CN100421656C - 乌索脱氧胆酸在制备治疗与出血相关的神经系统损伤的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

通过施用亲水性胆酸，例如乌索脱氧胆酸(UDCA)，其盐以及其类似物(例如，甘氨乌索脱氧胆酸，牛磺乌索脱氧胆酸，以及其它共轭衍生物)处理与出血相关的神经系统损伤的方法。

Description

乌索脱氧胆酸在制备治疗与出血相关的神经系统损伤的药物中的用途
本申请要求2002年11月7提交的美国临时申请序列号60/425,210及2003年3月3日提交的美国临时申请序列号60/451,615的权益，二者全部引用与此作为参考。
背景
出血性中风一直是一种破坏性脑血管事件，估计的发病率为100，000分之15到35，死亡率接近50％。目前，约有两百九十万中风幸存者，其中大部分严重残疾。数据显示10-15％的中风是由脑内出血造成的，这就占大约300,000到450,000中风幸存者。脑内出血(ICH)的主要危险因素包括高血压、创伤、动静脉畸形和肿瘤。
诸如出血性和缺血性中风等急性中枢神经系统疾病常常导致迟发的神经元细胞死亡。尽管脑损伤的确切机制还不完全清楚，但许多研究表明凋亡，即细胞程序死亡，可能起关键作用。
继发于血肿的占位效应的损伤被认为是源于组织对血产物侵入的反应，造成缺血、水肿、剧烈的炎症，最终细胞死亡。出血性中风造成细胞死亡的机制复杂，似乎涉及从坏死到凋亡的多事件的相互作用。但是，人们已经认识到，脑缺血再灌注以后细胞表现一些包括染色质浓缩、TUNEL标记以及caspase激活在内的凋亡特征。凋亡的特征性体征在出血性中风后的脑也见描述。然而，出血性中风后神经元损失的机制没有被很好记述，部分归因于缺少足够的实验模型。
乌索脱氧胆酸(UDCA)属内源胆酸，过去几十年中临床一直用于治疗多种肝脏疾病。有关UDCA及其共轭衍生物，诸如牛磺乌索脱氧胆酸(TUDCA)，对肝脏和非肝脏细胞的凋亡阈值的调节发挥独特作用的观察资料拓展了这些分子的生物学作用。UDCA和TUDCA稳定线粒体膜从而阻止一些凋亡事件发生，包括线粒体膜去极化及通道形成、产生活性氧类、释放细胞色素c，caspase激活以及核酶聚(ADP-核糖)聚合酶分解。此外，UDCA可能是有丝分裂原激活的蛋白激酶存活途径的强激活剂。最后，最近有人报道施用TUDCA不仅对化学诱导和转基因的亨廷顿氏病动物模型起神经保护作用，而且对急性缺血性中风也起神经保护作用。大鼠的中脑动脉阻塞后静脉施用TUDCA可保护细胞免于死亡，减少梗塞范围并改善神经功能，同时显著降低线粒体膜混乱以及凋亡相关的caspase的下游激活。
出血性中风之后，手术和药物治疗在降低发病率或死亡率上都没有效果，在这些患者中的临床试验已远远落后于缺血性中风的患者。迫切需要治疗剂来缓解与出血性中风相关的广泛细胞死亡以及与出血性中风相关的神经系统的其它损伤。
概述
本发明提供了一种治疗与出血相关的神经系统损伤(对某些实施方案，中枢神经系统损伤)的患者的方法。优选地，患者为人类患者，并且施用步骤包括施用有效量的乌索脱氧胆酸，其盐，类似物或其组合。
本发明一方面提供了一种方法，包括给患者施用有效量的乌索脱氧胆酸、其盐、其类似物(例如，甘氨乌索脱氧胆酸、牛磺乌索脱氧胆酸以及其他共轭衍生物)或其组合的步骤。优选地，施用步骤包括肠胃外施用或者口服。
神经系统损伤为脑和/或脊髓损伤，其典型特征为存在出血且与其相关。例如，与出血相关的神经系统损伤可能是出血性中风、头部创伤、脊髓损伤或者外周神经损伤。
此处，“患者”包括人、羊、马、牛、猪、狗、猫，等。优选地，对象是人或是其他哺乳动物。
附图简述
图1A-1D-在胶原酶输注之后两天胶原酶诱导的大鼠纹状体内出血导致右侧纹状体内大的出血性病变。(1A)通过实验ICH处理的大鼠脑的冠状切片后的出血损伤。标出的是同测(Ipsi)ICH核及其外周(Peri-ICH)。对侧(Contra)半球的同源组织作为分析对照。(1B)和(1C)：在施用胶原酶前的一小时，接受渐增剂量TUDCA(10-200mg/kg体重)的动物中病变总体积明显减小。每个处理组的典型的纹状体Nissl染色切片均给出。注射赋形剂的纹状体病变(1B)被标出作为参考并置于TUDCA处理过的动物的纹状体上方(1C)。(1D)病变体积的量用平均值±SEM(每组n＝5个动物)画图表示。注射赋形剂的动物同侧＊p＜0.05并且§p＜0.01。
图2A-2H-TUDCA减少了ICH同侧半球的凋亡。(2A)-(2F)典型的纹状体TUNEL染色切片的显微照片。赋形剂(2A)和100mg/kg体重TUDCA(2B)处理过的动物中对侧半球几乎见不到TUNEL阳性细胞。注射了赋形剂的动物的ICH同侧半球可见凋亡细胞显著增加(2C)，更高的放大倍数(2E)。TUDCA处理过的大鼠的TUNEL反应明显比假手术对照(2D)低很多，这也可以在更高倍的放大中观察到(2F)。切片用0.5％甲基绿复染。初始放大，200x。(2G)凋亡细胞的数量显示于柱形图中。相对于在施用胶原酶之前1小时接受了渐增剂量(10-200mg/kg体重)TUGCA的动物，注射了赋形剂的大鼠凋亡细胞占总细胞的比例显现出上升。数据以平均值±SEM(每组n＝5个动物)给出。(2H)DEVD-特异的caspase活性示于柱形图中。相对于对侧半球，注射了赋形剂的对照的同侧半球中的caspase-3样蛋白酶的激活作用明显大很多，但是提高TUDCA剂量会进行性降低caspase的激活作用。数据以平均值±SEM(每组n＝5个动物)给出。注射赋形剂的动物同侧＊p＜0.05并且§p＜0.01。
