PL186393B1 - Zastosowanie siarczanu kwasu 3 alfa, 7 beta-dihydroksy-5-beta-cholan-24-owego lub jego soli do wytwarzania kompozycji farmakologicznej - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie siarczanu kwasu 3 alfa, 7 beta-dihydroksy-5-beta-cholan-24-owego (UDCA) lub jego soli do wytwarzania kompozycji farmakologicznej, zawierajacej farma- kologicznie przyjety nosnik, do inhibitowania lub leczenia schorzenia watroby lub stanu zapalnego drogi zoladkowo-jelitowej u ssaków, zwlaszcza stanu zapalnego watroby lub stanu zapalnego jelita cienkiego, jelita grubego lub stanu zapalnego, takiego jak rak okrez- nicy, rak odbytnicy, nowotwór okreznicy, nowotwór odbytnicy, karcynogeneza okreznicy, karcynogeneza odbytnicy, wrzodziejace zapalenie okreznicy, polip gruczolakowaty, poli- powatosc rodzinna jelit i ich kombinacje. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie siarczanu kwasu 3 alfa, 7 beta-dihydroksy-5-beta-cholan-24-owego lub jego soli do wytwarzania kompozycji farmakologicznej.

Znane jest stosowanie kwasu 3-alfa, 7-beta-dihydroksy-5-beta-chołan-24-owego (zwanego też kwasem ursodeoksycholowym lub UDCA) do leczenia pacjentów z kamicą żółciową lub ze schorzeniami wątroby wynikającymi z zastoju żółci. W oparciu o wyniki długotrwałych prób klinicznych stwierdzono, ze doustne podawanie UDCA prowadzi do znaczącej poprawy dotyczącej enzymów surowicy wątroby i jest korzystne w leczeniu wczesnego etapu pierwotnej marskości wątroby. Dodatkowo próby kliniczne wykazały, ze stosowanie UDCA jest korzystne w poprawie klinicznych i biochemicznych wskaźników funkcji wątrobowych u pacjentów ze stwardniej ącym zapaleniem dróg żółciowych, mukowiscydozą i przewlekłym zapaleniem wątroby.

Pomimo obiecujących wyników wykazywanych przez UDCA leczeniu schorzeń wątroby, dokładny mechanizm jego działania pozostaje niejasny. Badania sugerują, ze przesunięcie równowagi ilości hydrofobowych do hydrofitowych kwasów żółciowych stanowi istotny czynnik określający jego efektywność, chociaż inne dane nie w pełni potwierdzają te argumenty; a poprawienie tonkcj ono wania wątroby jest prawie na pewno wynikiem zaznaczonego nadmiernego wydzielania żółci wywoływanego przez UDCA, który przyspiesza wydzielanie żółciowe potencjalnie bardziej toksycznych kwasów żółciowych lub innych endogennych czynników.

Znane jest również stosowanie siarczanu UDCA do leczenia. Przykładowo, z publikacji „Boli. Chim. Farm.” (vol. 126, nr 7, 1987, strony 282-288) wiadomo, ze doustne podawanie 3,7-siarczanu UDCA prowadzi do poprawy składu lipidów żółciowych, podobnej do poprawy spowodowanej przez UDCA, i umożliwia leczenie pacjentów z kamicą żółciową. Natomiast z opisu EP 117 570 jest znane stosowania soli trisodowej 3,7-disiarczanu UDCA do inhibitowania lub poprawienia (regulowania) hiperdyslipidemii, czyli zaburzenia w składzie lipidów żółciowych.

W badaniach koncentrujących się na metabolizmie UDCA u pacjentów z rozmaitymi chorobami wątroby, pojawianie się znaczących ilości C-3 estru kwasu siarkowego UDCA w moczu było zgodnie obserwowane, i ten konkretny metabolit, jak wykazano, jest użytecznym markerem podatności UDCA. W dodatku badania na zwierzętach sugerowały, ze tworzenie siarczanów kwasów żółciowych może stanowić istotną drogę metaboliczną dla zapobiegania cholestazie i ograniczenia uszkodzenia komórek wątroby.

Efekt cytotoksyczny kwasu żółciowego, lub uszkadzający membranę, powiązany jest z jego właściwościami fizykochemicznymi. Hydrofobowe kwasy żółciowe znacząco bardziej uszkadzają membranę niz hydrofitowe kwasy żółciowe, i względne wskaźniki cytotoksyczności ustalono opierając się na objętości retencji kwasu żółciowego w układach wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej, w fazach odwróconych, lub na współczynnikach podziału w oktanolu/wodzie. Jest paradoksalne, ze ludzka wątroba syntetyzuje kwas chenodeoksycholowy, hydrofobową cząsteczkę, która jest wewnętrznie toksyczna dla wątroby, jako jeden z jej

186 393 pierwotnych kwasów żółciowych; w cholestazie, akumulowanie w wątrobie kwasu żółciowego może wywoływać lub współuczestniczyć w zaostrzeniu uszkodzeń wątroby. W przeciwieństwie, UDCA, 73-epimer kwasu chenodeoksycholowego, jest silnie hydrofilowy i, jak wykazano, przeciwdziała efektom uszkodzenia membrany przez hydrofobowe kwasy żółciowe. Jest to jedno z racjonalnych wyjaśnień terapeutycznego działania UDCA w leczeniu rozmaitych schorzeń wątroby. W następstwie doustnego lub dożylnego podania UDCA, ten kwas żółciowy jest efektywnie biotransformowany w wątrobie, głównie poprzez tworzenie pochodnej. Pomijalne stężenia i proporcje nie przekształconego UDCA są w konsekwencji znajdowane w ludzkiej żółci, nawet po podaniu stosunkowo dużej dawki.

UDCA może pełnić rolę terapeutyczną również poza swym zastosowaniem w rozmaitych chorobach wątroby. W tym względzie, dane wyłaniające się z modeli zwierzęcej karcynogenezy okrężnicy, sugerują, że UDCA pełni rolę zabezpieczającą.

Jednakże, właściwe dostarczanie UDCA do okrężnicy jest problematyczne, pod tym względem, że przy zwyczajowych dawkach terapeutycznych podawanych doustnie (10-15 mg/kg ciężaru/dzień), UDCA jest stosunkowo dobrze absorbowany z jelita i skutecznie biotransformowany w wątrobie, głównie przez tworzenie pochodnej. W konsekwencji, jest wyjątkowo trudne podanie efektywnej ilości UDCA specyficznie do okrężnicy.

Celem wynalazku jest opracowanie skutecznego dostarczania UDCA do okrężnicy lub do innych fragmentów drogi zołądkowo-j elitowej, tak aby możliwe było leczenie schorzenia wątroby lub schorzenia zapalnego drogi zołądkowo-jelitowej.

Według wynalazku siarczan kwasu - alfa, 7 beta-dihydroksy-5-beta-cholan-24-owego (UDCA) lub jego sól stosuje się do wytwarzania kompozycji farmakologicznej, zawierającej farmakologicznie przyjęty nośnik, do inhibitowania lub leczenia schorzenia wątroby lub stanu zapalnego drogi zołądkowo-jelitowej u ssaków, zwłaszcza stanu zapalnego wątroby lub stanu zapalnego jelita cienkiego, jelita grubego lub stanu zapalnego, takiego jak rak okrężnicy, rak odbytnicy, nowotwór okręznicy, nowotwór odbytnicy, karcynogeneza okręznicy, karcynogeneza odbytnicy, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, polip gruczołakowaty, polipowatość rodzinna jelit i ich kombinacje.

Korzystnie, stosuje się siarczan wybrany z grupy zawierającej --siarczan UDCA, 7-siarczan UDCA, -,7-disiarczan UDCA, --siarczan gliko-UDCA, 7-siarczan gliko-UDCA, -,7-disiarczan gliko-UDCA, --siarczan tauro-UDCA, 7-siarczan tauro-UDCA, -,7-disiarczan tauro-UDCA i ich kombinacje, zwłaszcza siarczan wybrany z grupy zawierającej --siarczan UDCA, 7-siarczan UDCA, -,7-disiarczan UDCA i ich kombinacje, w szczególności siarczan wybrany z grupy zawierającej 7-siarczan UDCA, -,7-disiarczan UDCA i ich kombinacje.

Korzystnie, stosuje się siarczan w ilości efektywnej do inhibitowania lub leczenia stanu zapalnego drogi żołądkowo-jelitowej lub w ilości efektywnej do inhibitowania lub leczenia stanu zapalnego wątroby.

Korzystnie, stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji do podawania dożylnego, a zwłaszcza do wytwarzania kompozycji zawierającej siarczan w ilości efektywnej do dostarczania UDCA do jelita grubego ssaka.

Korzystnie, stosuje się siarczan zawierający fragment siarczanowy na węglu C-7.

Korzystnie, stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji inhibitującej jelitową absorpcję UDCA lub kompozycji inhibitującej jelitową transformację UDCA i jego metabolitów, zwłaszcza kompozycji inhibitującej poprzez degradację bakteryjną albo kompozycji inhibitującej poprzez 7 alfa-dehydroksylację.

Korzystnie, stosuje się siarczan zawierający fragment siarczanowy na węglu C-7 do wytwarzania kompozycji obniżającej ilość kwasu litocholowego lub jego soli i kwasu deoksycholowego lub jego soli w okręznicy.

Korzystnie, stosuje się siarczan zawierający fragment siarczanowy na węglu C-7 do wytwarzania kompozycji do dostarczania UDCA do okrężnicy bez znaczącego zwiększenia proporcji kwasu litocholowego lub jego soli do kwasu deoksycholowego lub jego soli w okrężnicy.

Korzystnie, stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji poprawiającej biochemię surowicy w schorzeniu wątroby i funkcjonowaniu wątroby, a zwłaszcza wytwarza się kompo186 393 zycję poprawiającą biochemię surowicy, która to biochemia obejmuje stężenia w surowicy enzymów wybranych z grupy zawierającej aminotransferazę alaniny, aspartatową aminotransferazę, alkaliczną fosfatazę, gamma-glutamylotranspeptydazę oraz ich kombinacje.

Korzystnie, stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji zwiększającej wypływ żółci.

Korzystnie, stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji obniżającej wydzielanie żółciowego lipidu, wybranego z grupy zawierającej fosfolipid, cholesterol oraz ich kombinacje.

Korzystnie, stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji w postaci do podawania doustnego, miejscowego lub dożylnego.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że podawanie siarczanu UDCA umożliwia dostarczenie terapeutycznie efektywnych ilości UDCA do okrężnicy i innych fragmentów drogi zołądkowo-jelitowej celem inhibitowania lub leczenia schorzeń zapalnych, takich jak rak okrężnicy i podobne. W dodatku, siarczany UDCA mogą być efektywnie wykorzystane do inhibitowania lub leczenia chorób wątroby lub poprawienia funkcjonowania wątroby.

Wyniki badań, ilustrujące działanie siarczanu UDCA, przedstawiono na rysunku.

