnym rozwiązaniem alternatywnym jest zwężający się kanał pomiędzy komorą górną a dolną, formowany techniką zgrzewania ultradźwiękowego kolumny po załadowaniu do niej odczynników. Alternatywnie, elementem barierowym może być tarcza lub zatyczka z porowatego materiału usytuowana w górnej części dolnej komory lub kolumny. Zatyczka ma postać cylindra o wymiarach umożliwiających jej wkładanie pomiędzy komorę górną a dolną, przystosowanego do zapobiegania rozchlapywaniu się zawartości komory dolnej (np. odczynnika i matrycy oddzielającej) do komory górnej.

Ponadto porowata zatyczka jest przystosowana do zapobiegania przedwczesnemu (np. przed wirowaniem) przepływowi próbki, ale do przepuszczania próbki pod ciśnieniem wyższym od atmosferycznego (np. w wyniku wirowania). Porowata zatyczka jest wykonana z dowolnego materiału nie zakłócającego reakcji aglutynacji ani oddzielania, ani wizualizacji wyników, ani nie wiążącego się specyficznie z jednym z jego składników, na przykład ze szkła, a bardziej korzystnie ze szkła spiekanego lub z tworzywa sztucznego, na przykład z polipropylenu.

Inne, nadające się do tego celu, elementy barierowe mogą mieć postać kołnierzy osadzonych w spirali, stopniowej kaskady wokół wewnętrznej ścianki komory, albo innych, podobnych konstrukcji o krętym biegu, działających w sposób podobny do opisanego powyżej i zapobiegających zanieczyszczeniu zawartości górnej komory. Bariera ta może mieć również postać kołowego zaworu lub przepony umieszczonej w kolumnie. W takiej przeponie może znajdować się, na przykład, centralny otwór oraz promieniowe nacięcia biegnące od ścianki

189 791 kolumny do centralnego otworu. Po przyłożeniu siły przepona otwiera się umożliwiając przepływ zawartości z komory górnej do dolnej. Przepona może być wykonana z dowolnego, nadającego się do tego celu materiału, nie zakłócającego reakcji aglutynacji ani oddzielania, ani wizualizacji wyników. Można ją wykonać z dowolnego giętkiego, podatnego materiału, na przykład z kauczuku silikonowego.

W przypadku stosowania naczynia do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek według wynalazku do przeprowadzenia reakcji aglutynacji i oddzielania, odczynniki i próbkę umieszcza się w komorze górnej do inkubacji. Podczas inkubacji element barierowy utrzymuje próbkę i odczynniki w komorze górnej.

W zalecanym przykładzie wykonania, gdy w elemencie barierowym znajduje się otwór, albo ma ona postać spiralnej wkładki, średnica otworu lub geometria spirali, odpowiednio, są na tyle małe, że przy normalnej grawitacji i ciśnieniu atmosferycznym napięcie powierzchniowe cieczy i próbki na otworze lub spirali utrzymuje zawartość w komorze górnej. Po wystarczającym czasie inkubacji, na element barierowy działa się siłą za pomocą jednego z różnorodnych środków, na przykład wirowania, ciśnienia lub ssania, w kierunku w przybliżeniu osiowym od komory górnej ku komorze dolnej. Wielkość tej siły musi być wystarczająca do przezwyciężenia elementu barierowego i umożliwienia przepływu zawartości komory górnej do komory dolnej.

W zalecanym przykładzie wykonania, gdzie w elemencie barierowym znajduje się otwór, lub gdzie element barierowy ma postać spiralnej wkładki, siła ta pokonuje opór elementu barierowego i zawartość spływa z komory górnej do komory dolnej na matrycę oddzielającą

Element barierowy ma również duże znaczenie dla zapewnienia środków do zmniejszania zanieczyszczenia komory górnej rozcieńczalnikiem lub roztworem z komory dolnej, jakie może ewentualnie wystąpić w wyniku rozchlapywania się lub innego zaburzania zawartości podczas transportu i manipulowania.

