CN103357017A

CN103357017A - met-RANTES在制备治疗遗传性视网膜变性药物中的应用

Info

Publication number: CN103357017A
Application number: CN2013103003539A
Authority: CN
Inventors: 曾惠阳; 陈星星; 刘谦; 陈艳; 邵长俊; 王沿强
Original assignee: Beijing Tongren Hospital
Current assignee: Beijing Tongren Medical Technology Co ltd
Priority date: 2013-03-07
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-17
Also published as: CN103357017B

Abstract

本发明涉及β趋化因子受体抑制剂或者包含所述受体抑制剂的组合物用于制备治疗遗传性视网膜疾病或保护遗传性视网膜变性感光细胞的药物中的应用。其中，β趋化因子受体抑制剂阻断β趋化因子与其受体的结合，进而阻断受体活化后的信号传导通路及引起的氧化损伤反应，从而治疗遗传性视网膜疾病或保护遗传性视网膜变性感光细胞。优选所述β趋化因子受体抑制剂为眼玻璃体腔内注射给药；优选所述β趋化因子受体抑制剂选自met-RANTES；优选所述疾病为遗传性视网膜变性。本发明的β趋化因子受体抑制剂对视网膜变性病变的干预明显提前，是治疗早期RP的理想手段，且不考虑特定的基因缺陷类型，具有实用性更强、应用更广泛等优点。

Description

met-RANTES在制备治疗遗传性视网膜变性药物中的应用

技术领域

本发明属于受体抑制剂相关生物技术领域，具体涉及met-RANTES用于制备治疗遗传性视网膜变性的药物或者保护感光细胞的药物中的应用。

背景技术

原发性视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa，RP）是一组以感光细胞进行性选择性丧失为特征的遗传性致盲性眼病，其发病率为1/3000-1/5000，也是引起各年龄人群视功能损害的常见原因。已有近50种基因变异确定可导致RP，但由于不清楚基因缺陷导致感光细胞变性的机理，目前对RP仍无有效的治疗方法。

rd小鼠是研究遗传性视网膜变性的天然动物模型，部分RP患者具有与rd小鼠相同的基因缺陷。由于PDE－6B基因变异，rd小鼠出生后8－10天出现视网膜变性，随后一周内感光细胞迅速丢失。文献1（Jomary C,Neal MJ and Jones S E.Characterization of cell death pathways in murine retinal neurodegeneration implicatescytochrome c release,caspase activation,and bid cleavage.Mol Cell Neurosci.2001;18:335–346）报道，rd小鼠的视网膜变性与基因变异导致cGMP感光细胞内蓄积，引起细胞内Ca流增加，并直接诱发感光细胞凋亡，但不清楚代谢紊乱引起的视网膜变性中的许多环节。目前认为，可能存在继发于基因缺陷的其他病理机制导致感光细胞凋亡。

文献2（Minghetti L.Role of inflammation in neurodegenerative diseases.CurrOpin Neurol2005;18:315-321）报道了中枢神经系统近期的研究成果：慢性炎症与神经元变性密切相关。

文献3（Cartier L,Hartley O,Dubois-Dauphin M,Krause KH.Chemokinereceptors in the central nervous system:role in brain inflammation andneurodegenerative diseases.Brain Res Brain Res Rev.2005;48:16-42）报道了炎症的重要介质之一，即趋化因子可能通过间接激活小胶质细胞杀伤机制或直接作用于神经元细胞受体引起神经元死亡。趋化因子是一类具有趋化白细胞功能的细胞因子，根据其结构及功能不同分为四个亚族，其中，CC或β亚族成员包括MCP（macrophage chemotacticprotein）－（1－5）、MIP（macrophage inflammatory protein）－1α,β、RANTES（regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted）等，这些趋化因子对单核细胞和小胶质细胞具有强大的趋化作用。趋化因子只有与细胞表面的G蛋白偶联受体（GPCRs）结合才能激发细胞反应。GPCRs是介导胞内信号传导的7次跨膜受体，其中，趋化因子受体CCR1-9与β趋化因子发生活化反应。具体来说，RANTES结合CCR1、CCR3及CCR5；MIP－1α作用于CCR1、CCR5及CCR9；MIP-1β作用于CCR5和CCR3；MCP－1作用于CCR2和CCR9；MCP-3作用于CCR1－3。小胶质细胞是中枢神经系统的组织吞噬细胞，在病理条件下可迅速活化并释放大量细胞毒性物质导致神经元变性包括感光细胞凋亡，所述细胞毒性物质包括活性氧（reactiveoxidative species，ROS）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）及TNF（tumor necrosis factor）－α等。在小胶质细胞的活化信号中，β趋化因子是将其激活并趋化至受损组织的主要介质。趋化因子及其受体表达上调，伴随小胶质细胞活化出现在多种中枢神经元变性疾病中，如多发性硬化（multiple sclerosis，MS）、阿尔茨海默病及HIV性痴呆等。