Figury 1A i IB przedstawiają porównanie całkowitej masy UDCA w całym jelicie czczym (fig. 1 A) i stężenie w tkance wątroby u szczurów testowych (fig. 1B) po podaniu doustnym UDCA, UDCA-3S, UDCA-7S i UDCA-DS. Kwasy żółciowe rozdzielono według ich zdolności do wiązania się poprzez chromatografię aniono-wymicnną poprzedzającą analizę indywidualnych frakcji z użyciem GC-MS. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie dla wszystkich zwierząt;

Figura 2 przedstawia wydalanie kwasu żółciowego z kałem szczurów porównawczych i szczurów, którym podano doustnie UDCA, UDCA-3S, UDCA-7S i UDCA-DS. Kwasy żółciowe rozdzielono według ich zdolności do wiązania się poprzez chromatografię aniono-wymienną poprzedzającą analizę indywidualnych frakcji z użyciem GC-MS. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie dla wszystkich zwierząt;

Figura 3 przedstawia proporcję kwasu litocholowego/deoksycholowego w kale szczurów porównawczych i szczurów, którym podano doustnie UDCA, UDCA-3S, UDCA-7S i UDCA-DS. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie dla wszystkich zwierząt;

Figury 4A-4D przedstawiają stężenie UDCA w tkance wątroby szczurów, którym podano doustnie UDCA (fig. 4A), UDCA-3S (fig. 4B), UDCA-7S (fig. 4C) i UDCA-DS (fig. 4D). Kwasy żółciowe rozdzielono według ich zdolności do wiązania się poprzez chromatografię aniono-wymienną poprzedzającą analizę indywidualnych frakcji z użyciem GC-MS. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie dla wszystkich zwierząt;

Figury 5A i 5B przedstawiają średni przepływ żółci i kwasu żółciowego u szczurów Sprague-Dawley podczas IV infuzji UDCA i pochodnych siarczanowych;

Figury 6A-6D przedstawiają zależność pomiędzy wydzielaniem kwasu żółciowego i przepływem żółci w następstwie infuzji UDCA oraz jego siarczanowych pochodnych;

Figura 7A i 7B przedstawia średni wypływ żółciowy cholesterolu i fosfolipidów u szczurów Sregue-Dawley podczas IV infuzji UDCA i pochodnych siarczanowych; i

Figura 8A-8E przedstawia widma ujemnych jonów FAB-Ms żółci szczura przed infuzją (fig. 8A), podczas infuzji UDCA (fig. 8B), podczas infuzji UDCA 3-S (fig. 8C), podczas infuzji UDCA 7-S (fig. 8D) i podczas infuzji UDCA-DC (fig. 8E).

Szczegółowy opis wynalazku

Dodatkowe skróty pojawiające się poniżej obejmują: GC (chromatografia gaz-ciecz), GC-MS (chromatografia gaz-ciecz ze spektrometrią masową), FAB-MS (spektrometria masowa bombardowania przyspieszonymi atomami), TLC (chromatografia cienkowarstwowa), HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa), UDCA-3S (3-siarczan kwasu ursodeoksycholowego), UDCA-7S (7-siarczan kwasu ursodeoksycholowego), UDCA-DS (3,7-disiarczan kwasu ursodeoksycholowego), tBDMS eter (eter tert-butylodimetylosililowy) i tBDMC (chlorek tert-butylodimetylosililowy).

Przedstawione poniżej dane porównują metabolizm jelitowy i zachowanie indywidualnych siarczanów kwasu żółciowego UDCA z niezwiązanymi kwasami żółciowymi i wykazują, między innymi, ze obecność fragmentu C-7 siarczanu zabezpiecza przed degradacją bakteryjną i inhibituje jelitową absorpcję UDCA.

186 393

MA TERIAŁ YI SPOSOBY

Synteza estrów kwasu siarkowego UDCA

UDCA, o czystości 99% uzyskano z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Estry, monosiarczan i disiarczan UDCA, otrzymano według metod opisanych szczegółowo, etap po etapie, później w tym szczegółowym ujawnieniu. W skrócie, synteza estrów kwasu siarkowego polega na selektywnym zabezpieczaniu każdej z grup hydroksylowych pierścienia cząsteczki UDCA, a następnie wprowadzanie grupy siarczanowej na niezabezpieczoną grupę hydroksylową i hydrolizę grup zabezpieczających celem uwolnienia monoestru kwasu siarkowego. Disiarczan, pochodną UDCA, otrzymano w reakcji UDCA z kwasem sulfonowym. Chromatografia gazowa ze spektrometrią masową (GC-MS) została zastosowana celem potwierdzenia lokalizacji grup siarczanowych drogą analizy produktów utleniania, solwolizy i konwersji do pochodnych estru metylowego/eteru trimetylosililowego. Czystość chromatograficzną syntetycznych soli żółciowych określono jako stanowiącą >97% dla 7-siarczanu UDCA i 3,7-disiarczanu UDCA oraz >95% dla 3-siarczanu UDCA, w wyniku pomiaru wysokociśnieniową chromatografią cieczową, chromatografią cienkowarstwową i chromatografią gazową na kolumnie kapilarnej.

BADANIA NA ZWIERZĘTACH

Samce szczura Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, IN), ważące 210-290 g, pielęgnowano przy 12-godzinnym cyklu światło-ciemność i karmiono standardową żywnością laboratoryjną ad libitum przez 3 dni. Zwierzęta następnie przeniesiono do metabolicznych klatek, w których przebywały indywidualnie i spożywały tę samą dietę. UDCA, 3-siarczan UDCA, 7-siarczan UDCA i 3,7-disiarczan UDCA podawano przez zgłębnik w dawce 250 mg/dzień przez 4 kolejne dni. Każda grupa składała się z 3-6 szczurów. Ciężary ciał zwierząt mierzono każdego dnia. Piątego dnia zwierzęta, anestezjowane eterem, zostały zabite przez wykrwawienie. Zebrano plazmę i zamrożono w -20°C. Wszystkie zwierzęta znajdowały się pod ludzką opieką zgodnie z „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” przygotowanym przez National Academy of Sciences (National Institutes of Health publikacja nr 86-23, skorygowana w 1985).

ANALIZA KWASU ŻÓŁCIOWEGO

Niezwiązane kwasy żółciowe oraz siarczany kwasów żółciowych w zawartościach jelit i kałach

Zawartości jelit zważono i podzielono na małe kawałki. W każdej grupie, kały (100 mg) od wszystkich zwierząt zebrano czwartego dnia eksperymentu i następnie zmielono na subtelną pastę. Wszystkie próbki poddano działaniu ultradźwięków i kolejno ogrzewano do wrzenia w 80% metanolu przez 2 godziny i chloroformie/metanolu (1:1) przez 1 godzinę. Próbki wysuszono, a następnie wysuszone ekstrakty ponownie zawieszono w 80% metanolu (20 ml). Frakcje ekstraktu metanolowego (próbki 1/40 zawartości jelitowych i 1/20 kału) usunięto i dodano wzorzec wewnętrzny, kwas nordeoksycholowy (10 pg). Ekstrakt ten rozcieńczono 0,01 mol/l kwasem octowym (20 ml) i przepuszczono najpierw przez kolumnę Lipidex 1000 (wielkość złoza, 4 x 1 cm; Packard Instrument Co., Groningen, Holandia), a następnie przez kartrydz Bond-Elut Cis (Analytichem, Harbor City, CA). Kwasy żółciowe odzyskano w wyniku elucji kolumny Lipidex 1000 i kartrydżu Bond-Elut metanolem (odpowiednio 20 ml i 5 ml) i połączone ekstrakty odparowano do sucha. Niezwiązane kwasy żółciowe oddzielono i odseparowano od obojętnego sterolu i pochodnych kwasów żółciowych poprzez lipofilową chromatografią aniono-wymienną na dietyloaminohydroksypropylo-Sephadexie LH-20 (Lipidex-DEAP; Package Instrument Co.). Niezwiązane kwasy żółciowe odzyskano poprzez elucję 0,1 mol/l kwasem octowym w 72% etanolu (7 ml), a następnie odparowanie rozpuszczalników. Całość pochodnych kwasów żółciowych odzyskano stosując 9 ml 0,3 mol/l kwasu octowego w 72% etanolu, pH 9,6. Sole usunięto przepuszczając przez kartrydż Bond-Elut C]₈ po dodaniu kwasu nordeoksycholowego (10 jtg) i pochodne kwasów żółciowych odzyskano eluując 5 ml metanolu. Solwolizę przeprowadzono w mieszaninie metanolu (1 ml), destylowanego tetrahydrofuranu (9 ml) i 1 mol/l kwasu trifluorooctowego w dioksanie (0,1 ml) i ogrzewano w 45°C przez 2 godziny. Po solwolizie niezwiązane kwasy tłuszczowe wydzielono poprzez chromatografię na Lipidex-DEAP. Pochodne, estry metylowe, otrzymano poprzez roz186 393 puszczenie próbki w metanolu (0,3 ml) i poddanie reakcji z 2,7 ml świeżo destylowanego eterowego diazometanu. Po odparowaniu reagentów, pochodne, estry metylowe przekształcono w etery trimetylosililowe przez dodanie 50 ml odczynnika Tri-Sil (Pierce Chemicals, Rockford, IL). Celem usunięcia reagentów i oczyszczenia próbki zastosowano kolumnę Lipidex 5000 (Packard Instrument Co.).

Niezwiązane kwasy żółciowe oraz siarczany kwasów żółciowych w plazmie i w moczu

Mocz od wszystkich zwierząt z każdej grupy zbierano w indywidualne dni pobierania. Dzień 1 stanowi próbkę odniesienia, a próbki z dni 2, 3 i 4 otrzymano podczas podawania kwasu żółciowego. Po dodaniu kwasu nordeoksycholowego (1 pg) kwasy żółciowe ilościowo wyekstrahowano z porcji moczu (3 ml) i plazmy (1 ml) stosując kartrydze Bond-Elut Cig. Po ekstrakcji ciecz-ciało stałe, izolacja i separacja niezwiązanych i związanych kwasów żółciowych została dokonana poprzez lipofilową chromatografię aniono-wymienną na Lipidex-DEAP. Solwolizę pochodnych kwasów żółciowych oraz izolację produktów hydrolizy przeprowadzono jak opisano powyżej, a kwasy żółciowe przekształcono w lotne pochodne, estry metylowe-etery trimetylosililowe.

Zawartość pochodnych kwasu żółciowego w wątrobie i zawartości jelita czczego

Próbki wątroby (100 mg) zmielono na subtelną pastę i kwasy żółciowe ekstrahowano we wrzeniu, i przepuszczono przez kolumnę Lipidex 1000, jak opisano powyżej dla zawartości jelita i kału. Rozdzielenie grup kwasów żółciowych, według ich zdolności do wiązania się, osiągnięto drogą lipofilowej chromatografii aniono-wymiennej. Zebrane ekstrakty od każdego zwierzęcia i kwasy żółciowe oraz ich pochodne rozdzielono z użyciem Lipidex-DEAP, stopniowo eluując złoże żelu następującymi buforami: 0,1 mol/l kwasu octowego w 72% etanolu (niezwiązane kwasy żółciowe); 0,3 mol/l kwasu octowego w 72% etanolu, pH 5,0 (pochodne glicyny); 0,15 mol/l kwasu octowego w 72% etanolu, pH 6,5 (pochodne tauryny); i 0,3 mol/l kwasu octowego w 72% etanolu, pH 9,6 (pochodne kwasu siarkowego). Po odparowaniu buforów, estry kwasu siarkowego kwasów żółciowych poddano solwolizie, podczas gdy amidowane pochodne hydrolizowano 50 U hydrolazy choliloglicyny (Sigma Chemical Co.) w 2,5 ml 0,2 mol/l buforu fosforanowego, pH 5,6, w 37°C przez noc. Uzyskane niezwiązane kwasy żółciowe wyizolowano na Lipidex-DEAP, a pochodne, ester metylowy-eter trimetylosililowy, otrzymano jak ujawniono powyżej.

Po solwolizie, amidowane kwasy żółciowe z fragmentu jelita czczego jelita szczura wyizolowano na Lipidex-DEAP eluując 0,15 mol/l kwasu octowego w 72% etanolu, pH 6,5 (6 ml). Hydrolizę enzymatyczną przeprowadzono jak powyżej, a uzyskane niezwiązane kwasy żółciowe wyizolowano i przeprowadzono w pochodne jak ujawniono powyżej.