图3A-3C-(3A)TUDCA(100mg/kg体重)降低损伤体积，(3B)TUNEL阳性细胞的数目，(3C)出血事件一小时前或者至少三个小时后给药时，ICH同侧半球caspase激活作用。数据以平均值±SEM(每组n＝3-5个动物)给出。相对于注射赋形剂的动物同侧＊p＜0.05并且§p＜0.01。
图4A-4D-TUDCA处理降低ICH同侧半球NF-KB激活。(4A)和(4B)典型纹状体切片显示ICH两天后同测纹状体内NF-KB/p65激活。免疫反应性的NF-KB在注射了赋形剂的对照中能被清楚地检测到(4A)，但是在100mg/kg体重TUDCA处理过得动物中较不明显(4B)。(4C)典型的同侧半球p65NF-KB亚基和IKBα免疫印记。假手术大鼠的同侧半球中可见NF-KB/IKBα蛋白复合物的变化而在施用胶原酶之前一小时施用渐增剂量(10-200mg/kg体重)TUDCA后就较不明显了。总蛋白提取物进行SDS-PAGE，并且印记用NF-KB和IKBα的抗体探测。(4D)NF-KB/IKBα蛋白复合物的变化的量值以平均值±SEM(每组n＝3-5个动物)画图给出(5C)和(5D)。注射赋形剂的动物同侧＊p＜0.05。
图5A-5D-TUDCA处理影响ICH同侧半球Bcl-2家族蛋白质生成和/或稳定。(5A)注射了赋形剂的大鼠脑中的Bcl-2，Bcl-xL和Bax蛋白质比对侧半球升高。渐增TUDCA剂量(10-200mg/kg体重)，在胶原酶之前1小时施用，进行性降低Bcl-xL和Bax，但不是Bcl-2的生成和/或稳定。Bcl-2、Bcl-xL和Bax的典型的免疫印记以及各自蛋白水平的定量。总蛋白提取物进行SDS-PAGE，并且印记用Bcl-2家族成员的抗体探测。(5B)相对于对侧半球，注射了赋形剂的大鼠的脑内bcl-2、bcl-xL以及bax的mRNA水平提高。渐增TUDCA剂量(10-200mg/kg体重)，胶原酶前1小时施用，会进行性降低bel-xL而不是bcl-2的转录活性。分离总RNA，并且通过RT-PCR扩增bcl-2、bcl-xL和bax mRNA。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙键染色进行分析。组成型表达的β肌动蛋白mRNA的产物作为对照。数据以平均值±SEM(每组n＝3-5个动物)给出(5C)和(5D)。注射赋形剂的动物同侧＊p＜0.05并且§p＜0.01。
图6A-6B-TUDCA激活Akt来保护ICH同侧半球神经元。相对于对侧半球，注射赋形剂大鼠的脑中磷酸化Akt-1 Ser-473以及磷酸化Bad Ser-136减少。渐增TUDCA剂量(10-200mg/kg体重)，胶原酶之前1小时使用，进行性提高Akt和Bad的磷酸化水平。P-Akt-1，Akt-1/2以及p-Bad的代表性免疫印记以及各自蛋白水平的量示于图6A。总蛋白提取物进行SDS-PAGE，印记用磷酸化Akt和Bad的抗体探测。数据以平均值±SEM(每组n＝3-5个动物)给出(6B)。注射赋形剂的动物同侧＊p＜0.05并且§p＜0.01。
说明性实施方案的详述
本发明提供一种处理具有与出血相关的神经系统损伤的患者的方法。目前尚无减少与出血相关的细胞死亡的有效处理方法。
神经系统损伤是神经的损伤，其特征是存在出血。例如，与出血相关的神经系统损伤可能为出血性中风、头部创伤、脊髓损伤或者外周神经损伤。
优选地，损伤为出血性中风，其特征是由于血管完整性的破坏而使真正的血液进入脑实质。这有别于以血流阻塞不能流入所特定脑区域为主要特征的缺血性中风。典型地，缺血性中风与出血无关但可能与该区域水肿有关。
尽管此处所描述的化合物在用于治疗缺血性中风方面是公知的，但出乎意料的是它们能被用于治疗出血性中风或者与出血性中风相关的固有损伤导致的其他神经系统损伤。过去并不清楚细胞死亡与凋亡、坏死和/或necroptosis是否有关。细胞立即死亡(出血性中风中很典型)是坏死的典型结果，而迟发的细胞死亡(缺血性中风中很典型)是凋亡的典型结果。
本发明的方法涉及使用亲水性胆酸、其盐、其类似物或者其组合。正如这里所用的，亲水性胆酸是比脱氧胆酸(DCA)更加亲水的那些。这可以通过评估水和辛醇间的分配系数来确定，越是亲水的胆酸越偏向于水。或者，越亲水的胆酸在高效液相色谱的反相柱上具有越早的保留时间。特别优选的亲水性胆酸包括乌索脱氧胆酸。亲水性胆酸类似物的实例包括胆酸共轭衍生物。两个特别优选的共轭衍生物包括甘氨乌索脱氧胆酸和牛磺乌索脱氧胆酸。其他共轭衍生物包括3-硫酸乌索脱氧胆酸，7-硫酸乌索脱氧胆酸以及3，7-硫酸乌索脱氧胆酸。
虽然并非所有的亲水性胆酸在本发明的所有方法中都有用，但是在使用已知可诱导凋亡的试剂的细胞培养系统中，检测它们抑制凋亡的能力就可.以很容易对其作出评价。
有效量的此类化合物被用来处理神经系统损伤，此种处理既指预防处理也指治疗性处理。优选地，处理是治疗性处理。例如，它用于出血性中风患者、汽车事故中的头部创伤患者，例如，工作相关的外周神经损伤，等等。处理一般应尽快以减少即将出现的细胞死亡。预防性应用主要用于有出血性中风危险的患者，诸如严重的高血压患者。
本发明方法使用化合物的“有效量”是能有效防止、降低、抑制或者阻抑出血造成的损害进一步发展的剂量水平。
如果需要，此类化合物也可以以还包含药物可接受载体组合物的形式用于本发明方法。典型地，优选实施方案中，此处描述的化合物制成药物组合物然后按本发明的方法，以多种适合选定的给药途径的形式用于患者，典型地为哺乳动物，诸如人类患者。制剂包括那些适于口服、直肠、阴道、表面、鼻、眼或者肠胃外(包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内、心室内、直接注射入脑组织)给药的制剂。
