PL185305B1 - Pochodne aza-antracyklinonowe - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne aza-antracyklinonowe, ich stosowanie w leczeniu skrobiawicy, sposoby ich wytwarzania oraz kompozycje farmaceutyczne zawierające te pochodne.

Związek skrobiawicy ze śmiercią komórek i utrata funkcji tkanek wydaje się być istotnym w różnego rodzaju zaburzeniach, w tym neurodegeneratywnych. Dlatego też zapobieganie powstawaniu amyloidu i/lub indukcja degradacji amyloidu może być ważnym narzędziem terapeutycznym we wszystkich zaburzeniach patologicznych związanych ze skrobiawicą, w tym skrobiawicą AL oraz zaburzeniami neurodegeneratywnymi typu Alzheimera.

Przedmiotem wynalazku sąnowe aza-antracyklinony i ich stosowanie w leczeniu skrobiawicy. Cechą charakterystyczną nowych związków jest obecność mostkowanego pierścienia heterocyklicznego, skondensowanego z układem antrachinonowym.

Nowa klasa cząsteczek nazwana jest związkami antrazalinonowymi, a związek macierzysty, nazwany antrazalonem, można uważać za pokrewny związkom 8-aza-antracyklinonowym.

antrazolon

185 305

Przedmiotem wynalazku jest pochodna antrazalinonowa o wzorze 1:

w którym:

- X, oraz X₂ oba oznaczają C=O;

- X₂ wybiera się spośród grup: ch₂,

C=O,

CHOH,

C=N(R₉), gdzie R oznacza grupę hydroksy lub aminoarylową;

- R,, R2 oraz R₃ każdy oznacza atom wodoru; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę C1₁₆alkoksylową;

- R5 oraz R_g wybiera się niezależnie spośród: atomu wodoru, grupy hydroksylowej;

- R6 wybiera się spośród: atomów wodoru, grupy R_b-CH2-, gdzie R_B oznacza grupę arylową lub heterocyklilową,

C2-₈alkenylowej,

C₃-₈cykloalkilowej; oraz

- R₇ wybiera się spośród: atomów wodoru, grupy metylowej;

lub jej dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Korzystnymi związkami o wzorze 1 są te, w których:

- X, oraz X₂ oba oznaczają C=O;

- X₃ wybiera się spośród grup:

CH2,

C=O,

CHOH oraz

C=N(Rg), gdzie Rg oznacza grupę hydroksy lub aminoarylową;

- R,, R2 oraz R3 każdy oznacza atom wodoru; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę C, ,₄alkoksylową;

- R₅ oraz R₈ wybiera się niezależnie spośród: atomu wodoru, grupy hydroksylowej;

- R₆ wybiera się spośród: atomów wodoru;

grupy RB-CH2-, gdzie Rb zdefiniowano wyżej, grupy C2-₆alkenylowej; oraz

- R7 wybiera się spośród atomów wodoru, grupy metylowej;

Szczególnie korzystnymi związkami o wzorze 1 są związki, w których:

- X, oraz X2 oba oznaczają C=O,

185 305

- X₃ wybiera się spośród grup: ch₂,

C=O,

CHOH;

- R,, R₂ oraz R₃ każdy oznacza atom wodoru; a R₄ oznacza atom wodoru lub grupę metoksylową;

- R₅ oraz R₈ wybiera się niezależnie spośród: atomu wodoru, grupy hydroksylowej;

- R₆ wybiera się spośród: atomów wodoru, grupy benzylowej, allilowej,

3,4-dimetoksybenzylowej, pirydynometylowej, (N-metylo-dihydropirydyno)-metylowej, nikotylowej; oraz

- R₇ wybiera się spośród atomów wodoru, grupy metylowej.

Najkorzystniejszymi związkami o wzorze 1 są te związki, w których:

- X, oraz Χ2 oba oznaczają C=O;

- Χ3 oznacza C=O;

- R,, R2 oraz R3 każdy oznacza atom wodoru; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę metoksylowąj

- R₅ oraz R₈ każdy niezależnie wybiera się spośród atomów wodoru, grupy hydroksylowej, metoksylowej lub aminowej;

- Rg wybiera się spośród atomów wodoru, grupy pirydynometylowej, (N-metylodihydropirydyno)-metylowej, nikotylowej, glicylowej i izoleucylowej; oraz

- R7 oznacza grupę metylową.

Grupa „alkilowa” jest z reguły grupą C_rC,₆alkilową.

Grupa C,-C₁₆alkilowa zawiera grupy alkilowe zarówno o łańcuchach prostych jak i rozgałęzionych.

Korzystnie grupą G-C^alkilowąjest grupa G-C^alkilowa taka jak heksylową, izoheksylowa, heptylowa, oktylowa, nonylowa, decylowa, undecylowa i dodecylowa lub ich izomery o łańcuchach rozgałęzionych.

Korzystnie grupąC, -C^alkilowąjest grupa CpCgalkilowa lub Ci-C₃alkilowa, takajak metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa; t-butylowa; izobutylowa lub pentylowa; lub ich izomery o łańcuchach rozgałęzionych. Omawiane powyżej grupy alkilowe mogą być podstawione jednym lub wieloma podstawnikami; na przykład podstawnikiem chlorowcowym, takim jak fluor, chlor, brom lub jod, grupa CF₃, podstawnikiem alkoksylowym, arylowym, alkiloarylowym, chlorowcoarylowym, cykloalkilowym lub alkilocykloalkilowym.

Stosowany tutaj termin „alkenyl” oznacza podstawniki zarówno o łańcuchach prostych, jak i rozgałęzionych, zawierających do 8 atomów węgla lub przykładowo grupę allilową, butenylową, heksenylową, oktenylową.

Termin „cykloalkil” oznacza grupę cykloalkilową, zawierającą 3 do 8 atomów węgla, korzystnie od 3 do 5 atomów węgla. Przykładami są grupy cyklopropylową, cyklopentylowa, cyklopentylometylowa, cykloheptylowa i cyklooktylowa.

Grupę heterocyklilową stanowi nasycony lub nienasycony pierścień heterocyklilowy 3 do 6 członowy, na przykład 3,4,5 lub 6 członowy, zawierający przynajmniej jeden heteroatom wybrany spośród atomów O, S i N, który jest ewentualnie skondensowany z drugą 5 do 6 członową, nasyconą lub nienasyconą grupą heterocyklilową lub z wymienioną grupą cykloalkilową lub arylowa,

185 305 zdefiniowań aponiżej. Przykładami grup heterocyklilowych są grupa pirolilowa, imidazolilowa, triazolilowa, tetrazolilowa, oksazolilowa, tiazolilowa, tiadiazolilowa, tienylowa, pirydynylowa, dihydropirydynylowa, piperydynylowa, piperazynylowa, pirazynylowa, pirymidynylowa, piranylowa, pirydazynylowa, furanylowa, pirazolilowa, izotiazolilowa, izoksazolilowa, morfolinylowa, tiopiranylowa, benzotienylowa, benzotiazolilowa lub grupa benzoksazolilowa.

Grupy te mogą być podstawione grupami hydroksylowymi, aminowymi pierwszo-, drugolub trzeciorzędowymi, gdzie podstawnikami w grupach aminowych drugo- i trzeciorzędowych są, na przykład grupy Cj-C₁₂alkilowe o łańcuchach prostych lub rozgałęzionych, grupy fenylowe, benzylowe, alkoksylowe, fenoksylowe lub benzyloksylowe albo atomy chlorowca.

Stosowany tutaj termin „aryl” oznacza aromatyczne grupy zarówno monocykliczne lub bicykliczne, zawierające od 6 do 10 atomów węgla w części pierścieniowej, takie jak grupa fenylowa, naftylowa, podstawiona fenylowa lub podstawiona naftylowa; gdzie podstawnikiem albo na grupie fenylowej albo na naftylowej może być na przykład grupa C_rC₆alkilowa, atom chlorowca lub grupa C_rC₆alkoksylowa.

Stosowany tutaj termin „chlorowiec” oznacza atomy fluoru, chloru, bromu i jodu.

