PL187925B1 - Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV

Info

Publication number
PL187925B1
PL187925B1 PL32917497A PL32917497A PL187925B1 PL 187925 B1 PL187925 B1 PL 187925B1 PL 32917497 A PL32917497 A PL 32917497A PL 32917497 A PL32917497 A PL 32917497A PL 187925 B1 PL187925 B1 PL 187925B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
hiv
cdimi
azt
compounds
cells
Prior art date
Application number
PL32917497A
Other languages
English (en)
Other versions
PL329174A1 (en
Inventor
Tamio Fujiwara
Original Assignee
Shionogi & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26423589&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL187925(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Shionogi & Co filed Critical Shionogi & Co
Publication of PL329174A1 publication Critical patent/PL329174A1/xx
Publication of PL187925B1 publication Critical patent/PL187925B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV, znam ienna tym, ze zawiera skuteczna ilosc 2-karbamoiloksymetylo-5-(3,5-dichlorofenylotio)-4-izopropylo-1 -(pirydyn-4-ylo)me tylo1lH-imidazolu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli i skuteczna ilosc jednego lub wiekszej ilosci innych zwiazków o aktywnosci skierowanej przeciw HIV obejmujacych nukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej, nienukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej i/lub inhibitor proteazy HIV. PL PL PL PL

Description

Wynalazek niniejszy dotyczy kompozycji farmaceutycznych przeciw HTV.
AIDS (zespół nabytego upośledzenia odporności) jest szeroko rozprzestrzeniony w świecie, i stanowi nieuleczalną chorobę powodowaną przez HIV (ludzki wirus upośledzenia odporności). Toteż, prowadzone w tej dziedzinie badania oraz rozwój wiedzy na temat środków leczniczych również mają charakter globalny, jednakże nie okazały się, jak dotychczas, zadowalające. Jak dotychczas, stosowane i testowane klinicznie kompozycje przeciw HIV reprezentowane są przez pochodne nukleozydowe, takie jak azydodeoksytymidyna (AZT), dideoksyinozyna (ddl), dideoksycytydyna (ddC), dideoksydidehydrotymidyna (d4T), 3'-tiacytydyna (3TC) itp., uważane za podstawowe środki lecznicze.
Jednakże, wszystkie te środki charakteryzują się poważnymi działaniami ubocznymi, takimi jak, na przykład, zapalenie trzustki, niedokrwistość, leukopenia, neutropenia, wymioty, afagia, zaburzenia żołądkowe, uogólniona wysypka, bezsenność, skurcz mięśnia, duszność, bolesne lub trudne oddawanie moczu, niewydolność nerek, upośledzenie słuchu itp. Stosowanie wspomnianych środków wiąże się z licznymi problemami, takimi jak spowodowane długotrwałym podawaniem leku pojawianie się wirusów lekoopornych, po którym następuje zmniejszenie się skuteczności tych środków, itp.
Jak dotychczas, do rozwiązywania problemów tego rodzaju na ogół stosuje się leczenie wieloma kompozycjami przeciw HIV.
W tym stanie rzeczy, doniesiono o zaistnieniu zjawiska synergizmu w trakcie leczenia polegającego na podawaniu kilku związków o aktywności skierowanej przeciw HIV. Przykładowe tego rodzaju działania synergiczne obserwuje się w przypadku zastosowania kombinacji 3TC z nienukleozydowymi związkami o aktywności skierowanej przeciw HTV, takimi jak, na przykład, {[(benzoksazol-2-ilo)metylo]amino}-5-alkilo-6-alkilo-2-(1H)-pirydynon itp., jak ujawniono w dokumencie patentowym JP-A 7-508997 oraz podobnej kombinacji 3TC z 11-cyklopropylo-5,1 1-dihydro-4-metylo-6H-dipirydo[3,3-b;21,31-e][1,4]diazepin-6-onem, jak ujawniono w dokumencie patentowym JP-A 7-508998.
Wskazuje się na znaczenie występowania problemów takich, jak fakt poważnego działania ubocznego związków o aktywności skierowanej przeciw HIV, pojawianie się wirusów opornych itp. Toteż, pożądana jest nowa kombinacja związków o aktywności skierowanej przeciw HIV przejawiająca synergizm ich działania, a więc kompozycja zawierająca te związki jako składnik aktywny.
Według wynalazku kompozycja przeciw HIV, charakteryzuje się tym, że zawiera skuteczną ilość 2-karbamoiloksymetylo-5-(3,5-dichlorofenylotio)-4-izopropylo-1-(pirydyn-4ylo)metylo-1H-imidazolu (określanego w dalszej części niniejszego opisu jako CDIMI) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli i skuteczną ilość jednego lub większej ilości innych związków o aktywności skierowanej przeciw HIV obejmujących nukleozydowy inhibitor
187 925 transkryptazy odwrotnej, nienukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej i/lub inhibitor proteazy HIV.
Kompozycja przeciw HIV według wynalazku jako związki o aktywności skierowanej przeciw HIV zawiera ddi, ddC, Saquinavir i/lub foskamet.
Kompozycje według wynalazku stosuje się do leczenia lub zapobiegania AIDS, polegającego na podawaniu CDIMI lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli jednocześnie, lub w sposób ciągły, z jednym lub większą ilością innych związków o aktywności skierowanej przeciw HIV.
Stosuje się CDIMI lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól i związki o aktywności skierowanej przeciw HIV do wytworzenia leku przeznaczonego do leczenia lub zapobiegania AIDS. Stwierdzono hamowanie namnażania się HIV przez kontaktowanie wirusa HIV z CDIMI, lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą, występującymi w kombinacji z jednym, lub większą ilością innych związków o aktywności skierowanej przeciw HIV.
Stosowany w niniejszym wynalazku CDIMI opisany jest w dokumencie patentowym WO 96/10019, a synteza i skierowana przeciw HIV aktywność związku ujawnione są w opisie wynalazku.
Figura 1 przedstawia współzależność stężenia związku o aktywności skierowanej przeciw HIV i toksyczności (CC50) w stosunku do komórek GEM.
Figura 2 przedstawia współzależność stężenia związku o aktywności skierowanej przeciw HIV i toksyczności (CC50) w stosunku do komórek U937.
Figura 3 przedstawia współzależność stężenia związku o aktywności skierowanej przeciw HIV i zahamowania wzrostu (IC50) komórek CEM.
Figura 4 przedstawia współzależność stężenia związku o aktywności skierowanej przeciw HIV i zahamowania wzrostu (IC50) komórek U937.
W niniejszym opisie, określenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole CDIMI” obejmuje, na przykład, sole z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy, kwas fluorowodorowy, kwas bromowodorowy itp., sole z kwasami organicznymi, takimi jak kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas winowy, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, kwas fumarowy, kwas maleinowy, kwas bursztynowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas toluenosulfonowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas kamforosulfonowy itp., oraz sole utworzone z metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicznych, takimi jak sód, potas, wapń itp.