Kolejnym przykładem wykonania urządzenia według wynalazku jest wkład, który wkłada się w górną część naczynia reakcyjnego bezpośrednio przed dodaniem próbki. Wkład ten ma korpus i jeden albo, korzystnie, więcej wystających z niego elementów lub komórek, mających kształt stożkowy względnie lejkowy. Zwężony wierzchołek elementu stożkowego, w którym znajduje się otwór, po włożeniu do kasety, jest zwrócony ku wnętrzu naczynia, jak widać na fig. 14 i 15.

Wkład ten można stosować w naczyniach z elementami barierowymi takimi jak zwężki lub wkładki lub bez elementów barierowych. W zalecanym przykładzie wykonania, wkład zawiera korpus oraz element stożkowy wystający z niego z otworem o średnicy na tyle małej, że utrzymuje próbkę doprowadzoną do naczynia do chwili, kiedy poddaje się je działaniu siły (np. podczas wirowania), pod warunkiem, że czas inkubacji nie przedłuża się wskutek jakiegoś zjawiska izolacji szczeliny powietrznej pomiędzy wierzchołkiem a matrycą oddzielającą w kolumnie, lub na tyle dużej, że umożliwia doprowadzonej próbce łatwy przepływ do komory naczynia reakcyjnego, pod warunkiem, że urządzenie testowe może tolerować wczesny kontakt z rozchlapanym odczynnikiem.

Korzystnie, element stożkowy wkładu ma elementy uszczelniające usytuowane w miejscu znajdującym się w pewnej odległości od zwężonego wierzchołka, np. na ich zewnętrznych powierzchniach górnych, bezpośrednio pod korpusem wkładu. Rozwiązanie to pokazano na fig. 14 i 15. Elementem uszczelniającym jest gruby pierścień, korzystnie integralny z wkładką. Element wystający wkładu wchodzi do górnej komory naczynia reakcyjnego tak, że podczas normalnych manipulacji nie można go łatwo odłączyć. Pierścień uszczelniający np. typu O-ring ma spoczywać na obrzeżu wokół naczynia na górnej powierzchni kasety, gdzie uszczelnia połączenie pomiędzy wkładem a kasetą. Pierścień uszczelniający zapobiega kapilarnemu przenikaniu rozchlapanej zawartości pomiędzy kolumnami.

Jak już wspomniano wcześniej, jeżeli w naczyniach nie ma wkładów, rozcieńczalnik lub roztwór z matrycą oddzielającą może podczas transportu lub manipulowania wchodzić do komory górnej. W takim przypadku, i w sytuacji, kiedy w matrycy oddzielającej mogą znajdować się również antyciała lub inne odczynniki wpływające bezpośrednio na wyniki testu, skutkiem takiego rozchlapywania może być zanieczyszczenie zawartości jednej z kolumn

189 791 odczynnikami z innych. Może to nastąpić kiedy użytkownik wkłada końcówkę pipety do górnej komory naczynia reakcyjnego, zanieczyszczając końcówkę rozchlapanym odczynnikiem, który może następnie przenieść na pipecie do innego naczynia. Może to doprowadzić do sfałszowania wyników testu aglutynacyjnego.

Zadaniem wkładu jest zapobieganie podczas pipetowania zanieczyszczaniu odczynnikami z jednego naczynia innych naczyń; a mianowicie takimi odczynnikami, które mogły rozchlapać się podczas transportu i manipulowania do komory górnej.

Wkład ten może zawierać korpus z pojedynczym stożkowym elementem lub komórką, który umieszcza się pojedynczo na szczycie każdego naczynia reakcyjnego.

Jednakże w zalecanym przykładzie wykonania, przedstawionym na fig. 15, wkład ten zawiera pojedynczy korpus z sześcioma takimi, umieszczonymi obok siebie stożkowymi elementami, stanowiącymi integralne elementy korpusu. Taka konfiguracja umożliwia umieszczanie pojedynczego wkładu z sześcioma poszczególnymi elementami stożkowymi na szczycie kasety BIOVUE™ z sześcioma naczyniami reakcyjnymi.