Termin „aryloalkilo” oznacza grupy alkilowe, zdefiniowane uprzednio, mające zdefiniowany powyżej podstawnik arylowy, na przykład benzylowy, 3,4-dimetoksybenzylowy, fenyloetylowy, difenylometylowy i trifenylometylowy.

Termin „aroilo” oznacza grupę o wzorze -COAr, gdzie Ar oznacza grupę „arylową”, zdefiniowaną uprzednio.

Termin „alkoksy” lub „aryloksy” obejmuje każdą z powyższych grup alkilowych lub aryloalkilowych przyłączonych do atomu tlenu.

Termin „alkoksyalkilo”, oznacza każdą z uprzednio zdefiniowanych grup alkilowych, przyłączoną do dowolnej grupy alkoksylowej, zdefiniowanej uprzednio, na przykład grupę etoksypropylową.

Termin „aryloksyalkilo” oznacza każdą z uprzednio zdefiniowanych grup alkilowych, przyłączonych przez atom tlenu do grupy arylowej, zdefiniowanej powyżej, na przykład grupę fenoksyetylową.

Termin „araloksyalkilo” oznacza uprzednio zdefiniowaną grupę aryloalkilową, przyłączoną przez atom tlenu do zdefiniowanej powyżej grupy alkilowej, na przykład grupę benzyloksyetylową.

Termin „acyloksyalkilo” oznacza grupę C_rC|₍₎acylową, przyłączoną przez atom tlenu do grupy alkilowej, zdefiniowanej powyżej, na przykład grupę acetoksymetylową.

Termin „hydroksyalkilo” oznacza zdefiniowanąuprzednio grupę alkilową, przyłączoną do grupy hydroksylowej, na przykład grupę hydroksyetylową.

Grupą acylową jest typowo grupa C(-C_wacylowa, na przykład grupa C(-C6acylowa, taka jak metanoilowa, etanoilowa, n-propanoilowa, i-propanoilowa, n-butanoilowa, sec-butanoilowa, pentanoilowa lub heksanoilowa.

Wynalazek obejmuje również wszystkie możliwe izomery związków o wzorze (1) i ich mieszaniny, na przykład mieszaniny diastereoizomeryczne i racemiczne. Tak więc, optycznie aktywne centra w pozycjach 7 i 9 mogą być w konfiguracji R lub S (lub obu; tj. mamy do czynienia z mieszaninąstereoizomerów). Podobnie wiązanie glikozydowe w cukrze może być w konfiguracji α lub β (lub obu, tj. mamy do czynienia z mieszaniną stereoizomerów). Przedmiotem wynalazku są również sole tych związków o wzorze 1, które mają podstawniki tworzące sole, zwłaszcza sole związków mających grupę karboksylową lub zasadową (np. grupę aminową). Typowo solami są tolerowalne fizjologicznie lub dopuszczalne farmaceutycznie sole, na przykład sole metali alkalicznych i ziem alkalicznych (np. sodu, potasu, litu, wapnia i magnezu), sole amoniowe i sole z odpowiednią aminą organiczną, lub aminokwasem (np. argininą, prokainą) oraz sole addycyjne, utworzone z odpowiednimi kwasami organicznymi lub nieorganicznymi, na przykład kwasem solnym, siarkowym, kwasami karboksylowymi i sulfonowymi (np. octowym, trifluorooctowym, p-toluenosulfonowym).

Z_wią_zki o wzorze 1, w którym R oznacza grupę R_B-CH₂, wytworzyć można przez: a) reakcję związku o wzorze 2

185 305

R. R_ą W

5 gdzie X,, X₂ oraz R, do R7 mają, znaczenia podane powyżej, a W oznacza grupę opuszczającą, z aminą o wzorze

H₂N-CHi-Rb gdzie Rb zdefiniowano powyżej; z utworzeniem związku o wzorze 1, gdzie Rg oznacza Rb-CH₂-;

(b) jeżeli trzeba, przekształcając tak otrzymany związek o wzorze (1) w inny związek o wzorze (1); i/lub (c) jeżeli trzeba, przekształcając związek o wzorze (1) w jego dopuszczalną farmaceutycznie sól.

Odpowiednimi grupami W sąO-sacharydy, takie jak pochodne O-daunozaminylowe, grupy O-acylowe, jak na przykład O-trifluoroacetylowa lub O-(p-nitrobenzoilowa) lub O-etoksykarbonylowa, grupy O-acetalowe, jak O-THP. Korzystnymi aminami o wzorze NH2-CH2-RB są aminy alkiloarylowe, na przykład benzyloamina, 3,4-dimetoksybenzyloamina lub pirydynometyloamina.

Związek o wzorze 2 typowo poddaje się reakcji z aminą o wzorze H2N-CH2RB, podanym powyżej. Amina jest z reguły obecna w 1 do 10-krotnym nadmiarze. Reakcja może przebiegać w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, takim jak chlorek metylenu lub pirydyna. Obecna może być zasada organiczna, taka jak pirydyna. Reakcję prowadzić można przez czas od 6 do 48 godzin, typowo w temperaturze od -10°C do pokojowej (tj. około 20°C). Korzystnie stosuje się czterokrotny nadmiar aminy o wzorze H2N-CH2RB. Najbardziej typowym rozpuszczalnikiem jest pirydyna. Korzystnymi warunkami reakcji są temperatura pokojowa przez czas od 12 do 24 godzin.

Należy podkreślić, że reakcja ta jest nową w dziedzinie chemii związków antracyklinowych i antracyklinonowych.

Pochodne antrazalinonowe, w których R6 oznacza atom wodoru, wytwarzać można, na przykład przez odblokowanie odpowiedniej pochodnej N-CH₂R'b, gdzie R'b oznacza grupę

3,4-dimetoksyfenylowąlub winylową. Odblokowanie uzyskuje się typowo przez utlenianie, na przykład przez traktowanie 5,6-dicyjano-1,4-benzochinonem (DQQ). Reakcję prowadzić można w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika. Korzystnie stosuje się równoważnikową ilość DDQ. Korzystnie rozpuszczalnik jest mieszaniną chlorku metylenu i wody (typowo w stosunku objętościowym 20:1). Reakcję prowadzi się typowo w temperaturze pokojowej przez czas od 1 do 6 godzin.

Pochodne antrazalinonowe o wzorze 1 można dalej przekształcać do 8-N-podstawionych pochodnych za pomocą standardowych procedur chemicznych. Na przykład korzystnie wytwarza się 8-N-alkilo, -alkenylo, -cykloalkilo antrazalinony o wzorze 1 w reakcji związku o wzorze 1, w którym R6 oznacza atom wodoru, z grupą o wzorze Rg-X₅ gdzie R6 oznacza grupę C₂-C₈alkenylową lub CR-C^cykloalkilową, a X oznacza grupę opuszczającą, taka jak atom chlorowca, O-SO2CH3, O-SO2CF3 lub O-SO2-C6H4CH3. Korzystnie, gdy X oznacza atom chlorowca. Korzystniej, gdy X oznacza atom jodu. Obecnym może być odpowiedni rozpuszczalnik. Korzystnie stosuje się 2 do 20-krotny nadmiar R6-X. Korzystnie reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chlorek metylenu lub dimetyloformamid. Reakcję typowo prowadzi się w temperaturze od 40 do 80°C, przez od 4 do 24 godzin.

185 305

Również grupę C-13-karbonylową można redukować do grupy C-13-dihydro lub przekształcić w hydrazon i następnie redukować z uzyskaniem pochodnych C-13-dezokso, stosując procedury znane z chemii związków antracyklinowych. Na przykład, w celu wytworzenia pochodnych C-13-dihydro o wzorze 1, poddaje się reakcji antrazalinon o wzorze 1 (X₃=CO) z czynnikiem redukującym w rozpuszczalniku organicznym w temperaturze od -10°C do pokojowej przez 5 do 30 minut.