GC-MS

Pochodne, ester metylowy-eter trimetylosililowy, rozdzielano na krzemionkowej kolumnie kapilarnej 30 m x 0,25 mm DB-1 (J&W Scientific, Folson, CA) stosując program temperaturowy do 225°C do 295°C z inkrementami 2°C/min i końcowy okres izotermiczny 30 minut. Analizę GC-MS przeprowadzano z użyciem spektrometru masowego Finnigan 4635 (Finnigan Inc., San Jose, CA), posiadającego identyczną kolumnę do chromatografii gazowej pracującą w identycznych warunkach. Widma masowe przy jonizacji elektronowej (70 eV) rejestrowano w zakresie mas 50-800 daltonów poprzez powtarzane skanowanie eluowanych składników. Identyfikacji kwasów żółciowych dokonano w oparciu o wskaźnik retencji chromatografii gazowej w odniesieniu do homologicznej serii n-alkanów, cytowany jako wartość jednostki metylenowej oraz porównanie widma masowego z autentycznymi wzorcami. Oznaczenia ilościowe kwasów żółciowych zostały dokonane z użyciem chromatografii gazowej poprzez porównanie wysokości piku odpowiednich indywidualnych kwasów żółciowych z wysokością piku uzyskanego dla wzorca wewnętrznego.

Spektrometria masowa wtórnej jonizacji w cieczy

Widma masowe jonów ujemnych, w wyniku wtórnej jonizacji w cieczy, dla próbek moczu otrzymano po umieszczeniu w przybliżeniu 1 jal ekstraktu metanolowego na małej kropli matrycy glicerol/metanol, nakroplonej na sondzie ze stali nierdzewnej. Sondę tę wprowadzono do źródła jonów spektrometru masowego VG Autospec Q i wiązka szybkich atomów cezu,

186 393 generowanych z jodku cezu (35 kev), została wystrzelona w cel zawierający próbkę. Widma jonów ujemnych otrzymano w zakresie mas 50-1000 daltonów.

ANALIZA STATYSTYCZNA

Dane przedstawiono jako średnia ± średnie odchylenie standardowe lub jako średnie wartości dla wszystkich zwierząt, od których zbierano ekstrakty przed analizą. Wyniki dla różnych grup zostały porównane z zastosowaniem sparowanego i niesparowanego testu /-Studenta. Wartości P <0,05 uznano za statystycznie znaczące.

WYNIKI

Kompozycja kwasu żółciowego wewnątrz

Jelito

Przeciętny ciężar wyciętych fragmentów jelita zwierząt z grupy porównawczej i tych którym podano indywidualne kwasy żółciowe, był podobny. U zwierząt porównawczych całkowita ilość UDCA w jelicie czczym (0,03 ± 0,01 mg) była pomijalna, doliczając się jedynie 0,3% całkowitej ilości kwasów żółciowych. Jednakże całkowita masa UDCA (i jego zawartość procentowa w całości kwasów żółciowych) w jelicie czczym była większa u wszystkich zwierząt w 24 godziny po podaniu finalnej dawki UDCA, 3-siarczanu UDCA, 7-siarczanu UDCA i 3,7-disiarczanu UDCA, licząc odpowiednio 9,95 ± 0,49 mg (35,9%), 3,67 ± 0,45 mg (16,4%), 1,09 ± 0,34 mg (4,7%) i 0,21 ± 0,07 mg (2,0%). Wynik ten wskazuje na bardzo małe zatrzymywanie UDCA, gdy grupa siarczanowa jest związana w pozycji C-7 (tabela 1).

Δ²² UDCA, specyficzny metabolit egzogennie podawanego UDCA, został wykryty w dużych proporcjach i ilościach w jelicie czczym zwierząt, którym podano UDCA i 3-siarczan UDCA. Jednakże metabolit ten nie był wykryty w grupie porównawczej i wynosił <3% całości kwasów żółciowych w jelicie czczym u zwierząt, którym podano C-7 siarczan pochodny UDCA (tabela 1).

Badając skład pochodnych UDCA w jelicie czczym, po rozdzieleniu kwasów żółciowych drogą lipofilowej chromatografii aniono-wymiennej (fig. 1), u zwierząt którym podano UDCA znaleziono głównie gliko- i tauro-UDCA, mniejsze ilości niezwiązanego UDCA i pomijalne ilości pochodnych kwasu siarkowego UDCA. Aczkolwiek amidowane i niezwiązane postacie UDCA zostały znalezione w jelicie czczym po podaniu C-7 siarczanów, całkowita masa UDCA w jelicie czczym była bardzo mała. U szczurów, którym podano 3-siarczan UDCA, jelito czcze zawierało znaczące proporcje amidowanego UDCA, wskazując na istotne biotransformacje odbezpieczania i/lub amidowania.

Odnośnie endogennych kwasów żółciowych, kwas cholowy był głównym kwasem żółciowym w jelicie czczym u zwierząt porównawczych, stanowiąc 48,5% ± 2,9% (6,82 ±1010 mg) całości kwasów żółciowych, a po podaniu UDCA zmniejszając się znacząco (^=0,01) do 16,8% ± 1,3% (4,68 ± 0,65 mg). 3-Siarczan UDCA wywoływał również zmniejszenie (P=0,05) proporcji kwasu cholowego, ale w mniejszym stopniu niz UDCA, podczas gdy podanie C-7 siarczanu UDCA wywołało wzrost (^=0,01) proporcji kwasu cholowego w jelicie czczym (tabela 1).

W okręznicy zwierząt porównawczych większość kwasów żółciowych była drugorzędna, identyfikując głównie kwas deoksycholowy i ω-muricholowy, lecz tylko niewielkie ilości kwasu litocholowego zostały wykryte (tabela 2). Podanie UDCA spowodowało zmniejszenie (P=0,003) proporcji kwasu deoksycholowego, i kwas litocholowy stał się głównym obecnym kwasem żółciowym, stanowiąc 32,0% ± 0,8% całości kwasów żółciowych okręznicy (/^=0,0004). W przeciwieństwie, podawanie 7-siarczanu UDCA oraz 3,7-disiarczanu UDCA prowadziło do istotnego zmniejszenia się masy i proporcji zarówno kwasu deoksycholowego jak i litocholowego w okręznicy.

WYDALANIE KWASU ŻÓŁCIOWEGO Z KAŁEM

Nie znaleziono istotnych różnic w ciężarze kałów wydalanych każdego dnia pomiędzy grupami zwierząt. Całkowita ilość kwasu żółciowego wydalanego przez zwierzęta, którym podano UDCA, 3-siarczan UDCA, 7-siarczan UDCA i disiarczan UDCA wynosiła odpowiednio 14,85, 10,70, 12,65 i 10,88 mg/g kału. Kały wszystkich zwierząt stały się wzbogacone w UDCA; jednakże w przypadku tych zwierząt, którym podano niezwiązany kwas żółciowy, UDCA został prawie wyłącznie znaleziony w postaci niezwiązanej. W przeciwieństwie,

186 393 znaleziono pomijalne stężenia niezwiązanego UDCA w kale szczurów, którym podano 7-siarczan UDCA i 3,7-disiarczan UDCA; te dwie pochodne były wydalane w kale rzeczywiście niezmienione (fig. 2). Stężenia głównych drugorzędnych kwasów żółciowych wydalanych w kale różniły się pomiędzy grupami zwierząt. W grupie UDCA kwas litocholowy wzrósł znacząco względem wartości porównawczych, podczas gdy wydalanie z kałem kwasu litocholowego, po podaniu 7-siarczanu UDCA i 3,7-disiarczanu zostało zmniejszone. Podobna tendencja została znaleziona w przypadku wydalania kwasu deoksycholowego. Porównując z normalnym kałem szczura, proporcja kwas litocholowy/kwas deoksycholowy wzrosła więcej niż 20 razy po podaniu UDCA, wzrosła 11 razy po podaniu 3-siarczanu UDCA i nie wzrosła po podaniu C-7 siarczanów (fig. 3).

Kompozycja kwasu żółciowego w tkance wątroby

Stężenie i proporcje indywidualnych kwasów żółciowych w tkance wątroby są zestawione w tabeli 3. Stężenie UDCA wynosiło 12,0 nmol/g u zwierząt porównawczych i stanowiło 2,8% całości wątrobowych kwasów żółciowych. Podanie UDCA i C-3 siarczanu wywołało wzrost stężeń i proporcji UDCA w tkance wątroby (fig. 1). Dodatkowo, A²² UDCA został znaleziony w wątrobie w stosunkowo wysokich proporcjach. W przeciwieństwie, znaczące obniżenie całkowitego stężenia UDCA i procentu kompozycji nastąpiło, gdy zwierzętom podano C-7 siarczan kwasów żółciowych. Podanie UDCA wywołało wzrost stężenia wątrobowego kwasu litocholowego, podczas gdy obniżenie stężenia kwasu litocholowego nastąpiło po podaniu pochodnych kwasu siarkowego. Stężenie kwasu deoksycholowego obniżało się we wszystkich grupach po podaniu kwasu żółciowego, a zmniejszenie było największe dla C-7 siarczanów. Stężenie kwasu cholowego w tkance wątroby zmniejszyło się prawie 4 razy po podaniu UDCA, ale wzrosło nieznacznie po podaniu C-7 pochodnych kwasu siarkowego.

Po podaniu indywidualnych kwasów żółciowych, ustalono przekształcanie UDCA w tkance wątroby, że niezwiązane UDCA i jego C-3 siarczan są oba biotransformowane przez sprzęganie, głównie przez taurynę. Niezależnie od podanego kwasu żółciowego, pomijalne stężenia i proporcje niezwiązanego UDCA i pochodnej kwasu siarkowego UDCA znaleziono w tkance wątroby u wszystkich zwierząt (fig. 4).

Kompozycja kwasu żółciowego w plazmie i w moczu

Stężenie niezwiązanego UDCA w plazmie u zwierząt, którym podano UDCA wynosiło 4,8 ± 2,2 jimol/1, i wartość ta była znacząco wyższa niz ta znaleziona u zwierząt, którym podano 3-siarczan UDCA (0,9 ± 0,4 (jimol/1), 7-siarczan UDCA (0,7 ± 0,5 pmol/1) i disiarczan UDCA (1,0 ± 0,2 pmol/1). Stężenia pochodnych kwasu siarkowego UDCA były podobne i wynosiły <0,3 ± pmol/1 we wszystkich grupach zwierząt.

Wydalanie UDCA z moczem było pomijalne (<0,4 nmol/dzień) zanim podano wszystkim zwierzętom kwas żółciowy. Po UDCA wydalanie z moczem niezwiązanego UDCA wynosiło 642,7 nmol/dzień. Było znacząco większe aniżeli stężenie UDCA wydalanego z moczem zwierząt po podaniu pochodnych kwasu siarkowego (3-siarczan UDCA, 5,2 nmol/dzień; 7-siarczan UDCA, 1,8 nmol/dzień; i 3,7-disiarczan UDCA, 1,3 nmol/dzień). Pochodne kwasu siarkowego UDCA zostały również znalezione w moczu po podaniu niezwiązanego UDCA (4,6 nmol/dzień), 3-siarczanu UDCA (2,7 nmol/dzień), 7-siarczanu UDCA (317,8 nmol/dzień) i 3,7-disiarczanu UDCA (217,1 nmol/dzień). Aczkolwiek stanowi to <0,05% podanej dziennej dawki, możliwe było wykrycie tych pochodnych kwasu żółciowego za pomocą analizy spektrometrią masową z wtómąjonizacją w cieczy.

OMÓWIENIE

Stężenia UDCA w tkance wątroby wzrosły znacząco po doustnym podaniu UDCA, przy czym ten kwas żółciowy był głównie wiązany poprzez amidowanie. Znaleziono pomijalne ilości niezwiązanego UDCA (fig. 4) i w tym względzie jego metabolizm jest podobny do tego u ludzi. W przeciwieństwie, gdy podano pochodne, C-7 siarczan i disiarczan, wątrobowe stężenia UDCA były niskie w porównaniu ze zwierzętami porównawczymi, wskazując, ze te pochodne nie były absorbowane z jelit i zatem zatrzymywanie UDCA było pomijalne. Wątrobowe stężenia UDCA wzrastały po podaniu C-3 siarczanu, a fakt, ze ulegał on głównie amidowaniu wskazywał, że zachodziło w znaczącym stopniu odsiarczanowanie i amidowanie

3-siarczanu UDCA. Schemat wiązania UDCA w jelicie czczym był analogiczny do tego

186 393 w tkance wątrobowej, z tym wyjątkiem, że w grupach, którym podano UDCA i 3-siarczan UDCA występowała wyższa proporcja niezwiązanego UDCA (fig. 1). Uprzednie badania po podaniu kwasu żółciowego wykazały, że maksymalne wzbogacenie puli kwasu żółciowego osiągnięto po 4 dniach i przedłużanie podawania nie powodowało dalszych zmian kompozycji kwasu żółciowego.