制剂可以很便利地以单位剂型存在，也可以用任何一种制药领域中已知的方法制备。所有的方法均包括活性化合物与载体混合这一步，载体可含有一种或者多种辅助成分。概言之，按如下方法制备制剂：将活性化合物与液体载体、精细分割的固体载体或这两者均匀和紧密混合，然后如果需要，将产物塑形成需要的制剂。
本发明的制剂适合口服，可以呈分散的单位，如片剂、糖锭、胶囊、锭剂、晶片或者扁胶囊，各含预定量的粉末状的限制凋亡的化合物，以颗粒形式掺入脂质体，或者以溶液或者悬液形式掺入水性液体性或非水液体，诸如糖浆、酏剂、乳剂或者吸饮剂。
片剂、糖锭、药丸、胶囊等还可包含以下一种或多种物质：粘合剂，如黄着胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者白明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；以及天然或人造香味剂。若单位剂型为胶囊，可能还要含有流体载体，诸如植物油或者聚乙二醇。其它各种物质可作为包衣或用来改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、糖锭或胶囊可用白明胶、蜡、虫胶或者糖等包被。糖浆或者酏剂可能含一种或者多种甜味剂、防腐剂诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、延缓糖结晶的试剂、提高其它任一成分的溶解性的试剂诸如多元醇，例如甘油或者山梨醇、染料和香味剂。用来制备任何单位剂型的原料在使用量下基本无毒。此化合物可掺入到持续释放的制剂和装置中。
适于本发明方法使用的化合物可作为添加剂、补充物等直接加到患者日常食用的食物中。所以，本发明进一步提供了一种食品。虽然已用作营养补充物或者强化物的来源的加工食品，诸如面包、谷类食品、乳、等等用于此目的更为便利，但是任何食物均适于此目的。
适于肠胃外施用的制剂方便地包含所需化合物的无菌的水制剂，或者包括所需化合物的无菌粉末分散液，它们优选与接受者的血液等渗。可以含于流体制剂中的等渗剂包括糖、缓冲液以及盐诸如氯化钠。所需化合物的溶液可在水中制备，任选地混合无毒的表面活性剂。所需化合物的分散液可在水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇，等等)、植物油、甘油酯、及其混合物中制备。最终剂型无菌、是流体且在制造和储藏条件下稳定。必需的流动性可以，例如，利用脂质体、在分散液的情况下采用适当的颗粒尺寸、或者使用表面活性剂来获得。流体制剂消毒可以采用任何保持所需化合物生物活性的简便方法，优选过滤除菌。制备粉剂的优选方法包括无菌注射液的真空干燥和冷冻干燥。后续的微生物污染可用各种抗生物剂来抑制，诸如抗菌、抗病毒、抗真菌剂，其中包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等。延长所需化合物吸收时间可以通过加入延迟试剂，例如单硬脂酸铝和白明胶的方法来完成。
鼻喷雾剂可含有所需化合物和防腐剂以及等渗试剂的纯化水溶液。此类制剂优选地将pH和等渗状态调整到与鼻粘膜相容。眼用制剂用类似于鼻喷雾剂的方法制备，除了pH和等渗因子优选调整到与眼匹配。直肠或阴道用制剂可以制备为带有诸如可可油或者氢化脂肪或者氢化脂肪酸的适当载体的栓剂。
表面制剂可含有溶解或者悬浮于一种或多种介质诸如矿物油、石油、多羟基醇或者用于表面药物制剂的其它基质。此类制剂的实例包括用于皮肤的美容洗液、乳霜、防晒剂。
除了上述成分外，本发明的制剂可以更进一步含有一种或者多种辅助成分，包括稀释剂、缓冲剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。
此处描述的所需化合物的有用剂量可通过比较其在动物模型中的体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其它动物的有效剂量外推至人的方法在本领域所是众所周知的。
一般，成人注射、输注或者摄取的剂量一般为约200mg/天至约7000mg/天(即，约15mg到50mg每千克体重每天的剂量)。例如，每天施用约1到3次，以达到每升血清约10到15μmol或者更高的水平。这可以是单次快速浓注然后视损伤情况连续滴注24-48小时。本发明的优点用下面的实施例来阐明。但是，在这些实施例中叙述的特定的材料及其量以及其它条件和细节，应被解释为本领域更宽泛的应用而不应该解释为过度地限制了本发明。
实施例
在下列实施例中，对胶原酶诱导的ICH模型中凋亡的作用进一步进行了表征，并且描述了TUDCA诱导的神经保护的性质和机制。具体地，TUDCA处理引起神经元细胞的死亡和退化的显著减少。而且，NF-κB激活显著减少，Bcl-2水平持续上升，大鼠显示出改善了的神经功能。此外，TUDCA处理激活Akt并诱导Bad磷酸化，从而提高细胞的存活率。所以，可以得出以下结论：诸如TUDCA的化合物是独特的、无毒的内源性、以及可能有效的、用于出血性中风以及可能的其它与凋亡相关的脑损伤治疗的治疗剂。
材料和方法
ICH大鼠模型