Korzystne warunki obejmują rozpuszczenie aglikonu o wzorze 1 zdefiniowanego uprzednio w suchym chlorku metylenu i traktowaniu go 5 do 10-krotnym nadmiarem borowodorku tetrabutyloamoniowego w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

Związki o wzorze 1 dostępne są z surowców naturalnych lub można wytwarzać je z wykorzystaniem znanych metod syntezy, wychodząc ze znanych antracyklin lub antracyklinonów. Na przykład, 7-O-sacharyd, w którym cukier oznacza daunozaminyl, otrzymać można z surowca naturalnego, takiegojak daunorubicyna lub wytworzyć można za pomocą syntetycznego jej modyfikowania.

Inne aglikony, funkcjonalizowane w pozycji C-7 wytworzyć można za pomocą dobrze znanych procedur.

Na przykład: pochodne 7-O-THP związku o wzorze 2 (związki, w których W oznacza O-THP) wytwarza się łatwo w reakcji aglikonu o wzorze 3:

z dihydropiranem w rozpuszczalniku organicznym i w obecności katalizatora kwasowego, w temperaturze pokojowej przez 1 do 4 godzin.

Korzystnie związek o wzorze 3 rozpuszcza się w chlorku metylenu i reaguje z 4 równoważnikami dihydropiranu w obecności katalitycznej ilości kwasu p-toluenosulfonowego w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Pochodną 7-O-THP odzyskuje się przez płukanie mieszaniny reakcyjnej wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu i wodą, po czym usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem.

7-0-Acylowe pochodne związku o wzorze 2 wytwarza się w reakcji związku o wzorze 3 z odpowiednim kwasem karboksylowym, bezwodnikiem kwasowym lub chlorkiem kwasowym w rozpuszczalniku organicznym w obecności zasady, w temperaturze od -10°C do pokojowej przez 1 do 6 godzin.

Na przykład pochodną 7-O-acetylową o wzorze 2 (W=O-COCH₃) wytwarza się w reakcji związku o wzorze 3 z bezwodnikiem octowym w rozpuszczalniku organicznym, takimjak chlorek metylenu w obecności zasady organicznej, takiej jak pirydyna.

Związek odzyskuje się przez wytrącanie surowego produktu w rozpuszczalniku apolamym, takim jak heksan.

Niektóre z substancji wyjściowych do wytwarzania związków o wzorze 1 są znane, inne można analogicznie wytworzyć, wychodząc ze znanych związków antracyklinowych lub antracyklinonowych, z zastosowaniem znanych procedur. Na przykład następujące znane związki antracyklinowe można przedstawić tym samym wzorem 2:

daunorubicyna (2a: R,=R₂=R₃=Tł, R₄=OCH₃, R₅=R₈=OH, X,=X₂=CO, R₇=CH₃, L=O-daunozaminyl), doksorubicyna (2b: R,=R₂=R₃=H; R₄=OCH₃, R₅=R₈=OH, X₁=X₂=CO, R₇=CH₂OH, L=O-daunozaminyl),

185 305

4-demetoksydaunorubicyna (2c: R,=R2=R3=R4=H, R₅=R₈=OH, X,=X2=CO, R₇=CH3, L=O-daunozaminyl),

11-dezoksy daunorubicyna (2d: R,=R2=R3=H, R4=OCH₃, R5=OH, R₈=H, X,=X2=CO, R7=CH₃, L=O-daunozaminyl),

11-aminodaunorubicyna (2e: Ri=R₂=R3=H, R4=OCH3, R5=OH, R8=NH2, X,=X₂=CO, R7=CH3, L=O-daunozaminyl),

6-dezoksydaunorubicyna (2f: Rf=R2=R3=H, R4=OCH3, R5=H, R8=OH, X1=X2=CO, R7=CH3, L=O-daunozaminyl),

6-aminodaunorubicyna (2g: R1=R2=R₃=H; R4=OCH₃, R₅=OH; R8=NH2, X1=X₂=CO, R7=CH3, L=O-daunozaminyl),

4-aminodaunorubicyna (2h: R₁=R2=R3=H, R4=NH2, R5=R8=OH, X1=X2=CO, R₇=CH₃, L=O-daunozaminyl),

9-deacetylo-9-formylo-N-trifluoroacetylodaunorubicyna (2i: R1=R₂=R₃=H, R4=OCH3, R₅=R8=OH, X1=X2=CO; R₇=H, L=O-(N-trifiuoroacetylodaunozaminyl).

Znane są również niektóre 7-O-pochodne o wzorze 2, na przykład 7-O-etoksykarbonylodaunomycynon (2j : R1=R2=R3=H, R4=OCH3, R5=R₈=OH, X1=X₂=CO; R7=CH3, L=O-CoOC₂H₅), 7-O-(tetrahydropiranylo)daunomycynon (2k: R1=R₂=R3=H, R4=oCh3, R5=R₈-OH, X1=X2=CO, R7-CH3, L=O-THP), 7-O-acetylodaunomycynon (21: R1=R₂=R3=H, R4=OCH3, R5=R8=OH, X1=X₂=CO, R7=CH3, L=O-COCH3).

Związki według wynalazku charakteryzują się wysoką aktywnością inhibitorową w stosunku do skrobiawicy. Dlatego przedmiotem wynalazku jest stosowanie zdefiniowanych powyżej związków o wzorze 1 lub ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli w traktowaniu skrobiawicy.

Tak więc traktować można człowieka lub zwierzę, np. ssaka, sposobem, polegającym na podaniu mu związku o wzorze (1) lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Termin skrobiawica obejmuje różne schorzenia, których wspólną cechąjest tendencja pewnych protein do agregacji i wytrącania się w postaci nierozpuszczalnych włókien w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co powoduje uszkodzenie struktury i funkcji organu i tkanek. Klasyfikacja amyloidów i skrobiawicy była ostatnio dyskutowana w Bulletin of the World Health Organisation 71(1): 105 (1993).

Wszystkie różne typy amyloidów posiadaj ątę samąultrastrukturalnąorganizację antyrównoległych β-płytek; niezależnie od tego, że składają się z różnych bardzo zróżnicowanych podjednostek białkowych [patrz: Glenner G.G., New England J. Med. 302(23): 128-38 1980)]. Skrobiawica AL wywoływana jest przez szczególne monoklonalne lekkie łańcuchy immunoglobuliny, tworzące włókna amyloidowe. Te monoklonalne lekkie łańcuchy produkowane sąprzez monoklonalne komórki plazmatyczne z niskim współczynnikiem mitotycznym, który odpowiada za ich dobrze znanąodpomość na chemioterapię. Złośliwość tych komórek polega na ich aktywności w syntezie białek.

Kliniczny przebieg choroby zależy od selektywności zaatakowanego organu; prognoza może być skrajnie niekorzystna w przypadku naciekania serca (mediana przeżycia< 12 miesięcy) lub bardziej łagodna w przypadku zaatakowania nerek (mediana przeżycia około 5 lat). Biorąc pod uwagę względną oporność złogów amyloidogenicznych na trawienie proteolityczne, wydaje się, że dla pacjentów ze skrobiawicą AL jedyną rozsądną nadziejąjest molekuła, która może zablokować lub spowolnić tworzenie amyloidu i zwiększyć rozpuszczalność istniejących złogów amyloidowych. Ponadto, ponieważ supermolekulama organizacja włókien amyloidowych jest identyczna dla wszystkich typów skrobiawicy, dostępność leku, który oddziałuje na powstawanie amyloidu i zwiększa rozpuszczalność istniejących złogów, zezwalając na oczyszczenie za pomocą normalnych mechanizmów, może być bardzo korzystna dla wszystkich rodzajów skrobiawicy, a zwłaszcza w traktowaniu choroby Alzheimera.