Jak widać na fig. 14 i 15, każdy stożkowy element wkładu ma zwężający się, ostro zakończony wierzchołek z przelotowym otworem. Naczynia BIOVUE™ dostarcza się w formie kasety zawierającej sześć kolumn, z górnymi częściami szczelnie zamkniętymi paskami folii pod naciskiem ręki spiczaste wierzchołki stożkowych elementów wkładu przebijają foliowe uszczelnienie nad wszystkimi sześcioma kolumnami. Następnie można doprowadzić próbkę badawczą pipetą bezpośrednio do komórek. Dzięki takiemu rozwiązaniu w czystych komórkach wkładu nie ma żadnych odczynników zanieczyszczających ani matrycy oddzielającej, które w przeciwnym przypadku mogłyby zetknąć się z próbką i przenieść się wraz z nią do innej kolumny.

Użytkownik może wygodnie włożyć wkład do kolumn ręcznie albo za pomocą odpowiedniego ostrego narzędzia. W celu włożenia sześciokomórkowego wkładu do kasety BIOVUE™, przebija się folię kasety końcówkami wkładu, po czym wkłada w całości ruchem kołyszącym. Odpowiednie narzędzie z występami pomaga w zestrojeniu pozycyjnym wkładu i kasety podczas wkładania. Ponieważ pole i kształt korpusu wkładu i górnej powierzchni kasety są, korzystnie, takie same, to podczas manipulowania kasetą wkład może, korzystnie, pozostawać w miejscu.

Taki sposób stosowania wkładu nie zakłóca przebiegu ani wyników testu (np. wirowania, swobodnego przepływu niezaglutynowanych krwinek przez matrycę oddzielającą, oraz wchodzenia zaglutynowanych krwinek do kolumny). Jednakże kolumny, w których nie ma pierścieni uszczelniających typu O-ring nie zapobiegają możliwości międzykolumnowego zanieczyszczania podczas eksploatacji. Patrz przykłady 10 i 11 dotyczące porównawczych testów funkcjonalnych wkładów z pierścieniami O-ring. Podane tam wyniki świadczą o zapobieganiu przez pierścienie O-ring międzykolumnowemu zanieczyszczaniu odczynników, jakie może wystąpić wskutek „przesączania” się odczynnika pomiędzy folią kasety a wkładem z towarzyszącym temu przepływem odczynnika po górnej powierzchni kasety.

Wkład i jego elementy stożkowe stanowiące komórki mogą być wykonane z dowolnego, nadającego się do tego celu materiału, nie zakłócającego reakcji aglutynacji ani oddzielania, na przykład ze szkła lub z tworzywa sztucznego. Materiał ten musi nadawać się do przebijania foliowego uszczelnienia na kasecie. Dla umożliwienia sprawnego dostarczania próbki z komórki wkładu do komory górnej, korzystnie, tekstura i wykończenie ścianki komórki wkładu powinny być stosunkowo gładkie.

Korzystnie, jako materiał stosuje się tworzywo sztuczne, na przykład poliester, acetal, akryl, akrylo-nitrylo-butadieno-styren (ABS), nylon, poliwęglan, poliamid lub polipropylen. W zalecanym przykładzie wykonania jako materiał zastosowano tworzywo akrylowe.

W systemie Biovue™ inkubacja 10 (il krwinek odczynnikowych w 40 pl surowicy pacjenta wraz z 40 pl roztworu o małej mocy jonowej pojawia się w komorze górnej po 10 minutach, umożliwiając założonym antyciałom IgG pacjenta związanie się z antygenem (lub antygenami) znajdującym się na powierzchni krwinek. Te składniki testu dodaje się oddzielnie i ważne jest, żeby pozostały w komorze górnej tak, żeby mogły się mieszać, zapewniając stały stosunek roztworu o słabej mocy jonowej do krwinek i do surowicy w każdym z testów. Zadaniem elementu barierowego jest ułatwianie tego przy normalnej