Stosowane w niniejszym opisie określenie „związek o aktywności skierowanej przeciw HIV” oznacza, bez konkretnych ograniczeń, jakikolwiek związek wykazujący aktywność skierowaną przeciw wirusowi HIV, na przykład związki przeciwwirusowe o aktywności skierowanej przeciw wirusowi HIV, takie jak nukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej, nienukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej, inhibitor proteazy HIV, inhibitor polimerazy DNA itp.
W ujęciu praktycznym, określenie „nukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej” obejmuje AZT, ddl, ddC, d4T, 3TC itp., określenie „nienukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej” obejmuje związki opisane w dokumencie patentowym WO 96/10019, takie jak, na przykład, 3-(5-(3,5-dichlorofenylotio)-4-izopropylo-1 (pirydyn-4-ylometylo)- 1H-imidazol-2ylopropan-1 -ol lub 2- [ 5-(3,5 -dichlorofenylotio)-1 -etylo-4-izopropylo-1 H-imidazol-2-ilo] etanol itp., a określenie „inhibitor proteazy HIV” obejmuje Saquinavir, Indinavir, Ritonavir, Nelfinavir, VX-478 itp. Do innych leków wykazujących aktywność skierowaną przeciw HIV należą, na przykład, foskamet, środek leczniczy stosowany w terapii zapalenia siatkówki oka w następstwie zakażenia wirusem cytomegalii, o aktywności inhibitora polimerazy DNA i inhibitora transkryptazy odwrotnej itp. Szczególnie korzystne są w tym przypadku aZt, ddl, ddC, 3TC, Saquinavir lub foskamet, ponieważ w działaniu łącznym z CDIMI wykazują wysoki stopień synergizmu pod względem aktywności skierowanej przeciw HTV. W szczególniejszy sposób korzystne są: AZT, ddl, ddC, Saquinavir lub foskamet, a w sposób najbardziej szczególny AZT, ddC lub Saquinavir. Najkorzystniejsze są AZT i ddC, które wyraźnie hamują pojawianie się wirusów lekoopomych.
187 925
Kompozycja przeciw HIV według niniejszego wynalazku może zapewnić skuteczne leczenie AIDS, a to ze względu na synergizm, nieobecny w przypadku stosowania pojedynczo każdego ze związków o aktywności skierowanej przeciw HIV. W szczególności, z uwagi na to, że w przypadku stosowania kompozycji przeciw HIV według niniejszego wynalazku występuje synergia aktywności skierowanej przeciw HIV, jak to przedstawiono w następujących eksperymentach, wystarczającą aktywność skierowaną przeciw HIV uzyskuje się przy stosowaniu dawek mniejszych od dawek każdego poszczególnego związku, wybranego spośród związków o aktywności skierowanej przeciw HIV, podawanego indywidualnie. Rezultatem tego jest redukcja działań ubocznych, takich jak toksyczność itp. Stosowanie kompozycji według niniejszego wynalazku, zawierającej wszystkie związki o aktywności skierowanej przeciw HIV w ilości równej dawce pojedynczego środka, skutecznie zahamowuje pojawianie się wirusów lekoopomych i w oczywisty sposób zapewnia przeprowadzenie leczenia w sposób energiczny i efektywny.
Tak więc, kompozycja przeciw HIV według niniejszego wynalazku jest skuteczną kompozycją farmaceutyczną stanowiącą lekarstwo przeznaczone do leczenia lub zapobiegania AIDS.
Wynalazek niniejszy charakteryzuje się synergicznym działaniem CDIMI w połączeniu z jednym lub większą ilością innych związków o aktywności przeciw HIV. Zgodnie z tym, wszystkie składniki aktywne można podawać jednocześnie, w postaci jednej kompozycji. Ten sam skutek daje podawanie wszystkich tych składników aktywnych osobno, w sposób ciągły i w odstępach czasu zapewniających utrzymanie działania synergicznego.
Jeśli chodzi o stosowanie kompozycji przeciw HIV według niniejszego wynalazku, to można ją bezpiecznie podawać drogą doustną lub drogą pozajelitową. W przypadku stosowania doustnego, kompozycję można podawać w postaci typowych preparatów, takich jak tabletki, granulki, proszek, kapsułki, pigułki, roztwory płynne, syrop, tabletki podpoliczkowe, tabletki podjęzykowe itp. W przypadku stosowania pozajelitowego, kompozycję korzystnie podaje się w jakichkolwiek odpowiednich postaciach, takich jak postacie do wstrzykiwania, na przykład do wstrzykiwań domięśniowych itp., czopki, wcierki przezskóme, roztwory wytwarzające parę do inhalacji itp. Szczególnie korzystne jest podawanie drogą doustną.
Kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku można wytworzyć za pomocą zmieszania ze sobą składników aktywnych użytych w ilości skutecznej, a jeżeli to potrzebne także z udziałem dodatków medycznych odpowiadających postaci ostatecznego preparatu gotowego do podawania, takich jak nośniki, środki wiążące, środki zwilżające, środki rozsadzające, środki poślizgowe, rozcieńczalniki itp. I tak, na przykład, postacie do wstrzykiwań można wytworzyć za pomocą wyjaławiania, z użyciem odpowiednich nośników.
W praktycznym wykonaniu, jako nośników użyć można laktozy, sacharozy, glukozy, skrobi, węglanu wapnia, celulozy krystalicznej itp. Do środków wiążących należą, między innymi, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, żelatyna, poliwinylopirolidon itp. Jako środki rozsadzające wymienić można, między innymi, karboksymetylocelulozę, sól sodową karboksymetylocelulozy, skrobię, alginian sodu, agar w proszku, siarczan laurylo-sodowy itp. Do środków poślizgowych należą: talk, stearynian magnezu, Macrogol itp. Jako podłoża czopkowe wymienić można masło kakaowe, Macrogol, metylocelulozę itp. W przypadku wytwarzania preparatów płynnych lub emulsji, albo postaci do wstrzykiwań, można dodatkowo wprowadzić typowe środki solubilizujące, emulgatory, stabilizatory, środki konserwujące, środki izotonizujące itp. W przypadku wytwarzania preparatów do stosowania doustnego, można dodać środki słodzące, środki aromatyzujące itp.
CDIMI, zastosowany jako składnik aktywny w kompozycji przeciw HIV według niniejszego wynalazku, można połączyć w jednym, lub większą ilością innych związków o aktywności skierowanej przeciw HIV.
W przypadku indywidualnego, a więc osobnego podawania CDIMI lub innych związków o aktywności skierowanej przeciw HIV, stosowana dawka każdego środka aktywnego wynosi zazwyczaj od 0,05 mg/dzień do 3000 mg/dzień, korzystnie od 0,1 mg/dzień do 1000 mg/dzień, a przy podawaniu drogą pozajelitową stosowana dawka wynosi od 0,01 mg/dzień do 1000 mg/dzień, korzystnie od 0,05 mg/dzień do 500 mg/dzień.