I rzeczywiście, główną patologiczną cechą choroby Alzheimera (AD), zespołu Downa, otępienia pugilistycznego i amyloidowej angiopatii mózgowej jest osadzanie amyloidu w miąższu mózgu i ścianach naczyń. Znaczniki te związane sąz zanikiem komórek nerwowych w korze mózgowej, obszarach limbicznych i w jądrach podkorowych. W kilku pracach wykazano, że selektywne

185 305 uszkodzenie różnych systemów neuronowych i zanik połączeń synaptycznych w przedniej części kory mózgowej związany jest z obniżeniem zdolności pojmowania. Patogeneza i podstawy molekularne neurodegeneratywnych procesów w chorobie Alzheimera nie są znane, ale rola β-amyloidu osadzonego w miąższu mózgu i ścianach komórek była pokazana w ostatnim raporcie dotyczącym jego aktywności neurotoksycznej w badaniach in vitro i in vivo (Yanker i in. Science, 245: 417,1990; Kowali i in. PNAS, 88: 7247,1991). Ponadto segregacja znanej AD za pomocą genu amyloidowego prekursora protein (APP) spowodowała wzrost zainteresowania potencjalnąpatogenetycznąrolą P-amyloidu w AD [Mullan M. i in. TINS, 16(10): 392 (1993)]. Neurotoksyczność β-amyloidu wiązana jest z fibrylogenicznymi właściwościami proteiny. Badania homologicznych peptydów syntetycznych wskazują, że komórki hipokampa były niewrażliwe na działanie świeżego roztworu β1-42 przez 24 godziny, podczas gdy ich żywotność obniżyła się, gdy neurony poddano działaniu A β1 -42, przechowywanego uprzednio w roztworze soli fizjologicznej przez 2-4 dni w 37°C w celu ułatwienia agregacji peptydów. Związek między włóknami i neurotoksycznościąjest dalej potwierdzony przez ostatnie doniesienia wskazujące, że rozpuszczalna postać β-amyloidu wytwarzana jest in vivo i in vitro podczas normalnego metabolizmu komórek (Hass i in. Nature, 359,322,1993) i tylko wtedy, gdy agreguje on w strukturach wybarwiających się czerwienią Kongo wiązana jest z dystrofią neurytów. Z drugiej strony nie wybarwiające się czerwienią Kongo, „preamyloidalne” tworzenie p-amyloidu nie było wiązane ze zmianami neuronów. (Tagliavini i in. Neurosci. Lett. 93: 191, 1988).

Neurotoksyczność β-amyloidu była również potwierdzona z zastosowaniem homologowego peptydowego fragmentu β-amyloidowego 25-35 (β25-35), który zachowywał samoagregujące właściwości całkowitego fragmentu β-amyloidu β1-42.

Chroniczne, ale nie ostre poddanie neuronów hipokampa działaniu mikromolowych stężeń P25-35 indukowało śmierć neuronów w wyniku aktywacji mechanizmu programowanej śmierci komórek, znanego jako apoptoza (Forloni i in. NeuroReport, 4:523; 1993). I znów neurotoksyczność wiązana była z właściwością samoagregacji p25-35.

Inne zaburzenia neurodegeneratywne, takie jak encefalopatia gąbczasta (SE) charakteryzują się śmiercią neuronów i zewnątrzkomórkowymi złogami amyloidu, w tym przypadku pochodzącymi od proteiny Prion (PrP). Analogicznie do obserwacji neurotoksyczności β-amyloidu, badano wpływ syntetycznych peptydów, homologicznych z różnymi segmentami PrP na żywotność pierwszorzędowych neuronów hipokampa szczurów. Chroniczne podawanie peptydu odpowiadającego PrP 106-126 indukowało śmierć neuronów przez apoptozę, podczas gdy w tych samych warunkach wszystkie inne badane peptydy oraz rozbita sekwencja PrP 106-126 nie zmniejszały żywotności komórek (Forloni i in., Nature 362:543). PrP jest wysoce fibrylogenne in vitro i agregat peptydowy wybarwiony czerwienią Kongo wykazuje zieloną dwójłomność optyczną, wskazującą na β-płytkową konformację, charakterystyczną dla amyloidu.

Związki według wynalazku stosować można do wytworzenia lekarstw użytecznych w zapobieganiu lub zatrzymywaniu postępu chorób spowodowanych proteinami amyloidowymi, takich jak skrobiawica , AL, choroba Alzheimera lub zespół Downa.

Związki według wynalazku badano według standardowych procedur pod względem ich właściwej cytotoksyczności na kulturach komórek PC 12.

Stwierdzono, że wszystkie związki nie są cytotoksyczne do stężenia 10 mM.

Wynalazek obejmuje również swoim zakresem kompozycje farmaceutyczne zawierające jeden lub więcej związków o wzorze (1) jako składniki aktywne, w połączeniu z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami, zarobkami lub innymi dodatkami, w zależności od potrzeb.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające związek o wzorze 1 lub jego sole, wytworzyć można w sposób konwencjonalny z wykorzystaniem typowych nietoksycznych nośników lub rozcieńczaczy farmaceutycznych w różnych postaciach dawek i drogach podawania.

W szczególności związki o wzorze 1 podawane być mogą:

185 305

A) doustnie, na przykład w pdstaci tabletekb kcdkc^ków, k^aWylek do ss arna, aawiesin wodnych lub oleistych, proszków zawiesinowych lub granulek, emulsji, kapsułek twardych lub miękkich albo syropów lub eliksirów.

Kompozycje przeznaczone do stosowania doustnego wytwarzać można według każdej z metod znanych fachowcom w dziedzinie wytwarzania kompozycji farmaceutycznych i kompozycje te mogą zawierać jeden lub więcej środków wybranych spośród środków słodzących, smakowych, barwiących i konserwujących, w celu uzyskania preparatów farmaceutycznie eleganckich i smacznych.

Tabletki zawierają składnik aktywny w domieszce z nietoksycznymi dopuszczalnymi farmaceutycznie zarobkami, odpowiednimi do wytwarzania tabletek. Zarobkami tymi mogą być na przykład, bierne rozcieńczacze, takie jak węglan wapnia, węglan sodu, laktoza, fosforan wapnia lub fosforan sodu; środki granulujące i rozpraszające, na przykład skrobia kukurydziana lub kwas alginowy; środki wiążące, na przykład skrobia kukurydziana, żelatyna lub guma arabska oraz środki smarujące, na przykład stearynian magnezu lub kwas stearynowy lub talk. Tabletki mogą być niepokryCe lub pokryte znanymi technikami, w celu opóźnienia dezintegracji i absorpcji w drogach pokarmowych, dając w ten sposób przedłużone w czasie działanie. Np przykład, jako opóźniający materiał można stosować menestekrynikn gliceryny lub distearynión gliceryny.

Preparaty do doustnego stosowania mogą występować w postaci twardych kapsułek żelatynowych, gdzie składnik aktywny zmieszany jest z biernym stałym rozcieńczaczem, na przykład węglanem wapnia, fosforanem wapnia lub kaolinem, albo w postaci miękkich kapsułek żelatynowych, gdzie składnik aktywny zmieszany jest z wodą lub olejem, na przykład olejem z orzeszków ziemnych, ciekłą parafiną lub oliwą z oliwek. Zawiesiny wodne zawierają składniki aktywne w domieszce z zarobkami odpowiednimi do wytwarzania zawiesin wodnych.