Brak absorpcji jelitowej C-7 siarczanów UDCA jest dalej odwzorowany w kompozycji kwasu żółciowego w kale. Stężenie całkowite UDCA w kale u zwierząt, którym podano 7-siarczan UDCA i 3,7-siarczan UDCA było znacznie większe niz te znalezione w kale zwierząt, którym podano UDCA lub 3-siarczan UDCA. W dodatku, C-7 siarczany UDCA były głównie wydalane niezmienione w kale. Odkrycia te mogą być objaśnione poprzez substratową specyficzność bakterii siarczanowych, które jak uprzednio wykazano są czynne jedynie wobec C-3 siarczanów kwasów żółciowych. Podanie UDCA miało znaczący wpływ na wydalanie z kałem podstawowych drugorzędnych kwasów żółciowych, kwasu litocholowego i deoksycholowego. Znaczny wzrost stężenia kwasu litocholowego nastąpił po podaniu niezwiązanego UDCA i 3-siarczanu UDCA, natomiast podanie 7-siarczanu UDCA i 3,7-disiarczanu UDCA nie miało istotnego znaczenia na wydalanie z kałem tych drugorzędnych kwasów żółciowych.

Wzrost stężeń w kale i wątrobie kwasu litocholowego może być wyjaśniony biotransformacją, z udziałem bakterii jelitowych, UDCA oraz w mniejszym stopniu jego C-3 siarczanu. Biotransformacja UDCA do kwasu litocholowego zachodzi w podobnym stopniu zarówno u szczurów jak i u ludzi. Wzrost ilości kwasu deoksycholowego w kale zwierząt, którym podano UDCA jest zgodny ze znanym inhibitowaniem wychwytywania kwasu cholowego w końcowym jelicie krętym, które prowadzi do wzrastającego przelewania się do okrężnicy i kolejnego 7a-dehydroksylowania z utworzeniem kwasu deoksycholowego. Ciekawe, że C-7 siarczany UDCA wydają się mieć przeciwstawne działanie; stężenia kwasu cholowego w tkance wątrobowej były nieznacznie podwyższone względem zwierząt porównawczych, a stężenia kwasu cholowego i kwasu deoksycholowego w kale były zmniejszone.

W świetle faktu, że UDCA ulega znacząco biotransformacjom do kwasu litocholowego i podwyzsza stężenie w kale kwasu deoksycholowego, które to oba kwasy są hydrofobowymi kwasami żółciowymi, jest zapewne zaskakujące, że korzystne efekty UDCA zostały wykazane na modelach zwierzęcych z chemicznie wywołanym rakiem okrężnicy. Na tych modelach wykazano w konkluzji, że hydrofobowe kwasy żółciowe sprzyjają wzrostowi nowotworu. Doodbytnicze i doustne podanie kwasów żółciowych, odprowadzanie żółci do jelita ślepego, podawanie cholestyraminy, tłuszcz dietetyczny i pewne włókna, warunki, które wszystkie zwiększają przepływ kwasów żółciowych przez okrężnicę, zwiększają powstawanie nowotworu, zgodnie z efektem aktywującym. Badania in vitro wskazują, ze kwasy deoksycholowy i litocholowy współdziałają i zwiększają stopień proliferacji komórek śródbłonka okrężnicy. Inne efekty, jak wpływ na czynność dekarboksylazy ornityny i na antygeny HLA klasy I i II również były wykazane.

Istnieje kilka możliwych wyjaśnień chemoprewencyjnego efektu UDCA. Jakikolwiek szkodliwy wpływ zwiększonego powstawania kwasu litocholowego w okrężnicy może być buforowany obecnością stosunkowo dużych stężeń UDCA w sposób podobny do cytozabezpieczających efektów UDCA, gdy są współinkubowane in vitro lub poddane wspólnej infuzji z hydrofobowymi kwasami żółciowymi, które uszkadzają membranę. Alternatywnie, efekty zabezpieczające mogą być wynikiem obniżonego stężenia kwasu deoksycholowego w okręznicy, co mogłoby implikować, ze kwas deoksycholowy jest głównym czynnikiem aktywującym raka okrężnicy. Niezaleznie od podobnego obniżenia kwasu deoksycholowego w okrężnicy po podaniu pochodnych kwasu siarkowego kwasów żółciowych, C-7 siarczany UDCa mogą w zasadzie być lepsze niż UDCA, ponieważ te pochodne nie są biotransformowane do bardziej hydrofobowych kwasów żółciowych. Dodatkowo, brak absorpcji C-7 siarczanów w jelicie cienkim może pozwolić na zastosowanie mniejszych dawek celem osiągnięcia podobnych chemoprewencyjnych efektów.

Rola kwasów żółciowych w karcynogenezie ludzkiej okrężnicy jest mniej jasna. Wcześniejsze badania wskazują, że wydalanie kwasu żółciowego w kale, szczególnie kwasów lito186 393 cholowego i deoksycholowego zwiększało się u pacjentów z rakiem okręznicy, polipem gruczołakowatym i polipowatością rodzinną jelit, jednakże te odkrycia nie były poparte przez kilku innych badaczy. W porównaniu z innymi, pacjenci z rakiem okrężnicy lub polipami gruczołakowatymi, jak donoszono, mieli podwyższone stężenia kwasów litocholowego i deoksycholowego w fazie wodnej kału, i te stężenia były skorelowane ze stopniem proliferacji komórek okrężnicy. Pomimo, że wcześniejsze dane potwierdzają chemozabezpieczający i/lub cytozabezpieczający efekt UDCA w zwierzęcych modelach raka okrężnicy i zespołach komórek in vitro, zwiększone powstawanie kwasu litocholowego, po podaniu UDCA, może ograniczać sumaryczną skuteczność UDCA w okrężnicy. Proporcja litocholan/deoksycholan w kale jest znacząco zwiększona po podaniu UDCA i --siarczanu UDCA w porównaniu z próbami porównawczymi (fig. -). To może być mniej pożądane, ponieważ proporcja w kale litocholan/deoksycholan jest zwiększona u pacjentów z rakiem okrężnicy, a u pacjentów o wysokim stopniu ryzyka chorobowego jest proponowana jako czynnik diagnostyczny. Z drugiej strony, podanie 7-siarczanu UDCA i -,7-disiarczanu UDCA nie wywołuje zmiany proporcji litocholan/deoksycholan. Aczkolwiek nie jest to statystycznie znaczące, zaobserwowano tendencję w kierunku obniżenia tej proporcji, podczas gdy ilości wydalanych w kale tych drugorzędnych kwasów żółciowych były podobne jak u zwierząt porównawczych.

Ponadto, jak omawiano powyżej, wprowadzenie grupy siarczanowej w pozycję C-7 UDCA znakomicie podnosi hydrofilowość cząsteczki, co zabezpiecza przez absorpcją jelitową, i zatem przyspiesza specyficzne dostarczanie UDCA do okrężnicy. W przeciwieństwie do niezwiązanego UDCA, który ulega przekształceniu do kwasu litocholowego i zatem podwyższa proporcję kwasu litocholowego/deoksychołowego w kale, co jest uważane za czynnik ryzyka choroby okrężnicy, C-7 siarczany są metabolicznie inertne. Dlatego też te pochodne kwasów żółciowych mogą być bardziej skutecznymi czynnikami chemozabezpieczającymi niz UDCA w okrężnicy.

METABOLIZM I WPŁYW ESTRÓW KWASU SIARKOWEGO KWASU URSODEOKSYCHOLOWEGO NA PRZEPŁYW ŻÓŁCI I WYDZIELANIE ŻÓŁCIOWYCH LIPIDÓW U SZCZURÓW

Estry, C-- i C-7 siarczany oraz disiarczan, pochodne UDCA, otrzymano jak szczegółowo omówiono, etap po etapie, bezpośrednio poniżej. Kolejno badano metabolizm wątrobowy tych kwasów żółciowych w przetoce żółciowej, i te kwasy żółciowe porównano z UDCA celem określenia ich wpływu na przepływ żółci i wydzielanie żółciowych lipidów.

MATERIAŁY 1 SPOSOBY

Synteza --siarczanu kwasu ursodeoksycholowego (UDCA--S)

Imidazol (-,5 g) i chlorek tert-butylodimetylosililowy (1,6 g) dodano do ochłodzonego w lodzie roztworu UDCA (2 g) w bezwodnym dimetyloformamidzie (1,5 ml) - pirydynie (0,75 ml) i mieszaninę mieszano przez 30 min. Mieszaniną reakcyjną następnie wylano na wodę z lodem (20 ml) i ekstrahowano octanem etylu (100 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą, wysuszono bezwodnym Na2SO.} i odparowano. Otrzymaną oleistą pozostałość rozpuszczono w heksanie-octanie etylu (-:1 objętościowo, 250 ml) i przesączono przez kolumnę z 40 g żelu krzemionkowego (28-200 mesh, Aldrich Chemical Co. Inc., Wisconsin). Po odparowaniu roztworu pozostałość rozpuszczono w etanolu i produkt, eter UDCA---tbDMS (2,15 g, wydajność 8-%) przekrystalizowano. Działając na eter UDCA--tBDMS (2,0 g) bezwodnikiem octowym (20 ml) i pirydyną (20 ml) w temperaturze pokojowej przez 5 otrzymano 7-octan eteru UDCA --tbDMS jako oleisty produkt. Do roztworu 7-octanu eteru UDCA --tbDMS w acetonie (24 ml) dodano 18% HCl (2,4 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez -0 min. Uzyskany produkt ekstrahowano octanem etylu, przemyło wodą, wysuszono bezwodnym Na_?SO.i i rozpuszczalnik odparowano otrzymując 7-octan kwasu ursodeoksycholowego jako oleisty produkt. Dodano kwas chlorosulfonowy (1,2 ml) w bezwodnej pirydynie (12 ml) do ochłodzonego w lodzie roztworu 7-octanu UDCA (1.2 g) i roztwór ogrzewano do 50°C. Po -0 minutach reakcję zakończono dodając do mieszaniny wodę (400 ml) i produkt zaabsorbowano na dużym kartrydzu zelu krzemionkowego ze związanym oktadecylosilanem, MEGA-BOND-ELUT (Varian, Harbor City, CA) i odzyskano eluując metanolem. Ekstrakt metanolowy następnie odparowano do sucha a sól pirydyniową 7-octanu --siarczanu

186 393

UDCA przekształcono w sól dwusodową poprzez rozpuszczenie w 0,2 M metanolowym roztworze NaOH (40 ml) i przesączono. Przesącz rozcieńczono zimnym eterem (400 ml), osad zebrano, przemyto zimnym eterem i wysuszono. Ciało stałe (1,0 g) rozpuszczono w MeOH (10 ml), dodano 3,5 M NaOH (10 ml) i roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godz. Produkt wyekstrahowano za pomocą MEGA-BOND-ELUT po rozcieńczeniu wodą (500 ml). Ekstrakt metanolowy z kartrydzu odparowano do sucha, rozpuszczono w 0,2 M metanolowym NaOH (30 ml) i przesączono. Przesącz rozcieńczono zimnym eterem (300 ml) a uzyskany osad zebrano i przemyto eterem. Procedurą powtórzono trzykrotnie z metanolem (20 ml) i eterem (200 ml) otrzymując sól dwusodową 3-siarczanu UDCA (0,62 g, wydajność 50%).