189 791 sile grawitacji i ciśnieniu. Służy on również do zmniejszania szansy wtłoczenia jednego ze składników testu do komory dolnej podczas dodawania próbki. Element barierowy umożliwia również pozostawanie składników testu w komorze górnej w ciągu całego procesu inkubacji. Ten element barierowy ma również duże znaczenie dla zapobiegania przedwczesnemu wiązaniu się antyciał przeciwludzkich IgG z założonymi przeciwciałami antykrwinkowymi w surowicy pacjenta, zanim zwiążą się one z krwinkami, co zmniejsza szansę wyłącznego przebiegu aglutynacji w komorze dolnej. Po inkubacji, na zespół działa się siłą odśrodkową w celu przemieszczenia zawartości komory górnej przez barierę do komory dolnej, w której znajduje się antyludzki IgG wiążący się z IgG pacjenta na powierzchni krwinek odczynnikowych, powodując w ten sposób aglutynację do postaci, w której nie przechodzą przez matrycę na dno komory dolnej.

Poniżej przedstawiono przykłady, które mają wyłącznie charakter ilustracyjny, a nie ograniczający zakres wynalazku.

Przykład 1

Porównywano kolumny BIOVUE™ z wkładkami z kolumnami bez wkładek dla wyznaczenia sprawności każdej konfiguracji pod względem utrzymania przestrzeni powietrznej separującej substancje reagujące od matrycy oddzielającej. Stosowano wkładki z otworem o średnicy 1,016 mm. Do każdej z 840 testowanych kolumn dodano 40 mikrolitrów roztworu buforowego. Podczas dodawania tych 40 mikrolitrów trzymano ręczną pipetę pod kątem około 45 stopni do pionowej osi kolumny. Następnie obserwowano kolumny, określając, czy utrzymuje się przestrzeń powietrzna pod komorą reakcyjną.

Liczbę „przebić” podano w tabeli 1.

Tabela 1

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami	840	0	0%
Kolumny bez wkładek	840	231	27,5%

Przykład 2

Do kolumn (z wkładkami i bez nich) dodano również odczynniki i inkubowano je przez 10 minut w temperaturze 37°C. Do każdej zbadanych 480 kolumn dodano 40 mikrolitrów buforu, surowicy i 10 mikrolitrów zawiesiny krwinek. Podczas dodawania substancji reagujących trzymano pipetę pod kątem około 45 stopni. Po okresie inkubacji sprawdzono czy w kolumnach poniżej komór reakcyjnych znajduje się przestrzeń powietrzna. Liczbę „przebić” podano w tabeli 2.

Tabela 2

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami	480	0	0%
Kolumny bez wkładek	480	16	3,3%

Przykład 3

Kolumny napełniono 40 mikrolitrami buforu za pomocą automatycznej pipety trzymanej pod kątem około 45 stopni. Zazwyczaj pipety automatyczne wprowadzają substancje z większą siłą niż modele ręczne. Po napełnieniu obserwowano kolumny, sprawdzając czy pod komorą reakcyjną utrzymuje się przestrzeń powietrzna.

Uzyskane wyniki dla kolumn z wkładkami i bez podano w tabeli 3.

Tabela 3

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami	240	0	0%
Kolumny bez wkładek	240	103	43%

189 791

Przykład 4

Napełniono 240 kolumn 40 mikrolitrami buforu za pomocąjednej pipety trzymanej pionowo. Przy trzymaniu pipety w położeniu pionowym, ciecz jest wtłaczana do otworu z większym ciśnieniem a zatem jest większe prawdopodobieństwo przebicia przestrzeni powietrznej oddzielającej komorę reakcyjną od komory oddzielania. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 4.

Ta b e1a 4

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami	240	0	0%
Kolumny bez wkładek	240	144	60%

Przykład 5

Komory reakcyjne 240 kolumn napełniono również 40 mikrolitrami buforu za pomocą trzymanej pionowo automatycznej pipety, co zwiększa prawdopodobieństwo przebicia znajdującej się poniżej przestrzeni powietrznej w porównaniu z napełnianiem za pomocą automatycznej pipety trzymanej pod kątem. Wyniki tych testów dla kolumn z wkładkami i bez wkładek podano w tabeli 5.