187 925
W przypadku podawania choremu kompozycji przeciw HIV według mniejszego wynalazku, dawka każdego składnika aktywnego obecnego w preparacie powinna być ustalona z uwzględnieniem wieku i masy ciała tego chorego, zaawansowania choroby, drogi podawania itp. Tym niemniej jednak, ilość każdego składnika aktywnego w składzie kompozycji może wynosić od 0,1 do 1,0-krotności dawki podanej powyżej w odniesieniu do każdego związku o aktywności skierowanej przeciw HIV, podawanego indywidualnie. Zgodnie z tym, w przypadku stosowania CDIMI łącznie z innymi związkami o aktywności skierowanej przeciw HIV, z więc w przypadku stosowania kompozycji według niniejszego wynalazku, dawka każdego składnika aktywnego może wynosić: przy podawaniu drogą doustną od 0,005 mg/dzień do 3000 mg/dzień, korzystnie od 0,01 mg/dzień do 1000 mg/dzień, a przy podawaniu drogą pozajelitową od 0,001 mg/dzień do 1000 mg/dzień, korzystnie od 0,005 mg/dzień do 500 mg/dzień. Kompozycję tę można podawać jednorazowo lub kilka razy dziennie, co pewien czas.
Przykład
Wynalazek niniejszy objaśniają szczegółowo następujące przykłady i opisy eksperymentów, których nie należy interpretować jako ograniczających zakres wynalazku.
Eksperyment 1. Synergizm aktywności skierowanej przeciw HIV.
W podłożu RPMI-1640, wzbogaconym 10% płodową surowicą cielęcą, przeprowadzono hodowlę linii ludzkich komórek T Molt-4, trwale zakażonych HIV-1 (szczep IIIB, klon 2), po czym supematant przesączono i przechowywano w temperaturze -80°C, po czym ustalono miano wirusa.
Sporządzono dwukrotne rozcieńczenia stężenia CDIMI z 10 ng/ml do 0,157 ng/ml i 0 ng/ml, oraz stężenia AZT ze 100 ng/ml do 0,4 ng/ml i 0 ng/ml. Połączenia tych dwóch leków dokonano metodą szachownicową, przy użyciu 96-dołkowych mikropłytek. Do każdego dołka 96-dołkowych mikropłytek wprowadzono 50 pl wyżej wspomnianego podłoża zawierającego 105 komórek MT-4/ml i 50 (ii dwukrotnego rozcieńczenia AZT tym samym podłożem. Po upływie 4 godzin dodano 50 pl supematantu hodowli wyżej wspomnianego HTV-1 (szczep IIIB, klon 2) i w tym samym czasie także 50 pl CDIMI w dwukrotnym rozcieńczeniu. Następnie przeprowadzono inkubację, w inkubatorze przy 5% CO2 i w temperaturze 37°C w ciągu 5 dni.
Miano wirusa w supematancie hodowli ustalono z wykorzystaniem, jako wskaźnika, aktywności wirusowej transkryptazy odwrotnej, w sposób następujący:
Do 100 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 150 mM KC1, 10 mM MgCh, 0,1% Nonidet P-40, 10 mM ditiotreitolu, 5 pg/litr poli (A), 5 pg/ml (dT)i2-is i 1 pCi [3H]dTTP, wprowadzono 10 pl supematantu hodowli i całość inkubowano w temperaturze 37° w ciągu 3 godzin. Następnie, mieszaninę reakcyjną oziębiono lodem i przeniesiono, z zastosowaniem kolektora komórek na DEAE-Filtermat. Filtr przemyto 5% roztworem Na2HPO4.12 H2O i wodą, po czym dokonano pomiaru radioaktywności włączonej do DNA, przy użyciu licznika scyntylacyjnego LKB Beta Platę, w celu oznaczenia aktywności wirusowej transkryptazy odwrotnej.
Przeprowadzono trzy oznaczenia tego rodzaju i obliczono średnią wartość szybkości hamowania transkryptazy odwrotnej (w %) w zestawieniu z aktywnością enzymatyczną stwierdzoną w warunkach nieobecności CDIMI i AZT. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 1.
187 925
Tabela 1
o o »*· <© OT OT n to σί OJ <n <© cn OT 9 9.55 : 99.65 : CD to 05 OJ 99.67 : ..... 40 O OT OT
CM o OT v-» cn b- co ty
o <O to <o to to to to 40
UD OT OT OT OT 05 OT 05 OT
OT OT OT OT OT OT OT OT
b- ty OT ty CJ tn CD to
<O to to to <O <o <O UD
<N OT OT OT OT OT OT OT OT
OT OT OT OT OT OT OT OT
UD <O CM ty CM CM T- CD
to to to IO to to ty CD
OT OT OT OT OT OT OT OT
*** OT OT OT OT OJ OT OT OT
·—(
ε V· O) <o *<y
Ο) UD b* to to tn tn ty to
cz o> • • « 05 OT OT • ao
1- <Ó OT OT OT OT OT OT OT OT OT OT OT
c*> OT CD ty (O tn CD CD
N tO to to tn tn O
OT OT OT OT OT OT OT to
< Η OT OT OT OT OT Oj OT OJ
b- v~ CM to to ty O)
<o to to ty co
OT OT o> OT OT OT a> b-
OJ OT ot OJ O) OT OT
OT tn to tn CD OT CD
03 (O to to tn CD T— *r
o OT OT OT OT OT OT co CM CD
OT OT OT OT OT OT *rr
OT b- ty b- o CM UD CM
tO to to tn OT b- ▼— CO
OT OT OT OT OT to OT b-
OT OT OT OT OT OT b- ł
CM OT CM ty cu rt
b- to 40 o OT
Cd • O o
OT OT OT OJ b- CJ
OT OT OT OT b- 1
UD CU UD CD
O) UD 2.5 .62 Cn UD o
o Ó O
(TUI/5U) ΙΙΛΙ1 ao
187 925
Zakładając, że hamowanie wykazywane przez oba te związki o aktywności skierowanej przeciw HIV było addytywne, szybkość hamowania namnażania się wirusa obliczono dla wszystkich kombinacji stężeń zgodnie z równaniem (I):
Z = X + Y (1 - X) w którym:
Z oznacza addytywną szybkość hamowania,
X oznacza szybkość hamowania wykazywaną przez CDIMI, oraz
Y oznacza szybkość hamowania wykazywaną przez inny związek o aktywności skierowanej przeciw HIV.
I tak, na przykład, w przypadku, gdy stężenie CDIMI wynosiło 5 ng/ml i stężenie AZT wynosiło 0,8 ng/ml, wtedy wartość X wynosiła 99,63%, gdy stężenie CDIMI wynosiło 5 ng/ml i stężenie AZT wynosiło 0 ng/ml w tabeli 1, a wartość Y wynosiła 43,43%, gdy stężenie CDIMI wynosiło 0 ng/ml i stężenie AZT wynosiło 0,8 ng/ml w tabeli 1. Następnie, obliczono addytywną szybkość hamowania Z i wynosiła ona, zgodnie z równaniem (I), 99,79%.
Następnie, obliczono różnicę między wartościami zmierzonymi, podanymi w tabeli 1, a obliczonymi jak wyżej wartościami addytywnej szybkości hamowania. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 2, a wartości granic przedziału ufności (99%) przedstawiono w tabeli 3.