Synteza 7-siarczanu kwasu ursodeoksycholowego (UDCA-7S)

Kwas chlorosulfonowy (0,9 ml) w bezwodnej pirydynie (9 ml) dodano do ochłodzonego w lodzie roztworu eteru 3-tbDMS UDCA (900 mg) i mieszaninę ogrzewano do 50°C. Po 30 minutach reakcję zakończono dodając wodę (400 ml). Wytrącona sól pirydyniowa 7-siarczanu 3-tbDMS UDCA została przemyła wodą, wysuszona w próżni i hydrolizowana z użyciem HC1 jak opisano powyżej. Produkt ekstrahowano z użyciem kartrydża MEGA-BLUT-ELUT, a ekstrakt metanolowy odparowano do sucha i rozpuszczono w 0,2 M metanolowym NaOH (30 ml). Roztwór metanolowy rozcieńczono zimnym eterem (300 ml) i wytrąconą sól dwusodową wydzielono następnie tak jak opisano powyżej, otrzymując czystą dwusodową sól 7-siarczanu UDCA (640 mg, wydajność 76%).

Synteza 3,7-disiarczanu kwasu ursodeoksycholowego (UDCA-DS)

Kwas chlorosulfonowy (1 ml) w pirydynie dodano do ochłodzonego w lodzie roztworu UDCA (1 g) w bezwodnej pirydynie (10 ml) i mieszaninę ogrzewano do 50°C. Po 60 minutach reakcję zakończono dodając wodę (500 ml). Produkt wyekstrahowano z użyciem kartrydża MEGA-BOND-ELUT i wydzielono jak opisano powyżej uzyskując sól dwusodową disiarczanu UDCA (1,1 g, wydajność 91%).

Chromatografia gazowa - spektrometria masowa (GC-MS) została wykorzystana celem potwierdzenia położenia grup siarczanowych we wszystkich syntetyzowanych związkach po utlenieniu, solwolizie i konwersji do pochodnych metylowych i eterów trimetylosililowych (Me-TMS). Stwierdzono, że czystość chromatograficzna związków syntezowanych wynosi >97%, określona za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC), chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i chromatografii gazowej (GC) na kolumnie kapilarnej.

Badania na zwierzętach

Dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (ciężar ciała 200-230 g) anestezjowano poprzez wewnątrzotrzewną injekcję pentobarbitalu (nembutal, 7,5 mg/l 00 g ciężaru ciała) i utrzymywano w uśpieniu za pomocą dodatkowych dawek. Prawą żyłę szyjną i typową drogę żółciową kanulowano z użyciem węża polietylenowego PE-50 (Clay-Adams, Parsippany, N.J.). Temperaturę ciała w czasie eksperymentu utizymywano przy 37°C stosując doodbytniczą sondę i termostatowaną płytę grzeeną (Haryard Apparatus Co., Inc., Millis, Mas.). Roztwór soli fizjologicznej podawano jako wlew w tempie 1,0 ml/godz. stosując pompę Haryard (Haryard Apparatus Co., Inc.) do żyły szyjnej przez okres porównawczy 2 godz. Po zabraniu dwóch 10 minutowych próbek żółci do analiz jako odnośnik, indywidualnie infuzjowano dożylnie (i.y.) kwasy żółciowe przez 30 minut w stopniowo zwiększanych dawkach (0,5, 1,0 i 2,0 (}moi/mm/1()0 g ciężaru ciała). Roztwory kwasów żółciowych przygotowano w 3% ludzkiej albuminie w 0,45% soli fizjologicznej. W każdym eksperymencie używano sześciu zwierząt i kwasy żółciowe zbierano co 10 minut do starowanych probówek. Na zakończenie eksperymentu pobrano krew poprzez punkcję serca, a mocz otrzymano przez wyssanie pęcherza. Wszystkie próbki biologiczne przechowywano w -20°C. Taki protokół badań na zwierzętach (#IB 1O044) został zaaprobowany przez Bioethics Committee of the Children's Hospital Medical Center (Cincinnati, Ohio).

Techniki analityczne

TLC przeprowadzano na płytkach z uprzednio impregnowanym żelem krzemionkowym G (Merck, 0,2 mm grubości) stosując układ rozpuszczalników n-butanol-kwas octowy-woda

186 393 (10:1:1, objętościowo). Plamki wywoływano poprzez spryskiwanie 10% etanolowym roztworem kwasu fosforomolibdenowego i następne wygrzewanie w 120°C przez 5 minut.

HPLC przeprowadzano z użyciem aparatu Varian 5000 HPLC (Varian Associates Inc., Palo Alto, CA), wyposażonym w detektor UV o zmiennej długości fali i posiadającym kolumnę 25 x 0,46 cm Hypersil ODS (wielkość ziarna 5 pm; Keystone Scientific, Bellefonte, PA). Kolumna pracowała w temperaturze otoczenia a rozpuszczalnikiem eluującym był metanol - 0,01 M bufor fosforanowy (65:35, objętościowo), skorygowany do pH 6,8 i zmodyfikowany według sposobu Rossi et al. (High pressure liquid chromatographic analysis of conjugated bile acids in human bile: simultaneous resolution of sulfated and unsulfated lithocholyl amidates and the common conjugated bile ducts, J. Lipid Res. 28: 589-595 (1987)). Szybkość przepływu wynosiła 1,0 ml/min, i kwasy żółciowe wykrywano rejestrując absorpcję przy 205 nm.

GC przeprowadzano na chromatografie gazowym Hewlett-Packard 5890 posiadającym 30 metrową kolumnę kapilarną z wtopionym żelem krzemionkowym DB-1 (4 mm wewn. średn.; 0,25 pm film) (J and W Scientific Inc., Rancho Cordova, CA) i stosując program temperaturowy od 225°C do 295°C z inkrementem 2°C/min, z początkowym i końcowym okresem izotermicznym, odpowiednio 2 minuty i 30 minut. Jako gaz nośny stosowano hel o przepływie 1,8 ml/min.

GC-MS przeprowadzano zarówno na aparacie magnetyczno-sektorowym VG Autospec Q jak i aparacie kwadrupolowym Finnigan 4635 GC-MS-DS, posiadających identyczne kolumny GC i pracujących w tych samych warunkach chromatograficznych. Widma masowe jonizacji elektronowej (70 eV) rejestrowano w zakresie mas 50 do 1000 Da/e poprzez powtarzane skanowanie eluowanych składników.

Spektrometria masowa bombardowania przyspieszonymi atomami (FAB-MS), widma jonów ujemnych próbek żółci, moczu i związków zsyntezowanych otrzymano w wyniku umieszczenia równoważnika, w przybliżeniu 1 pg pierwotnego ekstraktu żółci, 1 pl - 50 pl ekstraktu moczu i pg ilości syntetycznych kwasów żółciowych rozpuszczonych w metanolu, na małej kropli matrycy glicerolowej nakroplonej na miedzianą tarczę sondy FAB. Sonda została wprowadzono bezpośrednio do źródła jonów spektrometru masowego i wiązka przyspieszonych atomów zarówno ksenonu, generowanych przy pomocy działa atomowego (lon Tech, Teddington, Middlesex, UK) pracującego przy 8 kV i 20 pA, jak i cezu, generowanych z jodku cezu (35 kV), została wystrzelona w cel zawierający próbką. Widma jonów ujemnych otrzymano w zakresie mas 50-1000 Da/e.

Analiza żółci

Objętość żółci zmierzono grawimetrycznie, zakładając gęstość 1 g/ml. Całkowite stężenie kwasów 3a-hydroksy-żółciowych w żółci oznaczono enzymatycznie przed solwolizą (niesiarczanowe kwasy żółciowe) i po hydrolizie (całość kwasów żółciowych) (Mashige, F., et al., Direct spectrometry of total bile acids in serum. Clin. Chem. 27: 1352-1356 (1981)). Wydzielanie kwasu żółciowego obliczono mnożąc szybkość przepływu żółci przez stężenie kwasu żółciowego. Żółciowe fosfolipidy zostały oznaczone za pomocą procedury enzymatycznej opartej na metodzie oksydazy choliny (Nippon Shoji Kaisha, Ltd., Osaka, Japan) (Grantz, D., et al., Enzymatic measurement of choline-containing phospholipids in bile. J Lipid Res. 22:273-276 (1981)). Cholesterol również oznaczono enzymatycznie (Boehringer Mannehim, Indianapolis, IN) (Fromm, H., et al., Use of simple enzymatic assay for cholesterol analysis in human bile. J. Lipid Res. 21: 259-261 (1980)).

Analiza kwasu żółciowego w żółci i moczu

Celem określenia biotransformacji wątrobowej infuzjowanego kwasu żółciowego, zebrano żółć od sześciu zwierząt i kwasy żółciowe w żółci oznaczono drogą GC-MS po ekstrakcji, solwolizie, hydrolizie i przekształceniu w pochodne. Oznaczenie ilościowe kwasów żółciowych zostało dokonane z użyciem GC, poprzez porównanie wysokości piku danego kwasu żółciowego z wysokością piku pochodzącego od wzorca wewnętrznego, kwasu nordeoksycholowego dodanego do pierwotnej próbki żółci. Identyfikację kwasu żółciowego wykonano w oparciu o wkaznik retencji względem serii homologicznych n-alkanów, cytowany jako wartość jednostki metylenowej (MU), oraz schemat fragmentacji w widmie masowym po porównaniu z autentycznymi wzorcami. Zestawienie ponad 100 widm masowych autentycznych

186 393 wzorców kwasów żółciowych oraz wskaźniki retencji, jako punkt odniesienia, zostały ostatnio zawarte w (Lawson, A.M., et al., Mass spectrometry of bile acids, The Bile Acids, Vol. 4, Methods and Applications, str. 167-267 (1988)). Mocz zebrano od sześciu zwierząt i kwasy żółciowe wyekstrahowano drogą ekstrakcji ciecz-ciało stałe z użyciem kartrydża Bond ElutCispo solwolizie, hydrolizie i przekształceniu w pochodne.

Rozdzielanie grup kwasów żółciowych z wykorzystaniem lipofilowei chromatografii aniono-wymiennej

W przypadku zwierząt infuzjowanych z użyciem UDCA-3S, żółć zbierano w trakcie końcowego okresu infuzji kwasu żółciowego (1,0 pmol/min/100 g ciężaru ciała). Kwasy żółciowe poddano solwolizie i rozdzielono na grupy zależnie od ich zdolności do wiązania się, stosując lipofilowy żel aniono-wymienny, dietyloaminohydroksylopropylo-Sephadex LH-20; Packard Instruments, Groningen, Holandia). Kompozycja kwasów żółciowych została oznaczona w każdej frakcji za pomocąGC-MS po hydrolizie i otrzymaniu eterów Me-TMS.

Metody statystyczne

Wyniki wyrażono jako średnia ± standardowy błąd średniej (SEM). Przepływ żółci i wydzielanie żółciowych lipidów wyrażono, odpowiednio, jako pl/min/g wątroby i nmol/min/g wątroby. Analizę statystyczną przeprowadzono stosując program INSTAT (Graphpad Software Inc., San Diego, CA). Dane parametryczne między grupami analizowano z użyciem testu t-Studenta. Porównania statystyczne pomiędzy różnymi grupami zostały dokononane poprzez jednokierunkową analizę wariancji (ANoVA). Jeśli wartości okazywały się znaczące w odniesieniu do infuzji różnych soli żółciowych, porównanie pomiędzy dwoma grupami było dokonywane poprzez test-t Bonferroniego. Przeprowadzono analizę liniowej regresji. Czynność choleretyczna każdego kwasu żółciowego została oznaczona z nachylenia linii regresji korelacji pomiędzy stopniem wydzielania kwasu żółciowego i przepływem żółci, i została wyrażona jako pl/pmol. Porówniania między nachyleniami dokonano stosując jednokierunkowo ANOVA.