所有的动物受到的人道的照料，遵守“实验室动物饲养及使用指南”中列出的研究所的指导方针，该指南由国家科学院起草，国家卫生部颁布(NIH发布号86-23，1985修订)。肌肉注射氯胺酮和赛拉嗪混合物以麻醉雌性Sprague-Dawley大鼠(250-300克；HarlanSprague-Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)，使其仰卧置于Kopf头部固定器。暴露右颈动脉、外支及内支，游离颈外动脉远端并抽出与颈内动脉并列。将PE-10聚乙烯管(Becton-Dickinson，Sparks，MD)从颈外动脉插入颈内动脉，结扎前者以固定管。TUDCA(Calbiochem-Novabiochem Corp.，SanDiego，CA)以每毫升400毫克(mg/kg)溶解于pH7.4的磷酸缓冲液。将盐水或者TUDCA溶液(每千克体重1毫升(ml/kg bw))在5分钟内直接注射入颈内动脉。在注射胶原酶前1小时或者注射后1、3、6小时施用不同浓度的TUDCA(10，50，100和200mg/kg bw)。最后除去聚乙烯管，烧灼颈外动脉末端，闭合伤口。为诱发中风损伤，将动物置于立体定位器并且通过输注胶原酶诱发ICH。(Rosenberg et al.，Stroke 1990；21：802-807和Chesney etal.，Stroke 1995；26：312-316)。简言之，通过头皮做一正中切口暴露颅骨。用10-μl Hamilton注射器将1μl含有0.5单位(U)细菌胶原酶(VII型；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的盐水立体定位注射入纹状体下列坐标处：前囱前0.4毫米(mm)和侧3.0mm处以及皮层表面腹侧5.0mm处。一旦输注结束，将Hamilton注射器在该处放置3分钟。手术过程中，用CMA/150温度控制器把体温保持在37℃。手术后大鼠在盛有食物并有白炽灯泡加温的笼子里复原。神经学测试在诱发ICH两天后进行。然后处死动物，取出脑于-70℃冷冻用于连续冷冻切片或者用于RNA和蛋白质的提取。每一小组动物的血清和脑样品收集起来以备胆酸分析。
神经学测试
手术两天后，测试动物对阿朴吗啡刺激产生的旋转行为。皮下注射阿朴吗啡(1mg/kg体重；Sigma Chemical Co.)，旋转用电脑控制的Columbus Instruments Videomex-V系统(Columbu，OH)来测定。注射后每5分钟进行一次计数并持续计数60分钟。ICH两天后通过独立分析左右前肢的步进行为来评估起步。在这个测试中，动物保持限制一前肢和两后肢的姿态。自由肢置于平面上使该动物身体重量集于该肢。大鼠开始步进动作，观察者调整大鼠的姿势以使动物的体重又集于该肢。计数1分钟内每一肢起始的步数。
血肿体积
行为测试后，处死大鼠并取出脑用作连续冷冻切片。出血病变的体积，包括ICH核心及周边区域，对按Nissl方案染过色的20μm冷冻切片用无偏的立体体积分析来量化。体积分析按照Cavalieri’s方法(Howard et al.，Unbiased stereology：three-dimentional measurementinmicroscopy.New York：BIOS Scientific Publisher Ltd 1998)操作。确定11张厚20μm，间隔900μm的Nissl染色切片中的病变面积。体积(mm3)按照公式V＝Txa/px∑Pi进行计算，其中V＝目的体积，T＝切片间距(mm)，a/p＝与每一点相关的面积(mm2)，Pi＝每一切片中命中目标的点。
TUNEL染色
胶原酶输注两天后，处死大鼠用于凋亡细胞的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)。脑切片厚10μm，用1％甲醛进行固定，乙酸-乙醇溶液-20℃进行后固定，用pH7.4磷酸缓冲液冲洗。Apoptag原位凋亡检测试剂盒(Intergen Co.，Purchase，NY)按照制造商建议用于TUNEL染色。简言之，将各个动物的相同连续脑切片用平衡缓冲溶液温育。末端脱氧核苷酸转移酶和洋地黄毒苷-dNTP加到切片上，37℃温育一小时。然后用抗洋地黄毒苷-过氧化物酶溶液处理载玻片30分钟(min)，用DAB底物显色，再用0.5％甲基绿复染。在计算机筛选网格上数出每个动物出血核心相邻区域内至少三个随机视野(400X)的TUNEL阳性细胞数目。
DEVA-特异的caspase活性
测定同侧和对应的对侧区域的解剖的脑组织中的caspase活性。组织在含有10mM pH7.6的Tris-HCl缓冲液，5mM MgCl2，1.5mMKAc，2mM DTT以及蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(COMPLETE；RocheDiagnostics，GmbH，Mannheim，Germany)的分离缓冲液中匀浆。caspase常规活性通过酶切底物N-乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-pNA(DEVD-pNA；Sigma Chemical Co.)上的生色基团对硝基苯胺来测定。蛋白水解反应在含有50μg胞质蛋白和50μM DEVD-pNA的分离缓冲液中进行。反应混合物在37℃温育一小时，用96孔板读数器于405nm处测定pNA的形成。蛋白质浓度使用Bio-Rad蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，按照制造商的说明书来测定。
RNA分离和RT-PCR
Bcl-2家族表达的变化通过RT-PCR来确定。用LifeTechnologies，Inc。(Grand Island，NY)的TRIZoL试剂从脑组织中提取总RNA。用寡(dT)(ID T，Inc.，Coraville，IA)和SUPERSCRIPT II反转录酶(Life Technologies，Inc.)反转录5μg总RNA用于RT-PCR。用Roche Diagnostics，GmbH的Expand High Fidelity PCR系统将特异的寡核苷酸引物对与cDNA模板温育进行PCR扩增。下列序列用作引物：