187 925
Tabela 2
100 -0.36 -0.37 j -0.35 -0.35 r^· CM © 0.01 0.06 o
00 O) σ> ęy Q>
CO 00 oo 00 CM o o e>
d d 1 © 1 d 1 d 1 d ©
25 CO (O r- (O §
00 00 oo 00 CM V ©
© o © 1 o 1 O 1 © d
00 (£> r- co
c\j 00 00 00 00 CM 0M o
*2 d © © 1 d 1 O 1 d ©
E $ oo 38 38 60 cn §
ra c US © d d O 1 © o
H
N 3.13 -0.3 0.36 •0.35 0.41 0.37 2.99 3.26 o
<
1.57 -0.24 -0.3 -0.29 1 -0.19 i r·» Cf> sr 21.75 25.2 o
m 00 co 00 ©
Go GS o d d 2.0 T— cn 6.9 o
1 1 I r* (O (O
0.4 I o 07 05 Io CM T“ oo CM 2.5 o
o 1 © © © 23 O T* O v-
O o o o o o o o o
co >s. 2.5 .25 625 312 157 o
¢5 ej CS
(|iu/6u) | im | ao
187 925
Tabela 3
100 -0.36 -0.293 -0.273 -0.299 -0.219 o co 00 o o o o
tn co cn co co co
50 CM CO gj τ— CO T“ CO τ· CN o CD CO o o
O o o ó o
• 1 I o
3 co CM cn b- co co
25 00 o co oo oo
to o CM Ó 0.2 0.3 0.1 CM O h* o • o
1 Ó o
cn co cn cn CO cn
00 in 00 T“ h- y··
12. CM O co o 0.2 0.3 0.1 co CM in o o
ó ó
00
cn co co cn co cn
Ε o o 0.34 T“ CM w
□) c td CM O co o 0.3 0Ό CM 00 oo oo o
ó o
Η
Ν co 74 3 r»- co I 72 587 CM l·-
CM co CM CM co IO o
«ó O o Ó O CN V“
< o CM có
CO cn cn cn Γ·
τ— l·- co CM cn
CM CM CM r~ O) co cn o
O Ó Ó ó 10 r· Ό
1 a CM CM
cn cn cn cn .65 r^·
80 cn 00 CM CM CM T“
o o V“ cn cn O- o
ó 1 o R Ó 1 o ó τ— CM cn 54.
CO co co cn T“
00 co co cn
<d o 3 .02 Zn o có 00. τ- Ο o
o o ó CM T“ r—
o o o o o o o o o
o 2.5 .25 625 312 «d
>9. cd cd
(|iu/6u) l W I a □
187 925
W przypadku, gdy wartość zmierzona jest większa od wartości addytywnej szybkości hamowania, a mianowicie, gdy wartość ta jest większa od 0 w tabeli 3, sądzi się, że ma się do czynienia z synergią. Poziom synergii oznaczono jako całkowitą sumę wartości większych od 0 w tabeli 3.
W taki sam sposób dokonano analizy danych z wykorzystaniem wyników eksperymentów przeprowadzonych z udziałem ddl, ddC, Saquinaviru i foskametu zamiast AZT.
Dodawanie do komórek Saquinaviru przeprowadzono w takim samym czasie jak w przypadku CDIMI, gdy dokonywano zakażenia wirusem. W przypadku użycia kombinacji ddC, ddl i Saquinaviru, stężenie CDIMI mieściło się w zakresie od 5 ng/ml do 0,08 ng/ml w dwukrotnym rozcieńczeniu i 0 ng/ml, a stężenie ddC, ddl, Saquinaviru i foskametu mieściło się w zakresie od 500 ng/ml do 2 ng/ml w dwukrotnym rozcieńczeniu i 0 ng/ml.
Otrzymane wyniki analizy przedstawiono poniżej. W tabelach 4-6 przedstawiono wyniki dla ddl, w tabelach 7-9 przedstawiono wyniki dla ddC, w tabelach 10-12 przedstawiono wyniki dla Saquinaviru, a w tabelach 13-15 przedstawiono wyniki dla foskametu.
187 925
Tabela 4
500 99.15 98.91 98.94 98.87 ! 98.84 1 98.3 91.19 50.13
250 99.1 8.96 8.96 8.84 8.65 7.64 0.45 S90
cn cn cn cn cn oo Ό
co 00 V“ CM co «3· »3· CO
o cn o cn r— cn r- co
cń oó cń oó oó r-1 cń d
cn cn cn cn cn cn r- co
to cn r- T- cn co w co
r- o o cn co co o co
c\j <3 cń cń cń oó oó U CM
cn cn cn cn cn cn co co
1.25
έ σ> 99.16 in o ai 8.98 £ oó 8.78 7.51 0.83 0.43
c to cn cn cn cn cn r- CM
co CM r-. co co 44 CO CO
TJ to τ· T“ en cn r- oo CM
Vx. en cn oo oó oó r-l o (O
TJ cn cn cn cn cn cn co CM
oo V in cn 83
Qq Τ” cn cn cn cn in v-
cń oo oó oó oó r-1 oó uS
cn cn cn cn σ> cn
cn CM 00 I5.2
66 o σί 8.9 Γ- οό 8.7 7.4 o
oj cn cn en cn r-
ιη CM co co oo 00 CM
N 9.0 o cn cn 00 98.1 8.7 6.6 7.0 2.5
Ο) cn cn cn cn T“
τ· co r- co τ- uO co
to ο T-* o oo Γ- co CM o
σί cn cn oó oó iri cń
cn cn cn cn en cn CM
to 2.5 I 25 to <N to 80 to
CS ci CS CS
(|UI/6U) | ΙΛ1 | Q3
187 925
Tabela 5
500 -0.36 -0.66 -0.57 -0.55 1 -0.52 0.47 26.48 o
§ •ę-“ co w in m =4? h- g- s CM CM tn O
to d d 1 d d I o 1 d 22
to to ą? CM CM 7 co l·- CM 8 to cn .67 o
O 1 o o O © d 28
U) tn tn tn co 0.63 V
to <3 τ- ο co o 1 CM ó 1 CM o 1 Ό- d 1 10.4 o
s· 31.25
g O) c in (O co 7“ tn tr
-0.0 -0.2 -0.2 o 1 © tn d 27.1 o
Ό V· d -0.24 -0.3 -0.21 -0.29 0.65 13.07 o
Ό
CM to CM to co oo
Oo o o O to o
d 1 d 1 o d ΌΓ Ό-
to tn h- r- cn Oi
T~ CM 0.1 CM O o
d d o d
s f 1 1 to
to 80* .22 CM .28 .14 49 66 o
O 1 o c? 1 O O 1 d oo
O o o o o o o o o
to 2.5 25 625 s to .08 to
ci to to to
(|iu/6u) | W 1 α o
187 925
Tabela 6
500 -0.206 ! -0.583 -0.185 -0.216 -0.314 o 23.499 O
r- TT cn cn ca 1»
§ δ o V“ cn Ó h- M Ó cn o o 8 o o 8 s< o