WYNIKI

Przepływ żółci i wydzielanie kwasów żółciowych

Skutki i.v. infuzji UDCA, UDCA-3S, UDCA-7S i UDCA-DS na przepływ żółci i wydzielanie kwasów żółciowych są przedstawione na fig. 5A i 5B i zestawione w tabeli 4. Wszystkie kwasy żółciowe były znacząco choleretyczne, a szereg maksymalnego przepływu żółci był następujący UDCA-3S < UDCA < UDCA-7S = UDCA-DS. Stopień wydzielanie kwasów żółciowych w żółci wzrastał u wszystkich zwierząt w trakcie infuzji UDCA-3S, UDCA, UDCA-Ds i UDCA-7S do maksimum, odpowiednio, 138,9 ±11,8, 145,1 ± 17,3, 222,4 ± 24,3 i 255,4 ± 18,2 nmol/min/g wątroby. Dla porównania podstawowe wydzielanie kwasów żółciowych wynosi przeciętnie 40,4 ± 4,2 nmol/min./g wątroby. Zależność pomiędzy wydzielaniem kwasów żółciowych i wypływem żółci w następstwie infuzji każdego kwasu żółciowego jest przedstawiona na fig. 6. Niewątpliwe czynności choleretyczne UDCA, UDCA-7S, UDCA-3S i UDCA-DS obliczone z nachyleń linii regresji wynosiły, odpowiednio, 16 ±2, 15± 1, 13 ± 1 i 16± 1 pl/pmol. Punkty przecięcia linii wskazują, że niezależny od kwasu żółciowego wypływ żółci był tej samej wielkości (1,7 pl/min/g wątroby) dla wszystkich grup zwierząt.

Wydzielanie lipidów z żółcią

Efekt infuzji UDCA i jego siarczanowych pochodnych na wypływ cholesterolu oraz fosfolipidów z żółciąjest przedstawiony na fig. 7A i 7B. Przez pierwsze 40 minut infuzji UDCA i UDCA-7S wzrasta cholesterol żółciowy osiągając maksimum szybkości wydzielania, odpowiednio, 1,88 ± 0,19 i 1,76 ± 0,21 nmol/min./g wątroby, i wydzielanie cholesterolu było utrzymywane z UDCA-7S, ale wykazywało znaczący spadek, gdy UDCA podawano wlewowo nawet stopniowo zwiększając dawkę. W okresie przed infuzją odpowiednie szybkości wydzielania cholesterolu przeciętnie wynosiły, odpowiednio, 1,46 ± 0,1 i 1,42 ± 0,16 nmol/min/g wątroby. W przeciwieństwie, infuzje UDCA-3S i UDCA-DS znacząco obniżały wydzialanie cholesterolu żółciowego, odpowiednio, do 0,40 ± 0,05 i 0,37 ±0,12 nmol/min/g wątroby, w porównaniu z wartościami odniesienia. Wydzielanie fosfolipidów żółciowych

186 393 wzrastało znacząco po infuzji UDCA i UDCA-7S, ale dla kontrastu UDCA--S i UDCA-DS wywoływały znaczące obniżenie fosfolipidów żółciowych (tabela 4).

Analiza kwasów żółciowych żółci i moczu za pomocą FAB-Ms jonów ujemnych

Widma FAB-MS jonów ujemnych zebranej żółci szczura przed (moment odniesienia) i w trakcie infuzji niezwiązanego UDCA są przedstawione na fig. 8A i 8B. Jony m/z 514 i m/z 498 w odnośnych próbkach żółci oznaczają odpowiednio związane tauryną trihydroksyi dihydroksycholany i stanowią pierwszorzędowe kwasy żółciowe, które są głównymi składnikami żółci szczura. Podczas infuzji UDCA dominującymi jonami w widmie stają się m/z 498 i m/z 448, wskazując, że podawany drogą infuzji UDCA był prawie całkowicie wiązany przez taurynę i glicynę. Jon m/z 471 identyfikuje siarczan dihydroksycholanu (UDCA), podczas gdy m/z 567 i m/z 589 (addukt z sodem) oznaczają flukuronidowe pochodne UDCA.

Podczas infuzji UDCA-7S dominującymi jonami w widmie (fig. 8D) były m/z 471 i jego addukt z sodem m/z 49-, i jony te oznaczają niezmieniony UDCA-7S. Nie zaobserowano innych znaczących jonów, które wskazywałyby dalsze metaboliczne transformacje UDCA-7S.

Podczas infuzji UDCA--S jony m/z 471 i m/z 49- (addukt z sodem) potwierdziły wydzielanie z żółcią niezmienionego kwasu żółciowego, a jony m/z 550 i m/z 600 odzwierciedlały amidowanie glicyną i tauryną (fig. 8C).

Podczas infuzji UDCA-DS dominującymi jonami były m/z 471 i m/z 49- (addukt z sodem) oraz m/z 57-. Jon m/z 57- oznacza UDCA-DS, a m/z 471 i m/z 49- są jonami fragmentacyjnymi. Żadne inne jony nie były obecne, które mogłyby sugerować dalsze metaboliczne transformacje UDCA-DS (fig. 8E).

Analiza GC-MS kwasów żółciowych w żółci

Tabela 5 zestawia względne składy procentowe indywidualnych kwasów żółciowych w żółci w następstwie infuzji UDCA i rozmaitych pochodnych siarczanowych. W stanie odniesienia, kwas cholowy, kwasy a-muricholowy i β-muricholowy stanowiły główne kwasy żółciowe szczura. Podczas infuzji wszystkich związków UDCA stał się dominującym kwasem żółciowym w żółci i skład procentowy kompozycji był podobny we wszystkich grupach wskazując, że wszystkie pochodne siarczanowe kwasów żółciowych były pobierane przez wątrobę i efektywnie wydzielane z żółcią.

Nie znaleziono dowodu potwierdzającego jakiekolwiek transformacje łącznie z amidowaniem estrów UDCA, C-7 siarczanu i disiarczanu, aczkolwiek niezwiązany UDCA i UDCA--S były metabolizowane przez dalsze hydroksylowanie, najprawdopodobniej w łańcuchu bocznym, jednakże dokładna struktura tego hydroksylowanego metabolitu wymaga precyzyjnego ustalenia.

Rozdzielenie pochodnych kwasów żółciowych wydzielanych w żółci podczas infuzji UDCA--S wskazuje, ze równe porcje (25%) podawanego infuzyjnie kwasu żółciowego zostały odzyskane w postaci związanej z tauryną i glicyną, podczas gdy UDCA był niemal wyłącznie wiązany z tauryną i glicyną. Ze względu na brak biotransformacji UDCA-7S i UDCA-DS, potwierdzonych przez FAB-MS, prace nad dalszym rozdzielaniem pochodnych wydawały się zbędne.

Analiza kwasu żółciowego w moczu

Analiza FAB-MS jonów ujemnych wszystkich próbek moczu wskazuje, że wszystkie estry kwasu siarkowego UDCA są wydzielane w moczu, co zostało potwierdzone przez analizą GC-MS. Jednakże ilościowa względna proporcja siarczanu UDCA wydzielonego w moczu była mała w porównaniu z wydzielaniem z żółcią, która to droga była główną drogą wydalania. W wyniku infuzji UDCA pomijalne porcje (0,01%) całej podanej dawki pojawiły się w moczu. W przypadku --siarczanu UDCA, 7-siarczanu UDCA i disiarczanu UDCA odpowiednie porcje podawanych dawek, pojawiające się w moczu wynosiły odpowiednio 2,8%, 0,9% i 2,2%.

OMÓWIENIE

Wyniki przedstawione powyżej świadczą o tym, ze podobnie jak UDCA wszystkie pochodne siarczanowe znacząco pobudzają wydzielanie żółci i zwiększają wydzielanie kwasu żółciowego. Szereg maksymalnego wypływu żółci dla indywidualnych kwasów żółciowych był następujący UDCA-DS - UDCA-7S > UDCA > UDCA--S, i nie był bezpośrednio powią16

186 393 zany z ich względnym charakterem hydrofobowym/hydrofilowym, określonym z wskaźników retencji HPLC.

Obecność fragmentu siarczanowego w pozycji C-7 cząsteczki kwasu żółciowego powoduje znacząco większy wypływ żółci niż ten indukowany przez UDCA, podczas gdy C-3 siarczan, aczkolwiek pobudzający wydzielanie żółci, był mniej skuteczny w stymulowaniu wypływu żółci niż niezwiązany UDCA. Różnice te mogą być wytłumaczone poprzez fakt, ze istotne amidowanie C-3 siarczanu zachodzi w trakcie pierwszego oczyszczania wątrobowego, podczas gdy fragment siarczanowy w pozycji C-7 uniemożliwia biotransformację. Możliwe jest, ze amidowane siarczany słabiej pobudzają wydzielanie żółci. Interesujące, że względne proporcje UDCA pojawiającego sią w żółci były podobne dla wszystkich badanych kwasów żółciowych, nawet jeśli istniały znaczące różnice w wypływie żółci dla tych związków.

W odniesieniu do wydzielania cholesterolu i fosfolipidów oczywista jest tendencja. Kwasy żółciowe, które są najbardziej polarne (co jest uzasadnione poprzez ich wskaźniki retencji HPLC), wywołują znaczące obniżenie wydzielania żółciowego cholesterolu i fosfolipidów. Zależność ta pomiędzy hydrofobowością/hydrofilowością kwasu żółciowego i wydzielaniem cholesterolu i fosfolipidów jest najprawdopodobniej związana z detergencją cząsteczki, tj. mniej detergentne i wysoce polarne siarczany kwasu żółciowego mniej uszkadzają membraną niż bardziej hydrofobowe kwasy żółciowe.

Połączone efekty obniżonego wydzielania cholesterolu i fosfolipidów oraz większej hipercholerezy wywoływanej przez wysoce hydrofitowe pochodne UDCA, 3-siarczan i 3,7-disiarczan, w porównaniu z niezwiązanym UDCA, mogłyby sugerować, że te szczególne siarczany kwasu żółciowego byłyby bardziej skutecznymi czynnikami w leczeniu schorzenia wątroby wywołanego zaleganiem żółci.

Zaobserwowano znaczące różnice w wątrobowej biotransformacji indywidualnych siarczanów UDCA. Na przykład wstawienie fragmentu siarczanowego w pozycję C-7 cząsteczki utrudnia biotransformację wątrobowe, tak ze 7-siarczan UDCA i disiarczan UDCA są obydwa wydzielane niezmienione w żółci. Ten przypadek nie ma miejsca dla C-3 siarczanu UDCA, który jest wydzielany niezmieniony z żółcią jedynie w ograniczonym stopniu, lecz również ulega dostrzegalnemu amidowaniu tauryną i glicyną oraz dalszej hydroksylacji, najprawdopodobniej w łańcuchu bocznym. Z drugiej strony niezwiązany UDCA był głównie wiązany tauryną a w mniejszym stopniu był przekształcany w pochodne glicynową siarczanową i flukuroni dową przed wydzieleniem z żółcią.

Pomijalne ilości siarczanów UDCA były wydzielane w moczu, nawet w następstwie infuzji, o stosunkowo wysokich stężeniach. Było to szczególnie zaskakujące, ponieważ uważa się, że większość moczowych kwasów żółciowych to pochodne siarczanowe. Brak siarczanów kwasu żółciowego w żółci pacjentów z chorobą wątroby wynikającą z zastoju żółci oraz wykrycie wysokich ilości i wysokich stężeń pochodnych siarczanowych moczowych kwasów żółciowych może zatem jedynie być wytłumaczony tworzeniem siarczanów kwasów żółciowych w nerkach, a nie wątrobowym tworzeniem siarczanów. Obserwacje te jasno wykazują że pochodne siarczanowe kwasów żółciowych są łatwo pobierane przez wątrobę i transportowane do żółci, a zatem wydają się nie potwierdzać ogólnego przekonania, ze tworzenie siarczanów w wątrobie jest ważną drogą metaboliczną podczas cholestazy. Pod tym względem nerki mogą stanowić ważny organ metabolizujący, zabezpieczający wątrobę przed toksycznymi kwasami żółciowymi w trakcie cholestazy.