Zarobkami takimi są środki zawieszające, na przykład karboksymptylocplulozk sodowa, metyloceluloza, hydroksyeropylomeCyloceluloza, k^inikn sodu, poliwinylopirolidon, guma trpgakanCowa i guma arabska; środkami dyspergującymi lub zwilżającymi mogą być występujące naturalnie fosfótydy, na przykład lecytyna lub produkty kondensacji tlenku alkilenu z kwasami tłuszczowymi, na przykład stearynian poliokseetylpnowy lub produkty kondensacji tlenku etylenu z alkoholami alifatycznymi o długich łańcuchach; np przykład heetkdekaρtylenoksycetanel lub produkty kondensacji tlenku etylenu z częściowymi estrami, pochodnymi kwasów tłuszczowych i heksytolu, takie jak monoeleinian eelioksyptylpnosorbiColu lub produkty kondensacji tlenku etylenu z częściowymi estrami, pochodnymi kwasów tłuszczowych i bezwodników heksyCelu, na przykład monooleinian polioksyeCylenosorbiCknu. Wymienione zawiesiny zawierać mogą również jeden lub więcej środków konserwujących, na przykład p-hydroksybpnzeρsan etylu lub n-propylu, jeden lub więcej środków barwiących, jeden lub więcej środków smakowych albo jeden lub więcej środków słodzących, takich jak sacharoza lub sacharyna. Zawiesiny olejowe wytwarzać można przez zawieszenie środka aktywnego w oleju roślinnym, na przykład oleju arachidowym, oliwie z oliwek, oleju sezamowym lub oleju kokosowym albo w oleju mineralnym, takim jak ciekła parafina. Zawiesiny olejowe mogą zawierać środek zagęszczający, np przykład wosk pszczeli, parafinę stałą lub alkohol cetylowy. W celu uzyskania smacznego preparatu doustnego dodać można środki słodzące, takie jak wymieniono powyżej oraz środki smakowe. Kompozycje te można konserwować przez dodanie erseciwutleniacza, takiego jak kwas askorbinowy. Proszki zawiesinowe oraz granulki odpowiednie do wytwarzania zawiesiny wodnej przez dodanie wody zawierają składnik aktywny w domieszce ze środkiem dyspergującym lub zwilżającym. Przydatne środki dyspergujące lub zwilżające i środki zawieszające sązebrózewane przez środki wymienione wyżej.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą także mieć postać emulsji olej-w-wodzie. Fazę olejową może stanowić olej roślinny, np przykład oliwa lub olej arachidowy, albo olej mineralny, np przykład ciekła parafina, albo ich mieszaniny. Przydatne środki emulgujące mogą stanowić występujące w przyrodzie gumy, na przykład guma arabska lub guma tragakantowp, występujące w przyrodzie fosfótydy, na przykład lecytyna sojowa, i estry lub częściowe estry pochodzące z kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytolu, na przykład meaeelpiaian sorbitknu

185 305 oraz produkty kondensacji wspomnianych częściowych estrów z tlenkiem etylenu, na przykład monooleinian polioksyetylenosorbitanu. Emulsja może również zawierać środki słodzące i zapachowe. Syropy i eliksiry mogą być przygotowywane ze środkami słodzącymi, na przykład glicerolem, sorbitem lub sacharozą. Takie preparaty mogą również zawierać środek łagodzący, środek konserwujący oraz środki zapachowe i barwiące.

B) pozaj elitowe, albo podskórnie albo dolinie lyb domięśniowo, albo ś ródmostkowo, lub technikami wlewu, w postaci sterylnej zawiesiny wodnej lub olejowej. Kompozycj e farmaceutyczne mogą mieć postać jałowych wodnych lub olejowych zawiesin do zastrzyków.

Taka zawiesina może być przygotowana zgodnie ze stanem techniki, przy użyciu wymienionych wyżej środków dyspergujących lub zwilżających i zawieszających. Jałowym preparatem do zastrzyków może również być sterylny roztwór lub zawiesina do zastrzyków w nietoksycznym, dopuszczalnym do stosowania pozajelitowego rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład w postaci roztworu w 1,3-butanukiolu. Pośród dopuszczalnych nośników i rozpuszczalników, które mogąbyć stosowane, są woda, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo stosuje się zwykle sterylne zestalone oleje jako rozpuszczalnik lub medium zawieszające. Do tego celu stosować można zwykle każdy niedrażniący zestalony olej; w tym syntetyczne mono- lub diglicerydy. Dodatkowo, w preparatyce zastrzyków znajdują zastosowanie kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy.

Wynalazek podaje również sposób zwalczania skrobiawicy i/lub zapobiegania lub zatrzymywania postępu chorób spowodowanych proteinami amyluiduwymi, który to sposób polega na podaniu człowiekowi lub zwierzęciu, np. ssakowi, wymagającemu takiego traktowania; skutecznej terapeutycznie ilości jednego lub więcej związków o wzorze 1.

Dawki dzienne są w zakresie od około 0,1 do około 50 mg na kg wagi ciała, w zależności od aktywności konkretnego związku, wieku, wagi i stanu podmiotu traktowania; typu i ostrości choroby oraz częstości i drogi podawania; korzystnie poziomy dawek dziennych sąw zakresie od 5 mg do 2 g. Ilość składnika aktywnego, który może być połączony z nośnikami z wytworzeniem postaci pojedynczej dawki będzie się zmieniać, w zależności od pacjenta i konkretnego sposobu podawania: Na przykład, preparat mający być podany doustnie może zawierać od 5 mg do 2 g składnika aktywnego w połączeniu z odpowiednią i wygodną ilością nośnika; która może wahać się w granicach od około 5 do około 95 procent całkowitej ilości kompozycji. Postacie dawek jednostkowych z reguły zawierać będą między od okułu 5 mg do około 500 mg składnika aktywnego.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając go.

Przykład 1:

Wytwarzanie 8-N-(3,4-dimetuksydenzylu)-antrazalonu (1a).

Rozpuszcza się daunurubicynę (2a, 1,58 g, 3 mmol) w suchej pirydynie (20 ml), dodaje 3,4-dimetuksybenzyloaminę (2 g, 12 mmol) i utrzymuje w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Następnie dodaje się 1 N HC1 (400 ml) i ekstrahuje chlorkiem metylenu (200 ml). Fazę organiczną płucze się wodą (2x200 ml), suszy nad bezwodnym siarczanem sodu, zatęża do małej objętości pod zmniejszonym ciśnieniem i poddaje chromatografii szybkiej na silikażelu, stosując mieszaninę toluenu i acetonu (9:1 objętościowo) jako system eluujący, uzyskując związek tytułowy la (1 g): TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck), system eluujący: chlorek metylenu: aceton (95:5 objętościowo) Rf=0,56

FAB-MS(+): m/z 530 [MH]+; 380 [M-CH^H^ (OC^)2 + 2H]+;

185 305

'HNMR (400 MHz, CDCI3) 5:

1,43 (s, 3H, CH₃); 2,34 (d, J=17,5 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,66,2,77 (dwa dublety, J=19,4 Hz, 2H, CH2-1O); 2,81 (dd, J=7,3,17,5 Hz, 1H, CH(H)-12); 3,24, 3,79 (dwa dublety, J=12,8 Hz, 2H, N-CH2-Ph); 3,85, 3,86 (2xs, 6H, 2xOCH₃); 4,08 (s, 3H, 4-OCH₃); 4,77 (d, J=7,3 Hz, 1H, H-7); 6,6-6,8 (m, 3H, wodory aromatyczne); 7,38 (d, J=7,6 Hz, 1H, H-3); 7,77 (dd, J=7,6,7,8 Hz, 1H, H-2); 8,03 (d, J=7,8 Hz, 1H, H-1); 13,22 (s, 1H, OH-11); 13,50 (s, 1H, OH-6).

Przykład 2:

Wytwarzanie antrazalonu (1b).

Rozpuszcza się 8-N-(3,4-dimetoksybenzylo)-antrazalon (la, 0,5 g, 1 mmol) w mieszaninie chlorku metylenu (20 ml) i wody (1 ml), i traktuje 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinonem (DDQ, 0,25 g, 1 mmol) w temperaturze pokojowej. Po 4 godzinach mieszaninę reakcyjną płucze się wodnym 5% roztworem kwaśnego węglanu sodu (3x100 ml), następnie wodą. Fazę organiczną suszy się nad bezwodnym siarczanem sodu, po czym usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując związek tytułowy 1b (0,35 g), który przekształca się w odpowiednią pochodną sól chlorowodorkową traktując metanolowym bezwodnym chlorowodorem.

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck); system eluujący: chlorek metylenu:aceton (90:10 objętościowo) Rf=0,26 FD-MS: 380 [MH]+; 362 [M-NH₃]⁺;

'HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ:

1,45 (_s, 3H, CH₃)_; 2,43 (d, J=17,5 H_z, 1H, CH(H)-12)_; 2,76,2,84 (d_wa dublety, J=19,2 Hz, 2H, CH₂-10)_; 2,86 (dd, J=7,3, 17,5 Hz, 1H, CH(H)-12)_; 4,0 8 (s, 3H, OCH₃)_; 5,14 (d, >9,3 Hz, 2H, H-7)_; 7,37 (d, J=8,5 H_z, 1H, H-3); 7,76 (dd, 3^=7¹^^ 8,5 Hz, 1H, H-2)_; 8,01 (d, J=7,7 Hz, 1H, ^4); 13,14 (s, 1H, OH-11)_; 1H,60 (_s, 1H, OH-6).