Tabela 5

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami	240	0	0%
Kolumny bez wkładek	240	204	85%

Oprócz utrzymywania przestrzeni powietrznej pomiędzy komorą reakcyjną a matrycą oddzielającą podczas fazy inkubacji, wynalazek działa również jako środek zapobiegający rozchlapywaniu się, jakie może wystąpić podczas transportu i manipulowania, w trakcie którego część zawartości dolnej komory oddzielania może wychlapać się do górnej komory reakcyjnej. Dla sprawdzenia sprawności zapobiegania wychlapywaniu przewieziono kasety z wkładkami i bez wkładek na trasie New Jersey - Kalifornia i z powrotem. Transport odbywał się drogą lotniczą i lądową i obejmował również załadunek, wyładunek oraz dostawę do laboratorium. Zastosowana metoda jest powszechnie stosowana dla wyrobów tego typu. Po powrocie przesyłki zbadano kasety sprawdzając obecność wylanej cieczy w komorach reakcyjnych.

Uzyskane wyniki podano w tabeli 6.

Ta bela 6

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami	816	30	3,7%
Kolumny bez wkładek	768	571	74,3%

Przykład 7

Przeprowadzono dodatkowe badania transportowe dla sprawdzenia stopnia zmniejszenia wychlapywania z wkładkami z otworami o zmniejszających się średnicach. Średnice otworów pomiędzy komorą reakcyjną a matrycą oddzielającą wynosiły 0,635 mm, 0,508 i 0,381 mm. Wkładki te włożono do każdej z 600 kolumn. W obiektach kontrolnych nie było wkładek. Kasety zapakowano i przeprowadzono na nich zastępcze badania transportowe polegające na 10 krotnym zrzucaniu pudeł z wysokości 912 mm. Kąt, pod jakim pudła zrzucano, regulowano w taki sposób, żeby pojemnik spadał na wszystkie swoje płaskie powierzchnie, a także na 1 naroże i na 3 krawędzie. Jest to znormalizowane badanie będące najgorszym przypadkiem branym pod uwagę w warunkach transportowych i manipulacyjnych.

189 791

Przedstawione w tabeli 7 wyniki ukazują odwrotną zależność pomiędzy wielkością otworu a zmniejszeniem wychlapywania.

Tab e 1 a 7

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z wkładkami 0,381 mm.	600	75	13%
Kolumny z wkładkami 0, 508 mm	600	120	20%
Kolumny z wkładkami 0, 508 mm	600	132	22%
Kolumny bez wkładek	600	600	100%

Przykład 8

Innym środkiem umożliwiającym zmniejszenie otworu pomiędzy komorą reakcyjną a komorą oddzielania poniżej jest „obciśnięcie „kasety. Można to zrobić techniką tłoczenia udarowego polegającej na działaniu na szyjkę kasety bezpośrednio pod komorą reakcyjną. Siła i czas uderzenia wyznaczają stopień zmniejszenia otworu. Kształt narzędzia formującego określa postać otworu. Możliwych jest kilka konfiguracji. Proces obciskania można przeprowadzić na linii produkcyjnej po napełnieniu kolumn odczynnikami i kulkami szklanymi.

Obciśnięto 816 kolumn z linii produkcyjnej, jak opisano wcześniej, dla zwężenia otworu pomiędzy komorą reakcyjną a matrycą oddzielającą. Skutkiem obciśnięcia było utworzenie przekroju poprzecznego pokazanego na fig. 10 w obszarze wskazanym na fig. 9 w nawiasie. Następnie kolumny te, wraz z 768 nieobciskanych kolumnami kontrolnymi zapakowano i wysłano do Kalifornii i z powrotem, jak wspomniano wcześniej. Zmniejszenie wychlapywania do komór reakcyjnych w wyniku warunków transportowych podano w tabeli 8.