除了通过激活小胶质细胞，趋化因子还可直接与神经元受体结合，诱导凋亡发生。文献4（Hesselgesser J,Taub D,Baskar P,Greenberg M,Hoxie J,Kolson DL,Horuk R.Neuronal apoptosis induced by HIV-1gp120and the chemokine SDF-1alpha ismediated by the chemokine receptor CXCR4.Curr Biol.1998;8:595-598）报道了体外研究结果：趋化因子SDF-1可通过表达在神经元上的受体CXCR4直接诱导神经元凋亡。文献5（Hadida F,Vieillard V,Mollet L,Clark-Lewis I,Baggiolini M,Debre P.Cuttingedge:RANTES regulates Fas ligand expression and killing by HIV-specific CD8cytotoxic T cells.J Immuno.1999;163:105-109）报道了RANTES可调节细胞死亡蛋白（如Fas及Fas配体等）的表达。

关于炎性因素尤其趋化因子及其受体在视网膜变性中作用的研究较为少见。文献6（Zeng HY,Zhu XA,Zhang C,Yang LP,Wu LM,Tso MO.Identification of sequentialevents and factors associated with microglial activation,migration,and cytotoxicity inretinal degeneration in rd mice.Invest Ophthalmol Vis Sci.2005;46:2992-2999）报道了有关rd小鼠的研究发现：在视网膜变性过程中，β趋化因子（包括MCP－1、MCP3、MIP－1α、MIP-1β和RANTES）及小胶质细胞来源的细胞毒性因子TNF－α表达显著升高，小胶质细胞明显活化并向变性的感光细胞层浸润，早于感光细胞凋亡高峰期（见图1-3），提示小胶质细胞及其趋化因子等炎性因素在rd小鼠视网膜变性过程中发挥重要作用。该研究结果提示：由于基因突变导致rd小鼠感光细胞发育不良，可能释放β趋化因子，趋化并激活视网膜内层的小胶质细胞向受损的感光细胞层迁移。活化的小胶质细胞释放细胞毒性物质，如TNF－α或活性氧，最终导致感光细胞凋亡。在整个过程中，趋化因子与其在视网膜小胶质细胞表面受体的结合可能是诱导感光细胞凋亡的重要因素。

趋化因子受体活化后在细胞内的信号传导通路大致如下：1）激活与受体耦联的G蛋白异源三聚体，使其分解为α及βγ两个亚单位；2）激活多种信号级联反应效应分子，包括磷脂酶C（PLC）、PI3K或MAPK，产生各种功能效应。其中，PLC活化后可激发内质网暂时释放钙离子，使细胞内钙流增加成为趋化因子刺激最具特征性的标志并广泛用于研究功能性趋化因子受体的表达。PI3K活化后可促进一氧化氮合酶（iNOS）的合成表达。

文献7（Block ML,Zecca L,Hong JS.Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms.Nat Rev Neurosci.2007;8:57-69）报道的研究结果表明：在中枢神经系统神经元变性过程中，活化的小胶质细胞通过释放ROS引起神经元毒性反应；各种毒性刺激转化为ROS是共同的传导通路。其中，NADPH氧化酶活化产生细胞内及细胞外ROS是最重要的机制。NADPH氧化酶是结合于吞噬细胞（包括小胶质细胞）和非吞噬细胞表面的专有酶系。NADPH氧化酶活化后产生大量ROS，促进iNOS的合成表达，iNOS的活化产物NO被视为特殊的ROS。文献8（Sharma AK,Rohrer B.Sustained elevation of intracellular cGMP causes oxidative stress triggeringcalpain-mediated apoptosis in photoreceptor degeneration.Curr Eye Res.2007;32:259-269）报道：661W感光细胞经处理后，其钙内流增加，可诱发细胞内氧化应激反应释放ROS，加重细胞凋亡。但是，趋化因子刺激小胶质细胞或感光细胞受体后是否发生上述氧化应激反应迄今尚无报道。

近年来，研究人员已经采用基因治疗、干细胞移植、神经营养因子疗法、药物治疗及人工视觉等方法用于治疗RP，并取得一定进展。其中，基因治疗为针对病因的治疗，是解决问题的根本。但RP遗传的高度异质性使得仍有一半的基因未被发现，从而限制了基因治疗的范围。此外，基因导入眼内多需病毒作为载体，病毒载体在体内的长期安全性及治疗的长期有效性尚需要进一步观察。干细胞移植疗法也是治疗RP的热点，该方法中植入到眼内的干细胞在诱导下可分化成正常感光细胞。该疗法存在的问题包括如何控制肿瘤的发生，以及伦理和排斥反应等问题。此外，干细胞治疗的效果也优劣不一。神经保护治疗即在玻璃体腔内注射神经营养因子，所述的神经营养因子包括睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、视杆细胞源性的视锥细胞生成因子等。虽然以上神经营养因子的疗效已被动物和临床试验证实，但存在半衰期短、局部使用，多次玻璃体腔注射引起许多并发症等问题。药物治疗则针对RP不同的发病机制，采用维生素类、抗氧化剂、钙离子阻断剂等药物对RP进行治疗。但该方法主要对疾病的早期有效，长期作用效果不明。人工视觉旨在通过人工装置对视觉神经系统进行作用，在视觉中枢产生光幻觉，实现视觉功能恢复。该疗法主要针对晚期患者，且获得的视力不同于正常视力，需要对患者进行培训。