Bcl-2有义引物，5’-CTGGTGGCAACATCGCTCTG-3’(SEQ ID NO：1)；和
Bcl-2反义引物，5’-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3’(SEQ IDNO：2)；和
Bax有义引物，5’-TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG-3’(SEQ ID NO：3)；和
Bax反义引物，5’-GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC-3’(SEQ ID NO：4)；和
Bcl-x有义引物，5’-AGGTCGGCGATGAGTTTGAA-3’(SEQ ID NO：5)；和
Bcl-x反义引物，5’-CGGCTCTCGGCTGCTGCATT-3’(SEQ ID NO：6)；和
β-肌动蛋白有义引物，5’-TGCCCATCTATGAGGGTTACG-3’(SEQID NO：7)；和
β-肌动蛋白反义引物，5’-TAGAAGCATTTGCGGTGCACG-3’(SEQID NO：8)。组成型表达的β-肌动蛋白mRNA的产物作为对照。扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙键染色分析。
免疫印记和免疫组织化学
Bcl-2家族，NF-κB，IκB，p-Akt和p-Bad蛋白质水平由12％十二烷基硫酸纳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离的总蛋白质匀浆物来确定。印记用1∶500稀释的对Bcl-2和NF-κB起反应的第一鼠单克隆抗体或是对Bcl-xS/L，Bax，IκB，p-Akt和p-Bad起反应的第一兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)探测，然后与偶联了辣根过氧化物酶的抗鼠或者抗兔的二抗温育。最后，膜用SUPERSIGNAL底物(Pierce，Rockford，IL)处理检测特异蛋白。NF-κB激活的免疫组织化学实验使用IMMNOCRUZ染色系统(Santa CruzBiotechnology)，按照制造商的说明书在用1％甲醛进行固定，用乙酸-乙醇溶液-20℃进行后固定，pH7.4磷酸缓冲液洗涤的10μm厚的冠状冷冻切片上进行。简言之，在用普通的山羊血清封闭后，冷冻切片用NF-κB p65亚基(Santa Cruz Biotechnology)的激活特异的单克隆抗体探测，该亚基的表位只有在IκB离解后才能够被结合。加入生物素偶联的抗小鼠二抗然后用HRP-链霉抗生物素蛋白复合物处理载玻片，用HRP底物混合物显色，而后用0.5％甲基绿复染。检验每个大鼠的多张切片上临近血肿的区域。
血清和脑的胆酸分析
注射TUDCA或者赋形剂后的1、3、和6小时，处死正常对照和纹状体内血肿的大鼠。收集血液、凝结、离心、取血清并冻于-20℃。此外，用5％水合氯醛麻醉并经颈心脏灌注磷酸缓冲液后取出脑，迅速冷冻并储藏在-70℃。胆酸在经有机溶剂萃取、Lipidex 1000纯化、液体-固体萃取、水解、亲脂阴离子交换层析分离并转变为甲酯-三甲基硅烷基醚衍生物后用气象色谱进行测定(Setchell et al.，Gastroenterology 1997；112：226-235)。胆酸浓度以nmol/g组织或者μmol/l血清表示。
密度测定和统计分析
蛋白质和核酸条带的相对强度用ImageMaster 1D Elite密度测定分析程序(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行分析。用适于Windows95的Graphpad Instat 3.00版(GraphpadSoftware，San Diego，CA)进行ANOVA和Bonferroni’s多重比较检验来完成统计分析。P值＜0.05即认为显著。
结果
TUDCA减少出血性中风后的血肿体积和凋亡。ICH重复人类中风造成的损伤，其可在成年大鼠中通过向脑实质中注射细菌胶原酶来诱导，引起该处血管的广泛性破坏。见图1A-1D。对Nissl染色的连续切片的计算机化体积分析揭示在输注胶原酶两天后右纹状体有大的出血病变(图.1A)。病变体积与纹状体萎缩程度相关，但同侧脑室体积的增大补偿了同侧纹状体减小的体积(数据未给出)。此外，在注射胶原醇前1小时施用了渐增剂量TUDCA的动物的病变尺寸明显减小。注射赋形剂组的脑出血病变面积比100mg/kg体重TUDCA-处理过的大鼠大了大约50％(赋形剂与处理组分别为278.4±39.2mm3与143.9±46.5mm3；p＜0.05)。200mg/kg体重TUDCA时，也观察到大约60％的病变体积减少(p＜0.01)，然而10和50mg/kg体重的剂量方案保护性明显低很多。最后，接受了TUDCA的动物的脑表明出血核心外围存在较少炎症细胞(数据未给出)。