Tabela 8

	Liczba testów	Liczba przebić	Procentowy wskaźnik przebić
Kolumny z obciśnięciami	816	548	67%
Kolumny bez odciśnięć	768	571	74%

Przykład 9

Do ograniczenia wielkości otworu pomiędzy komorą reakcyjną (górną) a komorą oddzielania (dolną) można zastosować spiralną wkładkę barierową. Wkładkę tę wykonano z polipropylenu i włożono w szyjkę kasety bezpośrednio pod zmodyfikowaną komorą górną. Spiralną wkładkę umieszcza się w szyjce kasety podczas procesu produkcji po napełnieniu kolumn odczynnikami i matrycą oddzielającą (np. szklanymi kulkami).

Przykład 10

Dla określenia czy pierścienie samouszczelniające typu O-ring zapobiegają międzykolumnowemu zanieczyszczaniu, porównywano kolumny BIOVUE™ z wkładami i pierścieniami samouszczelniającymi typu O-ring z kolumnami z wkładami, ale bez pierścieni uszczelniających O-ring. Symulowano transport kaset w taki sposób, żeby wychlapać zawartość do górnej komory oraz na folię, stukając lub uderzając kasetą o twardą powierzchnię roboczą.

Obejrzano sto dziewięćdziesiąt dwie (192) kasety z wkładkami bez pierścieni O-ring, poszukując śladów przesiąkania odczynnika kolumny po włożeniu do kaset z kolumnami. Połowę wkładek (96) włożono do kaset ręcznie a drugą połowę za pomocą omówionego powyżej narzędzia z dwoma występami.

Obejrzano trzysta trzydzieści sześć (336) kaset z wkładami mającymi pierścienie uszczelniające typu O-ring, poszukując, podobnie jak wyżej, śladów przesiąkania. Połowę (168) wkładów włożono do kaset ręcznie, a 168 za pomocą narzędzia z dwoma występami.

Przeanalizowano przesiąkanie kolumn wzrokowo, oglądając górną powierzchnię kaset. Przesiąkanie notowano w przypadku zobaczenia cieczy reagującej pomiędzy górną foliową częścią kasety, a spodnią powierzchnią korpusu wkładu.

189 791

W tabeli 9 przedstawiono liczby i wskaźniki procentowe dla kaset z wykrytymi śladami przesiąkania odniesione do łącznej liczby przebadanych kaset. Sposób wkładania wkładu nie wpływał na wyniki dla wkładów z pierścieniem samouszczelniajacym O-ring, ale wpływał na wyniki w przypadku wkładów bez pierścienia samouszczelniającego. Jak widać, w przypadku ręcznego wkładania wkładów (kasety w położeniu odwróconym), liczba kaset, w których wykryto przesiąkanie odczynnika, była około dwa razy większa od liczby dotyczącej wkładów wkładanych za pomocą narzędzia (kasety w położeniu stojącym).

Tabela 9

Sposób wkładania wkładu	Wkłady bez pierścieni samouszczelniających (O-ring)	Wkłady z pierścieniami samouszczelniającymi (O-ring)
Narzędzie	39/96 (40,6%)	0/168
Ręcznie	74/96 (77,1%)	0/168

Przykład 11

Przeprowadzono badania funkcjonalne, porównując kasety z wkładami bez pierścieni samouszczelniających typu O-ring z kasetami z wkładami z pierścieniami samouszczelniąjącymi O-ring.

Symulowano transport kaset w taki sposób, żeby wychlapać zawartość do górnej komory oraz na folie, jak w przykładzie 10.

Wkłady wkładano do kolumn kaset zarówno ręcznie jak i za pomocą opisanego wcześniej narzędzia z dwoma występami. W połowie kaset do każdej z kolumn wprowadzono za pomocą pipety BIOVUE™ BioHit (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan NJ) dziesięć 10 (iL4% RBC (w normalnym roztworze soli). W drugiej połowie kaset do każdej z kolumn kasety wprowadzono za pomocą pipety 50 μ L 0,8% RBC (w normalnym roztworze soli) z antygenem powierzchniowym według tabeli 10 poniżej. W połowie kaset stosowano kasety Ortho BIOVUE™ ABE International (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan NJ); w drugiej połowie badanych kaset stosowano kasetę Ortho BIOVUE™ RHK (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan NJ).