文献9（Savarin-Vuaillat C,Ransohoff RM.Chemokines and ChemokineReceptors in Neurological Disease:Raise,Retain,or Reduce?Neurotherapeutics2007:4:590-601）报道了某些β趋化因子受体抑制剂在治疗多发性硬化及其动物模型，如实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalitis，EAE）上取得了不错的治疗效果，并已进入临床实验阶段。其中，作为β趋化因子受体CCR5及CCR1抑制剂的met－RANTES被证实在EAE慢性平台期可缓解神经性病损。Met-RANTES是在重组人RANTES的氨基端加上蛋氨酸（met）修饰后得到的RANTES类似物。研究发现，met-RANTES是人CCR1及CCR5有效的拮抗剂，可以竞争性结合趋化因子受体而抑制RANTES和MIP-1α的趋化作用，特异性抑制其对单核细胞及小胶质细胞的趋化作用。Met-RANTES的分子量为7978，分子式C₃₅₅H₅₄₃N₉₇O₁₀₁S₆；结构式为H-Met-Ser-Pro-Tyr-Ser-Ser-Asp-Thr-Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala-Tyr-Ile-Ala-Arg-Pro-Leu-Pro-Arg-Ala-His-Ile-Lys-Glu-Tyr-Phe-Tyr-Thr-Ser-Gly-Lys-Cys-Ser-Asn-Pro-Ala-Val-Val-Phe-Val-Thr-Arg-Lys-Asn-Arg-Gln-Val-Cys-Ala-Asn-Pro-Glu-Lys-Lys-Trp-Val-Arg-Glu-Tyr-Ile-Asn-Ser-Leu-Glu-Met-Ser-OH（SEQ ID No：1）。目前，met-RANTES已经商品化。

文献6的研究显示，小胶质细胞及其趋化因子在rd小鼠视网膜变性中发挥重要作用。趋化因子是活化小胶质细胞重要的刺激因子，但趋化因子受体在小胶质细胞及感光细胞的表达及活化机制还不清楚，也不确定其活化后是否引发氧化损伤反应。

前述研究内容及其文献公开的全文内容作为参考引入本发明。

发明内容

本发明的目的提供β趋化因子受体抑制剂或者包含所述受体抑制剂的组合物在制备治疗遗传性视网膜变性的药物或保护感光细胞的药物中的应用。

本发明通过研究发现，遗传性视网膜变性的发病机制之一为：在rd小鼠视网膜变性过程中，由于基因缺陷导致感光细胞或其他组织细胞受损，引起β趋化因子产生增加，而β趋化因子通过两条途径发挥病理作用：1）β趋化因子激活视网膜内层的小胶质细胞（与表面受体如CCR5结合），使其活化外移并释放ROS（包括NO），促进感光细胞凋亡；2）β趋化因子直接与感光细胞表达的受体结合（如CCR1），加重感光细胞凋亡。同时，本发明研究发现，β趋化因子受体抑制剂阻断β趋化因子与其受体的结合，进而阻断受体活化后的信号传导通路及引起的氧化损伤反应，从而用于治疗遗传性视网膜变性。

因此，本发明通过如下技术方案实现：

（1）一种β趋化因子受体抑制剂或者包含所述受体抑制剂的组合物在制备治疗遗传性视网膜变性的药物中的应用。

（2）根据（1）的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体抑制剂为眼玻璃体腔内注射给药。

（3）根据（1）或（2）的应用，其特征在于，所述的β化因子受体抑制剂选自met-RANTES。

（4）根据（1）-（3）任一项的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体选自CCR1、CCR2、CCR3、CCR5的任一种或其组合，优选为CCR1、CCR5的任一种或其组合。

（5）根据（1）的应用，其特征在于，所述药物是保护感光细胞的药物。

（6）根据（5）的应用，其特征在于，所述的保护感光细胞是指减轻或延缓感光细胞凋亡。

（7）根据（5）或（6）的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体抑制剂为眼玻璃体腔内注射给药。

（8）根据（5）-（7）任一项的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体抑制剂选自met-RANTES。

根据本发明，所述注射给药的给药量是本领域的常规给药剂量。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

除非另有说明，本发明实验数据的表示均为平均数±标准差。实验结果采用单因素方差（One-way ANOVA）分析不同鼠龄实验数据差异表达的统计学意义。Turkey Honest差异（HSD）法进行两两比较。P<0.05视为有统计学意义。

本发明检测了不同鼠龄rd小鼠视网膜β趋化因子受体的表达与定位，并验证了小胶质细胞或感光细胞β趋化因子受体活化后所发生的氧化损伤反应，即分别产生细胞外ROS（包括NO）或细胞内ROS（包括NO），而ROS（包括NO）引起感光细胞凋亡。

本发明的体外试验证实，β趋化因子直接刺激661W感光细胞（表达CCR1）未引起钙流反应及细胞凋亡，可能与β趋化因子的刺激浓度、CCR1的表达强度有关。

基因治疗因RP表型的复杂性及该技术本身存在的问题，其在临床的应用还不现实。并且，基因治疗多采用视网膜下腔注射方法，技术操作难度较大，应用于人可能需行玻璃体切割手术。本发明的β趋化因子受体抑制剂对视网膜变性病变的干预明显提前，是治疗早期RP的理想手段，且不考虑特定的基因缺陷类型，具有实用性更强、应用更广泛等优点，仅行眼玻璃体腔注射即可，而眼玻璃体腔注射技术目前已成为治疗视网膜某些疾病的常规治疗手段。