• 1 1 1 1 T—
163 CM w 219 CM O oo in cn V— cn ca o
>4 ó O o d O r- CM
o CM
U) 47 17
c\i o CM o o O o o
M5 O T
o
E~ $ 34 τ- Ο T— ω cn 05
Oł >< o CM T- o o .53 uo o
c ΓΊ O o d 00
1 » 1 O
O) r- cn
T3 <o >> 0.11 o o o o o s o .470 to o T— o
n 1 o ca
06 64 in ▼—
«0 o o o o o V— <o o
o o
1 d Tf
O) Tf cn m cn
o co cn T— o
N· o o o o o 0.1 K o> CM o
1 » o CM
T— 1» CM
r-
«Ν o o o ó o o .28 Tf r- o
1 o cn
O o o o o o o o o
U) 2.5 25 625 C*5 & 80 co
ς> <3 <5
(|ui/Bu) | w 1 a o
187 925
Tabela 7
500 99.12 98.87 98.96 98.85 98.84 98.67 98.68 98.66
oo OJ (O 05 IA T- co
o 05 00 r- (O to CM
05 00 oó oó OÓ oó 05 oó OÓ
05 05 0» 05 05 05 05
125 9.14 9.05 8.88 8.76 tO co | 98.7 8.59 3.25
05 05 05 05 05 05 00
62.5 tO 05 00 r- to 05 (O
O O oo to CM to
05 05 05 oó oó oó 05 OÓ CM
05 05 05 05 05 05 to
Ε ty) 25 in V— 02 05 τ- Ο) 88 57 36 $
05 05 98 oó oó oó ty CM
c U c*l 05 05 05 05 05 05 ”3·
CO 00 00 tn
Ό tc o O) b> 00 oó 05 o to
V*. 66 05 oó oó ty o oó
Ό 05 05 05 O) 05 05 T~
tO 00 66 00 oo CM CM
oo o 05 00 tO 05 05
05 00 00 oó oó ty 05 ty
05 O) 05 05 05 05 OO
r- in (£5 'r· to *?— 00 to
T 05 O) 00 to *3· in co
05 OÓ OÓ oó oó ty CM ty
05 05 05 05 05 05 h- T—
.04 tO T- OO to oo
om 05 05 co to C»5 o CM
66 σ> OÓ oó oó to 05 to
05 05 O) 05 CO
r- OO CM T— I.88
o σ> 05 oó OO OÓ OO OÓ 8.6 5.4 O
o 05 05 05 05 05
to 2.5 25 625 i 313 16 I § «i
<55 <2> CS
(łUi/Bu) i W l α o
187 925
Tabela 8
500 -0.87 CM Ί— τ- ι -1.02 i_ co Τ- ι τ— I -1.27 -0.01 Ο
§ © g CM σ> τ— R ιη m ©
Ν • ( Τ 1 Τ- ι 1 Τ- ι ο
C\j Τ“ r- οο r- 00 © § τ- Ο 00 ιη .03 ο
ο ο ο r- © ιη
1 ( 1 β I Τ-
62.5 ί -0.5 -0.53 1 -0.55 -0.69 -0.82 0.41 34.93 ο
.25
ε σ) Ε, 34 39 46 42 33 © ν— .33 θ
31. Ο 1 Ο 1 Ο 1 Ο © « Τ“ 53.
ο
Ό & 03 <\ι τ— (D ’Γ· .26 ο 65 © ο
ο © I © I Ο 1 τ- © ιο
Ό
Ο) .06 CM ”3· ιη ©
0θ τ- οο ΟΜ ο
ό © Ο I © 1 ο I
(Ο h- C0 C0 ιη ,
ο ο τ- τ— οο (Ο ο
ο I ο I ο ό ι Ο ι τ— 56
CN CO 00 CM rp
Ν ο ο ο Ο (Ο ο
ο 1 Ο 1 ο ό I © • σ Ύ“ ©
ο ο ο ο ο Ο ο Ο ο
2.5 25 625 cn <ο 80 Ci
*< ς> ς» <5> <5
(|ω/βιι) ι W 1 α □
187 925
Tabela 9
500 -0.664 -0.786 CM cn co o D -1.079 -0.832 -1.244 O o
to co CM 8 CM to to CM $ CO «e co
50 to CO o cn o Ό· d to O cn o T- s o
1 1 6 1 » ©
to to o> CM 09 CM CO LO
o to O O to
to (O co CO CO to CM » o
*-» o 1 o O d ó 0 O P Ό·
to cn o> to CO CO CO
to to CD 7- CM σ>
to to CM o 1 © 1 τ- Ο 1 -0.6 I -0.0 o 34.4 o
lo co co CM co
Ε to co 00 Τ» ćó LO
Si O 7“ co T- o cn CM o
e, O to Ó 1 o d 1 d 1 o 53
o> to
•o to o o o o o .572 8.85 o
XI to
o> CM (O
to 04 o o 90 o .56 o
o o CM
1 1 r- h*
cn CO CM
CN 00
o 7“ o o o o LO o
o o ęy
1 1 *cy
to o o o o o 403 .618 o
d 47
to o o o o o o o o
to 2.5 25 625 to to to 08 to
to to to to
(|Ui/Bu) 1 (ΛΙ i α o
187 925
Tabela 10
1 99.05 98.95 98.79 98.71 98.56 98.41 98.45 93.95
250 06 00 oo 72 55 54 i— CM
oJ oó oó oó oó oó oó 3
σ> 05 05 05 05 05 O)
125 9.04 98.8 8.85 8.63 8.69 8.75 8.43 05 <q- eó
σ> 05 05 05 05 05 05
tn r- CM CO 00 tn O) T“
V 05 CO tn 00 tn
Λ N 99. 66 OÓ OÓ oó oó OÓ V“
Ε 05 05 05 05 05 05
c 25
CM 93 58 ty 72 <£> 3 33
05 oo oó có 05 oó 98 oó CD
> tO 05 05 05 05 05 00
c 00 (£5 00 05 CM
to 05 r*. r*. m t£5 CM
66 od oó oó 98 oó ty r>-
□ 05 05 05 05 05
σ
rt
w «0 CM ,07 T“ σ> V*· (O .67 54 .77 .48
σ> σ> I 99. oó oó oo 00 r*· V“
05 05 05 05 05 CM
CM 90 73 98.6 56 CM t£5 49
66 99. 98. 98. 98 97. CM 0
T“ tn 00 r*· r— co
<N CM C5 00 ty co o 05 05
05 05 co oó oó oó Ύ—
O) 05 05 05 05 05 05
w *3“ 8.77 et CO
o CM T“ o r>- 05 O
05 05 05 oó t£5 V*
05 05 05 05 05 05 1
to 2.5 25 625 to ł-. to £ 05 to
C5 <3 to
(|iu/Su) l W I α o
187 925
Tabela 11
500 -0.9 I τ- ι in T“ τ- ι -1.22 -1.36 Tf a 4.57 o
cn © CM 00 cn T-
§ O 1 CM τ- ι co co • r* 1 Tf 1 co •ti· o
•sr σ> cn co IO
σ> r- o CM CM o o o
>»» O 1 1 T- r- T“ ui
E αϊ 62.5 o -0.73 V O 1 -1.27 -1.31 -0.89 7.08 I o
c u>
U 0.78 0.95 1.29 1.13 t— r- 86 Ό 2.36 o
*o 1 T—
>
m
c 16 cn 00 h- m w
— (O © 1^. d 6Ό 0.9 0.8 0.5 cn tri o
Z3 I 1 CM
σ
ni
W 00 CM .25 .34 .42 .32 94 CO -r- o
o O 1 O 1 O O * o
co to en <± CM Tf co d
N- o ó o CM r- T“ co o
d d o d V— s
T-
to ^r CM to Tf ti·
o o CO o r— o
d 1 o I 1 © > CM cn
o o o o o o o o o
Ul 2.5 1.25 l 0.625 0.313 0.16 0.08