Jak widać z tabeli 10 poniżej, w kasetach ABE i RHK znajdowały się w odpowiednich kolumnach antyciała.

Tabela 10

KASETA ABE
kolumna	antyciało	Spo<dziew<my wynik z komórkami Αιΐτ
1	anti-A	+
2	anti-B	-
3	anti-AB	+
4	anti-D	-
5	anti-CDE	-
6	kontrolna (rozcieńczalnik)	-
KASETA RHK
kolumna	antyciało	Spodziewany wynik z komórkami R^RKE)
1	anti-C	+
2	anti-E	-
3	anti-c	-
4	anti-e	+
5	anti-K	-
6	kontrolna (rozcieńczalnik)	-

189 791

W przypadku kaset ABE, jako próbkę używano komórki Ajrr. W przypadku kaset RHK, jako próbkę stosowano komórki RjRiK (-). Pipetowanie prowadzono od skrajnej lewej kolumny kasety do prawej. Kasety wirowano w wirówce Ortho BIOVUE™ Centrifuge (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan NJ) przez 2 minuty w warunkach 794 +/- 16 xg, a następnie przez 3 minuty w warunkach 1510 +/- 30xg. Oceniano każdą kolumnę z reakcją negatywną (brak aglutynacji RBC) pod kątem stopnia swobody przepływu krwinek przez całą kolumnę. Fałszywa reakcja pozytywna pojawi się jeżeli, na przykład, antyciało anti-A z kolumny 1 kasety ABE zostanie przeniesione do kolumny 2, i komórki w tej sytuacji będą reagowały w kolumnie 2.

Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 11. W kolumnach z pierścieniami samouszczelniającymi O-ring wszystkie oczekiwane reakcje pozytywne były pozytywne. Jednakże nie wszystkie oczekiwane reakcje negatywne były negatywne. Wystąpił jeden fałszywy wynik pozytywny. Przyczyną, której nie wykryto, nie było przesiąkanie odczynnika. W tabeli 11 pokazano liczby i wskaźniki procentowe kaset i kolumn z fałszywą reakcją pozytywną w odniesieniu do łącznej liczby zbadanych kaset.

Sposób wkładania wkładu nie miał wpływu na wyniki dla wkładów z pierścieniami samouszczelniającymi typu O-ring, ale miał pośredni wpływ na wyniki dla wkładek bez pierścieni samouszczelniających O-ring, ponieważ wszystkie fałszywe wyniki pozytywne były w kasetach z widocznym przesiąkaniem odczynnika.

Tabela 11

Sposób wkładania wkładu		Wkłady bez pierścieni samouszczelniających (O-ring)	Wkłady z pierścieniami samouszczelniającymi (O-ring)
Narzędzie (Stojące)	Kasety	1/96(1%)	1/96 (1%)
Kolumny	1/384 (0,3%)	1/384 (0,3%)
Ręcznie (Odwrócone)	Kasety	9/96 (10%)	0/96
Kolumny	10/384 (2,6%)	0/384
Łącznie	Kasety	10/192 (5,2%)	1/192 (0,5%)
Kolumny	11/768(1.4%)	1/768 (0,1%)