干细胞移植需要视网膜下腔注射，技术难度较大。与干细胞移植相比，本发明所采用的β趋化因子受体抑制剂获得简单（如R&D公司商购），不存在伦理或在体内成瘤问题。

人工视觉用于晚期RP患者治疗，视觉装置制作复杂，且视力体验与真实视力差距较大。而本发明的β趋化因子受体抑制剂疗法干预更早，视觉质量理论上更接近于自然状态。

附图说明

图1是文献6报道的rd小鼠视网膜冰冻切片TUNEL染色结果的图。

其中，图A显示rd小鼠出生后10天（rd P10d）外核层开始出现凋亡细胞；图B显示rd小鼠出生后16天（rd P16d）的感光细胞凋亡达到高峰；图C显示rd小鼠出生后18天（rd P18d）凋亡的感光细胞开始减少。ONL为外核层；INL为内核层；GCL为节细胞层。箭头指向的细胞为凋亡的感光细胞。

图2是文献6报道的小胶质细胞在rd小鼠视网膜变性过程中活化过程的图。

由图2可见，在正常对照鼠视网膜中（图A－图B），少量小胶质细胞分布于内层视网膜（从ONL到GCL）并呈分支状；rd小鼠出生后10天（图C），开始出现小胶质细胞活化，数量增加并向外核层侵润；rd小鼠出生后14天（图D－图E）小胶质细胞活化达到高峰，小胶质细胞呈阿米巴状；rd小鼠出生后18天时（图F），小胶质细胞活化明显减轻。图G为免疫组化阴性对照，未显示阳性细胞染色。图B及图E为视网膜铺片（wholemount），其余为视网膜切片。箭头表示阳性染色的小胶质细胞。

图3是文献6报道的利用RT－PCR法检测β趋化因子，包括MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β、RANTES、fractalkine及IP-10在rd小鼠视网膜变性过程中表达变化的图。

其中，rd小鼠出生后8天（P8d），可见MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β及RANTES的微弱表达；rd小鼠出生后10天（P10d），MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β及RANTES的表达明显增加；rd小鼠出生后12天（P12d），MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β及RANTES的表达达到高峰；rd小鼠出生后14天及16天，MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β及RANTES的表达逐渐减少；rd小鼠出生后18天（P18d），MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β及RANTES仅有少量表达。而MCP－1、MCP－3、MIP－1α、MIP-1β及RANTES在对照鼠（N）的表达不明显。此外，fractalkine在对照鼠及各鼠龄rd鼠表达无差别。IP-10在对照鼠及rd鼠中无表达。

图4是利用RT－PCR（A）及免疫荧光法（B）检测β趋化因子受体，包括CCR1、CCR2、CCR3及CCR5在视网膜变性过程中其转录产物表达变化的图。

其中，图A结果显示，除了CCR2外，CCR1、CCR3及CCR5的转录产物在rd小鼠感光细胞凋亡高峰期（12d到16d）的表达均较对照组明显增加。图B结果显示，β趋化因子受体在变性的视网膜除了表达在视网膜内层神经元外（细箭头），CCR1及CCR5还分别表达于外核层神经元及疑似小胶质细胞中（粗箭头）。C为正常对照组；Beta-actin为内参照。

图5是利用免疫组化及免疫荧光双染法检测CCR1在rd小鼠视网膜变性过程中表达及定位的图。

其中，图A显示，对照鼠视网膜（control）外核层（ONL）未见CCR1阳性细胞；图B显示，rd小鼠出生后8天外核层开始出现CCR1阳性细胞；图C显示，rd小鼠出生后第10天，CCR1阳性细胞明显增多；图D-图E显示，rd小鼠出生后第12天及14天，CCR1阳性细胞达到高峰；图F显示，rd小鼠出生后第18天，外核层CCR1阳性细胞明显减少。图G-图I显示，图G中箭头所指为CCR1阳性染色细胞；图H中箭头所指为rhodopsin阳性感光细胞;图I为图G与图H的共定位图，箭头所指表示CCR1表达于rodopsin标记的感光细胞中（有共定位细胞）。图J-图L显示，图J箭头所指为CCR1阳性染色细胞；图K箭头所指为CD11b标记的小胶质细胞；图L为图J与图K的共定位图，表示CCR1不表达于CD11b标记的小胶质细胞中（无共定位细胞）。图M－图O显示，图M中箭头所指为CCR1阳性染色细胞；图N箭头所指为TUNEL阳性凋亡细胞；图O为图M及图N的共定位图，箭头所指表示部分CCR1阳性细胞与TUNEL阳性细胞共定位（有共定位细胞）。Merge为共定位。