TUNEL染色用以鉴定含有核DNA断裂的细胞。两个试验组的对侧半球观察到很少的凋亡细胞(图2A-2G)。但是，假手术大鼠的同侧半球中TUNEL阳性细胞显著增加(p＜0.01)。从出血脑的病变半球提取的DNA电泳图也表明有典型的DNA分梯为约200bp的片段(数据未给出)。100mg/kg体重TUDCA处理将凋亡细胞数从大约30％降低到大约10％(p＜0.05)。此外，当施用更大剂量的TUDCA时，它能使凋亡降低＞65％(p＜0.01)。输注胶原酶后对同侧和对侧半球的caspase活性也进行了检查。从相关的脑组织中制备蛋白提取物然后与DEVD-pNA，即一种caspase-3样酶的优选底物一起温育。对侧半球的caspase活性与正常脑组织相比没有明显的升高(数据未给出)。相反，注射赋形剂的大鼠脑的同侧部分caspase活性几乎被提高了4倍(p＜0.01)(图.2H)。施用100和200mg/kg体重TUDCA后，TUDCA将损伤半球的caspase活性降低45-60％(分别p＜0.05和p＜0.01)。事实上，在最高剂量TUDCA处理过的同侧和对侧区域并不存在统计学差异。这些发现表明，在出血性中风的胶原酶模型中，核心区域外的神经元正死于凋亡且能用TUDCA有效挽救。
接着，确定了TUDCA施用的治疗窗。用相同的模型，输注胶原酶之前1小时或之后1、3和6小时注射100mg/kg体重的赋形剂或TUDCA。在出血事件之前1小时或之后最多达三小时接受了TUDCA的动物在出血两天后脑病变的体积显著减少(p＜0.05)(图.3A)。到6小时，这一40-50％的保护作用会部分消失但仍很明显。ICH周围的体积，其约占总出血病变的多达72％，在任何时间点都能被TUDCA显著缩小(p＜0.05)(参见下面表1)。但是，若6小时以后给药，TUDCA对核心病变体积不提供明显的保护，表明TUDCA越是在小出血核心之外效果越强，越是早施用效果越明显。在整个时间-进程试验中，TUDCA处理过动物的TUNEL染色和caspase活性始终明显低于注射赋形剂的动物(图3B和图3C)。所以，在这个中风模型中，看来至少到出血后3小时这一时段适合用TUDCA进行干涉，因为在1小时或者3小时接受TUDCA的动物显示了与预处理相同的保护作用。
表1-TUDCA缩小ICH核心及其周边(Peri-ICH)
Figure C20038010283400151
数据以平均值±SEM(每组n＝3-5个动物)给出。
＊在各个时间点，与注射赋形剂的动物相比p＜0.05。
胆酸分析表明动脉施用TUDCA致使血清中和脑中的浓度上升。事实上，100mg/kg体重的单一剂量的TUDCA导致血清中的胆酸在注射后3小时从0.3μmol/l显著上升至10.6μmol/l(p＜0.01)。这一变化与此种胆酸在脑内浓度比注射赋形剂对照上升10倍相关(p＜0.01)。此外，接受了TUDCA的大鼠中，在中风动物和正常对照二者之间脑内总胆酸浓度几乎升高了2倍(p＜0.05)，表明跨血脑屏障的运输增加。
TUDCA改善神经缺陷
出血2天后的神经功能缺陷在TUDCA处理过的大鼠中得到改善，表明病变减少可能伴有改善的神经功能。观察到注射赋形剂的一组在手术后两天反应于阿扑吗啡施用而产生强的净同侧旋转。相反，施用TUDCA减弱运动活力的这种常规的反应。事实上，旋转反应从注射赋形剂对照每5分钟约20降至TUDCA处理大鼠的10以下(p＜0.05)。在较早施用的情况下保护作用更明显，但在ICH后6小时给予TUDCA，保护作用也是显著的。也评估了动物放置肢体并且起始步进移动的能力。通过De Ryck变量检验肢体放置的检测(De Ryck，Eur.Neurol.1990；30(suppl.2)：21-27)表明运动活力在TUDCA施用的时间-进程实验中改进了25-40％。实际上，在1分钟期间，在用TUDCA处理了单侧纹状体出血的动物中，左前肢比注射赋形剂的大鼠起始了明显更多步(P＜0.05)。此外，输注胶原酶之前1小时或者之后1小时接受TUDCA的大鼠左右前肢间的差异小于在更迟时间点处理的大鼠。
TUDCA处理的大鼠中NF-κB激活减少
为探索出血性中风信号转导传递途径以及TUDCA的保护作用，我们使用临近核心病变的脑组织，该处蛋白质仍可以合成，以及对侧半球的同源组织作为对照。见图4A-4D。细胞中主要的氧化应激感受器和效应器，即NF-κB/IκBα蛋白质复合物的变化在假手术大鼠同侧半球很显著而在TUDCA处理后就明显地不那么显著了。IκBα蛋白质印记分析显示注射赋形剂的对照比对侧半球减少了近40％(p＜0.05)，但能被渐增剂量的TUDCA很大程度上恢复。而且，在假手术大鼠中，NF-κB p65亚基的表达显著增加(p＜0.05)，而注射TUDCA的动物则未见明显差异(图4C和4D)。为了证实NF-κB在ICH之后激活，采用免疫组织化学实验，其中用到激活依赖性抗NF-κB抗体。假手术对照动物同侧半球的免疫反应性NF-κB能够清楚地检测到，而TUDCA处理显著降低ICH周围区域NF-κB激活(图4A和4B)。而且，NF-κB激活作用的分布区域与TUNEL染色测量的DNA断裂的分布区域重合(数据未给出)。
以前的报道已经阐明Bcl-2发挥着抑制细胞色素c从线粒体释放到胞质及后续细胞死亡的作用(Kluck et al.，Science 1997；275：1132-1136和Yang et al.，Science 1997；275：1129-1132)。所以，对纹状体内出血是否会诱导表达与NF-κB激活作用相关的Bcl-2蛋白和其它家族因子，Bcl-x和Bax的问题也进行了考察。见图5A-5D.蛋白质印记显示胶原酶输注后同侧半球内的Bcl-2蛋白水平显著上升了大约6倍(p＜0.01)，Bcl-xL上升较不明显(p＜0.05)(图5A和5C)。促凋亡的Bax也显著升高(p＜0.05)。在TUDCA存在下，Bcl-2蛋白水平与NF-κB激活不相关，因为在整个剂量-反应的研究中，Bcl-2持续上升，而转录因子激活显著下降。Bcl-xL蛋白水平稍微被TUDCA降低，而Bax蛋白则在处理过程中回复到对侧半球的值。RT-PCR分析表明在纹状体内出血之后bcl-2(p＜0.05)和bcl-xL(p＜0.01)的mRNA水平显著升高，而bax mRNA保持不变(图5B和5D)。TUDCA进一步升高了Bcl-2的转录激活，但减少了Bcl-xL mRNA。这些发现表明，在出血性中风的胶原酶模型中，bcl-2和bcl-xL的表达与NF-κB激活相关联，这一激活又会依次被TUDCA显著降低。而且，在ICH之前施用TUDCA关系到Bcl-2产生量和/或稳定性的提高，可能是通过了不依赖NF-κB激活的替代途径。