189 791

FIG.2

189 791

FIG.5

FIG. 6

FIG. 7

189 791

FIG. 8

\ \ \ \ \ \ \ \ \

189 791

FIG. 11

wwwwwww¹

189 791 . 12Α FIG. 12B

DIA.1

DIM.3

DIA.1

189 791

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek zawierające komorę z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, znamienne tym, ze zawiera dwie komory, komorę górną (20), z otworem do doprowadzania płynnych substratów reakcji i komorę dolną połączoną z komorą górną (20) i zawierającą matrycę do oddzielania aglutynatów, przy czym pomiędzy komorą górną (20), i komorą dolną usytuowany jest element barierowy w postaci spiralnej wkładki (10), posiadającej elementy utrzymujące płyn w górnej komorze (20) w warunkach normalnych w postaci kanału wyznaczonego przez zwoje usytuowane na trzonie centralnym.
2. Naczynie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że spiralna wkładka (10), jest z polipropylenu lub reksolitu.
3. Naczynie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że średnica spiralnej wkładki (10) jest w przedziale od około 2,794 mm do 3,556 mm.
4. Naczynie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że średnica trzonu spiralnej wkładki (10) wynosi od około 0,762 do 2,286 mm.
5. Naczynie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że spiralna wkładka (10) ma około 2,36 do 11,81 zwojów na cm.
6. Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek zawierające komorę z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, znamienne tym, że zawiera dwie komory, komorę górną (20) z otworem do doprowadzania płynnych substratów reakcji i komorę dolną połączoną z komorą górną (20) i zawierającą matrycę do oddzielania aglutynatów, przy czym pomiędzy komorą górną (20) i komorą dolną usytuowany jest element barierowy w postaci przepony posiadającej elementy utrzymujące płyn w górnej komorze (20) w warunkach normalnych w postaci centralnego otworu.
7. Naczynie według zastrz. 6, znamienne tym, że przepona jest z kauczuku silikonowego.
8. Naczynie do przeprowadzania testów aglutynacyjnych krwinek zawierające komorę z otworem wlotowym i element barierowy umieszczony w naczyniu, znamienne tym, że zawiera dwie komory, komorę górną (20) z otworem do doprowadzania płynnych substratów reakcji i komorę dolną połączoną z komorą górną (20) i zawierającą matrycę do oddzielania aglutynatów, przy czym pomiędzy komorą górną (20) i komorą dolną usytuowany jest element barierowy w postaci porowatej zatyczki posiadającej elementy utrzymujące płyn w górnej komorze (20) w warunkach normalnych w postaci przelotowych kanałów.
9. Naczynie według zastrz. 1 albo 8, znamienne tym, że porowata zatyczka jest z polipropylenu.
10. Wkład zapobiegający krzyżowemu zanieczyszczaniu odczynnikiem lub roztworem z jednej kolumny kasety do testów aglutynacyjnych innej kolumny tej kasety, zawierający korpus oraz co najmniej jeden element wystający z korpusu, znamienny tym, że element wystający z korpusu stanowi element stożkowy, mający otwór w swoim zwężonym wierzchołku (50), przy czym element stożkowy jest otoczony pierścieniem samouszczelniającym (40) o przekroju okrągłym.
11. Wkład według zastrz. 10, znamienny tym, że element stożkowy zawiera pierwszy koniec, w którym znajduje się zwężony wierzchołek (50), oraz drugi koniec, znajdujący się w pewnej odległości od niego w sąsiedztwie korpusu, przy czym pierścień samouszczelniający (40) o przekroju okrągłym znajduje się w drugim końcu lub w jego pobliżu.
12. Wkład według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że pierścień samouszczelniający (40) o przekroju okrągłym stanowi integralną część elementu stożkowego.

189 791
13. Wkład według zastrz. 10, znamienny tym, że w jego skład wchodzi sześć wystających z korpusu elementów stożkowych o wierzchołkach usytuowanych w jednej linii.
14. Wkład według zastrz. 10 albo 13, znamienny tym, że ma wymiary dobrane do naczyń reakcyjnych kasety.
15. Wkład według zastrz. 10, znamienny tym, że jest z akrylu.
16. Kaseta uszczelniona folią, zawierająca więcej niż jedno naczynie reakcyjne oraz wkład zawierający korpus z co najmniej jednym wystającym z niego elementem, znamienna tym, że zawiera sześć naczyń reakcyjnych rozmieszczonych w niej liniowo, zaś wkład zawiera korpus z sześcioma wystającymi z niego elementami stożkowymi o wierzchołkach usytuowanych w jednej linii, przy czym elementy stożkowe mają zwężony wierzchołek (50) do przebijania uszczelnienia foliowego, i włożony wkład jest sprzężony ciernie w kasecie, zaś uszczelnienie stanowią pierścienie samouszczelniające (40) o przekroju okrągłym otaczające każdy z elementów stożkowych i stanowiące ich integralną część.