Szczur jest gatunkiem, który istotnie 6p-hydroksyluje kwasy żółciowe, i u którego όβ-hydroksylacja CDCA i UDCA, jak wykazano, zachodzi. W tych badaniach, nie można było wykryć znaczących ilości hydroksylowanych produktów UDCA, takich jak izomery kwasu muricholowego. Donoszono, ze disiarczany kwasu taurochenodeoksycholowego i disiarczany kwasu glikochenodeoksycholowego były metabolizowane w 90% do 3 a, 7a-disiarczanu kwasu όβ-hydroksy 5β-cholanowego (3a, 7a-disiarczanu kwasu a-muricholowego) w szczurach z przetoką żółciową. W eksperymentach prowadzonych w odniesieniu do wynalazku zarówno UDCA-7S jak i disiarczan UDCA nie były hydroksylowane. Eksperymenty te wyraźnie sugerują że obecność grup siarczanowych zapobiega wątrobowej transfomacji

186 393 szkieletu cząsteczki. Jednakże, jest możliwe, że enzymy odpowiedzialne za hydroksylację preferencyjnie reagują z amidowanymi kwasami żółciowymi jako substratami.

Sądzi się, że wiązanie kwasów żółciowych z tauryną zalezy od powinowactwa substratu do enzymu (kwas żółciowy CoA:glicyno/taur^'no-\-acylo-transferaza) i dostarczania tauryny w wątrobie. Wyniki nasze z FAB-MS i GC-MS wykazują, że UDCA-3S było amidowane częściowo tauryną i glicyną, wskazując, że ester kwasu siarkowego posiada mniejsze powinowactwo do enzymu w porównaniu z kwasem żółciowym bez funkcji siarczanowej. Obserwacja, że UDCA-7S i UDCA-DS nie były amidowane tauryną lub glicyną wskazuje, że obecność fragmentu 7P-siarczanowego przesłania czynność enzymu.

186 393

Indywidualne szczegółowe aspekty niniejszego wynalazku zostały szczegółowo omówione powyżej, zakres wynalazku nie jest ograniczony do tych aspektów i wymaga określenia przez następujące zastrzeżenia.

........ .......... s T a bela 1 |

Skład wagowy i procentowy zasadniczych kwasów żółciowych w jelicie czczym u szczurów porównawczych i po doustnym podaniu UDCA, 3-siarczanu UDCA, 7-siarczanu UDCA lub 3,7-disiacczauu UDCA.. Oznaczoee przez GC-MS

3,7-siarczan UDCA |

£ 2 UJ O o „ a: 0. Si

O

5,2 ± 0,3

66,,0 ±1,3

2,0 ±0,4

21 ±0J

MASA (mg)

Q 2

•Η ιχ} in o o’ o*

0,12 ± 0,04

Q 2

6,78 ± 1,03

0,21 ± 0,07

0,221 ± 0,03

1,70 ± 0,14

0,34 ± 0,09

7-siarczan UDCA

PROCENTY (%)

0,1 ±01

3,3 ±0,1

69,0 ±0,6 1 1

4,7 ± 1,3

31 ±01

MASA (mg)

0,01 ± 0,01

0,76 ± 0,08

0,26 ± 0,06

0,04 ± 0,01

15,78 ±1,30

1,09 ± 0,34

0,70 ± 0,05

2,21 ± 0,17

1,4-9 ± 0,22

3-siarczan UDCA

PROCENTY (%)

0,3 ±0,1

in -H oo

37J± 0,9

16,4 ±0.5

9,2 ±1,0

MASA (mg)

0,07 ± 0,01

1,96 ± 0,68

0,43 ± 0,10

0,18 ± 0,02

8,49 ± 1,22

3,67 ± 0,45

Ή Tt 00 O O <Ń‘ O

3,02 ± 0,80

2,09 ± 0,16

UDCA

PROCENTY (%)

1,0 ±0,1

5,6 ± 0,3

16,8 ± 1,3

35,9 ± 0,4

14-,5 ±0,7

MASA (mg)

0,266 ± 0,01

1,56 ± 0,18

0,98 ± 0,06

0,75 ± 0,02

4,68 ± 0,65

9,555 ± 0,49

4,00 ± 0,05

4,12 ± 0,25

0,815 ± 0,01

Próba kontrolna

PROCENTY (%)

0,2 ± 0,1

4,8±1,1

481,5 ± 2,9

0,3 ± 0,2

O

MASA (mg)

0,02 ± 0,01

0,550 ± 0,03

0,25 ± 0,05

1,,88 ± 0,24

6,82 ± 1,10

0,03 ± 0,01

QN

0,64 ± 0,18

3,44 ± 0,57

KWAS LITOCHOLOWY

KWAS DEOKSYCHOLOWY

KWAS CHENODEOKSYCHOLOWY

KWAS aMURICHOLOWY

KWAS CHOLOWY

UDCA

< o Q Z) Si' <

KWAS βMURICHOLOWY

> OJ Π < X co S2 < CY

186 393 <

Ο α

ω □

c (0

Ό

Ο

Ω.

Ε >>

c ο ω σ 2 aó - ο •π ^Ν υ φ φ

C ο Ν υ ο c

CL Ν ο

< ο Ω Ω □

-* c Ε ro

Ε Ν δ' β ν ·2 ο .22 φ 7 ’ο Νφ co ? ą jó

Q .2 3 •V □ *ο c •Ν φ Ν υ $

-Ο m <η tg > ^-(Ρ J (4

-C <

£υ .2 0 a =3 w £ w 5 co N n o >.<3 3 w £ « c

O

L_

CL

O

O) (0

Ό

JS ω

0,24 ± 0,02	0,12 ± 0,01	10,24 ± 1.37
0,31 ± 0,04	0,26 ± 0,01	22,91 ±2,11
0,37 ± 0,03	0,24 ± 0,01	22,57 ±3,53
0,31 ± 0,01	0,30 ± 0,01	27,77 ± 1,69
0,10 ± 0,01	0,56 ± 0,08	4,04 ± 2,40
KWAS «MURICHOLOWY	KWAS Δ22-ωMURICHOLOWY	CAŁOŚĆ

LU ω

-H <p c

Ό £

*ω o

CO

O c

o •N

CO

L O Έ * r r ćó φ £> c co . . Ό C

186 393

T a b e 1 a 2	Skład wagowy i procentowy zasadniczych kwasów żółciowych w okrężnicy u szczurów porównawczych i po doustnym podaniu UDCA, 3-siarczanu UDCA,, 7-siarczaua UDCA lub 3,7-disiarczauu UDCA,. Oznaczoee przez GC-MS	3,7-siarczan UDCA j	PROCENTY (%)	1,8 ±0,6	o co* -H CM rU CM			265,3 ± 9,8	14,7±11,0	O
MASA (mg)	0,02 ± 0,10	0,3) ± 0,04	0,07 ± 0,05	0,03 ± 0,01	0,23 ± 0,15	0.:20 ± 0,17	ND	0,06 ± 0,20
7-siarczan UDCA !	PROCENTY (%)	1,3 ±0,3	11,4 ±2,1			2,5 ±2,0	44,0 ± 9,5	o
MASA (mg)	0,04 ± 0,02	0,36 ±0,16	0,06 ± 0,03	0,03 ± 0,02	0,09 ± 0,09	1,28 ±0,38	O 2	0,06 ±0,04
3-sizrczan UDCA	PROCENTY (%)	CN h* +1 Ν’ od	17,4 ±3,3			13,8 ±5,3	1,5 ±0,2	0,2 ±0,1
MASA (mg)	0,61 ± 0,19	0,58± 0,07	0,06 ± 0,01	0,02 ± 0,01	0,44 ± 0,12	0,05 ± 0,02	0,0) ± 0,01	0,20 ± 0,03
1 UDCA	PROCENTY (%)	32,0 ± 0,8	10,4 ± 0,9			8,9 ±2,8	8.3 ± 3,4	! 0,4 ±0,1
< 11	0,97 ± 0,43	0,31 ± 0,13	0,05 ± 0,03	0,0) ± 0,01	0,24 ± 0,07	0,:3) ± 0,26	0,02 ± 0,01	0,13± 0,06
' Próaa kontrolna	PROCENTY (%)	3,4 ± 0,2	32,3 ± 0,8			15,5 ± 1,7	0,6 ± 0,2	O
< il	0,08 ± 0,02	0,94 ± 0,34	0,03 ± 0,01	0,15 ± 0,05	0,47 ± 0,12	0,02 ± 0,01	Q Z	0,:1) ± 0,06
		KWAS LITOCHOLOWY	| KWAS DEOKSY) | CHOLOWY	KWAS CHENODEOKSYCHOLOWY	KWAS αMURICHOLOWY	KWAS CHOLOWY	UDCA	< O O ZD 1 CM CM O	KWAS βMURICHOLOWY

186 393

									1
<
u									I
Q									I
X									I
=3
C TO		+)		+1		-H		Ή
Ό		V-	T—	•M·	o	CD	O	CM	tr>
O		o	o	CM	t—	O	co	CM	CM
E >»		o	o	O	O	o	o	V“	o
c
w	ω
□ o	2
T>	Ó
o £X	O
	N
_C O	0)
ϋ
>> N O 5	Ci	T—		O		CM		LD
Φ c	0,0		0,3		0,0		00 o“
TO	8	-H		Ή		-H		•H
$	nac	co		00		id		00
•p	o		00		*“		o
o	N o	o		o		o		CM
Ci
5	<f
o	o
D	Q
N O	X
N	-J
(Λ	c
3	TO
>»	N
U	u.
C	TO	-H		Ή		Ή		+1
•N αχ	dis	o	δ	,67	,34	5	80'	h. o	l·-
o	h-	o	O	T-	O	O	o	M	o 1
5	CO O
	D								E
O									E
	<								I
	o								1
o Ό	o								|
X
•N	O
i	TO N							Ή
•o			+1		Ή
(Λ TO 5 4½	o			co	ID	O	oo	3,04	r-
-sia	Q Z		00 ó*	0,3	V“ o’	o o’	coe
ΧΣ	r*-
O
>x	<
N O c	o
ω
T5	X
TO <0 TO N	3 C TO n
r o	o k. TO	-H		+)		Ή		-H
	w			CM	O		o	r-	▼—
c	co	o	o	00	co	CM	T“	T“	ID
8 o	o	o	o	o	o	O	co	O
CL i			>
o CO
TO		ώ_	o		o	•	o
5		_J		-J	3	-J
Ό			o		o	CN	o	o
TO		<3	X	3	X	<3	X
Σ ω		co	o	co	o	CO	υ	<0 O jj
	<	x	<	X	<	X
			X		X		X	<
		to	2	to	2	to	2	o

Σ ω

w

Ή

TO

C x>

0)

L_ *ω o

•Ł o

c o

•N

TO _ O Έ *

Φ c

TO

CD

TO □

186 393

Sl^ład wagowy i procentowy zasadniczych kwasów żółciowych w wątrobie u szczurów porównawczych i po doustnym podaniu UDCA,, 3-siarczanu UDCA,, 7-siarczauu UDCA lub 3,7-dwusiarczauu UDCA., Oznaczone przez GC-MS	3,7-siarcznn UDCA	PROCEN- TY (%)	θ·8 1	co	0,2	2,3	r- h- in	N- V*	*0 1	r-’	oo’
STĘŻENIE (nmol/g)	2,2	17.3	0,7 -	6,5	163,2 1	σ>	i 5,8 I_	o to	23,0 i
7-siarczan UDCA	PROCENTY (%)	ć>	in	CD	o	56,0	GO	co CN	00 o	18,0
STĘŻENIE (nmol/g)	CN CO	14,9	6,4	0,4	186,1	co’	oo’	36,1	59,8
3-siarcznn UDCA	PROCENTY (%)	O) Ó*	14,5	2,5	O τ—	23,9	15,6	9*8	18,1	10,0
STĘŻENIE (nmol/g)	3,2	52,6	9,2	6,0	86,6	56,6	31,3	65,4	36,3
UDCA	PROCENTY (%)	CN	6,8	3,7	4,8	12,7	30,0	co	18,3	6,3
STĘŻENIE (nmol/g)	8,0	22,5	12,4	co	42,3	99,6	37,4	60,6	20,9
Pi^Siba kontrolna	PROCENTY (%)	t—	6,7 1 1_	4,0	σ>	36,2	2,8	O o	10,5 . . . 1	29,7 1
STĘŻENIE (nmol/g)	CO	29,0	17,2	39,7	157,5	12,0	ND	45,8	129,1
		IIKWAS LITOCHOLOWY	KWAS DEOKSYCHOLOWY	KWAS CHENODEOKSYCHOLOWY	KWAS αMURICHOLOWY	KWAS CHOLOWY	(udca	< o Q Σ) a' <3	KWAS βMURICHOLOWY	> 5 I W O cz? S2 < tr

186 393 cd 'w

I co <

o

Q

Σ) d

'c to

-o o

o.