TUDCA激活Akt以保护出血性中风后的神经元
Akt，病毒癌蛋白v-Akt的细胞同系物，在很多类细胞中阻抑凋亡性细胞死亡。Akt也涉及Bad的磷酸化，将存活途径和Bcl-2家族潜在地连在一起。在探索TUDCA信号传递途径时发现，在ICH同侧半球中磷酸化形式的Akt-1的表达显著降低(p＜0.01)，但是能用TUDCA处理来很大程度上恢复。见图6A-6B。同样地，接受了TUDCA的大鼠脑中磷酸化Bad的水平比未处理的假手术对照提高了几乎2倍(p＜0.05)。细胞内信号传递是否经过3’-羟基磷脂酰肌苷激酶(PI3K)途径对TUDCA很关键，神经元内的作用通过体外使用PI3K选择性抑制剂阻断Akt的磷酸化来评定。渥曼青霉素处理原代皮质神经元可部分抑制TUDCA诱导的Akt的磷酸化，同时显著降低细胞生存活力(数据未给出)。
讨论
UDCA和TUDCA是无毒、内源产生的胆酸，其在体内和体外均可作为强效抗凋亡剂。它们除了通过抑制膜去极化和形成通道防止线粒体功能障碍外(Rodrigues et al.，J Clin Invest 1998；101：2790-2799和Rodrigues et al.，CeU Death Differ 1999；6：842-854)，这些分子也可能通过调节胞质钙水平在信号转导途径中以及通过调控转录在基因表达中起关键的调控作用(Guicciari et al.，Hepatology 2002；35：971-973)。给亨廷顿氏病遗传小鼠模型施用TUDCA显著降低纹状体退化并且改善运动和感觉缺陷(Keene et al.，Proc Natl Acad Sci USA2002；99：10671-10676)。而且，如果在中风的中脑动脉阻塞模型中缺血后给药，TUDCA显著减少凋亡、梗塞体积以及神经行为上的损害(Rodrigues et al.，J Cereb Blood Flow Metab 2002；22：463-471)。本研究拓展了我们以前的报道并展示了TUDCA在胶原酶诱导的ICH中风模型中的神经保护作用。施用TUDCA几乎完全消除了TUNEL阳性细胞的出现、caspase-3样蛋白酶激活以及ICH周围区域的组织损伤。这些发现与TUDCA抑制神经元凋亡一致。而且，从出血开始直到3小时，有些直到6小时，大部分神经元可以被挽救，与延迟激活神经元细胞死亡一致。所以，至少此模型中，许多细胞持续存活几小时并且如果在此时间窗内开始治疗则能由抗凋亡剂恢复。最后，TUDCA对减少头部钝伤大鼠模型中脑损伤之后的凋亡也明显有效。事实上，每一高倍视野内的TUNEL阳性细胞数在注射赋形剂的创伤性脑损伤的动物中接近27，但接受了TUDCA的大鼠中仅为12。用TUDCA损伤前处理24小时，随后在头部创伤当时和24小时后进行两次损伤后处理，减少了超过50％的凋亡。
ICH一直是一种破坏性脑血管事件，估计的发病率为100,000分之15到35(Broderick et al.，N Engl J Med 1992；326：733-736和Hankeyet al.，Stroke 1997；28：2126-2132)。手术治疗和药物治疗在降低ICH后的发病率和死亡率方面都没有什么效果，对这些患者进行的临床试验已远远滞后于缺血性中风患者。继发于血肿的占位效应的损伤被认为是起于组织对血产物侵入的反应，造成缺血、水肿、剧烈的炎症(Mendelow，Stroke 1993；24：III5-7)，细胞最终死亡。急性中风造成细胞死亡的机制复杂且显示涉及多事件的相互作用。但是，人们已经认识到，脑缺血再灌注以后细胞表现一些包括染色质浓缩、TUNEL标记以及caspase激活在内的凋亡特征(Choi，Curr Opin Neurobiol1996；6：667-672)。凋亡的特征性体征在出血性中风后的脑也见描述(Gong et al.，Neurosurgery 2001；48：875-882和Matz et al.，J CerebBlood Flow Metab 2001；21：921-928)。与这些观察报告相一致，TUNEL阳性细胞数急剧上升，紧密围绕血肿的区域内检测到显著的caspase活性。事实上，这一证据表明这个狭窄的选择性神经元损伤区域(此处表达多种凋亡相关蛋白)可能对中风预后结果很重要。近期用caspase抑制剂处理的动物以及caspase缺陷的遗传工程大鼠均表现出缺血脑损伤减少的研究支持这一结论(Loddick et al.，Neuroreport1996；7：1465-1468和Hara et al.，Proc Natl Acad Sci USA1997；94：2007-2012和Cheng et al.，J Clin Invest 1998；101：1992-1999和Endres et al.，J Cereb Blood Flow Metab 1998；18：238-247和Schielke et al.，J Cereb Blood Flow Metab 1998；18：180-185和Rabuffetti et al.，J Neurosci 2000；20：4398-4404)。