Pnykład 3

Wytwarzanie 8-N-(pirydynometylo)-antrazalonu (1c)

Wytwarza się związek tytułowy 1c z daunorubicyny (2a, 1,58 g, 3 mmol) i 4-aminometylopirydyny (1,2 g, 12 mmol) według tej samej procedury, co opisana w przykładzie 1. Wydajność 0,95 g.

185 305

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck), system eluujący: chlorek metylenu:aceton (80:20 objętościowo) R1=0,4

FAB-MS(+): m/z 471 [MH]⁺; 380 [M-CH₂(C₅H4N) + 2H]+;

ⁱHNMR (400 MHz, CDCR) δ:

1,35 (s, 3H, CH3); 2,50 (d, J=17,9 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,78 (s, 2H, CH_r10); 2,96 (dd, J=7,3, 17,9 Hz, 1H, CH(H)-12); 3,70, 4,07 (dwa dublety, J=l6,7 Hz, 2H, N-CH2-pirydynowy); 4,07 (s, 3H, OCH3); 4,76 (d, J=7,3 Hz, 1H, H-7); 7,40 (d, J=7,3 Hz, 1H, H-3); 7,79 (dd, J=7,3 Hz, 1H, H-2); 7,89 (d, J-6,0 Hz, 2H, wodory pirydynowe); 8,02 (d, J=7,7 Hz, 1H, H-l); 8,70 (d, J=6,0 Hz, 2H, wodory pirydynowe); 13,14 (s, 1H, OH-11); 13,45 (s, 1H, OH-6).

Przykład 4:

Wytwarzanie 4-demetoksy-8-N-(pirydynometylo)-antrazalonu (ld)

Wytwarza się związek tytułowy ld z 4-demetoksydaunorubicyny (23, 1,38 g, 3 mmol) i 4-aminometylopirydyny (1,2 g, 12 mmol) według tej samej procedury, co opisana w przykładzie 1. Wydajność 0,87 g.

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck), system eluujący: chlorekmetylenu:aceton (80:20 objętościowo) Rf=0,46

FAB-MS(+): m/z 441 [MH]+; 350 [M-CH2 (C5H4N) + 2H]+;

¹HNMR (200 MHz, CDCI3) δ:

1,41 (s, 3H, CH3); 2,46 (d, J=17,6 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,73 (m, 2H, CH₂-10); 2,89 (dd, J=7,0, 17,69 Hz, 1H, CH(H)-12); 3,37, 3,85 (dwa dublety, J=14,6 Hz, 2H, N-C^-pirydynowe); 2,73 (d, J-7,0Hz, 1H,H-7); 7,24 (m, 2H, wodory pirydynowe); 7,80 (m, 2H,H-2 + H-3); 8,28 (m, 2H, H-l + H-4); 8,54 (2H, wodory pirydynowe); 13,05, 13,06 (2xs, 2H, OH-6 + OH-11).

Przykład 5:

Wytwarzanie 8-N-benzyloantrazalonu (le)

Wytwarza się związek tytułowy le z daunorubicyny (2a, 1,58 g, 3 mmol) i benzyloaminy (1,2 g, 12 mmol) według tej samej procedury, co opisana w przykładzie 1. Wydajność 1 g. TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck); system eluujący: chlorek metylenu:aceton (90:10 objętościowo) Rf=0,7

185 305

FAB-MS(+): m/z 470 [MH]+; 320 [M-C^C,^) + 2H]+;

'HNMR (200 MHz, CDCR) 5:

1,42 (s, 3H, CH3); 2,37 (d, J=17,4 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,68,2,76 (dwa dublety, J=19,6 Hz, 2H, CH₂-10); 2,81 (dd, J=7,0, 17,4 Hz,1H, CH(H)-12); 3,30, 3,84 (dwa dublety, J=13,2 Hz, 2H, N-CH2-Ph); 4,07 (s, 3H, 4-OCH3); 4,74 (d, J=7,0 Hz, 1H, H-7); 7,2-7,3 (m, 5H, wodory fenylowe); 7,38 (dd, J=1,^, 7,7 Hz, 1H, H-1); 7,77 (dd, J=7,7, 8,4 Hz, 1H, H-2); 8,02 (d, J=1,0,7,7 Hz, 1H, H-1); 13,22, 13,42 (2xs, 2H, OH-6 + OH-11).

Przykład 6:

Wytwarzanie 4-dęmętoksy-8-N-bęnzyloantrazalonu (1f)

Wytwarza się związek tytułowy 1f z 4-demetoksydaunorubicyny (2c, 1,38 g, 3 mmol) i benzyloaminy (1,2 g, 12 mmol) według tej samej procedury, co opisana w przykładzie 1. Wydajność 0,9 g.

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck), system eluujący: chlorek metylenu^ceton (80:20 objętościowo) R/=0,84

FAB-MS(+): m/z 440 [MH]+; 290 [M-CH₂(C6'H₅) + 2H]+;

‘HNMR (200 MHz, CDO3) δ:

1,44 (s, 3H, CH3); 2,38 (d, J=17,4 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,70,2,78 (dwa dublety, J=19,7 Hz, 2H, CH₂-10); 2,85 (dd, J=7,2,17,4 Hz, 1H, CH(H)-12); 3,31,3,87 (dwa dublety, J=13,0 Hz, 2H, N-CH2-Ph); 4,74 (d, J=7,2 Hz, 1H, H-7); 7,2-7,3 (m, 5H, wodory fenylowe); 7,83 (m, 2H, H-2 + + H-3); 8,33 (m, 2H, H-1 + H-4); 13,1, 13,2 (2xs, 2H, OH-6 + OH-11).

Przykład 7:

Wytwarzanie 4-demętoksy-8-N-(3,4-dimetoksybęnzylo)antrazalonu (1g)

Wytwarza się związek tytułowy 1 g poddając reakcji 4-demętoksy-daunorubicynę (2c, 1,38 g, 3mmol)z3,4-dimetoksybęnzyloaminą(2g, 12 mmoł)jak opisano w przykładzie ‘.Wydajność 1 g.

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck), system eluujący: chlorek metylenu:aceton (95:5 objętościowo) Rf=0,65

FAB-MS(+): m/z 500 [MH]⁺; 350 [M-CH^Ha) (OCH₃)2 + 2H]⁺;

Przykład 8:

Wytwarzanie 4-demetoksyantrazalonu (1h)

185 305

Przekształca się4-demetoksy-8-N-(3,4-dimetoksybenzylo)-anttazalon(lg, 0,5 g, 1 mmol) w związek tytułowy 1h, w obecności DDQ, jak opisano w przykładzie 2. Wydajność 0,4 g.

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck), system eluujący: chlorek metylenu:aceton (95:5 objętościowo) Rf=0,34

FD-MS(+): 350 [MH]+;

'HNMR (200 MHz, CDCl₃) 5:

1,46 (s, 3H, C H₃); C,H3 (d, J= ld,7 Hz, 1H, ^H 2,12, ,,86 (dwa dublety Hz,

2H, CH2-10); 2,87 (dd, >7,0,17,7 Hz, 1H,CH(H)-12);5,94(Z,J=7,0Hz, 1H,H-7);7,83 (m,2H, H-2 + H-3); 8,33 (m, 2H, H-1 + H-4); 13,18, 13,25 (2xs, 2H, OH-6 + OH-11).

Przykład 9:

Wytwarzanie 8-N-alliloentrazalonu (1i)

Wytwarza się związek tytułowy li poddając reakcji daunorubicynę (2a, 1,58 g, 3 mmol) z elllloamlną(0,9 g, 12 mmol) jak opisano w przykładzie 1. Surowy materiał poddaje się chromatografii szybkiej na silikażelu, stosującjako eluent mieszaninę chlorku metylenu i acetonu (98:2 objętnściown-, co daje czysty związek li (0,85 g).