图6是利用免疫组化及免疫荧光双染法检测CCR5在rd小鼠视网膜变性过程中表达及定位的图。

其中，图A显示，正常对照鼠视网膜（Normal）外丛状层（OPL）可见CCR5弱表达；图B显示，rd小鼠出生后12天（rdP12d），视网膜外丛状层可见CCR5阳性染色增强，并向外核层侵入。图C-图E显示，图C中箭头所指为CCR5阳性染色细胞；图D箭头所指为CD11b阳性染色细胞；图E为图C与图D的共定位图（merge），箭头所指表示部分CCR5表达于CD11b标记的小胶质细胞中（有共定位细胞）。

图7是利用免疫组织化学及分子生物学技术检测NADPH氧化酶的主要亚单位——gp^91phox在rd小鼠视网膜变性过程中表达变化及定位的图。

其中，图A显示，正常对照鼠（control）视网膜外丛状层（OPL）可见gp^91phox弱表达；图B显示，rd小鼠出生后8天，可见gp^91phox阳性细胞少量表达；图C显示，rd小鼠出生后第10天，gp^91phox阳性细胞明显增多；图D-图E显示，rd小鼠出生后第12天-第14天，gp^91phox阳性细胞达到高峰；图F显示，rd小鼠出生后第18天，只见少量gp^91phox阳性细胞。图G-图I显示，图G中箭头所指为CD11b标记的视网膜小胶质细胞；图H箭头所指为gp^91phox阳性染色细胞；图I为图G与图H的共定位图，箭头所指表示gp^91phox主要表达于CD11b标记的小胶质细胞中。图J-图L显示，图J箭头所指为gp^91phox阳性染色细胞；图H箭头所指为CCR5阳性染色细胞；图L为图J与图H的共定位图，箭头所指表示部分gp^91phox与CCR5在小胶质细胞中共定位（有共定位细胞）。图M的Real-time PCR与图N的Western-blot对gp^91phox转录产物及蛋白的测定与免疫组化结果一致。图N中C为对照组。

图8是iNOS在rd小鼠视网膜变性过程中表达及定位的图。

其中，图A显示，正常对照组视网膜外核层无iNOS阳性细胞；图B显示，rd小鼠出生后8天，外核层（ONL）开始出现iNOS阳性细胞，图C显示，rd小鼠出生后第10天，外核层（ONL）出现的iNOS阳性细胞增多，图D-图E显示，rd小鼠出生后12天-14天，外核层（ONL）出现的iNOS阳性细胞达到高峰，图F显示，rd小鼠出生后第16天，外核层（ONL）出现的iNOS阳性细胞开始减少。图G显示，RT-PCR对iNOS转录产物的检测与免疫组化结果基本一致。

图9是显示met-RANTES小鼠眼玻璃体腔注射对感光细胞的保护作用的图。

其中，图A显示，rd小鼠出生14天，对照组（PBS注射对侧眼）rd小鼠的视网膜外核层（ONL）明显缺失（残留4-6层）；图B显示，rd小鼠出生14天，实验组（注射met-RANTES）的rd小鼠的视网膜外核层明显增加（8-10层）。

图10是显示CCR5在BV-2细胞表达的图。与阴性对照相比（图A），CCR5在BV－2细胞的表达明显增加（图B）。

图11是显示不同种类β趋化因子受体活化导致细胞内钙流增加的图。

与对照组（阴性对照）相比，不同浓度β趋化因子RANTES、MIP－1α及MIP－1β刺激BV-2细胞后钙流产生明显增强。

图12是显示不同β趋化因子刺激BV－2细胞导致661W感光细胞凋亡情况的图。

其中，图A-图B分别为PBS对照组及blank对照组；图C、图D及图E分别显示RANTES、MIP－1a、MIP－1β刺激BV-2细胞导致661W感光细胞凋亡增加30％，深染色细胞为凋亡细胞；图F显示，MCP-3（非CCR5配体）刺激BV-2细胞不会引起凋亡细胞增加。

图13是met-RANTES竞争抑制BV-2细胞活化，减少661W感光细胞凋亡的图。

其中，图A显示，加入RANTES但未加入met-RANTES的661W感光细胞凋亡结果；图B显示，加入RANTES之前加入met-RANTES的661W感光细胞凋亡结果；图C显示，加入MIP－1a但未加入met-RANTES的661W感光细胞凋亡结果；图D显示，加入MIP－1a之前加入met-RANTES的661W感光细胞凋亡结果；图E显示，加入MIP－1β但未加入met-RANTES的661W感光细胞凋亡结果；图F显示，加入MIP－1β之前加入met-RANTES的661W感光细胞凋亡结果。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质，任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

实施例1不同鼠龄rd小鼠视网膜β趋化因子受体的表达与定位研究

1）动物及组织切片制备：

雄性rd小鼠及正常C57BL/6N小鼠各350只。rd小鼠出生后8天，10天，12天，14天，16天及18天，各取6只rd小鼠的12个眼球进行检测，并同等数量同龄同种鼠作为对照。小鼠断颈处死后迅速摘取眼球进行组织切片或收集视网膜进行分子生物学检测。组织切片采用冰冻切片，冷丙酮后固定进行免疫荧光染色。