E £ ω

OT 2

Só

T> Q O o.

υ >. a s to c 5 •2 o

O Q Σ3· 3 C TO N O i? TO s ot ² 3 p

co js ft •N

II § ΰ <5 c O -§ O cd D w cd N o

σ>

OJ £

D <0 ω

o

CM o

•m· co co* σο σ>

co co’ o

o’

LII ω

Ή cd c

Ό

Φ

O

Jad

CD

O c

o

-N

CD •o <0

O <

O

Έ l^r

CD Φ g> c CD

Ό O C

186 393

OT Q 1 < o Q =3

2,06 ± 0,08 |

5,92 ± 0,21

40,20 ±5,50

222,40 ± 24,30 |

1,52 ± 0,12

0,37 ± 0,07

9,80 ±0,70

2,50 ±0,30

0

co

co

CO

80

to

CM

0

0

_c o

ω co

o o

o

co

-H

0 0

O O

0,8

0,5

I1

<

Ή

Ή

0

O CD

-H

-H

-H

+1

o

o

in

σζ

<0

co’ CO

CO

O

O

0

c

Q

co

o>

CM

CO

0

CD N

Z3

T-

CO

co

*“

O

CD

2

CD

ω

-C

o

>%

c

§

O CM

χ: o

co

40

co

CD

CO

O

70

o o.

-7S

0‘0

co o”

M7 4-1

Ή

θ'

0,2

O

+1

1 C3

o O)

<

+1

-H

O

O

Ή

-H

+ł

0

1 '

CD

O

in

CO

CO

55,

CM

CO

O

0

1

Q

cd

co_

’Μ;

r\

O

JO

<

=3

T“

ΙΌ

CO

CM

·*“

CD~

1 Λ

o

f—

Q

=3

'f7

2

O

CO

ikutk

.05

CO

4,30

o

CD Ί“

0,70

1,90

Vł

O

o

-H

0

o

-H

-H

CD C

<

+1

+1

O

O

+i

Ή

O

O

N

O

r-

co

CO

45,

CO

00

CO

CM

O

Q

o>

00_

Μ·_

°O-

θ

N.

zjoloc

D

V

M·

t—

s:

U-

Xi o u. CD*

roby)

>> 0

5 O)

OJ* 5

Ϊ

/min

CD _c

,□> c

ątroby

(nmol

mol/m

nol/mi

5

c

O)

“*2

o. >s

£

jL

F

O.

Ή.

>v

1 <D 5>

>.

>%

r

>»

- wy

>

υ

$ o

c CD

Ó Ό

z 0

aln

O u.

§ 0

aln

X5 n

O

aln

•N

i

E

i

E

s

E

s

E

dsta

ksyi

•N 0)

-S 07 Ό

iksyi

oles

GJ ω Ό

tksyi

£ ω

dsts

iksy

o

CD

O

O

ro

O

TO

o

O

5

o.

2

OT

0.

2

0

o.

2

u_

CL

UJ ω

+ι <p ’c

X» <D

L_ '(Λ

O fO

0>

c o

•N

CD >s o

c

CD §

186 393

T a b e 1 a 5

Względny skład % indywidualnych kwasów żółciowych wydzielanych w zótci podozas i.v. infuzji UDCA i siarczanowych pochodnych UDCA Czas (min) DCA CDCA α-MCA CA UDCA β-MCA MCA inne

Infuzla UDCA

Podstawowa [2,0 [5,4 [5,9 76,5 [3,2 126.9 [7,5 [nd

186 393

T a b e i a 5	Względny sWad % indywidualnych kwasów żółciownych wydzie^nych w żółci podczas i.v. infuzji UDCA i siarczanowych pogodnych UDCA ||	T3 C	Ό C	1	Ό C
CO	3,2	CM cm'
18,0	N- O)	r- cd	lO co
	54,6·	70,7	79,1
56,7	24,5	15,3	CD O
cn	co	CM cm'	co
co co'	in CM	b- O	σ> o
4 2	cm'	CM	Ό c
| Podstawowa	II20-30 minut	O C E o co 1 o LO	80-90 minut

186 393

186 393

DEOKSYCHOLAN

BRAK DANYCH

-, □ PRÓBA PORÓWNAWCZA LITOCHOLAN DUD UDCA

UDCA-3S O UDCA-7S

UDCA-DS

NIEZWIĄZANY

URSODEOKSYCHOLAN

BRAK DANYCH

ZWIĄZANY

URSODEOKSYCHOLAN

-,-,-,-,-j

4 6 8 10

STĘŻENIE KWASU ŻÓŁCIOWEGO W KALE (mg/g)

FIG. 2

KWAS LITOCHOLOWY / KWAS DEOKSYCHOLOWY

FIG. 3

186 393

STĘŻENIE UDCA W WĄTROBIE (nmol/g) STĘŻENIE UDCA W WĄTROBIE (nmol/g)

SIARCZAN SIARCZAN

FIG. 4A FIG. 4B

UDCA-7S

NIEZWIĄZANY GLICYNO-TAURYNO SIARCZAN

FIG. 4C

186 393

FIG.5A

FG.5B

186 393

STOPIEŃ WYDZIELANIA KWASU ŻÓŁCIOWEGO (nmol/MIN/g WĄTROBY)

FIG. 6A

STOPIEŃ WYDZIELANIA KWASU ŻÓŁCIOWEGO (nmol/MIN/g WĄTROBY)

186 393

STOPIEŃ WYDZIELANIA KWASU ŻÓŁCIOWEGO (nmol/MIN/g WĄTROBY)

FIG. 6C

STOPIEŃ WYDZIELANIA KWASU ŻÓŁCIOWEGO (nmol/MIN/g WĄTROBY)

FIG. 6D

186 393

ŚREDNIE WYDZIELANIE ŻÓŁCIOWE CHOLESTEROLU U SZCZURÓW SPRAGUE-

(Aqoj)%/w 6/uiui/|ouiu) mOH3±S31OHO 3ΙΝ\Π3ΙΖαΑΜ 3M0I0T0Z

186 393

ŚREDNIE WYDZIELENIE ŻÓŁCIOWE FOSFOLIPIDU U SZCZURÓW SPRAGUE-DAWLEY ii o

X <

OT υ

>

z α

o x

o o

o.

<

o o

X a

X

u.

z

OT ί

O o

o

o.

CZ)

ω	CD
ό	rt	«*» ο
<	<	<
o	ϋ	Ο
Ω	Ω	Ω
Ω	Ω	Ω

MM

es ó

u» (Aq<>4feM 6/ui<u/|oiuu) naidnOJSOd 3ΙΝ\Π3ΙΖαλΛΛ 3ΛΛΟΙΟ1ΟΖ

186 393

ó

IM s

o

CM o

o o

co

Ό

O

Ό *O

O o

o

CM

Ό

O

O

Ό

O

CD o

Ό

IfJ

O v>

O

CM

ŁO

O

O

W)

O co ^r o

Ό o

<r o

CM

O o

•oo co co o

Ό co

u.

co

GO »

o

u.

186 393

186 393

186 393

FIG. ΙΑ

120 o

ε c

UJ m

o

u.

£ §

<

o α

UJ

10080·

6040DCA □ NIEZWIĄZANY DEl GLICYNA + TAURYNA SIARCZAN

UDCA-3S

UJ

N ur ίο)

20PRÓBA

PORÓWNAWCZA

UDCA-7S UDCA-D5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (20)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie siarczanu kwasu 3 alfa, 7 beta-dihydroksy-5-beta-cholan-24-owego (UDCA) lub jego soli do wytwarzania kompozycji farmakologicznej, zawierającej farmakologicznie przyjęty nośnik, do inhibitowania lub leczenia schorzenia wątroby lub stanu zapalnego drogi żołądkowo-jelitowej u ssaków, zwłaszcza stanu zapalnego wątroby lub stanu zapalnego jelita cienkiego, jelita grubego lub stanu zapalnego, takiego jak rak okrężnicy, rak odbytnicy, nowotwór okrężnicy, nowotwór odbytnicy, karcynogeneza okrężnicy, karcynogeneza odbytnicy, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, polip gruczołakowaty, polipowatość rodzinna jelit i ich kombinacje.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan wybrany z grupy zawierającej 3-siarczan UDCA, 7-siarczan UDCA, 3,7-disiarczan UDCA, 3-siarczan gliko-UDCA, 7-siarczan gliko-UDCA, 3,7-disiarczan gliko-UDCA, 3-siarczan tauro-UDCA, 7-siarczan tauro-UDCA, 3,7-disiarczan tauro-UDCA i ich kombinacje.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się siarczan wybrany z grupy zawierającej 3-siarczan UDCA, 7-siarczan UDCA, 3,7-disiarczan UDCA i ich kombinacje.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan wybrany z grupy zawierającej 7-siarczan UDCA, 3,7-disiarczan UDCA i ich kombinacje.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan w ilości efektywnej do inhibitowania lub leczenia stanu zapalnego drogi żołądkowo-jelitowej.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się siarczan w ilości efektywnej do inhibitowania lub leczenia stanu zapalnego wątroby.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, ze stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji do podawania dożylnego.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 6 albo 7, znamienne tym, że stosuje się siarczan w ilości efektywnej do dostarczania UDCA do jelita grubego ssaka.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że stosuje się siarczan zawierający fragment siarczanowy na węglu C-7.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji inhibitującej jelitową absorpcję UDCA.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji inhibitującej jelitową transformację UDCA i jego metabolitów.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 10 albo 11, znamienne tym, że stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji inhibitującej poprzez degradację bakteryjną.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 10 albo 11, znamienne tym, że stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji inhibitującej poprzez 7 alfa-dehydroksylację.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się siarczan zawierający fragment siarczanowy na węglu C-7 do wytwarzania kompozycji obniżającej ilość kwasu litocholowego lub jego soli i kwasu deoksycholowego lub jego soli w okrężnicy.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że stosuje się siarczan zawierający fragment siarczanowy na węglu C-7 do wytwarzania kompozycji do dostarczania UDCA do okrężnicy bez znaczącego zwiększenia proporcji kwasu litocholowego lub jego soli do kwasu deoksycholowego lub jego soli w okrężnicy.
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji poprawiającej biochemię surowicy w schorzeniu wątroby i funkcjonowaniu wątroby.

    186 393
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że wytwarza się kompozycję poprawiającą biochemię surowicy, która to biochemia obejmuje stężenia w surowicy enzymów wybranych z grupy zawierającej aminotransferazę alaniny, aspartatową aminotransferazę, alkaliczną fosfatazę, gamma-glutamylotranspeptydazę oraz ich kombinacje.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji zwiększającej wypływ żółci.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji obniżającej wydzielanie żółciowego lipidu, wybranego z grupy zawierającej fosfolipid, cholesterol oraz ich kombinacje.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze stosuje się siarczan do wytwarzania kompozycji w postaci do podawania doustnego, miejscowego lub dożylnego.