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck); system eluujący: chlorek metylenu, Rf=0,1 'HNMR (200 MHz, CDCl₃) δ:

1,37 (s, 3H, CH₃); 2,41 (d, J=17,6 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,64 (m, 2H, CH_r10); 2,88 (dd, J=7,2, 17,6 Hz, 1H, CH(H)-12); 2,8-3,4 (m, 2H, C^CHhCH,); 4,04 (s, 3H, 4-OCH3); 5,0-5,2 (m, 2H, CH2CH=CH2); 5,90 (m, 1H, CH2CH=CH₂); 7,37 (d, J=8,4 Hz, 1H, H-3); 7,75 (dd, J=7,6, 8,4 Hz, 1H, H-2); 8,00 (d, J=7,6 Hz, 1H, H-1); 13,0,13,5 (2xs, 2H, OH-6 + OH-11).

Przykład 10:

Wytwarzanie 8-N-benaylo-13-dihydroαntrazαlnnu (1j)

Rozpuszcza się w bezwodnym chlorku metylenu 6-N-benz9loantraaalnn (1e, 0,75 g, 1,5 mmol), wytworzony jak opisano w przykładzie 5, i traktuje borowodorkiem czterobutylnamoniow9m (1,6 g) w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną wylewa się na wodny roztwór 1N kwasu solnego i ekstrahuje chlorkiem metylenu. Rozdziela się fazę organiczną, płucze wodą i suszy nad bezwodnym siarczanem sodu. Usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, a surowy produkt poddaje chromatografii szybkiej na silikażelu, stosując jako eluent mieszaninę toluenu i acetonu (9:1 objętościowo), uzyskując związek tytułowy 1j (0,65 g).

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck); system eluujący: chlorek metylenu i aceton (90:10 objętościowo), Rf=0,4.

'HNMR (200 MHz, CDCy δ:

1,42 (s, 3H, CH3); 1,51 (m, 1H, CH(H)-12); 2,6 (m, 2H, CH(H)-12 + CH(H)-10); 3,06 (d, J=19,6 Hz, 1H, CH(H)-10); 3,21, 3,79 (dwa dublety, J=12,9 Hz, 2H, N-CH_rPh); 4,08 (s, 3H,

185 305

OCH₃); 4,20 (m, 1H, H-9); 4,34 (d, J=7,2 Hz, 1H, H-7); 7,1-7,3 (m, 5H, wodory fenylowe); 7,37 (dd, J=1,0, 8,8 Hz, 1H; H-3); 7,76 (dd, J=7,7, 8,8 Hz, 1H, H-2); 8,02 (dd, J=1,0,7,7 Hz, 1H, H-1); 13,24, 13,51 (2xs, 2H, OH-6, OH-11).

Przykład 11:

Wytwarzanie 8-N-(3,4-di-metoksybenoylo) 13-dihykroantraz.alonu (1k)

Rozpuszcza się w atmosferze argonu w THF (20 ml) 8-N-(3,4-kimetoksydenzylu)antrazalon(500mg, 1,1 mmol), po czym dodaje się mieszając MgBr2*OEt2 (1,13 g,4,4 mmol). Mieszaninę schładza się w -50°C i dodaje małymi porcjami przez 10 minut NaBH₄ (84 mg, 2,2 mmol). Dodaje się metanol (2 ml) i mieszaninę reakcyjną miesza się jeszcze przez godzinę. Dodaje się aceton (2 ml) i mieszaninę wlewa się do schłodzonego wodnego roztworu kwasu szczawiowego (100 mg w 100 ml wody) i ekstrahuje chlorkiem metylenu. Fazę organiczną oddziela się, płucze wodą, i suszy nad bezwodnym siarczanem sodu. Usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt poddaje się chromatografii szybkiej na silikażelu, stosując mieszaninę chlorku metylenu, metanolu i kwasu octowego (30:2:1 objętościowo) jako eluent, co daje 320 mg produktu w postaci pojedynczego izomeru.

tLc na płytce Kieselgel F254 (Merck); system eluujący: chlorek metylenu:metanol:kwas octowy (30:2:1 objętościowo) Rf=0,5

FAB-MS(+): m/z 532 [M+H]+; m/z 382 [M+2H - CH₂C6H3(OCH3)2]⁺ 'HNMR (600 MHz, DMSO-d6): δ:

1,57 (m, 1H, H-8); 1,70 (s, 3H, CH₃); 2,74 (m, 1H, H-8); 2,98 (d, 1H, J=19,4 Hz, H-10); 3,40 (d, 1^, >19,0 Hz, H-10); 3,64 (55,3H, OCH₃3; 3,74 (s, 3H, OCH₃3; 3,84 (m, 1H, CH(H)-Ph); 4,53 (m, 1H, H-7); 5,95 (s, 1H, oH-9); 6,77 (m, 1H, wodory aromatyczne); 6,92 (m, 1H, wodory aromatyczne); 6,94 (m, 1H, wodory aromatyczne); 7,69 (m, 1H, wodory aromatyczne); 7,94 (m, 2H), wodory aromatyczne); 11,09 (szerokie pasmo, 1H, nH+); 13,03 (s, 1H, OH); 13,56 (s, 1H, OH).

Przykład 12:

Wytwarzanie oksymu 8-N-(óirykynometylo)-13-antrazalonu-(1Γ).

Rozpuszcza się w EtOH (10 ml) 8-N-(pirydynometylo)- 13-antraz^ilon (1 c, 210 mg, 0,5 mmol) i traktuje chlorowodorkiem hydroksyloaminy (59 mg, 0,85 mmol) i trójwodzianem octanu sodu (66 mg, 0, 5 mmol) rozpuszczonym w 0,25 ml wody. Mieszaninę reakcyjną podgrzewa się do wrzenia pod chłodnicą zwrotną mieszając przez 2 godziny, wylewa do wody i ekstrahuje chlorkiem metylenu. Fazę organiczną oddziela się, płucze wodą i suszy nad bezwodnym siarczanem sodu. Usuwa się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt poddaje się chromatografii szybkiej na silikażelu, stosując jako eluent mieszaninę chlorku metylenu i acetonu (8:2: objętościowo), co daje 120 mg mieszaniny oksymów.

185 305

TLC na płytce Kieselgel F254 (Merck); system eluujący: chlorek metylenu i aceton (8:2 objętościowo) Rf=0,44 i 0,36 FAB-MS(+): m/z 486 [M+H]⁺m/z 470 (M+2H 0]+; m/z 468 [M+H - H₂O]⁺ 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:

1,40 (s, 3H, CH₃), 2,52 (d, 1H, J=17,2 Hz, H-8a); 2,57 (d, 1H, J=18,8 Hz, H-10); 2,89 (dd, J=17,2 i 6,8 Hz, H-8b); 2,97 (d, 1H, J=18,8 Hz, H-10); 3,63 (d, 1H, J-18,0 Hz, CH(H)-Ph); 3,96 (s, 3H, OCH3); 4,22 (d, 1H, J=18,0 Hz, CH(H)-Ph); 4,52 (d, 1H, J=6,8 Hz, H-7); 7,65 (dd, 1H, J=6,8 i 2,9 Hz, H-3); 7,91 (m, 2H, H-1 + H-2); 7,95 (m, 2H, H-3' + H-50; 8,78 (m, 2H; H-2'+H-6'); 10,77 (s, 1 H; =N-OH); 13,09 (s, 1H, OH), 13,53 (s, 1H, OH).

Test biologiczny

Analizuje się oddziaływanie pochodnych antrazalinonowych o wzorze 1 z aktywnością samoagregacji fragmentów 25-35 β-amyloidu i fragmentów 106-126 PrP, stosując analizę rozpraszania światła. Syntetyzuje się P-25-35 (GSNKGAIIGLH) oraz PrP 106-126 (KTNMKHMAGAAAGAWGGLG) stosując chemię fazy stałej z wykorzystaniem urządzenia 430A Applied Biosystems Instruments i oczyszcza stosując HPLC z fazami odwróconymi (Beckman Inst. model 243); według procedury opisanej w pracy Forloni i in., Nature 362: 543, 1993.