2）RT-PCR及免疫荧光检测在rd小鼠感光细胞变性过程中视网膜CCR1、CCR2、CCR3及CCR5的表达水平变化及细胞定位。

RT-PCR：rd小鼠及对照小鼠新鲜视网膜总RNA的提取如下:分别将不同鼠龄的12个视网膜加入1mL TRIZOL中在冰上研磨。RNA经过氯仿提取，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后溶解在无RNA酶水中。提取的总RNA用于cRNA合成。

根据试剂盒操作步骤，以mRNA为模板，oligo(dT)12-18为引物，Superscript^TMRT逆转录酶作用下合成cDNA第一链。以逆转录的cDNA为模板，引物在

TaqDNA多聚酶的作用下扩增mRNA的特定片段，β-actin为内参照。引物序列见表1。25μl的反应混合物由1μl cDNA，1μl上游和下游引物，2.5μl10×PCR缓冲液（含25mmol/L MgCl₂）及0.5U

Taq DNA多聚酶组成。扩增反应条件下:94℃预热5min;94℃变性、退火及延伸72℃各30s，共35个循环;最后72℃延伸7min。将各鼠龄等量PCR产物置于含EB的1%琼脂糖凝胶电泳中分离，凝胶成像系统捕捉荧光条带并利用Quantity One图像分析软件进行光密度分析，计算与β-actin产物积分光密度比值。

表1

免疫荧光法：冰冻切片以正常二抗血清工作液封闭20分钟。切片与适宜稀释度的抗小鼠CCR1、CCR2、CCR3及CCR5多克隆抗体孵育，4℃过夜。PBS洗，FITC或TRITC藕联的二抗室温孵育30分钟。PBS洗后封片，并在荧光显微镜下以相应的激发波长观察并拍照。PBS取代一抗孵育作为阴性对照。

荧光双染法：神经元细胞及小胶质细胞可能是趋化因子受体（如CCR1或CCR5）的主要来源，荧光双染法可将部分趋化因子受体阳性染色定位于神经元或小胶质细胞中。小胶质细胞的标记物为CD11b；神经元的标记物为rhodopsin。将组织切片与来自不同种属两种一抗（如CCR5抗体来自兔，CD11b抗体来自大鼠）4℃过夜孵育。PBS洗后，与其对应的偶联TRITC或FITC的二抗室温孵育45分钟。感光细胞凋亡由TUNEL荧光试剂盒确定。对于荧光双染，切片与TUNEL反应混合物32℃孵育1小时，再加入CCR1一抗孵育30分钟。PBS洗涤，并与来源于驴的荧光二抗TRITC孵育。切片在共聚焦显微镜下（TCS-NT；Leica）观察染色结果并拍照。

研究结果表明：与对照组相比，除了CCR2，大部分rd小鼠视网膜β趋化因子受体，包括CCR1、CCR3及CCR5在感光细胞凋亡高峰期表达水平均升高（图4A），且位于内层神经元细胞（图4B，细箭头）；此外，受体CCR1主要表达于不同鼠龄rd小鼠的感光细胞（对照组无表达），部分与TUNEL细胞共定位（图5）。CCR1表达水平与感光细胞凋亡平行（图4A及图5）。CCR5表达于rd小鼠视网膜活化的小胶质细胞，且与后者的活化程度及感光细胞凋亡一致（图6及图4A）。

实施例2小胶质细胞或感光细胞β趋化因子受体活化后发生氧化损伤机制的研究

本实施例证实了小胶质细胞或感光细胞β趋化因子受体活化后发生的氧化损伤反应，分别产生细胞外或细胞内ROS（包括NO），进而引起感光细胞凋亡。

1、免疫组织化学：检测在rd小鼠视网膜变性中iNOS及gp^91phox的组织表达。冰冻切片自然晾干。3%H₂O₂溶液室温孵育30min，封闭内源性过氧化物酶。正常二抗血清工作液封闭，室温孵育15min。小鼠抗小鼠gp^91phox单克隆抗体（1:500，SignalTransduction Laboratory公司）或兔抗小鼠iNOS（1:100，Santa Cruz Biotechnology公司）4℃孵育过夜，用PBS代替一抗孵育作阴性对照。次日，滴加生物素化抗小鼠或抗兔IgG工作液，室温孵育30min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液（ZYMED公司SP试剂盒），室温孵育30min。DAB显色，光镜观察显色情况。苏木精复染核后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，40倍光镜下观察。

2、免疫荧光及荧光双染法：免疫荧光法观察视网膜iNOS及gp^91phox的细胞定位表达。荧光双染法将gp^91phox染色定位于小胶质细胞中。同法将小胶质细胞表达的趋化因子受体（实验已证实分别为CCR5）与gp^91phox共定位。具体操作步骤与实施例1中相应的免疫荧光法和荧光双染法操作步骤相同。

3、Western blot、Real-time/RT PCR免疫荧光法测定rd小鼠感光细胞变性过程中视网膜NADPH氧化酶（gp^91phox为主要亚单位）及iNOS的表达及细胞定位，以证明它们与β趋化因子受体的相关性。