(|Ul/Bu) | ΙΛΙ I Ω O
187 925
Tabela 12
500 -0.515 -0.769 -0.996 -1.117 -0.975 -0.629 4.1588 ©
CM CM to (O cn
cn to § S b* V m o o co V- 00 o
d d r· 7” T“ •
1 1 θ β B
to co co 00 to o 02 .87 co cn to
cm oo oo oo r* ’ί o
d o o d © d ŁO
1 1 1
62.5 T— to cn co to co
Τ -0.64 d -0.59 -0.83 -0.92 -0.37 6.56I o
rai
c y·} co «3· cn cn
k_ cm to o> 1.08 cn oo to
w © co d 8Ό 0.6 o CD O o
> 1 0 V
<0
c 3· cn cn CM -0.66 in cn
<O CO *3· co CM co ν
D <Q· O -0.5 to d OO d 1 τ- Ο 1 25.3 o
σ
« cn co τ- cn
w T (O co <3-
to o o o O o .50 O o
o d 1 có
1 o to
cn to
to co tn
o o o d 1 o o .36 7.9 o
o cn
CM r- ŁO T· CO
CM o o O o o o τί CO 3.5 o
d oo
o o o o o o o o o
to 2.5 25 625 to >— to 80 to
to to to to
(l lu/Bu) 1 ΙΛΙ 1 α o
187 925
Tabela 13
o o Ό 98.52 cn co co OT M- CO co CD 98.52 86‘96 96.91 69.91 cn CS co co
CM co <o co CS in co
Ci IO b- <d CM o- cn b-
to <N CS GO 98 bi co co co tn
cn O) cn cn cn co b-
w co a co b- co a> to
to co co co cn tn b-
<N >— 98 98. 86 96. 92. 90. cn CO TT IO
o* TT co co co co CO CM
to TT b~ V- o cn b-
c\i co CO co CD in T- b·- T O
to OT OT cn cn co co
z—\ t—4 25 .71 b- b- tt in v— I .61 .23 .02 (O CM CO
ΕΞ CD co co in CM
cn co o OT cn cn CS b- TT
c
*»—' ID CM co <o CD TT CO
4-* co cn o CM IO (O co O
O • IO • -
c V— co OT co CM co to co
k. σ> cn ot cn (D co co
0]
o w IO co co co CM io
cn o TT in 'T co
0 co co σ> cn CM CM co ó to
cn cn cn to CM CM
co OT CO ID cn cn IO
b- cn cn o o
V co co 98 CM b- ó
cn cn cn co to
GO CD CM O cn b-
b- cn CO CM co CM to co
c\j o CD có CM b- cn V IO
cn cn cn CD tt co CM -ł-
CM co cn CD cn T
ID co o> b- o <n Ύ—
c CO CO b- y- Tf CO O) o
cn cn cn cn co co
to C\l to CO b.
o to CM »— to
to to co V— o
ci ó O
(Tuj/bu) ι ιλι ι ao
187 925
Tabela 14
500 | -1.26 -0.88 ty o « 1 -0.16 7.46 7.55 ty OT CU o
250 -1.05 b- co ó 1 Ύ““ σ> ό 0 -0.33 12.05 9.46 ty LO CD o
UD cu co co ó 0.58 b- o 3.08 τ- Ο CU CD <<r ó CD tr ó o
< 1 CU CU CU
62.5 -0.68 -0.26 o 0.05 29.94 27.42 -16.89 ! o
LO <D o> b- cn CD
<—1 ε CU 0.3 6 0.2 CO o ty CD 6.7 ty ty o
Ο) co < 1 CU v—
c
+-> CU σ> b co OT
υ <o io co CO ID IO o
c u Ó • 6 O 1 Ύ““ 1 CO b σ> 1
co
υ .22 ’
w CD io LO co CO LO
0 co KT CU CD co o CO
• o
O 1 o O 1 CU CU 1
ty CD cn b cn cn co
O ty ld CU to co o
V o « o o o CD co CU
<D LO b ty co ro
cu o o 1 0.3 0.3 co o t 2.0 -5.1 -10.: o
o o o o o o o o o
1.25 UD CO b
o UD UD CU CU to co LT) Cj
o o o
(fiu/eu) i w i a o
187 925
Tabela 15
z—> r—I ε cn c <D C V (0 O 0 0 1- 1 500 -0.566 o -0.06 o 2.9368 1 > 4.9029 1 o o
1 | 250 o o o o 7.5525 o 1.1641 o
125 o o o o 14.917 0.4024 0.0742 o
I i 62.5 o o o o 16.242 19.53 o o
31.25 I o o o o o o o o
o o o o o o o o
Co CO o o o o o o o
o 0.0945 o o o o o o
CM o o o o o o o o
O o o o o o o o o
o o 2.5 1.25 0 625 co co <s 0. 157 Cż
(τω/Bu) ι ιλι ι ao
187 925
Wszystkie analizy danych przeprowadzono z wykorzystaniem oprogramowania Mac Synergy II soft [M.N. Prichard i C. Shipman, jr.., Antiviral Res., 14, 181 - 206 (1990)]. Zgodnie z podręcznikiem, poziom synergii oszacowano w sposób następujący: gdy poziom synergii wynosi 25 - 50, synergia jest niewielka, ale znacząca (+), gdy poziom synergii wynosi 50 - 100, synergia jest znacząca (++) i gdy poziom synergii wynosi ponad 100, wtedy synergia jest bardzo wysoka (+++).
Poziom synergii w obrębie granic przedziału ufności (99%) i wyniki oszacowania przedstawiono w tabeli 16.
Tabela 16
Związek o aktywności skierowanej przeciw HIV Poziom synergii Synergia
CDIMI + AZT 405 + + +
CDIMI + ddl 163 + + +
CDIMI + ddC 341 + + +
CDIMI + Saquinavir 314 + + +
CDIMI + foskarnet 76 + +
Tabela 16 uwidacznia bardzo wysoką synergię wykazywaną przez CDIMI użyty w kombinacji z innymi związkami o aktywności skierowanej przeciw HiV.
Eksperyment: 2. Cytotoksyczność i hamowanie wzrostu.
Do przeprowadzenia testu cytotoksyczności i testu hamowania wzrostu użyto 96-dołkowych mikropłytek płaskodennych. Sporządzono roztwory CDIMI o stężeniu od 50 pg/ml do 0,78 g/ml w dwukrotnym rozcieńczeniu i 9 g/ml, oraz roztwory AZT o stężeniu od 200 g/ml do 0,18 g/ml w dwukrotnym rozcieńczeniu i 0 ng/ml. Oba te leki połączono ze sobą metodą szachownicową.