Rozpraszanie światła na roztworach peptydu ocenia się spektrofluorymetrycznie (Perkin Elmer LS 50B); pobudzenie i emisja badane były przy długości fali 600 nm. Fragmenty β-amyloidu 25-35 i PrP 106-126 rozpuszcza się w stężeniach od 0,5 do 1 mg/ml (odpowiednio, 0,4-0,8 mM oraz 0,2-0,4 mM) w roztworze buforu fosforanowego o pH 5, 10 mM agregują spontanicznie w ciągu godziny.

W celu oszacowania procesu tworzenia włókien do roztworów peptydowych dodaje się 8-N-pirydynometylenoantrazalon (1c); rozpuszczony w kilku stężeniach (0,2-2 mM) w buforze TRIS, 5-mM, pH 7,4. Związek lc dodany do roztworu fragmentu 25-35 β-amyloidu i 106-126 PrP w równoważnikowym stężeniu wykazuje całkowite zablokowanie agregacji.

Test tioflawinowy T

Roztwory wyjściowe peptydu P-25-35 wytwarza się rozpuszczając liofilizowany peptyd w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia 7,07 mg/ml.

Próbki tych roztworów rozpuszcza się w 50 mM buforze fosforanowym pH 5, tak by otrzymać końcowe stężenie peptydu 100 mM, po czym inkubuje przez 24 godziny w 25°C w obecności lub bez 30 mM związku testowego w końcowej objętości 113 ml. Związki testowe rozpuszcza się uprzednio w DMSO do stężenia 3,39 mM; końcowe stężenie procentowe (objętościowo) DMSO w mieszaninie inkubacyjnej było mniejsze niż 3%.

Pomiary fluorescencji prowadzi się jak opisano w Naiki i in., Anal. Biochem. 177, 244, 1989, oraz M. LeVine III; Protein Sci. 2; 404,1993. W skrócie, inkubowane próbki rozcieńcza się do stężenia peptydu 8 mg/ml buforowym roztworem 50 mM cytrynianu sodu pH 5, zawierającym 47 mM tioflawiny T (ThT) do końcowej objętości 1,5 ml. Pomiary fluorescencji wykonuje się w spektrofotometrze fluorescencyjnym Kontron i wartości uśrednia się po odjęciu fluorescencji tła 47 mM Thm.

Wyniki przedstawia się jako fuorescencję względną; tj. procentową fuorescencję względem peptydu β-25-35 inkubowanego bez dodatków (kontrola). Tabela 1 przedstawia wyniki pomiarów dla kilku związków.

Tabela 1

Związek	Fluorescencja względna
1b	40,26
lc	6,82
1k	15,70
1	1,99

185 305

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek o wzorze 1

   R

   R,

   R.

   R.

   R.

   R

   R '5 którym:

   - X, oraz X2 oba oznaczają C=0;

   - Χ3 wybiera się spośród grup: ch₂,

   C=O,

   CHOH, koksylową;

   C=N(R₉), gdzie Rę oznacza grupę hydroksy lub aminoarylową;

   - R,,R₂ oraz R3 każdy oznacza atom wodoru; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę C,.₁₆al koksylową;

   - R₅ oraz R₈ wybiera się niezależnie spośród:

   - atomu wodoru,

   - grupy hydroksylowej;

   - R₆ wybiera się spośród:

   atomów wodoru, grupy R_b-CH2-, gdzie R_B oznacza grupę arylową lub heterocyklilową,

   C2_₈alkenylowej,

   C3-₈cykloalkilowej; oraz

   - R₇ wybiera się spośród:

   - atomów wodoru,

   - grupy metylowej;

   lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
2. 2. Związek według zastrz. 1, w którym:

   - X, oraz Χ2 oba oznaczają C=O;

   - Χ3 wybiera się spośród grup:

   CH2, c=o,

   CHOH oraz

   C=N(Rę), gdzie Rę oznacza grupę hydroksy lub aminoarylową;

   -R,, R₂ oraz R3 każdy oznacza atom wodoru; a R₄ oznacza atom wodom lutb grupę C,_₄al

   - R₅ oraz R8 wybiera się niezależnie spośród: atomu wodoru, grupy hydroksylowej;

   - R6 wybiera się spośród:

   atomów wodoru;

   grupy RB-CH2-, gdzie Rb zdefiniowano w zastrz. 1, grupy C2~6alkenylowej; oraz

   - R7 wybiera się spośród

   185 305 atomów wodoru, grupy metylowej;

   lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
3. 3. Związek według zastrz. 1, w którym:

   - X, oraz X2 oba oznaczają C=O,

   - Χ3 wybiera się spośród grup:

   CH2,

   C=O,

   CHOH;

   - R,, R2 oraz R3 każdy oznacza atom wodoru; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę metoksylową;

   - R₅ oraz R_g wybiera się niezależnie spośród: atomu wodoru, grupy hydroksylowej;

   - R₆ wybiera się spośród: atomów wodoru, grupy benzylowej, allilowej,

   3,4-dimetoksybenzylowej, pirydynometylowej, (N-metylo-dihydropirydyno)-metylowej, nikotylowej; oraz

   - R₇ wybiera się spośród atomów wodoru, grupy metylowej;

   lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
4. 4. Związek według zastrz. 1, w którym:

   - X, oraz Χ2 oba oznaczają C=O;

   - Χ3 oznacza C=O;

   ^{- R}1, ^R2 oraz R3 każdy oznacza atom wodoru; a R4 oznacza atom wodoru lub grupę metoksylową;

   - R₅ oraz R₈ każdy niezależnie wybiera się spośród atomów wodoru, grupy hydroksylowej, metoksylowej lub aminowej;

   - R₆ wybiera się spośród atomów wodoru, grupy pirydynometylowej, (N-metylodihydropirydyno)-metylowej, nikotylowej, glicylowej i izoleucylowej; oraz

   - R7 oznacza grupę metylową;

   lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
5. 5. Sposób wytwarzania związku o wzorze 1 według zastrz. 1, znamienny tym, że:

   a) poddaje się reakcji związek o wzorze 2:

   gdzie Χ1, Χ2 oraz R1 do R7 zdefiniowano w zastrz. 1 oraz W oznacza grupę opuszczającą, z aminą o wzorze

   H2N-CH2-RB gdzie Rb ma znaczenie podane w zastrz. 1, z wytworzeniem związku o wzorze 1, gdzie IR oznacza grupę RB-CH2-;

   185 305

   b) jeżeli trzeba, przekształca się tak otrzymany związek o wzorze (1) w inny związek o wzorze (1); i/lub

   c) jeżeli trzeba, przekształca się związek o wzorze (1) w jego dopuszczalną farmaceutycznie sól.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap (a) prowadzi się w 1-10-krotnym nadmiarze aminy, w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w obecności zasady organicznej przez czas od 6 do 48 godzin, w temperaturze od -10°C do pokojowej.
7. 7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że w etapie (b) przekształca się związek o wzorze (1), gdzie IR, oznacza grupę R_B-CH₂- w związek o wzorze 1, w którym R₆ oznacza atom wodoru.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że przekształcenie prowadzi się przez utlenienie, a R_b oznacza grupę 3,4-dimetoksyfenylowąlub winylową.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że utlenienie prowadzi się zapomocą2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinonu, a Rb oznacza grupę 3,4-dimetoksyfenylową.
10. 10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że przekształca się związek o wzorze (1), w którym R6 oznacza atom wodoru w związek o wzorze 1, gdzie R6 oznacza grupę C₂.₈alkenylową lub C3_₈cykloalkilową.
11. 11. Sposób według zastrz. 5,6,7 albo 10, znamienny tym, że w etapie (b) prowadzi się redukcję związku o wzorze (1), w którym X₂ oznacza C=0, z wytworzeniem związku o wzorze 1, gdzie X₃ oznacza CHOH lub CH2.
12. 12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jako składnik aktywny związek o wzorze 1, jak zdefiniowano w każdym z zastrz. 1-4 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w domieszce z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczaczem.
13. 13. Związek o wzorze 1 według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, do stosowania w leczeniu skrobiawicy.
14. 14. Związek o wzorze 1 według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, do stosowania w leczeniu skrobiawicy AL, choroby Alzheimera lub zespołu Downa.