Western blot：检测视网膜gp^91phox蛋白表达。将组织置于500μl组织裂解液里研磨。匀浆液4℃，12000rpm离心20分钟后，将样品10μg在12％SDS－PAGE胶中电泳分离。分离后的蛋白电转到硝酸纤维膜中进行免疫测定。硝酸纤维膜经5％脱脂牛奶封闭后，与一抗单克隆抗体gp^91phox（1:1500，Transduction Laboratory公司）室温孵育1小时。清洗三次后，一抗被结合有辣根过氧化物酶（1:2000）的二抗抗体识别，然后进行化学发光显影（ECL试剂盒，Amersham公司）。电泳前样品总蛋白浓度由BCA蛋白测定法确定，所加样品蛋白量相同。GAPDH作为加样内参照。显影条带由凝胶成像系统捕捉并分析表达浓度。

Real-time PCR：检测gp^91phox的转录产物的表达水平。小鼠视网膜总RNA提取同实施例1中的RT-PCR中总RNA的提取。以逆转录的cDNA为模板，在SsoFast^TMEvaGreen多聚酶的作用下扩增gp^91phoxmRNA的特定片段。引物序列为：上游引物：5'GAG TGC CCA GTA CCA AAG T3'（SEQ ID No：12），下游引物:5'CCA CAA GCATTG AAT AGC C3'（SEQ ID No：13）。β-actin作为内参照，引物序列为：上游引物:5'AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG3'（SEQ ID No：14），下游引物:5'TGG CGTGAG GGA GAG CAT AG3'（SEQ ID No：15）。20μl反应混合物由1μl cDNA模板、10μl SsoFast EvaGreen混合液、1μl上游引物、1μl下游引物和7μl无RNA酶水组成。使用Bio-Rad CFX96^TM荧光定量PCR仪，扩增反应条件如下：酶反应时间95℃30s，96℃变性和60℃退火各5s，40个循环。融解曲线65℃-95℃，每0.5℃10s。将各鼠龄等量PCR产物置于含EB的1%琼脂凝胶电泳中分离，凝胶成像系统捕捉荧光条带。

RT-PCR：检测iNOS转录产物的表达水平。试验步骤同实施例1中相应步骤。iNOS上游引物:5'CGA CCC GTC CAC AGT ATG T3'（SEQ ID No：16）；下游引物:5'TACAGT TCC GAG CGT CAA AG3'（SEQ ID No：17）。退火温度60℃，产物片段417bp。

4、体外实验

1）观察β趋化因子对小胶质细胞的活化作用

BV－2细胞系：为永久性小鼠小胶质细胞系，可结构性地表达CCR5。细胞在含有10%热灭活的胚胎小牛血清及0.5%青霉素-链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO₂条件下培养。

细胞免疫荧光法证实BV-2细胞表面表达CCR5抗体（参见图10）。

细胞内钙流检测：利用动态图像显微系统测定趋化因子与受体作用后细胞内钙浓度变化，以证实受体活性。细胞在盖玻片生长4天，承载含有4mM Fura-2AM的PBS37℃孵育1小时。冲洗后，加以RANTES、MIP-1α或MIP－β（10nM，100nM或1000nM）刺激。每两秒钟记录一次荧光影像并根据340nm及380nm荧光强度比值计算细胞内Ca浓度。

趋化因子诱导BV-2细胞产生NO及ROS：RANTES、MIP-1α或MIP－β（10nM，100nM或1000nM）刺激BV－2细胞3－5天后，测定上清中NO及ROS（O₂ ^·－）含量。

测定NO含量：采用Griess法。100μl上清液与100μl Griess试剂混合，25℃反应15分钟后形成有色物质，利用ELISA读板仪测定570nm波长处的吸收率。NO水平表示为氮浓度并由氮化钠的标准曲线计算得来。

测定ROS浓度：小胶质细胞产生的超氧化物由超氧化物歧化酶（SOD）抑制性细胞色素C减少法测定。小胶质细胞（1×10⁵）在24孔板内与0.5ml含有细胞色素C（80μl）及N－formyl－methionyl－leucyl－phenylalanine（fMLP；0.5μM）的HBSS37℃孵育足够长的时间。超氧化物歧化酶（10μl，3mg/ml）加入分光光度仪对照孔中，550nm波长测定减少的细胞色素C（摩尔萃灭效率，21,000M^-1cm^－1）。

观察活化的BV-2细胞对661W感光细胞的毒性作用：将趋化因子诱导活化的BV-2细胞上清加入661W细胞中，观察细胞的凋亡（TUNEL法）。TUNEL试剂盒商购于Roche公司。

2）观察β趋化因子对661W感光细胞系的刺激作用

661W细胞是能被多种感光细胞标记物标记的永久性小鼠感光细胞系。预实验显示，正常小鼠感光细胞无CCR1表达。通常情况下，在含有10％小牛血清和1％的青霉素/链霉素的DMEM全培养基内生长，环境条件为37℃、5％CO₂和95％空气。

免疫荧光染色证实661W细胞表达CCR1。

细胞内钙流检测：RANTES、MIP-1α或MCP－3（10nM，100nM或1000nM）直接刺激661W感光细胞。检测方法同前。

细胞内生成ROS检测：661W感光细胞贴壁和扩散后给予RANTES、MIP-1α或MCP－3（10nM，100nM或1000nM）2-5天。细胞内产生ROS通过双氯荧光乙酰乙酸染料（DCFH/DA）测定。661W感光细胞在室温下承载DCF染料（10μmol/L）15分钟。细胞内ROS由荧光测定，激发/发射波长为480nm/520nm。