Test cytotoksyczności.
Przeprowadzono hodowlę komórek CEM, lub komórek U937, w podłożu RPMI-1640, wzbogaconym 10% płodową surową cielęcą. Komórki wprowadzono do wszystkich dołków 96-dołkowej mikropłytki płaskodennej w ilości 1 x 104 komórek/dołek, po czym do każdego dołka dodano, zgodnie z powyżej opisanym sposobem postępowania, CDIMI i AZT w rozcieńczeniu w takim samym podłożu. Następnie płytki inkubowano w inkubatorze przy 5% CO2, w temperaturze 37°C, w ciągu 3 dni, po czym do wszystkich dołków dodano po 5 mg/ml MTT [bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego] i 30 pl PBS i przeprowadzono inkubację w ciągu 1 godziny. W trakcie tej inkubacji, komórki przeżywające redukowały MTT do nierozpuszczalnego formazanu. Pobrano po 150 pl supematantu hodowli ze wszystkich dołków i następnie dodano po 150 pl roztworu (złożonego z izopropanolu zawierającego 10% Triton X-ł00 i 0,4% HC1). Formazan przeprowadzono do roztworu za pomocą wytrząśnięcia i przeprowadzono pomiar OD560 przy użyciu OD 690 jako odniesieniowej długości fali. Obliczono wartość 50% stężenia cytotoksycznego (CC50) i naniesione na wykres dane uwidoczniono na fig. 1 i na fig. 2. Figura 1 przedstawia wyniki otrzymane dla komórek CEM, a fig. 2 przedstawia wyniki otrzymane dla komórek U937.
Test hamowania wzrostu komórek.
Przeprowadzono hodowlę komórek CEM, lub komórek U937, w podłożu RPMI-1640, wzbogaconym 10% płodową surową cielęcą. Komórki wprowadzono do wszystkich dołków 96-dołkowej mikropłytki płaskodennej w ilości 1 x 104 komórek/dołek, po czym do każdego dołka dodano, zgodnie z powyżej opisanym sposobem postępowania, CDIMI i AZT w rozcieńczeniu w takim samym podłożu. Następnie płytki inkubowano w inkubatorze przy 5% CO2, w temperaturze 37°C, w ciągu 5 godzin, po czym do wszystkich dołków dodano po 0,2 pCi [3H]tymidyny i przeprowadzono inkubację w ciągu 24 godzin. W trakcie tej inkubacji, komórki przeżywające redukowały MTT do nierozpuszczalnego formazanu. Komórki zebrano przy użyciu kolektora komórek na filtr DEAE. Zmierzono radioaktywność włączoną
187 925 do komórek przy użyciu licznika scyntylacyjnego Beta Platę w celu określenia wzrostu komórek. Obliczono pobór [3H]tymidyny dla 50% stężenia hamującego (IC 50) i naniesione na wykres dane uwidoczniono na fig. 3 i na fig. 4. Figura 3 przedstawia wyniki otrzymane dla komórek CEM, a fig. 4 przedstawia wyniki otrzymane dla komórek U937.
Figury 1-4 pokazuje że kombinacja CDIMI z AZT nie przejawia działania synergistycznego zarówno pod względem cytotoksyczności jak i hamowania wzrostu komórek.
Eksperyment 3. Tłumienie pojawiania się odmian lekoopomych.
W podłożu RPMI-1640, wzbogaconym 10% płodową surowicą cielęcą, przeprowadzono hodowlę linii ludzkich komórek T Molt-4, trwale zakażonych HIV-1 (szczep IIIB, klon 3), po czym supematant przesączono i przechowywano w temperaturze -80°C, po czym ustalono miano wirusa.
Do każdego dołka 12-dołkowych płytek wprowadzono po 1 ml powyższego podłoża zawierającego 106 komórek M 8166, po czym dodano 100 μΐ powyższego HIV-1 (szczep IIIB, klon 3) i całość inkubowano w ciągu 2 godzin w celu zakażenia komórek wirusem. Komórki przemyto wyżej wspomnianym podłożem, po czym do każdego dołka dodano po 4 ml podłoża zawierającego CDIMI lub inne związki o aktywności skierowanej przeciw HIV, same lub w kombinacji, i przeprowadzono inkubację w inkubatorze przy 5% CO2, w temperaturze 37°C. CDIMI dodawano w stężeniu wynoszącym 1 ng/ml, a ddC dodawano w stężeniu wynoszącym, odpowiednio, 50 ng/ml. Takich samych stężeń użyto w przypadku dodawania kombinacji omawianych związków. Dwa razy na tydzień dokonywano przesiewu hodowli i po zaobserwowaniu namnażania się wirusa, stężenie związku o aktywności skierowanej przeciw HIV podwojono. W przypadku, gdy nie stwierdzono namnożenia się wirusa, stężenie leku utrzymywano na poziomie takim samym, jak w ostatniej hodowli.
Miano wirusa ustalono z wykorzystaniem jako markera aktywności wirusowej transkryptazy odwrotnej, w sposób następujący.
Do 100 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 150 mM KC1, 10 mM MgCh, 0,1% Nonidet P-40, 10 mM ditiotreitolu, 5 pg/litr poli (A), 5 pg/ml (dT^-is i 1 pCi [3H]dTTP, wprowadzono 10 pl supematantu hodowli i całość inkubowano w temperaturze 37° w ciągu 3 godzin. Następnie, mieszaninę reakcyjną oziębiono lodem i przeniesiono, z zastosowaniem kolektora komórek, na DEAE-Filtermat Filtr przemyto 5% roztworem Na2HPO4.12 H2O i wodą, po czym dokonano pomiaru radioaktywności włączonej do DNA, przy użyciu licznika scyntylacyjnego LKB Beta Platę, w celu oznaczenia aktywności wirusowej transkryptazy odwrotnej.
W przypadku zaobserwowania namnażania się wirusa, wirusy wyodrębniono i w zwykły sposób zbadano wrażliwość na każdy z badanych składników aktywnych. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 17.
Tabela 17
Związek o aktywności skierowanej przeciw HIV Po ilu tygodniach pojawiły się oporne mutanty Stosunek oporności w porównaniu ze szczepem macierzystym
CDIMI po 4 tygodniach 10 razy
ddC po 1 tygodniu 20 razy
CDIMI + ddC po ponad 5 tygodniach -
Tabela 17 uwidacznia, że w przypadku użycia kombinacji złożonej z ddC i CDIMI odmiana oporna nie występuje.
Eksperyment 4. Powrót do wirusa wrażliwego na lek przez kombinację mutacji lekoopomych.