TUDCA，最多至ICH 3小时后施用，通过防止凋亡性细胞死亡从而显著减少纹状体病变体积，附带改善了神经功能。TUDCA直接抑制活性氧类产生、膜电势消失、线粒体外膜破坏(Rodrigues et al.，MolMed 1998；4：165-178和Rodrigues et al.，Biochem Biophys ResCommun 2001；281：468-474)。此外，TUDCA通过抑制Bax从胞质向线粒体转移从而缓解线粒体缺陷和毒性(Rodrigues et al.，J Neurochem2000；75：2368-2379和Rodrigues et al.，Mol Med 1998；4：165-178和Rodrigues et al.，Cell Death Differ 1999；6：842-854)。膜稳定性抑制了细胞色素c释放，从而调节了下游事件诸如caspase激活和底物裂解(Rodrigues et al.，Mol Med 1998；4：165-178和Rodrigues et al.，CellDeath Differ 1999；6：842-854和Benz et al.，J Hepatol 1998；28：99-106)。
NF-κB激活在中风损伤的脑中起重要作用是很确定的(Sharp et al.，J Cereb Blood Flow Metab 2000；20：1011-1032)。ICH特别伴有NF-κB的早期激活(Hickenbottom et al.，Stroke 1999；30：2472-2477)，这可能随之提高许多不同的基因包括一些涉及炎症和其它一些牵涉凋亡的基因的转录。但是，中风时的NF-κB的确切作用仍不清楚，因为一些研究表明NF-κB可能介导损伤，而其他研究表明它可能保护脑。虽然绝对量的p50和p65可能不可预测，但是NF-κB结合DNA的活性在实验ICH后升高且活性作用常常共同定位于含有断裂DNA的细胞(Hickenbottom et al.，Stroke 1999；30：2472-2477)，表明了NF-κB的有害作用。矛盾的是，ICH后用反义寡聚脱氧核苷酸降低NF-κB激活的关键介导物-促炎细胞因子肿瘤坏死因子α的表达可能有神经元保护作用(Mayne et al.，Stroke 2001；32：240-248)。与以前的报道一致，ICH两天后紧密围绕血肿的区域检测到了NF-κB的显著激活。NF-κB的下游靶基因编码抗凋亡蛋白Bcl-2及在较小程度上编码Bcl-xL，它们在同一脑区高度表达，表明激活了存活途径以保护脑避免最初的致细胞损伤的炎症反应。有趣的是，在施用TUDCA后虽然NF-κB的激活作用显著下降，但Bcl-2水平继续升高。所以，在ICH情况下，最初的炎症反应和/或氧化应激导致重要的NF-κB激活，这看起来是保护脑，因为Bcl-2和Bcl-xL的表达升高了，但可能通过激活其它介导细胞死亡的基因同时加重了损伤。实际上，凋亡仍是ICH周围区域细胞死亡的重要形式。通过抑制最初的损伤，TUDCA可能直接减少了NF-κB的激活。与此同时，Bcl-2的水平可能通过TUDCA激活替代存活途径而持续上升。本研究证实了反映造血细胞和其它细胞类型特征性特异信号传递级联在大鼠脑中也有功能且能被TUDCA调节的证据。更重要的是，这些途径对TUDCA的神经元保护效应似乎是决定性的。Akt被TUDCA磷酸化与Bad磷酸化潜在相联系，已知Bad磷酸化通过破坏其结合并灭活抗凋亡Bcl-2蛋白家族成员的能力从而提高存活(Datta et al.，Genes Dev 1999；13：2905-2927)。尽管本研究还没有彻底弄清TUDCA如何降低NF-κB激活并激活蛋白激酶途径以改变凋亡分子的能力来提高存活，但是治疗出血性中风时应着重考虑此种恢复神经元损伤的能力。
在此引入此处引用的所有专利、专利文件以及发表文献的完整公开内容作为参考。给出上面的详细描述和实施例仅是为了清楚地理解。不能从中推断任何不必要的限制。本发明不限于已给出的和已描述的确切的细节，对本领域技术人员显而易见的变化也将包括在权利要求书所限定的本发明中。

Claims (16)

1. 选自乌索脱氧胆酸、其盐、其共轭衍生物及其组合的化合物在制备用于治疗患有神经系统损伤的患者的药物中的用途，其中的神经系统损伤与出血相关，并且所述其共轭衍生物是牛磺乌索脱氧胆酸或甘氨乌索脱氧胆酸。
2. 权利要求1的用途，其中患者为人类患者。
3. 权利要求1的用途，其中所述药物还包含药物可接受的载体。
4. 权利要求3的用途，其中所述药物是用于肠胃外施用的制剂。
5. 权利要求3的用途，其中所述药物是用于口服的制剂。
6. 权利要求1的用途，其中与出血相关的神经系统损伤包括出血性中风、头部创伤、脊髓损伤或者外周神经损伤。
7. 权利要求1的用途，其中与出血相关的神经系统损伤包括出血性中风。
8. 权利要求1的用途，其中乌索脱氧胆酸的共轭衍生物为甘氨乌索脱氧胆酸。
9. 权利要求1的用途，其中乌索脱氧胆酸的共轭衍生物为牛磺乌索脱氧胆酸。
10. 牛磺乌索脱氧胆酸在制备用于治疗患有神经系统损伤的患者的药物中的用途，其中的神经系统损伤与出血相关。
11. 权利要求10的用途，其中患者为人类患者。
12. 权利要求10的用途，其中所述药物还包含药物可接受的载体。
13. 权利要求12的用途，其中所述药物是用于肠胃外施用的制剂。
14. 权利要求12的用途，其中所述药物是用于口服的制剂。
15. 权利要求10的用途，其中与出血相关的神经系统损伤包括出血性中风、头部创伤、脊髓损伤或者外周神经损伤。
16. 权利要求10的用途，其中与出血相关的神经系统损伤包括出血性中风。
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