采用TUNEL法观察细胞凋亡情况。

体内试验结果表明：在rd小鼠视网膜变性过程中，小胶质细胞中的NADPH氧化酶（gp^91phox为其主要亚单位）表达明显增加，且部分与CCR5共定位（图7）。一氧化氮合酶（iNOS）在外核层的表达亦增加，但未发现其与CCR1的对应关系（图8）。NADPH氧化酶与iNOS的活化表达在时间与空间上皆与感光细胞凋亡一致。该结果提示，NADPH氧化酶与iNOS的活化均参与了视网膜变性的发展，其中，NADPH氧化酶的活化与CCR5的激活密切相关。

体外试验结果显示：β趋化因子刺激BV－2小胶质细胞（表达CCR5）可产生细胞内钙流（图11），引起上清中ROS及NO升高（表2）并导致661W感光细胞凋亡加剧（32%凋亡细胞，图12A-F）。β趋化因子直接刺激661W细胞未引起钙流、细胞内ROS产生及细胞凋亡。

实施例3met－RANTES在体内及体外对感光细胞的保护及对视网膜变性的治疗作用研究

1、met－RANTES在体内对感光细胞的保护及对视网膜变性的治疗作用研究

1）全身给药

鉴于文献6证实rd小鼠出生8天为β趋化因子表达起始期，本实施例选用出生后第7天的rd小鼠比较研究腹腔内注射met－RANTES的PBS溶液对感光细胞的保护作用及其对视网膜变性的治疗作用。

实验设置对照组和治疗组，每组为6只出生后第7天的rd小鼠。其中，对照组腹腔注射0.2ml PBS；治疗组腹腔注射0.2ml met－RANTES的PBS溶液，注射剂量为0.05mg/kg/day。每组每天注射1次，连续注射5－8天。

2）眼玻璃体腔注射

实验设置对照组和治疗组，每组为6只出生后第7天的rd小鼠。其中，对照组眼玻璃体腔内注射1μl PBS；治疗组眼玻璃体腔内注射1μl met－RANTES的PBS溶液，met-RANTES的注射量为0.7μg。注射一次即可。

体内抑制试验结果表明：与对侧对照眼相比，眼玻璃体腔注射met－RANTES可显著减轻/延缓感光细胞的凋亡（图9），而全身（腹腔）注射met－RANTES则没有显示met－RANTES减轻/延缓感光细胞凋亡作用的效果。

2、met－RANTES在体外对感光细胞的保护及对视网膜变性的治疗作用研究

抑制实验：加入趋化因子前，对661W感光细胞给予50nmol/ml的met－RANTES，观察661W细胞内Ca浓度变化、细胞内ROS的产生及细胞成活情况。

阴性对照：用空白PBS刺激BV-2细胞或661W感光细胞，观察细胞内Ca浓度变化、细胞内ROS的产生及细胞成活情况。

表2met-RANTES体外对β趋化因子刺激BV－2细胞释放ROS及NO的影响

由表2可见，与对照组相比，β趋化因子（包括RANTES、MIP－1α及MIP－1β）刺激BV-2细胞释放的ROS及NO明显增加（P<0.01）；在加入β趋化因子（RANTES、MIP－1α及MIP－1β）之前，加入met-RANTES，BV-2细胞释放的ROS及NO明显减少（P<0.05）。前述结果显示，met－RANTES对BV-2细胞活化具有抑制作用，使其释放的ROS及NO减少；图13显示，met－RANTES可显著抑制661W感光细胞的凋亡，使661W感光细胞的凋亡减少35-47%，表现出对661W感光细胞的保护作用。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京同仁医院

<120> met-RANTES在制备治疗遗传性视网膜变性药物中的应用

<160> 19 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile

1 5 10 15

Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser

20 25 30

Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg

35 40 45

Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn

50 55 60

Ser Leu Glu Met Ser

65

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagaagagaa tgaggagaca gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actgtctcct cattctcttc tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atccttggga atgagtaact g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacccaaagt aagaaccact g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcaggaatc attaaaactc tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctttgagagc atcagcattg 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctatggatgt gcctgact 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagtcctca tactcagcc 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgggcatgg gtcagaag 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taatgtcacg cacgatttcc 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagtgcccag taccaaagt 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccacaagcat tgaatagcc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aggccaaccg tgaaaagatg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tggcgtgagg gagagcatag 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgacccgtcc acagtatgt 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tacagttccg agcgtcaaag 20

Claims

1.一种β趋化因子受体抑制剂或者包含所述受体抑制剂的组合物在制备治疗遗传性视网膜变性的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体抑制剂为眼玻璃体腔内注射给药。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β化因子受体抑制剂选自met-RANTES。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体选自CCR1、CCR2、CCR3、CCR5的任一种或其组合，优选为CCR1、CCR5的任一种或其组合。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是保护感光细胞的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的保护感光细胞是指减轻或延缓感光细胞凋亡。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体抑制剂为眼玻璃体腔内注射给药。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述的β趋化因子受体抑制剂选自met-RANTES。