Na drodze in vitro mutagenezy w obrębie cząsteczki cDNA klonu NL432 HIV, otrzymano różne zmutowane klony genu transkryptazy odwrotnej, znane jako mutanty oporne na CDIMI lub mutanty oporne na AZT. cDNA mutantowych klonów transfekowano do komórek SW480. Utworzonymi mutantami wirusów zakażono komórki MT-4 stosując taki sam sposób postępowania jaki podano w opisie eksperymentu 1, w obecności leku. Po upływie 4 dni, zba187 925 dano namnażanie się wirusa, z wykorzystaniem aktywności transkryptazy odwrotnej jako markera. Obliczono 50% zahamowanie namnażania się wirusa (EC50) i 90% zahamowanie namnażania się wirusa (EC90) Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 18.
Tabela 18
Wirus CDIMI AZT
EC50 (ng/ml) EC90 (ng/ml) EC50 (ng/ml) EC90 (ng/ml)
NL432 (szczep dziki) 0,31 1,1 1,2 5,6
Y181C 4,2 18 0,9 3,6
F227C 2,4 9,8 0,14 1,1
L2341 6,8 14 0,78 3,0
VI06 A + F227L 117 310 0,58 6,0
D67N + K70R 0,31 1,0 2,0 32
T215Y 0,17 0,4 5,6 37
T215Y + L234I 0,69 2,7 1,6 6,8
Szczepy Y181C, F227C, L234I iV106A + F22iL, związane z opornością na CDIMI, były wrażliwe na AZT. Na odwrót, wrażliwość klonów opornych na AZT, a mianowicie klonów szczepów D67N + K70R i T215Y na CDIMI była równoważna wrażliwości szczepu dzikiego. Tak więc, CDIMI i AZT nie wykazują oporności krzyżowej.
Szczep T215Y + L234I wykazujący zarówno oporną na AZT mutację T215Y, jak i oporną na CDIMI mutację L234I był wrażliwy na CDIMI i AZT w takim samym stopniu, jak szczep dziki, co wskazuje na powrót szczepu opornego do szczepu wrażliwego. Ten uzyskany in vitro wynik pokazuje, że pojawienie się odmian opornych tak na CDIMI jak i na AZT jest mało prawdopodobne u zakażonych chorych, którym podaje się równocześnie CDIMT i AZT.
Preparat 1. Granulki.
Granulki wytworzono za pomocą jednolitego zmieszania ze sobą wszystkich następujących składników, a następnie fluidyzacyjnego granulowania, wysuszenia i przesiania.

Claims (2)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość 2-karbamoiloksymetylo-5 -(3,5 -dichlorofenylotio)-4-izopropylo-1 -(pirydyn-4-ylo)metylo1H-imidazolu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli i skuteczną ilość jednego lub większej ilości innych związków o aktywności skierowanej przeciw HIV obejmujących nukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej, nienukleozydowy inhibitor transkryptazy odwrotnej i/lub inhibitor proteazy HIV.
  2. 2. Kompozycja przeciw HIV według zastrz. 1, znamienna tym, że jako związki o aktywności skierowanej przeciw HIV zawiera ddi, ddC, Saquinavir i/lub foskamet.
PL32917497A 1996-04-04 1997-03-14 Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV PL187925B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8256396 1996-04-04
JP8513296 1996-04-08
PCT/JP1997/000812 WO1997037657A1 (fr) 1996-04-04 1997-03-14 Composition anti-vih contenant un derive d'imidazole

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL329174A1 PL329174A1 (en) 1999-03-15
PL187925B1 true PL187925B1 (pl) 2004-11-30

Family

ID=26423589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL32917497A PL187925B1 (pl) 1996-04-04 1997-03-14 Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6083958A (pl)
EP (1) EP0906756A4 (pl)
JP (1) JP3272369B2 (pl)
KR (1) KR100310888B1 (pl)
CN (1) CN1111406C (pl)
AU (1) AU712071B2 (pl)
BR (1) BR9708592A (pl)
CA (1) CA2250844C (pl)
MX (1) MXPA98008158A (pl)
NO (1) NO984616L (pl)
PL (1) PL187925B1 (pl)
TW (1) TW477701B (pl)
WO (1) WO1997037657A1 (pl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999066936A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Emory University Use of 3'-azido-2',3'-dideoxyuridine in combination with further anti-hiv drugs for the manufacture of a medicament for the treatment of hiv
GB9909154D0 (en) * 1999-04-22 1999-06-16 Nippon Glaxo Limited Pharmaceutical formulation
CN1446213A (zh) * 2000-06-13 2003-10-01 盐野义制药株式会社 含丙烯酮衍生物的药用组合物
WO2005016912A1 (en) * 2003-08-19 2005-02-24 Pfizer Inc. An efficient microbial preparation of capravirine metabolites m4 and m5

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2032259A1 (en) * 1989-12-18 1991-06-19 Wayne J. Thompson Hiv protease inhibitors useful for the treatment of aids
IL99843A0 (en) * 1990-11-01 1992-08-18 Merck & Co Inc Synergistic combination of hiv reverse transcriptase inhibitors
TW235963B (pl) * 1992-01-16 1994-12-11 Shionogi & Co
JP3155009B2 (ja) * 1994-09-26 2001-04-09 塩野義製薬株式会社 イミダゾール誘導体

Also Published As

Publication number Publication date
BR9708592A (pt) 1999-08-03
TW477701B (en) 2002-03-01
AU1940797A (en) 1997-10-29
EP0906756A1 (en) 1999-04-07
PL329174A1 (en) 1999-03-15
CN1111406C (zh) 2003-06-18
WO1997037657A1 (fr) 1997-10-16
NO984616L (no) 1998-11-26
MXPA98008158A (es) 2002-02-08
US6083958A (en) 2000-07-04
CA2250844A1 (en) 1997-10-16
KR100310888B1 (ko) 2001-12-12
CA2250844C (en) 2002-09-10
AU712071B2 (en) 1999-10-28
NO984616D0 (no) 1998-10-02
JP3272369B2 (ja) 2002-04-08
CN1220604A (zh) 1999-06-23
EP0906756A4 (en) 2000-11-22
KR20000005115A (ko) 2000-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200171027A1 (en) Combinations of a pyrimidine containing nnrti with rt inhibitors
EP2051703B1 (en) Pharmaceutical combination comprising nucleotide and nucleoside reverse transcriptase inhibitors (such as tenofovir and lamivudine) in different parts of the dosage unit
US11337991B2 (en) Methods for the treatment and prophylaxis of HIV and AIDS
Flexner Antiretroviral agents and treatment of HIV infection
ZA200607959B (en) Combinations for treating HIV infection
Kuritzkes Clinical significance of drug resistance in HIV-1 infection
TWI751456B (zh) 癌症療法
PL187925B1 (pl) Kompozycja farmaceutyczna przeciw HIV
KR100413312B1 (ko) 항바이러스 복합약제
EP3600332B1 (en) Hiv post-exposure prophylaxis
RU2188638C2 (ru) Анти-вич-композиция, содержащая имидазольные производные
US20080241265A1 (en) Pharmaceutical Combinations Containing Lamivudine, Stavudine and Nevirapine
KR101638999B1 (ko) 피리미딘 함유 ｎｎｒｔｉ와 ｒｔ 저해제의 배합물
EP3650015A1 (en) Combined medicinal preparation for treating viral infections

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20070314